及将1毫升转移至 另一个FAME管中，而制备所萃取的粗脂质的一试样。使用具FID检测的GC，测定生物质 的估计粗脂质含量为53. 2% (以FAME总和的形式）；同时自干燥生物质萃取52. 0% (重 量/重量）的脂质，而得97.8%的总脂质回收率。使用GC/FID，测定粗脂质为91.9%的脂 肪酸（以FAME总和的形式）。粗脂质中所含有的主要脂肪酸为C16:0(182. 5毫克/克）、 C20: 5n-3 (186. 8 毫克 / 克）及C22: 6n-3 (423. 1 毫克 / 克）。
[0252] 藉由将55. 0毫克的粗脂质称重置入一个体积为50毫升的烧瓶中及将一等分试样 转移至一个HPLC小瓶中以进行HPLC/ELSD/MS分析，而测定所萃取的粗脂质的脂质种类廓 型。依据HPLC/ELSD/MS分析，粗脂质含有0. 2%的固醇酯（SE)、95. 1 %的TAG、0. 4%的固醇 及0. 5%的1，2-甘油二酯（DAG)。TAG部分中的5%包括在TAG峰后直接洗提出的峰，但并 未产生一个可辨识的质谱。
[0253] 藉由急骤层析法的测定，自该试样所分离出的TAG构成约92. 4%的粗制油。在SPE 分离作用后，藉由重量或TLC并未检测到PL。TAG中所含有的主要脂肪酸（>50毫克/克） 为C16:0 (189 毫克 / 克）、C20: 5n-3 (197 毫克 / 克）及C22: 6n-3 (441 毫克 / 克）。
[0254]PTA-10208 试样 #2
[0255] 使用GC/FID测定PTA-10208试样#2的生物质与所萃取的粗脂质的脂肪酸廓型。 藉由将32. 0毫克的生物质直接称重置入一个FAME管中，而就地将生物质中的脂肪酸转酯 化；藉由将60. 1毫克的粗脂质称重置入一个体积为50毫升的烧瓶中及将1毫升转移至另 一个FAME管中，而制备所萃取的粗脂质的试样。使用具FID检测的GC，测定生物质的估计粗 脂质含量为52. 4% (以FAME总和的形式），同时自干燥生物质萃取48.0% (重量/重量）的 脂质，而得91. 7%的总脂质回收率。使用GC/FID，测定粗脂质为95. 3%的脂肪酸（以FAME 总和的形式）。粗脂质中所含有的主要脂肪酸为C16:0(217. 5毫克/克）、C20:5n-3(169. 3 毫克/克）及C22:6n-3(444. 1毫克/克）。
[0256] 藉由将60. 1毫克的粗脂质称重置入一个体积为50毫升的烧瓶中及将一等分试样 转移至一个HPLC小瓶中以进行HPLC/ELSD/MS分析，而测定所萃取的粗脂质的脂质种类廓 型。依据HPLC/ELSD/MS分析，粗脂质含有0. 2%的SE、95. 7%的TAG、0. 3%的固醇及0. 7% 的1，2-DAG。TAG部分中的5. 1%包括在TAG峰后直接洗提出的峰，但并未产生一个可辨识 的质谱。
[0257] 自该试样所分离出的TAG构成约93. 9%的粗制油。在SPE分离作用后，藉由重量 或TLC并未检测到PL。TAG中所含有的主要脂肪酸（>50毫克/克）为C16:0(218毫克/ 克）、C20: 5n-3 (167 毫克 / 克）及C22: 6n-3 (430 毫克 / 克）。
[0258]PTA-10208 试样 #3
[0259] 使用HPLC/ELSD/MS，分析在ATCC登录号PTA-10208所保藏微生物的粗制油的一试 样（试样PTA-10208#3)。回收总共 98.38%的脂质，其中固醇酯（SE)部分占0.32%，TAG 部分占96. 13%，1，3_甘油二酯（DAG)部分占0.22%，1，2-DAG部分占0.78%，及固醇部分 占 0· 93%。
[0260]PTA-10212 试样 #1
[0261] 使用GC/FID测定PTA-10212试样#1的生物质与所萃取的粗脂质的脂肪酸廓型。 藉由将27. 0毫克的生物质直接称重置入一个FAME管中，而就地将生物质中的脂肪酸转酯 化；藉由将52. 5毫克的粗脂质称重置入一个体积为50毫升的烧瓶中及将1毫升转移至 另一个FAME管中，而制备所萃取的粗脂质的一试样。使用具FID检测的GC，测定生物质 的估计粗脂质含量为38. 3% (以FAME总和的形式），同时自干燥生物质萃取36. 3%(重 量/重量）的脂质，而得94.6%的总脂质回收率。使用GC/FID，测定粗脂质为83.2%的脂 肪酸（以FAME总和的形式）。粗脂质中所含有的主要脂肪酸为C16:0(328. 5毫克/克）、 C20: 5n-3 (90. 08 毫克 / 克）及C22: 6n-3 (289. 3 毫克 / 克）。
