特性。 藉由标准程序，自PTA-10212制备基因组DNA。如见美国纽约冷泉港（ColdSpringHarbor) 的冷泉港实验室出版（ColdSpringHarborLaboratoryPress)公司于2001年出版的 SambrookJ.与RussellD.的"分子选殖：实验室手册"(MolecularCloning:ALaboratory Manual)乙书第三版。简述为：（1)将来自对数中期培养的500微升细胞离心。将细胞再 度离心，及以小孔径的管头自细胞片状沉淀物移除所有的水；（2)将片状沉淀物再悬浮于 200微升的分解缓冲液（20mMTrispH8. 0、125微克/毫升的蛋白酶K、50mM氯化钠、10mM EDTApH8. 0、0. 5%SDS)中；（3)细胞在50°C进行分解1小时；（4)将分解作用混合物量吸 至2毫升的锁相凝胶管（PLG-Eppendorf)中；（5)添加等体积的P:C:1及让其混合1. 5小 时；(6)该管于12,OOOxg离心5分钟；（7)自PLG管内将凝胶上方的含水相移除，及在含水 相中添加等体积的氯仿，及混合30分钟；（8)该管于14,OOOxg离心约5分钟；（9)自氯仿 将顶层（含水相）吸出，及置于一个新的管中；（10)添加〇. 1体积的3MNaOAC及加以混合 (倒置数次）；（11)添加2体积的100%乙醇及加以混合（倒置数次），而基因组DNA沉淀物 在本时期形成；（12)在微量离心机中，该管于4°C及14,OOOxg离心约15分钟；（13)将液 体平缓地倒除，及基因组DNA剩余在该管的底部；（14)以0. 5毫升的70%乙醇清洗片状沉 淀物；（15)在微量离心机中，该管于4°C及14,OOOxg离心约5分钟；（16)将乙醇平缓地倒 除，及干燥基因组DNA的片状沉淀物；及（17)在基因组DNA的片状沉淀物中直接添加适宜 体积的水与核糖核酸酶。以先前所述的引物（Honda等人于期刊"J.EuLMicro. "第46(6) 期第637-647页乙文（1999年）进行18srRNA基因的聚合酶链反应扩增作用。用于染色 体DNA模板的聚合酶链反应条件如下：位于50微升的总体积中的0. 2μMdNTP、0. 1μΜ的 各引物、8%DMS0、200奈克的染色体DNA、2. 5UHercu丨ase⑧II融合DNA聚合酶（史崔塔基 因（Stratagene)公司）及Herculase?缓冲液（史崔塔基因（Stratagene)公司）。聚合 酶链反应的操作程序包括下列步骤：（1) 95°C达2分钟；（2) 95°C达35秒；（3) 55°C达35秒； ⑷72°C达1分钟又30秒；（5)重复步骤2至4达30个循环；（6) 72°C达5分钟；及（7)保 持在4°C。
[0191] 聚合酶链反应扩增作用使用上述的染色体模板而产生具有预期大小的一种独特 的DNA产物。依据厂商的说明书，将聚合酶链反应产物植入载体pJETl. 2/平整（弗曼塔斯 (Fermentas)公司）中，及使用所提供的标准引物测定插入序列。
[0192] 系谱分析在中等的证明之下，将PTA-10212置于包括厚皮破囊壶菌属 (Thraustochytriumpachydermum)与聚合破囊壶菌（Thraustochytriumaggregatum)的 谱系内。厚皮破囊壶菌属（T.pachydermum)的孢子囊具有非常厚的细胞壁。聚合破囊壶菌 (T.aggregatum)形成明显可见的不透明孢子囊群的群集。PTA-10212并未显示所述特性中 的任一者。在其它分类群诸如吾肯氏壶菌属（Ulkenia)、T.gaertnerium、A.limiacinum及 红树林裂殖壶菌（S.mangrovei)中，曾述及存在众多的变形虫状细胞；然而，与所述分类群 相关联的叙述说明，与分离的微生物所观察到的特性不同。此外，PTA-10212并未显现对 于所述分类群中任一者的系谱亲和性。
