用于疫苗的活减毒细菌的制作方法

专利名称：用于疫苗的活减毒细菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于一种药剂的活减毒细菌、基于对预防微生物致病机制有用的细菌而产生的疫苗、携带异源基因的活减毒细菌以及这些疫苗和细菌的制备方法。
温血动物战胜微生物致病的方式是一个复杂的过程。对微生物引起的疾病的免疫是温血动物避免发病或遭受不强烈致病的一种方式。当群体接触病原体时，对所给病原菌的不完全免疫引起发病和致死。一般认为基于活减毒微生物的疫苗(活减毒疫苗)诱导一种高效型的免疫应答。这种疫苗有个优点，一旦动物宿主被接种疫苗，进入宿主的微生物病原菌诱导一个早期的细胞介导的或体液免疫的加速的回忆，其可以在感染呈现临床的显著比例之前控制微生物的进一步生长。基于死病原菌的疫苗(死疫苗)一般来说不能获得这种类型的免疫应答。然而，含活致病菌的疫苗，依赖于减毒的水平，会出现这样的危险，即，接种宿主在预防接种后可能患人们试图抵抗的疾病。因此，人们希望得到具有活微生物的免疫属性但不会在预防接种后引起不希望的副作用的疫苗。
细菌减毒的基本方法是去除一个或多个毒性因子。然而在大多数的情况下，毒性因子也在诱导免疫方面起到重要的作用。在那些情况下，毒性因子的缺失不可避免地削弱了细菌的免疫原性能力。这当然是一种不希望的情形。活疫苗优选地应保留野生型菌株的抗原成份。
此外，活疫苗应有充分的a-毒力以避免不可接受的病理学作用，但另一方面，其必须引起宿主足够水平的免疫。最后，减毒活疫苗菌株最好应该基本上没有回复为毒力野生型菌株的可能性。
现在令人惊奇地发现一个编码已知在许多细菌属的主要碳水化合物的代谢中起作用的蛋白质的基因可被缺失，引起在体内的减毒行为而没有减弱这些细菌在体内的生存力。这种基因被缺失的细菌的确出人意料地显示出一种减毒特征。此外，因为编码的蛋白质在免疫的诱导中不起什么作用，被缺失这种基因的细菌的抗原负载和野生型的相同。因此，这种细菌可出人意料地被优先应用于药剂制备的领域。更为具体地是用于活减毒疫苗的制备。
本发明所指可以被缺失并导致缺失突变体的体内减毒行为的基因以前被称为fruR基因，然而现在称为cra基因。已知缺少这个基因的突变体可在体外生长，但仅当由缺乏cra活性而导致的缺陷被生长培养基所补偿时才能生长。这意味着cra缺失突变体可以赖于生长的营养成分必须存在于生长培养基中。
一般地说，致病菌可自我支持是指其代谢能够适应可利用的营养物。在许多的主要代谢途径中(如下所示)cra基因起着这样一种适应性作用。然而cra基因已被缺失的突变体可依靠葡萄糖和许多其它作为碳源的糖很好地生长。在宿主动物中，这样的糖是可以利用的，因此人们不会期望cra基因在体内的条件下是有功能的。因此，人们不会料到cra缺失的突变体在宿主中显示出减毒特性。这就解释了为什么尽管这些突变体是本领域技术人员公知的但却从来没有人揭示其作为减毒活疫苗候选者的潜力。
本发明的一个实施方案涉及到用于疫苗的活减毒细菌，其由于Cra基因的突变导致不再能表达一种功能性的Cra蛋白。
基因产物(以前称为FruR；果糖阻抑蛋白)，现在也称为Cra(分解代谢物阻抑/激活蛋白)，是在许多碳水化合物代谢主要途径中的调节蛋白。
cra基因产物Cra调节着主要的碳代谢。更为具体地是，Cra通过结合编码生物合成酶和氧化酶(例如TCA循环、乙醛酸支路、葡糖异生途径以及电子转移中的关键酶)的基因的启动子上游区正调节这些基因的转录，负调节编码糖酵解酶(例如EM途径和ED途径中的关键酶)的基因的转录。
由于它在碳水化合物代谢中的关键地位，cra基因及其基因产物Cra广泛地存在于细菌中。Cra蛋白是一种高度保守的蛋白。例如，它可以存在于大肠杆菌，肠沙门氏菌例如鼠伤寒，肠炎以及都柏林血清型，放线杆菌属例如大叶性肺炎放线杆菌，嗜血杆菌属例如副鸡嗜血杆菌，杀鲑气单胞菌属、巴斯德氏菌属例如条鱼巴斯德氏菌，以及多杀巴斯德氏菌，链球菌属例如马链球菌、猪链球菌，耶尔森氏菌属例如鼠疫耶尔森氏菌。
Jahreis,K等人在1991年已经阐述了沙门氏菌属和埃希氏菌属的基因本身及其核苷酸全序列(Mol.Gen.Genet.226:332-336(1991)).Jahreis阐明肠沙门氏菌，鼠伤寒血清型和大肠杆菌的Cra蛋白仅仅在四个位置不同，其中的两个仅仅是保守性交换。这些当然符合对于一种在细菌碳水化合物代谢的如此众多的通用途径中起到一定作用的人们所期望的蛋白，尤其是在沙门氏菌和大肠杆菌在进化过程中趋异不那么远的情况下。Ramseier,T.M.等人至少部分阐述了Cra蛋白结合的机理(分子生物学杂志234:28-44(1993))。Cra蛋白的作用和功能已经被正式地记载在文献上，例如Saier,M.H.和Ramseier,T.M.最近发表的小综述上(细菌学杂志178:3411-3417(1996))。
这种突变可以是插入、缺失、取代或几种的组合，条件是突变导致了功能性Cra蛋白表达的失败。功能性Cra蛋白被认为是一种具有野生型蛋白的调节特性的蛋白。因此，至少其一种功能缺陷的Cra蛋白被认为是非功能性Cra蛋白。
本发明使用的活减毒细菌可通过多种途径获得。获得这种细菌的一种可能的途径是通过传统的方法例如用诱变剂例如碱基类似物处理带有cra基因的野生型菌株，或用紫外线处理或温度处理。