[0262] 藉由将52. 5毫克的粗脂质称重置入一个体积为50毫升的烧瓶中及将一等分试样 转移至一个HPLC小瓶中以进行HPLC/ELSD/MS分析，而测定所萃取的粗脂质的脂质种类廓 型。依据HPLC/ELSD/MS分析，粗脂质含有0. 2%的SE、64. 2%的TAG、1. 9%的FFA、2. 8%的 1，3-DAG、L4%的固醇、18. 8%的1，2-DAG及0· 5%MAG。TAG部分中的3. 4%包括在TAG峰 后直接洗提出的峰，但并未产生一个可辨识的质谱。
[0263] 自该试样所分离出的TAG构成约49. 8 %的粗制油。所分离出的PL构成约8. 1 % 的粗制油。在TAG部分中所含有的主要脂肪酸（>50毫克/克）为C16:0 (400毫克/克）、 C20: 5n-3 (91毫克/克）及C22: 6n-3 (273毫克/克）。在PL部分中所含有的主要脂肪酸 (>50 毫克 / 克）为C16:0 (98 毫克 / 克）、C20: 5n-3 (33 毫克 / 克）及C22: 6n-3 (227 毫克 / 克）。
[0264]PTA-10212 试样 #2
[0265] 使用GC/FID测定PTA-10212试样#2的生物质与所萃取的粗脂质的脂肪酸廓型。 藉由将29. 5毫克的生物质直接称重置入一个FAME管中，而就地将生物质中的脂肪酸转酯 化；藉由将56. 5毫克的粗脂质称重置入一个体积为50毫升的烧瓶中及将1毫升转移至另 一个FAME管中，而制备所萃取的粗脂质的试样。使用具FID检测的GC，测定生物质的估计粗 脂质含量为40.0% (以FAME总和的形式），同时自干燥生物质萃取41. 3% (重量/重量）的 脂质，而得106. 1 %的总脂质回收率。使用GC/FID，测定粗脂质为82. 8%的脂肪酸（以FAME 总和的形式）。粗脂质中所含有的主要脂肪酸为C16:0 (327. 3毫克/克）、C20: 5n-3 (92. 5 毫克/克）及C22:6n-3(277.6毫克/克）。
[0266] 藉由将56. 5毫克的粗脂质称重置入一个体积为50毫升的烧瓶中及将一等分试样 转移至一个HPLC小瓶中以进行HPLC/ELSD/MS分析，而测定所萃取的粗脂质的脂质种类廓 型。依据HPLC/ELSD/MS分析，粗脂质含有0· 2%的SE、58. 2%的TAG、2. 3%的FFA、3. 4%的 1，3-DAG、L7%的固醇、23. 4%的1，2-DAG及0· 6%的MAG。TAG部分中的3. 3%包括在TAG 峰后直接洗提出的峰，但并未产生一个可辨识的质谱。
[0267] 自该试样所分离出的TAG构成约51. 9%的粗制油。所分离出的PL构成约8. 8% 的粗制油。在TAG部分中所含有的主要脂肪酸（>50毫克/克）为C16:0 (402毫克/克）、 C20:5n-3(92毫克/克）及C22:6n-3(245毫克/克）。在PL部分中所含有的主要脂肪酸 (>50 毫克 /克）为C16:0(121 毫克/ 克）、C20:5n-3(48 毫克/ 克）及C22:6n-3(246 毫克 /克）。
[0268] 表4 :PTA-10208与PTA-10212的生物质与所萃取的粗脂质的脂肪酸廓型（毫克/ 克）
[0269]
[0271] 表5 :PTA-10208与PTA-10212的生物质与所萃取的粗脂质的脂肪酸廓型（％ )
[0272]
[0280] PTA-10212 试样 #3
[0281] PTA-10212试样#3的生物质中的FAME总和形式的脂质含量经估算为34%，及 在溶剂萃取作用后所得的粗制油量为37重量％，而得生物质中所存在的脂肪的回收率 为109%。在使用急骤层析法的份化作用后，约46%的粗制油被分离为TAG，28%被分离为DAG，该粗制油含有309毫克/克的DHA与264毫克/克的EPA。所分离出的TAG含有341 毫克/克的DHA与274毫克/克的EPA。所分离出的DAG部分含有262毫克/克的DHA与 237毫克/克的EPA。该生物质、所萃取的粗制油及分离部分的总脂肪酸廓型，分别以毫克 /克与％FAME的形式计算而示于表8与表9。
