共生培养制备富含虾青素的饲料添加剂的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及共生培养制备富含虾青素的饲料添加剂的方法，特别涉及共生培养制 备富含虾青素的海洋红酵母发酵饲料添加剂的方法，属于生物饲料技术领域。
【背景技术】
[0002] 海洋红酵母是指自然海域中存在的酵母菌，其细胞中富含蛋白质、氨基酸、肝糖颗 粒、不饱和脂肪酸、类胡萝卜素、虾青素和各种未知营养因子等生物活性物质。随着水产养殖 业的蓬勃发展，海洋红酵母已经被广泛选用为海参、虾、蟹、贝的幼体浮游期的鲜活饵料。海 洋红酵母的功能很大一部分与其含有的虾青素有关，虾青素是一种类胡萝卜素，具有极强的 抗氧化、消除自由基的作用，被誉为"超级维生素 E"，在水产养殖业中富含虾青素的饲料能 能显著地增加鱼、虾、蟹等的抗病能力，增强养殖对象的免疫能力，提高海洋生物的繁殖能 力而备受人们关注。
[0003] 当前传统生产工艺生产的海洋红酵母饲料普遍存在的问题是虾青素的含量低，极 大地影响了海洋红酵母发酵饲料的功能性，如何生产一种价格低廉的富含虾青素的海洋红 酵母发酵饲料成为亟待解决的问题。
[0004] 中国专利文献CN104774900A(申请号201510221380.6)公开了一种利用海洋红酵 母菌发酵生产饲料添加剂虾青素的工艺，以葡萄糖、酵母浸粉等为主要原料，进行特种酵母 菌种的液态深层发酵培养;发酵成熟后的虾青素酵母菌液用栗打入卧式低速离心机进行离 心;将离心获得的虾青素酵母菌渣悬液用箱式压滤机压榨到固形物含量为30%左右，移入 流化床中低温干燥将水分含量降至5%以下，然后经粉碎、过筛得到虾青素含量10%的饲料 添加剂虾青素。
[0005] 中国专利文献CN 101703152A(申请号200910193460.X)公开了一种利用啤酒麦糟 制备虾青素饲料添加剂的方法，该方法包括下述步骤：啤酒麦糟的预处理；啤酒麦糟的酶 解;灭菌;红发夫酵母种子液的制备;红发夫酵母发酵培养;以及干燥等。
[0006] 上述产品中，虾青素含量依然较低，并且红发夫酵母的培养由于条件苛刻，导致用 红发夫酵母进行制备虾青素时，成本明显提高。
【发明内容】
[0007] 本发明针对现有技术的不足，提供一种价格低廉、可广泛应用于海洋养殖的共生 培养制备富含虾青素的饲料添加剂的方法。
[0008] 本发明技术方案如下：
[0009] 共生培养制备富含虾青素的饲料添加剂的方法，步骤如下：
[0010] (1)将含有1.5~2.5 X108个/ml的红发夫酵母的种子液按体积百分比5~10%接 种于液体发酵培养基中，在温度25~28°C、通气量1.0~1.5vvm、pH 4.5~5.5的条件下，搅 拌发酵，发酵期间流加碳源溶液和氮源溶液，使发酵罐中的碳源浓度为10~20g/L，氮源浓 度为0.8~1.2g/L，发酵30~40h，得一次发酵液；
[0011]所述的液体发酵培养基每升组分如下：
[0012] 鹿糖20~30g，葡萄糖10~15g，玉米粉5~10g，酵母膏8~15g，大豆柏5~10g，磷酸 氢二钾0.5~1.5g，氯化铵2.5~5g，无水硫酸镁2.5~5g，水定容至1L，pH 5.0~5.5;
[0013] (2)直接向步骤（1)制得的一次发酵液中继续接种含有浓度为5.5~7.5 X 108个/ ml的海洋红酵母种子液，接种量为一次发酵液体积的5~20%，在温度25~30°C、通气量1.5 ~2.0vvm、pH 4.5~5.5的条件下，搅拌发酵，发酵期间流加碳源溶液和氮源溶液，使发酵罐 中的碳源浓度为20~30g/L，氮源浓度为1.80~2.5g/L，发酵20~30h，制得混合发酵液；
[0014] (3)将步骤(2)制得的混合发酵液经离心，固液分离，取固体，经真空冷冻干燥，制 得富含虾青素的饲料添加剂。
[0015] 根据本发明优选的，所述步骤⑴中，含有1.5~2.5X108个/ml的红发夫酵母的种 子液，制备步骤如下：
[0016] a、将红发夫酵母接种于活化培养基I中，20~30°C活化培养24~48h，制得活化红 发夫酵母；
[0017] b、将步骤a制得的活化红发夫酵母接种于摇瓶培养基I中，在20~30°C、200~ 240r/min条件下，培养24~48h，制得红发夫酵母一级种子；
[0018] c、将步骤b制得的红发夫酵母一级种子按5~10%的体积百分含量接种于种子培 养基I中，调节通气量为0.5~l.Ovvm，通气搅拌速度为150~300rpm、温度为25~30°C培养 24~30h，制得红发夫酵母的种子液。经检测，菌体浓度为1.5~2.5 X 108个/ml。
[0019] 进一步优选的，所述活化培养基I每升组分如下：
[0020] 葡萄糖20~30g，蛋白胨5~10g，海水晶5~10g，磷酸氢二钾0.5~1.5g，水定容至 lL，pH4.5~5.5。
[0021 ]进一步优选的，所述摇瓶培养基I每升组分如下：
[0022] 葡萄糖20~30g，蛋白胨5~10g，酵母浸粉5~10g，海水晶5~10g，磷酸氢二钾1~ 1.5g，无水硫酸镁0.5~lg，水定容至lL，pH4.5~5.5。