[0193] 表3显示来自在ATCC登录号PTA-10212所保藏微生物的18srRNA序列与国家生 物科技信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation) (NCBI)电子数据库 中的DNA序列的比较。使用二种不同的计算，测定相同度百分比。"计算#1"将出现在序列 中的来自非同源区域或部份序列的任一"间隔"纳入考虑（AlignX-载体NTI预设设定）。 "计算#2"并不包括间隔的计算罚分（AlignX-载体NTI"相同度"矩阵设定）。
[0194] 表3 :18srRNA序列的比较
[0195]
[0196] (p):指部份序列
[0197] 如表3所示，发现就相同度％而言，来自在ATCC登录号PTA-10212所保藏微生物 的18srRNA基因序列（SEQIDN0:1)，与NCBI数据库可取得的18srRNA基因序列相近，虽 然并非一致。一般认为在生物体属于不同的属或种之际，仍可具有非常相近的18srRNA基 因序列。
[0198] 基于上述的特性分析，在ATCC登录号PTA-10212所保藏的分离的微生物据信 代表一种新的破囊壶菌属（Thraustochytrium)物种，及因此亦命名为破囊壶菌属物种 (Thraustochytriumsp. )ATCCPTA_10212。
[0199] 在ATCC登录号PTA-10208所保藏的分离的微生物的分类特征
[0200] 在ATCC登录号PTA-10208所保藏的微生物（"PTA-10208")，经认定为在ATCC登 录号PTA-9695所保藏微生物（"PTA-9695"）的一种亚分离株（自培养物分离出的个别细 胞及保有一种分离与独特的培养株形式）/'PTA-9695"是述于第12/407, 687号美国专利申 请案与PCT/US2009/001720，其中各者在此完整地并入本案以为参考数据。
[0201]PTA-10208具有PTA-9695的分类特征。发现PTA-9695在释出时具有活跃地游动离 开成熟孢子囊的二鞭毛游走孢子，其壁残迹在释出孢子之后仍清楚可见（在位相差）。测得 PTA-9695孢子囊的直径为12. 5微米至25微米，而游走孢子的尺寸为2. 5微米至2. 8微米 x4. 5微米至4. 8微米。每个PTA-9695孢子囊具有8至24个孢子。稳定后的PTA-9695游走 孢子增大，及迅速进行均体分裂而形成四分体、八分体，及最后形成孢子囊聚簇。四分体形 成作用在孢子囊成熟前的非常早期的阶段开始。所述特性与裂殖壶菌属（Schizochytrium) 相符。就相同度％而言，发现PTA-10208亦具有PTA-9695的18srRNA基因序列（SEQID NO: 2)，其与Honda等人于期刊 "J.Euk.Micro. " 第 46 (6)期第 637-647 页乙文（1999 年） 中所提供的聚合破囊壶菌（T.aggregatum)的18srRNA基因序列非常相近的，虽然并非一 致。所发表的聚合破囊壶菌（Thraustochytriumaggregatum)的18srRNA序列是一种部 份序列，在序列中间具有约71个DNA核苷酸的一个间隔。PTA-9695据信代表一种新的裂 殖壶菌属（Schizochytrium)物种。因此，亚分离株PTA-10208亦命名为裂殖壶菌属物种 (Schizochytriumsp.)ATCCPTA_10208〇
[0202] 实施例2、在ATCC登录号PTA-10212所保藏的分离的微生物的生长特性
[0203] 在如后述的个别发酵操作中，检视在ATCC登录号PTA-10212所保藏的分离的微生 物的生长特性。典型的培养基与培养条件示于表1。