[0282] 表8 :PTA-10212试样#3的生物质与所萃取的粗脂质的脂肪酸廓型（毫克/克）
[0283]
[0284]
[0285] 表9 :PTA-10212试样#3的生物质与所萃取的粗脂质的脂肪酸廓型（％ )
[0286]
[0288] PTA-10212试样#4
[0289] PTA-10212试样#4含有以FAME总和形式所测定的约23%的脂质，使用己烷萃取 作用回收其中的107%。在使用急骤层析法的份化作用后，约42%的粗制油被分离为TAG， 18%被分离为DAG。该粗制油含有275毫克/克的DHA与209毫克/克的EPA。所分离出 的TAG含有296毫克/克的DHA与205毫克/克的EPA。所分离出的DAG部分含有245毫 克/克的DHA与219毫克/克的EPA。该生物质、所萃取的粗制油及分离出的部分的总脂肪 酸廓型，示于表10 (毫克/克）与表11(%FAME)。
[0290] 表10 :PTA-10212试样#4的生物质与所萃取的粗脂质的脂肪酸廓型（毫克/克）
[0291]
[0292]
[0293] 表11 :PTA-10212试样#4的生物质与所萃取的粗脂质的脂肪酸廓型（％ )
[0294]
[0296] PTA-10212 试样 #5
[0297] 使用FRIOLEX?方法（英国米尔顿凯恩斯（MiltonKeynes)的英国GEA威斯伐 里亚分离器（GEAWestfaliaS印aratorUK)有限公司），自PTA-10212的生物质萃取粗制 油试样，以产生微生物油PTA-10212试样#5。使用低压急骤层析法，自PTA-10212试样#5 分离个别的脂质种类，及测定各种类的重量百分比。使用GC-FID测定各种类的脂肪酸廓 型。
[0298] 简言之，藉由将240毫克的粗制油溶于600微升的己烷中及施用于管柱顶部，而 制备试样。在使用急骤层析法的试样份化作用后，所有部分的合并重量为240毫克，而 得100%的回收率。固醇酯部分占0.9%，TAG部分占42. 6%，游离脂肪酸（FFA)部分占 1. 3%，固醇部分占2. 2%，DAG部分占41. 6%。FRIOLEX雜粗制油与分离部分的总脂肪 酸廓型，分别以毫克/克与％FAME的形式计算及示于表12与表13。
[0299] 表12 :PTA-10212试样#5的粗制油的脂肪酸廓型（毫克/克）
[0302] 表13 :PTA-10212试样#5的粗制油的脂肪酸廓型（％ )
[0305] 实施例4
[0306] 使用非水逆相HPLC分离作用与APCI-MS检测作用，针对来自实施例3的 PTA-10208试样#1、PTA-10208试样#2、PTA-10212试样#1、PTA-10212试样#2及PTA-10212 试样#3、PTA-10212试样#4及PTA-10212试样#5中的各试样，测定存在于所萃取的粗脂质 中的各TAG异构物的相对量与脂肪酸组成。
[0307] TAG方法-
[0308] 仪器 安捷伦（Agilent) 1100HPLC
[0309] 安捷伦（Agilent) 1100MSD
[0310] 管柱 二种PhenomenexLunaC18 (2)，150x4· 6 晕米，
[0311] 5微米粒径及串联连接
[0312] 移动相 Α-乙腈
[0313] Β-具有0. 1%乙酸铵的ΙΡΑ
[0314] 梯度
[0315]
[0316] 管柱温度 20°C
[0317] 流速 0.5毫升/分钟
[0318] 注射体积 5微升
[0319] MSD 质量范围 350 至 1150
[0320] 碎裂器225伏特
[0321] 干燥气体温度350°C
[0322] 汽化器温度325°C
[0323] 毛细管电压3500伏特
[0324] 电晕电流10微安培
[0325] PTA-10208 试样 #1
[0326] 藉由将5. 5毫克的油称重置入一个HPLC小瓶中及以1毫升的己烷稀释，而制备用 于TAG分析的自PTA-10208试样#1所分离的粗脂质。
[0327] 表14 :鉴定PTA-10208试样#1中的TAG物种
[0328]
[0330] PTA-10208 试样 #2
[0331] 藉由将5. 3毫克的油称重置入一个HPLC小瓶中及以1毫升的己烷稀释，而制备用 于TAG分析的自PTA-10208试样#2所分离的粗脂质。