不产生功能性Cra蛋白的菌株很容易被挑出。它们在仅含葡萄糖和其他糖做为碳源的基本培养基中生长(这使它们和cya与crp突变体区分开来)但它们不能在利用以葡糖异生性底物作为唯一碳源的培养基上生长(Chin等人，细菌学杂志169:897-899(1987))。它们因此很容易在体外被选择。
传统突变技术引起的突变的本性是未知的。这可能是一个点突变，虽然不可能一定发生，但是通过点突变可能最终回复为野生型。为了避免这种小的危险，转座子诱变将是一个好的选择。转座子诱变引起的突变也是一个本领域的普通技术人员公知的突变技术。这是一个在染色体的局部位点完成的突变。转座子的插入不是针对一个特定的基因。由于cra-突变株在没有对缺乏Cra活性进行营养补偿的条件下不能在体外生长，所以很容易被筛选出来。因此它们从一群随机转座子突变的细菌中很容易被筛选出来。
重组DNA技术提供了有意地而不是随机地在预定位点导入一个突变的可能性。这种突变可以是核苷酸的插入、缺失或一个核苷酸被另一个核苷酸取代或它们的组合，唯一的条件是突变的基因不再编码功能性Cra。这种突变可以例如是一些核酸的缺失。甚至例如少至10个核酸的一段序列的缺失已经可以致使Cra无功能。甚至例如一个单核酸的缺失已经可以致使Cra无功能，由于此突变的结果，其它的核苷酸不再在正确的阅读框架内。大量的由三个不可分割的核酸所组成的核酸插入的缺失引起这种框移。更为优选的是一段长序列例如100个核酸被缺失，进一步优选的是整个cra基因被缺失。很容易发现，在开放阅读框架中导入了一个终止子的特定的突变，或在开放阅读框架中引起框移的突变非常适于去获得不再编码功能性Cra的菌株。
所有的构建Cra-缺失突变体的技术均为公知的标准技术。其包括cra基因的克隆，定点诱变引起的基因序列修饰，限制性酶的降解，然后是再连接或PCR-法及用突变基因取代野生型的cra基因(等位交换或等位取代)。标准的重组DNA技术如在质粒中克隆cra基因，用限制性酶降解基因，然后用内切核酸酶处理，再连接以及在宿主菌株中进行同源重组，均为本领域公知的技术并且描述在Maniatis/Sambrook上(Sambrook,J.等人，分子克隆实验室手册。ISBN 0-87969-309-6)。定点诱变可以通过例如使用购自Clontech.PCR-techniques的Transformer试剂盒在体外定点诱变，其描述在(Dieffenbach & Dreksler；PCR引物，实验室手册。ISBN 0-87969-447-3和ISBN 0-87969-447-5)上。
cra基因不仅含有编码Cra蛋白的编码序列，而且含有如启动子的调控序列，此基因也含有Cra mRNA的正确翻译所必需的位点，例如核糖体结合位点。
因此，不仅编码区的突变而且正确的转录和翻译所必需的序列的突变都被认为属于本发明的范围之内。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于疫苗的埃希氏菌属，沙门氏菌属，放线杆菌属，嗜血杆菌属，气单胞菌属，巴斯德氏菌，链球菌属和耶尔森氏菌属的活减毒细菌。
在本发明的一个更为优选的形式中，本发明的活减毒细菌选自肠沙门氏菌鼠伤寒，肠炎，猪霍乱，都柏林，伤寒，鸡，绵羊流产，马流产，鸡白痢血清型，大肠杆菌或鼠疫耶尔森氏菌。这些细菌含有大量对人类和不同动物品种致病的种。本发明的活减毒细菌优选为肠沙门氏菌，大肠杆菌或鼠疫耶尔森氏菌。
在其更优选的形式中，本发明的活减毒细菌是肠沙门氏菌，大肠杆菌或鼠疫耶尔森氏菌。
在一个更为优选的形式中，此实施方案涉及本发明所述的活减毒细菌，其中已利用重组DNA技术导致了cra基因的突变。
较好限定并周密进行的包括cra基因片段或甚至整个基因的缺失或异源DNA片段的插入的突变或二者同时发生的突变有以下优点和传统的诱导突变相比，其不会回复到野生型状态。
因此，在一个更为优选的形式中，本发明的这个实施方案是指活减毒细菌，其中cra基因含有插入和/或缺失。
如今一旦大量的疫苗用于宠物和农场动物，如果仅仅为了降低疫苗的成本，很显然几种疫苗的共同给药将是可取的。因此使用活减毒细菌作为异源基因的重组载体是非常具有吸引力的，其中的异源基因编码的抗原选自其它的致病微生物或病毒。这种重组载体的给药有一个优点即诱导同时抵抗两种或多种疾病的免疫力。由于编码Cra蛋白的基因可作为异源基因插入位点，本发明的用于疫苗的活减毒细菌便提供了用于这种异源基因的适合的载体。cra基因作为插入位点的应用有一个优点即cra基因失活的同时新导入的异源基因可被表达(和同源的细菌基因一起)。这种重组载体的构建可使用标准的分子生物学技术例如等位交换按常规进行。因此，本发明活减毒重组细菌的另一个实施方案优选为埃希氏菌属，沙门氏菌属，放线杆菌属，嗜血杆菌属，气单胞菌属，巴斯德氏菌属，链球菌属和耶尔森氏菌属，其中插入了异源基因但并不能产生功能性Cra蛋白。如此的异源基因可以如上所述例如是编码选自其它致病微生物或病毒的抗原的基因。此基因可得自例如致病疱疹病毒(例如编码疱疹病毒的结构蛋白的基因)，逆转录病毒(例如gp160包膜蛋白)，腺病毒等。异源基因也可得自致病细菌。作为一个实例，编码细菌毒素例如大叶性肺炎放线杆菌毒素，梭状芽胞杆菌毒素，外膜蛋白等的基因是很合适的细菌异源基因。另一种可能性是插入编码与触发免疫系统有关的蛋白，例如白介素或干扰素的基因，或另一个涉及免疫调控的基因。