[0204] 在添加碳（甘油）与氮的具有lOOOppm的氯离子与20 %溶氧的22. 5°C与pH7. 3 的培养中，PTA-10212在体积为10升的发酵槽中培养138小时之后，产生26. 2克/升的 细胞干重。脂质产率为7.9克/升；ω-3产率为5.3克/升；EPA产率为3.3克/升；及 DHA产率为1. 8克/升。脂肪酸含量为30. 3重量％ ;ΕΡΑ含量为41. 4%的脂肪酸甲基酯类 (FAME);及DHA含量为26. 2%的FAME。脂质生产力为1. 38克/升/日，及在所述条件下的 ω-3生产力为0.92克/升/日，而EPA生产力为0.57克/升/日及DHA生产力为0.31 克/升/曰。
[0205] 在添加碳（甘油）与氮的具有lOOOppm的氯离子与20%溶氧的22. 5°C与pH7. 3 的培养中，PTA-10212在体积为10升的发酵槽中培养189小时之后，产生38. 4克/升的细 胞干重。脂质产率为18克/升；ω-3产率为12克/升；EPA产率为5克/升；及DHA产率 为6. 8克/升。脂肪酸含量为45重量％ ;ΕΡΑ含量为27. 8 %的FAME;及DHA含量为37. 9 % 的FAME。脂质生产力为2.3克/升/日，及在所述条件下的ω-3生产力为1.5克/升/ 日，ΕΡΑ生产力为0.63克/升/日及DHA生产力为0.86克/升/日。
[0206] 在添加碳（甘油）与氮的具有lOOOppm的氯离子与20%溶氧的22.5°(：与？!1 6. 8-7. 7的培养中，PTA-10212在体积为10升的发酵槽中培养189小时之后，产生13克/ 升的细胞干重。脂质产率为5. 6克/升；ω-3产率为3. 5克/升；EPA产率为1. 55克/升； 及DHA产率为1. 9克/升。脂肪酸含量为38重量％;ΕΡΑ含量为29. 5%的FAME;及DHA含 量为36%的FAME。脂质生产力为0.67克/升/日，及在所述条件下的ω-3生产力为0.4 克/升/日，EPA生产力为0.20克/升/日及DHA生产力为0.24克/升/日。
[0207] 在添加碳（甘油）与氮的具有lOOOppm的氯离子与20%溶氧的22. 5至28. 5°C与 pH6. 6-7. 2的培养中，PTA-10212在体积为10升的发酵槽中培养191小时之后，产生36. 7 克/升至48. 7克/升的细胞干重。脂质产率为15. 2克/升至25. 3克/升；ω-3产率为 9. 3克/升至13. 8克/升；ΕΡΑ产率为2. 5克/升至3. 3克/升；及DHA产率为5. 8克/升 至11克/升。脂肪酸含量为42. 4%至53重量％ ;ΕΡΑ含量为9. 8%至22%的FAME;及DHA 含量为38. 1%至43. 6%的FAME。脂质生产力为1.9克/升/日至3.2克/升/日，及在所 述条件下的ω-3生产力为1.2克/升/日至1.7克/升/日，EPA生产力为0.31克/升/ 日至0.41克/升/日及DHA生产力为0.72克/升/日至1.4克/升/日。
[0208] 在ATCC登录号ΡΤΑ-10208所保藏的分离的微生物的生长特性
[0209] 在如后述的个别发酵操作中，检视在ATCC登录号ΡΤΑ-10208所保藏的分离的微生 物的生长特性。典型的培养基与培养条件示于表2。
[0210] 在添加碳（葡萄糖）与氮的具有lOOOppm的氯离子及氮进料期间的20 %溶氧与 之后的10%溶氧的22. 5°C与pH7. 0的培养中，ΡΤΑ-10208在体积为10升的发酵槽中培养 200小时之后，产生95克/升的细胞干重。脂质产率为53. 7克/升；ω-3产率为37克/ 升；ΕΡΑ产率为14. 3克/升；及DHA产率为21克/升。脂肪酸含量为57重量％ ;ΕΡΑ含 量为27. 7%的FAME;及DHA含量为39. 1%的FAME。脂质生产力为6.4克/升/日，及在所 述条件下的ω-3生产力为4.4克/升/日，EPA生产力为1.7克/升/日及DHA生产力为 2. 5克/升/日。