[0332] 表15 :鉴定PTA-10208试样#2中的TAG物种
[0333]
[0335] PTA-10212 试样 #1
[0336] 藉由将称重5. 3毫克的油称重置入一个HPLC小瓶中及以1毫升的己烷稀释，而制 备用于TAG分析的自PTA-10212试样#1所分离的粗脂质。
[0337] 表16 :鉴定PTA-10212试样#1中的TAG物种
[0338]
[0340] ND=未检测出
[0341] PTA-10212 试样 #2
[0342] 藉由将称重3. 6毫克的油称重置入一个HPLC小瓶中及以1毫升的己烷稀释，而制 备用于TAG分析的自PTA-10212试样#2所分离的粗脂质。
[0343] 表17 :鉴定PTA-10212试样#2中的TAG物种
[0344]
[0346] ND=未检测出
[0347] PTA-10212 试样 #3
[0348] 在己烷中制备PTA-10212试样#3的TAG部分的试样，及藉由HPLC/APCI/MS分析 以测定个别TAG异构物的身分。
[0349] 表18 :鉴定PTA-10212试样#3中的TAG物种
[0350]
[0353] ND=未检测出
[0354] PTA-10212 试样 #4
[0355] 在己烷中制备PTA-10212试样#4的TAG部分的试样，及藉由HPLC/APCI/MS分析 以测定个别TAG异构物的身分。
[0356] 表19 :鉴定PTA-10212试样#4中的TAG物种
[0357]
[0359] ND=未检测出
[0360] PTA-10212 试样 #5
[0361] 在己烷中制备PTA-10212试样#5的TAG部分的试样，及藉由HPLC/APCI/MS分析 以测定个别TAG异构物的身分。
[0362] 表20 :鉴定PTA-10212试样#5中的TAG物种
[0363]
[0365] 实施例5
[0366] 经由精制、脱色及除臭而进一步加工处理粗制油，以制得精制油。以高油酸的葵花 籽油稀释该精制油，以制得DHA含量约400毫克/克的最终油。分离个别的脂质种类，及使 用GC-FID测定各种类的FAME形式的脂肪酸廓型。
[0367] PTA-10208 最终油
[0368] PTA-10208最终油#1至5的脂肪酸廓型汇总于表21至22,包括与所分离的TAG 部分相关联（表23至24)及与所分离的固醇/DAG部分相关联（表24至26)的廓型。
[0369] 亦使用急骤层析法（表27)及具有ELSD与APCI-MS验证的正相HPLC(表28)，测 定最终油中的个别脂质种类。
[0370] 表21 :PTA-10208最终油的脂肪酸廓型（毫克/克）
[0393] ND=未检测出
[0394] PTA-10212 最终油
[0395] DHA以41. 63%与366. 9毫克/克存在于PTA-10212最终油中，而EPA以16. 52% 存在。测定个别脂肪酸廓型及汇总于表29。
[0396] 表29 :PTA-10212最终油的脂肪酸廓型FAME)
[0399] ND=未检测出
[0400] 实施例6
[0401] 使用实施例4所述的技术，进行实施例5所述的PTA-10208最终油的甘油三酯 (TAG)的分析。进行各脂肪酸部分的鉴定作用，及汇总于下列表30。
[0402] 表30 :鉴定PTA-10208最终油中的TAG物种
[0405] 实施例7
[0406] 在如表1与表2的培养基中，以添加碳与氮的培养形式，制备在ATCC登录号 PTA-10208与10212所保藏的分离的微生物的一个已二天的接种体烧瓶。
[0407] 依据下列程序进行诱突变作用：
[0408] 将一个已T= 2日的无菌烧瓶中的约50毫升，倒入一个无菌的40毫升玻璃均质 机中。该培养物在均质机中接受50次倾没型搅拌。将该培养物吸量出，及过滤通过置于一 个50毫升的无菌管中的一个无菌的50微米筛网过滤器（该筛网作为留住菌落的较大型群 集及同时让较小的聚簇与单细胞通过该50微米筛网的构件）。在一个无菌的50毫升管中 收集全部的浓缩浸出物。浸渍过的培养物进行涡漩，及以1 :1〇〇倍的水平稀释。稀释后的 浸出试样进行涡漩，然后将200微升的接种体添加至一个ΙΟΟχ15毫米、含有4至5个玻璃 珠（3毫米玻璃珠）的培养基洋菜平皿上。将各平皿平缓地搅拌，以使得玻璃珠将接种体均 匀地涂布在平皿上。自平皿上移除玻璃珠，及让平皿加盖静置约5分钟而干燥。当该程序 在暗光中进行时，将无菌通风橱与邻近区域的灯光关闭。仅存在使该程序得以进行的间接 与微弱的极少量的光。