在cra基因中插入异源基因是有益的，因为其不需要去寻找异源基因的插入位点，并且同时cra基因被敲除。
因而，在一个优选的实施方案中，异源基因被插入cra基因。异源基因可被插在cra基因的任一位置或被插入cra基因部分或全部缺失时的位点。
因为它们在体内除了致免疫特性之外出人意料地减毒，本发明用于疫苗的细菌非常适合作为活减毒疫苗的基础。因而，本发明的另一个实施方案涉及用于保护动物和人类抵抗含cra基因的野生型细菌感染的活减毒疫苗。
这些疫苗含有免疫有效量的本发明的用于疫苗的活减毒细菌或本发明的所述活重组载体细菌以及药学上可接受的载体。
更优选地，根据本发明含有活减毒细菌的疫苗选自埃希氏菌属，沙门氏菌属，放线杆菌属，嗜血杆菌属，气单胞菌属，巴斯德氏菌属，链球菌属和耶尔森氏菌属。
免疫有效性是指用于免疫给药的活减毒细菌的量足以在宿主中诱导引起抗细菌的毒性形式的有效免疫应答。
除了如上所述免疫有效量的活减毒细菌之外，本发明所述疫苗也含有药学上可接受的载体。这种载体可以简单地如水，但是，其也可以含有例如培养细菌的培养液。另一种合适的载体例如是生理盐浓度的溶液。
给药的有用剂量取决于年龄、体重、接种的动物，给药的方式以及疫苗作用的病原体的类型的不同而变化。
疫苗可以含有任意剂量的足以充分激起免疫应答的细菌。剂量范围在103和1010细菌之间是非常合适的剂量。
可选择地，一种或多种有佐剂活性的化合物可以被加到疫苗中。佐剂是免疫系统的非特异性刺激物。其增强宿主对疫苗的免疫应答。本领域技术人员公知的佐剂的实例为弗氏完全和不完全佐剂，维生素E，非离子嵌段聚合物，胞壁酰二肽，ISCOMs(免疫刺激性复合物，例如参见EP 109942)，皂苷，矿物油，植物油以及Carbopol。
特别适用于粘膜用的佐剂为例如大肠杆菌热不稳定毒素(LT)或霍乱毒素(CT)。
其它合适的佐剂为例如氢氧化铝，磷酸铝或氧化铝，油乳剂(例如，Bayol F(R)或Marcol 52(R)，)皂苷或维生素E可溶性盐。
因此，本发明所述疫苗优选含有佐剂。
其它的用于本发明的药学上可接受的载体或稀释剂的例子包括例如SPGA，碳水化合物(例如山梨醇，甘露糖醇，淀粉，蔗糖，葡萄糖，葡聚糖)，如白蛋白或酪蛋白的蛋白质，含牛血清或脱脂奶和缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液)的蛋白质。
尤其当这种稳定剂加入疫苗的时候，疫苗非常适于冷冻干燥。因此，在一种优选的形式中，疫苗是一种冻干的形式。
为了给动物或人类给药，本发明所述疫苗可鼻内给药，真皮内给药，皮下给药，口服，吸入或肌内给药。家禽给药时，翅膀给药和滴眼给药是非常合适的。
另一个实施方案涉及细菌在疫苗中的应用或本发明重组细菌用于制备保护动物和人类抵抗野生型细菌感染或感染的致病性影响的疫苗中的应用。
本发明的另一个实施方案涉及本发明所述疫苗的制备方法。此方法包括将本发明活减毒细菌或本发明重组载体细菌与药学上可接受的载体混合。
提供SR-11 Fad- a-毒力的突变基因的核苷酸序列公开于SEQ ID NO:1中。
SEQ ID NO:2公开了SEQ ID NO:1的核苷酸序列编码的蛋白分子的氨基酸序列。
现在已鉴定出鼠伤寒沙门氏菌SR-11 Fad-是cra基因突变株。转座子插入的点已被发现位于距cra翻译终止密码子的3｀末端的约45个碱基对处。
一个含有1.5kb Tn 10d Cam插入子的4.5kb的Pst1片段(一端侧接一段1.9kb鼠伤寒沙门氏菌SR-11 DNA片段而另一端侧接一段1.1kb鼠伤寒沙门氏菌SR-11 DNA片段)被插入到pBluescriptⅡ SK(+)的Pst1位点中。结果得到的质粒pJHA 7通过电穿孔进入到E.Coli HB101中。通过Sanger双脱氧热循环法测序侧接Tn 10d Cam插入子的区域。直接侧接Tn 10d Cam插入子每侧的核苷酸序列被发现与鼠伤寒沙门氏菌cra(fruR)基因有100％的同源性并发现插入点距cra翻译终止密码子的3｀末端45个核苷酸。这些表明了鼠伤寒沙门氏菌SR-11 Fad-是一个cra突变株。
与SR-11对比，SR-11 Fad-不能够在含有柠檬酸盐，油酸盐，丙酮酸盐，醋酸盐，丁二酸盐和延胡索酸盐的M9基本琼脂培养基平板上生长。
通过PCR扩增鼠伤寒沙门氏菌SR-11野生型cra(fruR)并且将其插入pBR322的氨苄青霉素抗性基因的pst1位点。所得pJHA8质粒恢复了鼠伤寒沙门氏菌SR-11 Fad的能力也可以象野生型菌株一样利用上述的每一种化合物作为碳源。这些实验确定鼠伤寒沙门氏菌SR-11-是cra(fruR)突变株。
SR-11 Fad的构建是通过将来自于LT-2d的微转座子突变株的氯霉素抗性通过噬菌体P22HT105int-转导入SR-11中实现的。尽管未必可能，SR-Fad-无毒性的可能性取决于一些SR-11 DNA在转导时的丢失，例如，致病性岛的丢失，而不是取决于缺陷性cra基因。因此，如下所描述，一个等同于SR-11的菌株，下文的SR-11 CramodAX-2，除了含有相同的存在于SRFad-中的cra基因突变，其是通过等位交换来构建的。