[0211] 在添加碳（葡萄糖）与氮的具有lOOOppm的氯离子及氮进料期间的20 %溶氧与 之后的10%溶氧的22. 5°C与pH7. 5的培养中，ΡΤΑ-10208在体积为10升的发酵槽中培养 139小时之后，产生56克/升的细胞干重。脂质产率为53克/升；ω-3产率为34克/升； ΕΡΑ产率为11. 5克/升；及DHA产率为22克/升。脂肪酸含量为58重量％ ;ΕΡΑ含量为 21. 7%的FAME;及DHA含量为41. 7%的FAME。脂质生产力为9. 2克/升/日，及在所述条 件下的ω-3生产力为5.9克/升/日，EPA生产力为2克/升/日及DHA生产力为3. 8克 /升/曰。
[0212] 在添加碳（葡萄糖）与氮的具有lOOOppm的氯离子及氮进料期间的20 %溶氧与之 后的10%溶氧的22. 5°C与pH7. 0的培养中，ΡΤΑ-10208在体积为2000升的发酵槽中培养 167小时之后，产生93.8克/升的细胞干重。脂质产率为47. 2克/升；ω-3产率为33. 1 克/升；ΕΡΑ产率为10. 5克/升；及DHA产率为20. 4克/升。脂肪酸含量为50. 6重量％; ΕΡΑ含量为23%的FAME;及DHA含量为42. 6%的FAME。脂质生产力为6.8克/升/日，及 在所述条件下的ω-3生产力为4.7克/升/日，EPA生产力为1.5克/升/日及DHA生产 力为2.9克/升/日。
[0213] 在添加碳（葡萄糖）与氮的具有lOOOppm的氯离子及氮进料期间的20%溶氧与之 后的10%溶氧的22. 5°C与pH7. 0的培养中，ΡΤΑ-10208在体积为2000升的发酵槽中培养 168小时之后，产生105克/升的细胞干重。脂质产率为46. 4克/升；ω-3产率为33克/ 升；ΕΡΑ产率为10. 7克/升；及DHA产率为20. 3克/升。脂肪酸含量为43. 9重量％;ΕΡΑ 含量为24%的FAME;及DHA含量为43. 7%的FAME。脂质生产力为6.6克/升/日，及在所 述条件下的ω-3生产力为4.7克/升/日，EPA生产力为1.5克/升/日及DHA生产力为 2. 9克/升/日。
[0214] 在添加碳（葡萄糖）与氮的具有lOOOppm的氯离子及氮进料期间的20%溶氧与之 后的10%溶氧的22. 5°C与pH7. 0的培养中，PTA-10208在体积为2000升的发酵槽中培养 168小时的后，产生64. 8克/升的细胞干重。脂质产率为38. 7克/升；ω-3产率为29. 9 克/升；ΕΡΑ产率为8. 5克/升；及DHA产率为16. 7克/升。脂肪酸含量为59. 6重量％ ; ΕΡΑ含量为23%的FAME;及DHA含量为42. 3%的FAME。脂质生产力为5. 53克/升/日， 及在所述条件下的ω-3生产力为3.8克/升/日，EPA生产力为1.2克/升/日及DHA生 产力为2.3克/升/日。
[0215] 实施例3、微生物菌株ATCCΡΤΑ-10208与ΡΤΑ-10212的脂肪酸廓型
[0216] 藉由溶剂萃取作用分析四个生物质试样（ΡΤΑ-10208试样#1 ;ΡΤΑ-10208试样#2; ΡΤΑ-10212试样#1 ;及ΡΤΑ-10212试样#2)的总粗制油含量，藉由高性能液相层析法/蒸发 光散射检测作用（HPLC/ELSD)测定脂质种类，藉由HPLC/质谱法（HPLC/MS)分析甘油三酯 (TAG)，及藉由具有火焰离子化侦检作用的气相层析法（GC-FID)测定脂肪酸（FA)廓型。藉 由使用己烷的溶剂研磨作用测定各冷冻干燥生物质的粗脂质含量，及与藉由直接转酯化作 用所产生的FAME总量（毫克/克）相比较，及藉由GC/FID分析将所产生的脂肪酸甲基酯 类（FAME)量化。亦藉由转酯化作用将所萃取的粗脂质中的脂肪酸量化，及使用GC/FID分 析将所产生的FAME量化。使用具有ELSD与大气压力化学离子化-MS(APCI-MS)鉴定的正 相HPLC，测定所萃取的粗脂质中的所有中性脂质（NL)与游离脂肪酸（FFA)的重量百分比。 该方法分离与量化固醇酯（SE)、TAG、游离脂肪酸（FFA)、1，3-甘油二酯（1，3-DAG)、固醇、 1，2-甘油二酯（1，2-DAG)及甘油单酯（MAG)。结果示于下列表4与表5。