[0023] 进一步优选的，所述种子培养基I每升组分如下：
[0024] 葡萄糖25~35g，蛋白胨10~15g，酵母浸粉5~10g，海水晶2~10g，氯化铵2~10g， 磷酸氢二钾10~15g，无水硫酸镁0.5~1.5g，水定容至lL，pH 4.5~5.5。
[0025]根据本发明优选的，所述步骤(2)中，含有浓度为5.5~7.5 X 108个/ml的海洋红酵 母种子液，制备步骤如下：
[0026] A、将海洋红酵母接种于活化培养基II中，20~30°C活化培养24~48h，制得活化海 洋红酵母；
[0027] B、将步骤A制得的活化海洋红酵母接种于摇瓶培养基II中，在20~30°C、200~ 240r/min条件下，培养24~48h，制得海洋红酵母一级种子；
[0028] C、将步骤B制得的海洋红酵母一级种子按5~10%的体积百分含量接种于种子培 养基II中，调节通气量为0.5~l.Ovvm，通气搅拌速度为150~300rpm、温度为25~30°C培养 24~30h，制得海洋红酵母的种子液。经检测，菌体浓度为5.5~7.5 X 108个/ml。
[0029] 进一步优选的，所述活化培养基II每升组分如下：
[0030] 葡萄糖20~30g，酵母浸粉5~10g，磷酸氢二钾1.0~5g，无水硫酸镁0.5~1.5g，水 定容至lL，pH 4.0~5.5。
[0031 ]进一步优选的，所述摇瓶培养基II每升组分如下：
[0032] 葡萄糖20~30g，蛋白胨10~20g，酵母浸粉5~10g，海水晶15~25g，磷酸氢二钾 1.0~2.(^，无水硫酸镁0.5~1.58，水定容至11^4!14.0~5.5。
[0033] 进一步优选的，所述种子培养基II每升组分如下：
[0034] 葡萄糖20~30g，蛋白胨10~20g，酵母浸粉5~10g，海水晶7~15g，氯化铵5~10g， 磷酸氢二钾7~15g，无水硫酸镁1~3g，水定容至lL，pH4.0~5.5。
[0035] 根据本发明优选的，所述步骤（1)和步骤(2)中流加碳源溶液的质量浓度为50g/L， 流加氮源溶液的质量浓度为3g/L。
[0036] 根据本发明优选的，所述步骤(1)和步骤(2)中碳源选自葡萄糖、蔗糖或葡萄糖浆； 氮源选自蛋白胨、酵母浸粉、玉米浆粉、豆柏粉、硝酸钠或硫酸铵。
[0037]根据本发明优选的，所述步骤(3)中离心机转速为1000~1500转/分，离心时间20 ~30min〇
[0038] 根据本发明优选的，所述步骤(3)中真空冷冻干燥温度为-20°C~-30°C。
[0039] 有益效果
[0040] 1、本发明首次采用红发夫酵母和海洋红酵母共生发酵培养的方法制备得到富含 虾青素的海洋红酵母发酵饲料，极大地提高了海洋红酵母饲料的功能性，应用在海洋水产 养殖中可显著地增加鱼、虾、蟹等的抗病能力，增强养殖对象的免疫能力，且价格便宜，适宜 在水产养殖中大力推广；
[0041] 2、本专利在发酵罐发酵阶段添加玉米粉、大豆柏、葡萄糖浆等为原料，且先添加红 发夫酵母培养，再添加海洋红酵母培养，这样添加的目的是因为相对于海洋红酵母，红发夫 酵母对培养基的要求比较苛刻，繁殖速度也慢，等红发夫酵母生长完成后再加入海洋红酵 母，由于海洋红酵母生长比较旺盛，可以充分地利用剩余的营养物质发酵，从而可以进一步 降低生产成本。
【具体实施方式】
[0042]下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明的保护范围并不仅 限于此。
[0043] 实施例中的红发夫酵母和海洋红酵母均购自中国海洋大学。
[0044] 实施例1
[0045] 共生培养制备富含虾青素的饲料添加剂的方法，步骤如下：
[0046] (1)将含有2.5X108个/ml的红发夫酵母的种子液按体积百分比5%接种于液体发 酵培养基中，在温度25°(：、通气量1.0^ 111、?!14.5的条件下，搅拌发酵，发酵期间流加碳源溶 液和氮源溶液，使发酵罐中的碳源浓度为l〇g/L，氮源浓度为0.8g/L，发酵30h，得一次发酵 液；
[0047] 所述的液体发酵培养基没升组分如下：
[0048]蔗糖20g，葡萄糖10g，玉米粉5g，酵母膏8g，大豆柏10g，磷酸氢二钾1.5g，氯化铵 5g，无水硫酸镁5g，水定容至lL，pH 5.2;
[0049] (2)直接向步骤(1)制得的一次发酵液中继续接种含有浓度为7.5 X 108个/ml的海 洋红酵母种子液，接种量为一次发酵液体积的1〇%，在温度25°(：、通气量1.5^111、？!14.5的 条件下，搅拌发酵，发酵期间流加碳源溶液和氮源溶液，使发酵罐中的碳源浓度为20g/L，氮 源浓度为1.80g/L，发酵20h，制得混合发酵液；
[0050] (3)将步骤(2)制得的混合发酵液经1000转/分离心20min，固液分离，取固体，经_ 20°C真空冷冻干燥，制得富含虾青素的饲料添加剂。
[0051] 所述步骤(1)中，含有2.5X108个/ml的红发夫酵母的种子液，制备步