含有SR-11 Fad-突变cra基因(cra基因含有氯霉素抗性基因)的4.3kb的Pst1 SR-11 Fad-DNA片段被插入到一个含有氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因的自杀载体pLD55的Pst1位点。其被称为pMJN10。pMJN10通过电穿孔进入E.coli S17-1λpir中。E.coli S17-1λpir(pMJN10)与SR-11接合之后，检测了一些氨苄青霉素，四环素和氯霉素SR-11转接合子利用油酸盐，柠檬酸盐，醋酸盐，丙酮酸盐，丁二酸盐和延胡索酸盐作为唯一碳源的能力。如果pMJN10已经通过同源序列的单交换整合到染色体中，则所有转接合子都能如所期望的那样利用上述盐类，即好象突变和野生型的cra等位基因都存在于染色体中。这样的五个“整合子”被用来检测其中是否存在作为游离质粒的pMJN10，结果并不存在，从而进一步确定该质粒已经插入到SR-11染色体中。五个整合子中的每一个被划线培养在含有氯霉素的Luria琼脂平皿上。在这种情况下，只要留在染色体中的cra等位基因是含有氯霉素抗性基因的突变等位基因则发生二次交换的细胞便能存活。划线培养的接合子样品然后划线培养在四环素敏感性筛选琼脂(TSS琼脂)上。TSS琼脂含有延胡索酸和四环素敏感性细胞，即已丢失自杀质粒的细胞相对于在染色体中仍然含有质粒的四环素抗性细胞长成很大的集落。总共34个大集落被用于检测氯霉素抗性，氨苄青霉素和四环素的敏感性以及利用油酸盐，醋酸盐，丙酮酸盐，柠檬酸盐，丁二酸盐和延胡索酸盐作为唯一碳源的能力。在34个分离物中，6个具有氯霉素抗性，但对氨苄青霉素和四环素敏感，不能利用上述化合物作为唯一碳源。其中一个分离物，被称为SR-11CramoddAX-2(AX是指等位基因交换)，被用pBR322或pJHA8转化(pJHA8含有野生型cra基因)且二菌株均被检测了用油酸盐，醋酸盐，丙酮酸盐，柠檬酸盐，丁二酸盐和延胡索酸盐作为唯一碳源的能力。对比SR-11CramodAX-2(pBR322),SR-11CramodAX-2(pJHA8)能够利用上述化合物作为唯一碳源，此表明SR-11CramodAX-2是cra突变株。此两个菌株，正如所预料的，能够利用葡萄糖和甘油作为唯一碳源。
为了确定功能性cra(fruR)基因是否使鼠伤寒沙门氏菌具有SR-11毒力，进行了以下的实验。
四只BALB/c小鼠用SR-11(2.1×108cfu/小鼠)经口感染以及五只小鼠用SR-11CramodAX-2(2.8×108cfu/小鼠)感染。到感染后第8天，所有4只感染SR-11的小鼠都死亡，然而5只感染SR-11CramodAX-2的小鼠仍然健康和活跃(表1)。因为除了存在于SR-11Cramod中的cra的相同的突变外，SR-11CramodAX-2和SR-11是一样的，在通过从LT-2菌株转导构建SR-11Cramod过程中发生的一些异常事件与cra无关的可能性已被排除，这可能是毒力丧失的原因。
也有可能氯霉素抗性元件在cra基因中的插入导致对下游基因的极性作用，因此SR-11 Fad-的减毒不取决于缺陷性cra基因。因此，SR-11Cramod用仅含有野生型cra基因的pJHA8来补偿，以检测是否SR-11Cramod(pJHAB)恢复毒力。作为一个对照，SR-11Cramod用pBR332来补偿，此载体用来构建pJHA8。四只BALB/c小鼠被用3.1×108cfu/小鼠的SR-11Cramod(pBR322)经口感染并且另外四只BALB/c小鼠被用4.3×108cfu/小鼠的SR-11 Fad-(pJHA8)感染。到感染后第9天，四只用SR-11Cramod(pJHA8)感染的小鼠中的三只死亡而用SR-11Cramod(pBR322)感染的4只小鼠仍然健康和活跃(表1)。所有死亡小鼠的肝脏与脾脏都含有大于108cfu/器官的SR-11 Fad-(pJHA8)。此结果排除了带有氯霉素抗性元件的cra基因的失活引起下游效应从而导致无毒力的可能性并且证明了功能性cra基因是SR-11毒力所必需的。鼠伤寒沙门氏菌菌株 感染数a存活数SR-11 4 0SR-11CramodAX-2 5 5SR-11Cramod(pBR322) 4 4SR-11Cramod(pJHA8)4 1a根据菌株的不同，用2.0×108cfu/小鼠～5.0×108cfu/小鼠的剂量口服感染小鼠。所有的死亡鼠都是到感染后第9天死亡。所有存活鼠完全恢复。表1检测不同细菌属中的cra基因鼠伤寒沙门氏菌四株，肠沙门氏菌，鸡沙门氏菌，都柏林沙门氏菌，和猪霍乱沙门氏菌各一株通过Southern杂交来检测cra基因。在所有的情况下，cra基因被发现与SR-11一样有4.3kb大小的Pst1 DNA片段。六个不同的致病E.Coli菌株也被检测都有cra基因，虽然六株菌中的cra基因存在于三种不同大小的Pst1片段中。此外，一株杀鲑气单胞菌和放线杆菌属，嗜血杆菌属，巴斯德氏菌属，链球菌属和耶尔森氏菌属的一些菌株经检测都显示出cra基因的存在。