[0409] 当照射所述试样时，将五重复的平皿的盖移开，及将平皿置于XL交联器（美国纽 约的斯贝克（SpectronicsCorporation)公司）的底板上。该交联器所输送的功率以微焦 耳为单位，及其水平是寻求达到90%至95%的杀死率。五重复的对照组平皿是使用相同的 操作程序接种未经诱发突变的细胞。使用细胞数目计算杀死％。一旦照射完成后，将平皿 取出及加盖，及依序以封口膜（parafilm)与铝箱包裹平皿。该平皿在第一周务必在黑暗中 生长，藉此其等无法修补受损的基因。
[0410] 将平皿置于22. 5°C房中约10日，然后计数菌落。当进行最终计数之后，以一个无 菌的接种环挑取菌落及再画线接种在新的培养基平皿上。将各菌落分植在个别的平皿上。 当平皿生长稠密时，使用一接种环采集一试样，及接种至含有50毫升的培养基的一个无菌 的250毫升摇瓶中。将该烧瓶置于22. 5°C房中的一个200rpm振荡器上。在T= 7日，将该 摇瓶的培养物采集置入一个50毫升的无菌管中。测定pH值，及将试样离心以收集生物质 的片状沉淀物。将各试样冲洗及再悬浮于异丙醇与蒸馏水的50 :50混合物中，然后再度离 心。将所收集的片状沉淀物冷冻干燥、称重及进行FAME分析。表31与表32的数据分别代 表以上述方法自菌株PTA-10208与PTA-10212所产生的突变株。
[0411] 表 31 :PTA-10208 突变株
[0417]
[0418] 能以任一与所有变化组合所述的各种方面、实施例及选项。
[0419] 在本说明书所提及的所有公开案、专利及专利申请案在此并入本案以为参考资 料，如同每个个别的公开案、专利及专利申请案个别地与单独地在此并入本案以为参考数 据。
【主权项】
1. 一种微生物油，其包含以重量计至少约20 %的二十碳五烯酸和以重量计各低于约 5%的二十碳四烯酸，二十二碳五烯酸n-6,油酸，亚麻油酸，十八碳三烯酸，二十烯酸，芥子 酸及十八碳四烯酸。2. 如权利要求1所述的微生物油，进一步包含至少约25重量％的二十二碳六烯酸。3. 如权利要求1至2任一项所述的微生物油，进一步包含至少约35重量％的二十二碳 六烯酸。4. 如权利要求1至3任一项述的微生物油，其中甘油三酯组分中3重量％或更少的脂 肪酸是二十碳四烯酸。5. 如权利要求4所述的微生物油，其中甘油三酯组分中2重量％或更少的脂肪酸是 二十碳四稀酸。6. 如权利要求1至5任一项所述的微生物油，其中所述油是粗制油。7. 如权利要求1至5任一项所述的微生物油，其中所述油是精制油。8. 如权利要求1至5任一项所述的微生物油，其中所述油是最终油。9. 一种供人类用的食用产品、化妆品或药学组成物，其包含如权利要求1至8任一项所 述的微生物油。10. 如权利要求9所述的食用产品，其中该食用产品选自：（i)婴儿奶粉，（ii)乳、饮 料、治疗用饮品、营养饮品或其组合，（iii)用于人类食品中的添加剂，和（iv)营养增补剂。11. 如权利要求1至8中任一项所述的微生物油，其用于治疗发炎或相关病况。
【专利摘要】本发明涉及生产二十碳五烯酸的微生物、脂肪酸组成物及其制作方法与用途，具体地，本发明有关于分离的微生物以及其菌株与突变株、生物质、微生物油、组成物及培养物；生产微生物油、生物质及突变株的方法；及使用分离的微生物、生物质及微生物油的方法。PTA-1020820090714
【IPC分类】A23L33/115, A23D9/04
【公开号】CN105360351
【申请号】CN201510520348
【发明人】K·E·阿普特, P·W·伯赫恩斯, J·M·汉森, J·W·普菲弗三世, T·L·斯托尔, R·泽克尔
【申请人】帝斯曼知识产权资产管理有限公司
【公开日】2016年3月2日
【申请日】2010年3月22日
【公告号】CA2787344A1, CA2896012A1, CN102884201A, CN102884201B, EP2526197A1, EP2526197A4, US20110177031, US20150237888, US20150313861, WO2011090493A1