[0217]自四个生物质试样（PTA-10208 试样 #1 ;PTA-10208 试样 #2 ;PTA-10212 试样 #1; 及ΡΤΑ-10212试样#2)所萃取的粗制油中分离出TAG与磷脂（PL)。使用低压急骤层析法分 离TAG，及使用固相萃取作用（SPE)分离PL。藉由薄层层析法（TLC)确认各分离部分的身 分。依循使用GC-FID的直接转酯化作用，测定所分离出的TAG与PL部分的FAME形式的脂 肪酸廓型。结果示于下列表6与表7。
[0218] 亦在来自微生物菌株ATCCPTA-10212的二个附加的生物质试样（ΡΤΑ-10212试 样#3与ΡΤΑ-10212试样#4)，测定所分离出的脂质种类的总粗制油含量与脂肪酸廓型。藉 由己烷萃取作用自各试样制得粗制油，及使用低压急骤层析法分离个别的脂质种类。使用 GC-FID，测定生物质、粗制油及分离部分的FAME形式的脂肪酸廓型。结果示于下列表8至 表11。
[0219] 自先前使用FRIOLEX?方法所萃取的来自微生物菌株ATCCPTA-10212的粗制油 试样（ΡΤΑ-10212试样#5)，分离个别的脂质种类，及使用GC-FID测定各种类的FAME形式的 脂肪酸廓型。结果示于下列表12与表13。
[0220] 使用具有ELSD与APCI-MS鉴定的正相HPLC，自微生物菌株ATCCPTA-10208的粗制 油试样（PTA-10208试样#3)，分离个别的脂质种类。
[0221] 实验程序
[0222] 粗制油萃取作用-使用溶剂研磨作用，自冷冻干燥的生物质试样，萃取粗制油。 例如，将约3克的生物质称重置入一瑞典式管中。在瑞典式管中添加3个滚珠轴承与30毫 升的己烷，以氯丁二烯橡胶塞密封该管及置于振荡器中2小时。使用布赫纳（Buchner)漏斗 与惠特曼（Whatman)滤纸，将所产生的浆料过滤。收集过滤后的液体，在真空中移除溶剂， 及以重量分析方式测定剩余粗脂质的量。
[0223] 脂肪酸分析-针对生物质、所萃取的粗脂质及分离出的脂质种类的试样分析 FAME形式的脂肪酸组成。简言之，将冷冻干燥的生物质与分离出的脂质种类直接称重置入 一螺旋盖试管中，同时将粗制油的试样溶于己烷中而得约2毫克/毫升的浓度。在各管中 添加含有内标准的甲苯及位于甲醇中的1.5N盐酸。所述管进行涡漩，然后加盖及加热至 100°C达2小时。然后让所述管冷却，及添加位于水中的饱和氯化钠。所述管再度进行涡 漩，及离心而使得各层分离。然后将一部分的有机层置入一个GC小瓶中，及藉由GC-FID分 析。藉由使用Nu-Check-PrepGLC参考标准（美国明尼苏达州伊利森（Elysian)的努伽克 (NuCheck)公司）所产生的三点校正曲线，而量化FAME。存在于萃取物中的脂肪酸是以毫 克/克的形式及以重量百分比的形式表示。假设藉由GC-FID分析时的反应与内标准相当， 而估算试样中的脂肪含量。
[0224]HPLC/ELSD/MS方法-
[0225] 仪器 安捷伦（Agilent) 1100HPLC、奥泰（Alltech)3300ELSD、安 捷伦（Agilent) 1100MSD
[0226]管柱PhenomenexLuna氧化娃，250x4.6 毫米， 5微米粒径及具保护管柱
[0227] 移动相 A-99.5%己烧（高压液相层析级（Omnisolv))
[0228] 〇· 4%异丙醇（高压液相层析级（Omnisolv))