cra基因存在于上述细菌的证明如下这些菌株的基因组DNA在37℃用20单位的Pst1(Promega)过夜降解。凝胶电泳(0.7％琼脂糖，1×TAE)用来分离不同大小的Pst1DNA片段。分离的DNA用S&S Turboblotter系统(Schleicher和Schuell)在碱性的条件下转移到带正电的尼龙膜上3小时。膜在90℃下烘焙30分钟将DNA连接到膜上。然后，鼠伤寒沙门氏菌cra基因的700碱基对片段被DIG标记并用于探测膜。膜在62℃下在含有5×SSC,0.1％的N-月桂酰肌氨酸，0.02％SDS,1.5％封闭试剂(带CSPD的DIG检测起子药盒Ⅱ,Boehringer Mannheim)中预杂交(在一个滚瓶杂交炉中)2～4小时。标记的探针被变性并加入新鲜的杂交缓冲液中，印迹在62℃下培养16-20小时。印迹用0.1％SDS,2×SSC在62～65℃下5分钟洗两次。然后用0.1％SDS,0.1×SSC在60℃下15分钟洗两次。通过下述的修饰来展开印迹2％封闭试剂被用于封闭溶液(通常使用1％)，印迹被封闭一个小时(通常封闭的时间为30分钟)且抗体的较低浓度(通常使用70％浓度)被用于DIG-标记探针的检测。这些变化被制造商建议用于较低的背景信号。
SR11CramodSR11Cramod对照第1天接种时剂量 6.0×1076.0×107-第11天接种时剂量- 8.3×107-第18天攻击时剂量1.9×1091.9×1091.9×109死亡率(％) 15 10 100表2联合接种的安全性与效力实验。在第二个实验中检测疫苗的效力和疫苗的安全性。疫苗的安全性在生长阻滞的基础上测得。一组15只小鸡被口服接种溶于培养基中的2.7×108CFU鼠伤寒沙门氏菌SR11Cramod。另一组15只小鸡口服接种溶于PBS中的1.3×108CFU的同一菌株。18天后，两组均用6.5×108毒力野生型菌株进行攻击。表3显示了结果。
SR11Cramod(ⅰ)SR11Cramod(ⅱ) 对照第1天接种时的剂量 2.7×1081.3×108--第7天的重量 178 ND 185第18天的重量 733 722749第18天攻击时的剂量6.5×1086.5×1086.5×108死亡率(％)0 13 100表3ⅰ=培养基，ⅱ=PBS结果两个实验显示，尽管所用的高攻击剂量，Cra-阴性的鼠伤寒沙门氏菌菌株获得了很高水平的保护。此外，发现接种疫苗的结果没有显著的生长阻滞。因此可以断定Cramod阴性的鼠伤寒沙门氏菌菌株非常适于用于保护家禽抵抗野生型细菌的感染的活减毒疫苗。
每一组的5头猪在5-6周龄时被攻击。猪被鼻内(0.5ml/鼻)攻击和口服攻击(1.0ml培养物+4.0ml细菌稀释剂)。攻击培养物大约为9.0×108CFU/ml。然后，猪被每日监视沙门氏菌感染的典型的临床症状包括体重损失，腹泻，和升高的直肠的温度。C．安乐死攻击后第7天，猪被实施安乐死。猪被尸体剖检且肺，肝脏，脾脏，肠系膜淋巴节(MLN)以及回肠被培养用于猪霍乱沙门氏菌的生长。D．体重增加平均日增加(ADG)是通过从最终体重中扣除起初体重再除以从攻击到安乐死的天数得到的。组ADG是个体猪ADG的平均数。2．小鼠安全性试验一个小鼠攻击实验被完成以检测不同猪霍乱沙门氏菌菌株的LD50，即Cra阳性亲本34682和35276菌株以及cra阴性的34682和35276敲除(KO)菌株的LD50。A．动物两百(200)只16-20克的CF-1Sasco小鼠被分成20组每组10只小鼠用于小鼠的安全性测试。在整个实验期间小鼠被放在同一房间内，但在不同的桶中。B．攻击每一个菌株供试于5个含有10只小鼠的亚组。这些亚组用0.25ml菌株的5种不同的稀释液(10-3-10-7)腹膜内(lP)攻击。
四种菌株的每一种的冷冻种子被稀释为10-3-10-7。这些稀释液的每一种被腹膜内注射(0.25ml)到10只小鼠中。结果Ⅰ．猪安全性试验A．体重增加猪的体重增加显示于

图1中。这些数据清楚地显示用KO菌株攻击和用亲本菌株攻击的猪的不同。数据也反映动物的全面健康状况的不同。两组用亲本菌株攻击的猪从攻击时到安乐死都减轻了体重；然而用KO菌株攻击的猪每天增加了大约0.75公斤。Ⅱ．小鼠安全性实验A．死亡小鼠实验的结果显示于下面表4中。右栏显示了不同菌株CFU的半致死剂量。敲除菌株清楚地显示出高水平的减毒。菌株 LD50cfu35276亲本 ＜7.7cfu35276敲除 1.5E+04cfu34682亲本 12.5cfu34682敲除 ＞9.0E+04cfu表4结论从猪安全性实验显示了经过攻击Cra敲除(KO)菌株相对于亲本菌株产生了明显较高的体重增加。其证明了CraKO突变株的减毒特性。除了猪安全性试验，小鼠安全性试验也显示Cra KO菌株被减毒KO突变株的LD50显著地高于亲本菌株的LD50。
攻击9天后，猪被实施安乐死，并被尸体剖检且在含有80μg/ml萘啶酮酸的Hektoen肠道(HE)琼脂平皿上培养肺，肝脏，脾脏，肠系膜淋巴节(MLN)和回肠来增殖猪霍乱沙门氏菌。腹泻评分腹泻评分是通过给攻击后每头猪每天的腹泻一个点来计算的。在试验结束时，实验期间的总点数除以从攻击到安乐死的天数。此数乘以100就得到所观察到的腹泻天数的百分数。沙门氏菌释放每日取猪的排泄物来检测在免疫后和攻击后猪霍乱沙门氏菌释放的时间。在两天的阴性结果后，停止取排泄物。排泄物被滴定在HE平皿上进行分离。在样品进行不同的稀释后发现与生长有关的点。点数如下所分配10-11点10-22点10-33点10-44点10-55点体重增加平均日增加(ADG)是通过从最终体重中扣除起初体重再除以从攻击到安乐死的天数得到的。组ADG是个体猪ADG的平均数。结果免疫后死亡有两头用猪霍乱沙门氏菌野生型亲本菌株34682接种的猪在接种后死亡。此组中的其它三头猪在实验终止的自始至终都活着。沙门氏菌分离/尸体剖检评分图2显示了每一个器官猪霍乱沙门氏菌分离的结果。对比亲本和非接种组，用KO疫苗免疫的猪的组中任何器官都没有分离到猪霍乱沙门氏菌。非接种组的所有5头猪的回肠和MLN中都分离到猪霍乱沙门氏菌而亲本组的那些器官中没有分离到。通过将每个分离到霍乱沙门氏菌的器官标记为一个点，每组分离评分被计算出来。结果证明了用KO疫苗接种的猪相对于亲本菌株接种的猪有较低的评分，且明显低于非接种组的评分。腹泻评分日平均腹泻评分显示于图3。此图显示出KO评分相对于其它的三组有明显的不同。KO组清楚地显示了最低的评分。沙门氏菌释放在接种疫苗和攻击后，猪的沙门氏菌的释放显示于图4和5中。接种疫苗后，图显示出亲本具有最高水平的释放。在攻击后的图中，非接种疫苗的动物释放的猪霍乱沙门氏菌持续最长的时间，因此得到最高的评分。体重的增加猪体重的增加显示于图6中。这些数据清楚地显示了不同组之间的差异。它们也反映出不同动物之间整体的健康水平。非接种疫苗组每天平均减重0.15公斤，而KO组平均每天增重0.6公斤。讨论猪霍乱沙门氏菌敲除菌株34682被证明为有效的和安全的疫苗菌株。沙门氏菌在尸体剖检时的分离对于敲除菌株是完全阴性的。非接种疫苗的评分在二次分离中最高。鉴于攻击后的日平均增重，基因敲除菌株接种的动物有最高的增重且非接种动物的增重明显较低。结论活KO-34682猪霍乱沙门氏菌疫苗株是安全且有效的。
附图的说明图1攻击后每头猪每天平均体重增加的磅数。该重量乘以0.4536就得到了公斤数。图2能从不同的组织中重新分离出猪霍乱沙门氏菌的猪的百分数(MLN=肠系膜淋巴节)。图3攻击后腹泻评分的平均百分比。图4免疫后沙门氏菌释放评分的日平均数。图5攻击后细菌释放评分的日平均数。图6攻击后每头猪增重的日平均磅数。
序列表(2)SEQ ID NO:1的资料(ⅰ)序列特征(A)长度1200个碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型DNA(ⅸ)特征(A)名称/关键词CDS(B)位置118..1119(ⅸ)特征(A)名称/关键词misc-特征(B)位置118..120(C)其它资料/产物=“编码氨基酸甲硫氨酸”(ⅹ)序列描述SEQ ID NO:1GTGGTAACCC GGAATAAAAG CGGTTGCCGG AGTGATCAAA CTGCGCTTAG ATGTTAACGA 60TTTTAACCCA TGCCGACATA AAGGTTATGG TTTGTACAAT TTACACAAGG GGCAATT 117GTG AAA CTG GAT GAA ATC GCT CGG CTG GCC GGT GTC TCG CGC ACA ACT 165Val Lys Leu Asp Glu Ile Ala Arg Leu Ala Gly Val Ser Arg Thr Thr1 5 10 15GCA AGC TAC GTT ATA AAC GGT AAA GCA AAG CAA TAC CGC GTG AGC GAC 213Ala Ser Tyr Val Ile Asn Gly Lys Ala Lys Gln Tyr Arg Val Ser Asp20 25 30AAA ACC GTA GAA AAA GTC ATG GCG GTA GTG CGT GAG CAC AAT TAC CAT 261Lys Thr Val Glu Lys Val Met Ala Val Val Arg Glu His Asn Tyr His35 40 45CCT AAC GCT GTG GCT GCC GGG CTG CGT GCT GGA CGC ACA CGT TCC ATT 309Pro Asn Ala Val Ala Ala Gly Leu Arg Ala Gly Arg Thr Arg Ser Ile50 55 60GGT CTG GTG ATC CCG GAC CTT GAA AAC ACG AGC TAC ACC CGT ATC GCA 357Gly Leu Val Ile Pro Asp Leu Glu Asn Thr Ser Tyr Thr Arg Ile Ala65 70 75 80AAC TAT CTT GAG CGC CAG GCA CGC CAG CGT GGC TAC CAA CTG CTG ATC 405Asn Tyr Leu Glu Arg Gln Ala Arg Gln Arg Gly Tyr Gln Leu Leu Ile85 90 95GCC TGT TCT GAA GAT CAG CCG GAT AAC GAA ATG CGC TGC ATT GAG CAC 453Ala Cys Ser Glu Asp Gln Pro Asp Asn Glu Met Arg Cys Ile Glu His100 105 