[0229] 0.1 % 乙酸
[0230]B-99. 9%乙醇（高压液相层析级（Omnisolv)，
[0231] 95:5 的乙醇：IPA)
[0232] 0.1 % 乙酸
[0233] 梯度
[0236] 管柱温度 30°C
[0237] 流速 1. 5毫升/分钟
[0238] 注射体积 5微升
[0239]ELSD检测 温度35°C，气流1. 2升/分钟
[0240]MSD 质量范围200至1200,碎裂器225伏特
[0241] 干燥气体温度350°C
[0242] 汽化器温度325°C
[0243] 毛细管电压3500伏特
[0244] 电晕电流10微安培
[0245] 固相萃取作用-使用置于一个VacElut装置（美国加州帕洛阿尔托（Palo Alto)的瓦瑞安（Varian)公司）中的2克的胺丙基匣（瑞典乌普萨拉（Uppsala)的百特基 (Biotage)公司），藉由固相萃取作用（SPE)自粗脂质分离PL部分。以15毫升的己烷调节 该匣，及将约60毫克的各试样溶于1毫升的三氯甲烷及施用至该匣。以15毫升的2 :1的 三氯甲烷：异丙醇清洗该管柱，以洗提所有的中性脂质，及予以弃置。然后以15毫升的位于 乙醚中的2%乙酸（HOAc)洗提脂肪酸，及予以弃置。以15毫升的6 :1的甲醇：氯仿洗提PL 部分，将其收集、在氮气下干燥及加以称重。
[0246] 急骤层析法-使用急骤层析法分离存在于粗制油中的脂质种类。将溶于己烷中 的约200毫克的粗制油注入至管柱顶部。该层析法系统采用硅胶（SilicaGel) 60 (美国纽 泽西州吉布斯敦（Gibbstown)的EMD化学公司），及移动相是由5毫升/分钟（表6至表 7)或3毫升/分钟（表8至表13)的石油醚与乙酸乙酯所组成。使用分级梯度，以选择性 地自该管柱洗提各脂质种类。该移动相梯度自100%石油醚开始及以50%乙酸乙酯终结。 使用一种吉尔森（Gilson)FC204大床式分液收集器（美国威斯康星州米德顿（Middleton) 的吉尔森（Gilson)有限公司），在10毫升试管中收集分液。藉由薄层层析法（TLC)分析各 管，及将含有个别脂质种类的所述管（如藉由TLC板上的具有预期滞留因子（Rf)的单一 点所判定）汇集、浓缩至干及加以称重。然后以重量分析方式测定总分液含量。
[0247]TLC分析-在硅胶板上进行薄层层析法。使用由石油醚：乙醚：乙酸（80 :20 :1) 所组成的溶剂系统洗提所述板，及使用碘蒸气显现。然后将各点的Rf值与文献所报导的各 脂质种类的数值相比较。
[0248]TAG与PL部分的分析-分析所分离出的TAG与PL部分的脂肪酸甲基酯（FAME) 形式的脂肪酸组成。将TAG部分溶于己烷，而得约1至2毫克/毫升的浓度。在氮气下，将 溶液的1毫升等分试样浓缩至干。在各管中添加含有内标准的甲苯及位于甲醇中的1. 5N盐 酸。所述管进行涡漩，然后加盖及加热至l〇〇°C达2小时。在含有PL部分的所述管中直接 添加内标准与盐酸甲醇，及予以加热。然后让所述管冷却，及添加位于水中的饱和氯化钠。 所述管再度进行涡漩及离心而使得各层分离。然后将一部分的有机层置入一个GC小瓶中， 及藉由GC-FID分析。藉由使用Nu-Check-Pr印GLC502B参考标准（美国明尼苏达州伊利 森（Elysian)的努伽克（NuCheck)公司）所产生的三点校正曲线，量化FAME。存在于萃取 物中的脂肪酸以毫克/克及以FAME的百分比表示。
[0249] 结果
[0250]PTA-10208 试样 #1
[0251] 使用GC/FID测定PTA-10208试样#1的生物质与所萃取的粗脂质的脂肪酸廓型。 藉由将28. 6毫克的生物质直接称重置入一个FAME管中，而就地将生物质中的脂肪酸转酯 化；藉由将55. 0毫克的粗脂质称重置入一个体积为50毫升的烧瓶中