110CTT TTG CAA CGC CAG GTG GAT GCA ATC ATT GTT TCA ACT TCG TTA CCG 501Leu Leu Gln Arg Gln Val Asp Ala Ile Ile Val Ser Thr Ser Leu Pro115 120 125CCG GAG CAT CCC TTC TAT CAG CGC TGG GCC AAC GAT CCG TTC CCC ATC 549Pro Glu His Pro Phe Tyr Gln Arg Trp Ala Asn Asp Pro Phe Pro Ile130 135 140GTC GCG CTC GAC CGC GCG CTG GAT CGC CAA CAT TTC ACC AGC GTG GTC 597Val Ala Leu Asp Arg Ala Leu Asp Arg Glu His Phe Thr Ser Val Val145 150 155 160GGC GCC GAT CAG GAT GAT GCC GAG ATG TTG GCG GAA GAG CTG CGT AAA 645Gly Ala Asp Gln Asp Asp Ala Glu Met Leu Ala Glu Glu Leu Arg Lys165 170 175TTC CCG GCG GAA ACG GTG CTT TAT TTG GGC GCG CTG CCG GAG TTG TCC 693Phe Pro Ala Glu Thr Val Leu Tyr Leu Gly Ala Leu Pro Glu Leu Ser180 185 190GTC AGT TTC CTG CGC GAG CAG GGG TTC CGC ACC GCA TGG AAA GAC GAT 741Val Ser Phe Leu Arg Glu Gln Gly Phe Arg Thr Ala Trp Lys Asp Asp195 200 205CCG CGG GAG GTG AAT TTC TTA TAT GCC AAC AGC TAT GAG CGC GAA GCC 789Pro Arg Glu Val Asn Phe Leu Tyr Ala Asn Ser Tyr Glu Arg Glu Ala210 215 220GCC GCG CAG TTG TTT GAG AAA TGG CTG GAA ACG CAT CCT ATG CCG CAG837Ala Ala Gln Leu Phe Glu Lys Trp Leu Glu Thr His Pro Met Pro Gln225 230 235 240GCG CTC TTT ACG ACA TCG TTC GCG CTA TTA CAG GGC GTG ATG GAC GTA885Ala Leu Phe Thr Tnr Ser Phe Ala Leu Leu Gln Gly Val Met Asp Val245 250 255ACG CTG CGG CGC GAT GGA AAA CTG CCT TCG GAT TTA GCG ATT GCG ACC933Thr Leu Arg Arg Asp Gly Lys Leu Pro Ser Asp Leu Ala Ile Ala Thr260 265 270TTC GGC GAT CAT GAG CTG CTG GAT TTT CTG CAA TGC CCG GTA CTG GCG981Phe Gly Asp His Glu Leu Leu Asp Phe Leu Gln Cys Pro Val Leu Ala275 280 285GTG GCG CAG CGT CAT CGT GAT GTC GCG GAA CGC GTG CTG GAG ATT GTG 1029Val Ala Gln Arg His Arg Asp Val Ala Glu Arg Val Leu Glu Ile Val290 295 300CTG GCA AGT CTT GAT GAA CCG CGT AAA CCG AAA CCC GGC TTA ACG CGT 1077Leu Ala Ser Leu Asp Glu Pro Arg Lys Pro Lys Pro Gly Leu Thr Arg305 310 315 320ATT CGG CGA AAC CTT TAT CGT CGC GGC ATT CTG AGC CGT AGC 1119Ile Aro Arg Asn Leu Tyr Arg Arg Gly Ile Leu Ser Arg Ser325 330TAAAGGACCG GCGGTAAAAG ACTCTCTCTT CTGCCGCCGT CAAACAAATG CGTATCAGTA 1179AAAATATCCC TTAAATAATT A 1200(2)SEQ ID NO:2的资料(ⅰ)序列特征(A)长度334个氨基酸(B)类型氨基酸(C)拓扑结构线性(ⅱ)分子类型蛋白质(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2Val Lys Leu Asp Glu Ile Ala Arg Leu Ala Gly Val Ser Arg Thr Thr1 5 10 15Ala Ser Tyr Val Ile Asn Gly Lys Ala Lys Gln Tyr Arg Val Ser Asp20 25 30Lys Thr Val Glu Lys Val Met Ala Val Val Arg Glu His Asn Tyr His35 40 45Pro Asn Ala Val Ala Ala Gly Leu Arg Ala Gly Arg Thr Arg Ser Ile50 55 60Gly Leu Val Ile Pro Asp Leu Glu Asn Thr Ser Tyr Thr Arg Ile Ala65 70 75 80Asn Tyr Leu Glu Arg Gln Ala Arg Gln Arg Gly Tyr Gln Leu Leu Ile85 90 95Ala Cys Ser Glu Asp Gln Pro Asp Asn Glu Met Arg Cys Ile Glu His100 105 110Leu Leu Gln Arg Gln Val Asp Ala Ile Ile Val Ser Thr Ser Leu Pro115 120 125Pro Glu His Pro Phe Tyr Gln Arg Trp Ala Asn Asp Pro Phe Pro Ile130 135 140Val Ala Leu Asp Arg Ala Leu Asp Arg Glu His Phe Thr Ser Val Val145 150 155 160Gly Ala Asp Gln Asp Asp Ala Glu Met Leu Ala Glu Glu Leu Arg Lys165 170 175Phe Pro Ala Glu Thr Val Leu Tyr Leu Gly Ala Leu Pro Glu Leu Ser180 185 190Val Ser Phe Leu Arg Glu Gln Gly Phe Arg Thr Ala Trp Lys Asp Asp195 200 205Pro Arg Glu Val Asn Phe Leu Tyr Ala Asn Ser Tyr Glu Arg Glu Ala210 215 220Ala Ala Gln Leu Phe Glu Lys Trp Leu Glu Thr His Pro Met Pro Gln225 230 235 240Ala Leu Phe Thr Thr Ser Phe Ala Leu Leu Gln Gly Val Met Asp Val245 250 255Thr Leu Arg Arg Asp Gly Lys Leu Pro Ser Asp Leu Ala Ile Ala Thr260 265 270Phe Gly Asp His Glu Leu Leu Asp Phe Leu Gln Cys Pro Val Leu Ala275 280 285Val Ala Gln Arg His Arg Asp Val Ala Glu Arg Val Leu Glu Ile Val290 295 300Leu Ala Ser Leu Asp Glu Pro Arg Lys Pro Lys Pro Gly Leu Thr Arg305 310 315 320Ile Arg Arg Asn Leu Tyr Arg Arg Gly Ile Leu Ser Arg Ser325 330
权利要求
1用于保护动物免受致病细菌感染或其致病作用的活减毒疫苗，其含有由于cra基因突变导致其不能表达功能性Cra蛋白的活减毒细菌，和药学上可接受的载体。
2．如权利要求1所述的活减毒疫苗，其特征在于其中的致病细菌属于埃希氏菌属，沙门氏菌属，放线杆菌属，嗜血杆菌属，气单胞菌属，巴斯德氏菌属，链球菌属和耶尔森氏菌属的任一种。
3．如权利要求1所述的活减毒疫苗，其特征在于活减毒细菌携带异源基因。
4．如权利要求3所述的活减毒疫苗，其特征在于其中的致病细菌属于埃希氏菌属，沙门氏菌属，放线杆菌属，嗜血杆菌属，气单胞菌属，巴斯德氏菌属，链球菌属和耶尔森氏菌属中的任一种。
5．如权利要求1-4所述的活减毒疫苗，其特征在于含有佐剂。
6．如权利要求1-5所述的活减毒疫苗，其特征在于为冻干的形式。
7．由于cra基因突变导致其不能表达功能性Cra蛋白的活减毒细菌用于制备保护动物免受致病细菌感染或其致病作用的疫苗的用途。
8．如权利要求7的用途，其特征在于活减毒细菌携带异源基因。
9．权利要求1所述疫苗的制备方法，包括将活减毒细菌与药学上可接受的载体混合。
10．用致病细菌免疫动物以抵抗感染的方法，包括给动物施用权利要求1所述的疫苗。
全文摘要
本发明涉及用作药剂的活减毒细菌。本发明也涉及基于活减毒细菌,对阻止微生物发病有用的疫苗。另外,本发明涉及带有异源基因的活减毒重组细菌及基于该细菌的疫苗。最后本发明涉及这些疫苗和细菌的制备方法。
文档编号A61K39/02GK1325731SQ00121980
公开日2001年12月12日 申请日期2000年6月9日 优先权日2000年6月9日
发明者P·S·科恩, D·C·劳克斯, P·J·M·努杰恩 申请人:阿克佐诺贝尔公司, 罗得岛大学