专利名称：治疗copd的方法
发明范围本发明涉及优先抑制或结合一种形式的磷酸二酯酶同工酶4(下文中称作PDE4)同时又显示出相等或优选较小的对第二种形式的酶的结合或抑制的化合物，它们因此可用于治疗慢性阻塞性肺部疾病(COPD)。虽然还没有得到证明，但据信这些同工酶形式是相同酶的不可互相转化的构象的不同形式，它们以对原型PDE4抑制剂-咯利普兰的结合亲和力而闻名。咯利普兰以高亲和力结合一种形式的位点，但以低亲和力结合其他形式的催化位点。在此处将一种形式命名为高亲和力咯利普兰结合位点，而其他形式确定为低亲和力咯利普兰结合位点。还公开了通过优先抑制PDE4同工酶中的低亲和力形式的催化位点来选择性地治疗慢性阻塞性肺部疾病的方法。还公开了治疗COPD的方法，该方法包括给药优先结合低亲和力结合位点的化合物。还公开了通过优先抑制PDE4同工酶中的低亲和力形式的催化位点来选择性地治疗运动诱发性哮喘(EIA)的方法。
背景技术：
环核苷酸磷酸二酯酶(PDE)代表能将遍在细胞内第二信使腺苷3′，5′-一磷酸(cAMP)和鸟苷3′，5′-一磷酸(cGMP)水解为它们相应的失活5′-一磷酸代谢物的一族酶。据信至少存在9类不同的PDE同工酶，每一类都具有独特的物理和动力学特性，且每一类都代表不同基因族的产物。使用数字1至9将它们区别开来。
本发明中的目标酶是所有不同形式和其在所有细胞中分布的全结构域形式的PED4同工酶。它是对cGMP(Km＞100μM)具有很小活性的低Km(cAMP Km＝1-5μM)cAMP-选择性酶。这类同工酶的成员具有有趣的以能与咯利普兰和具有不同级系能力的其他PDE4抑制剂结合的两种或多种不可互相转化或可缓慢地互相转化的形式存在的特性。因此相同的基因产物可以1个以上的催化活性构象状态存在。重要的是，不同结合形式的相对比例可以根据组织细胞类型变化。例如，炎性细胞可含有相对高比例的以低亲和力结合咯利普兰的形式，而脑和壁细胞可含有相对高比例的以高亲和力结合咯利普兰的形式。
在本发明中特别令人感兴趣的是这类同工酶在炎症和气管平滑肌中所起的作用。研究表明它在调节各种各样的炎性细胞(即肥大细胞、嗜碱细胞、嗜曙红细胞、嗜中性白细胞和单核细胞)和气管平滑肌中的cAMP中起着突出作用。本发明的产品特别适用于炎性细胞和气管平滑肌；在人单核细胞中表达的同工酶类型是尤其令人感兴趣的。这是因为环AMP充当第二信使来抑制炎性细胞的趋化性和活化作用。此外，cAMP介导气管平滑肌的松弛。这与PDE4在引起cAMP代谢中的主要作用联系起来提供了研究PDE4抑制剂的基础材料藉由它们抬高白细胞和气管平滑肌中cAMP含量的能力，PDE4抑制剂可具有抗炎和支气管扩张药活性。
目前在治疗炎症中所用的和作为支气管扩张药的PDE抑制剂，象茶碱和己酮可可碱这样的药物，不加区别地抑制所有组织中的PDE同工酶。这些化合物显示出副作用，显然是因为它们非选择性地抑制所有组织中的所有或大多数PDE同工酶种类。这在评定这些化合物的治疗概况时是要加以考虑的。目标疾病状态可以利用这类化合物进行有效的治疗，但可能显示出不希望的次生作用，如果它们能被避免或减至最小的话，将增加这种治疗特定疾病状态的方法的总体治疗效果。总体考虑，这样的信息提示与使用标准的非选择性PDE抑制剂有关的副作用可以通过将新颖的同工酶选择性抑制剂导向所研究的组织或细胞中的主要PED来减小。尽管在理论上同工酶选择性PDE抑制剂应当表现出超过非选择性抑制剂的进步，但迄今为止所测试的选择性抑制剂都还有因为延伸抑制了不适当的或非靶向组织中的有价值的同工酶而产生的副作用。例如，对开发作为抗抑郁药的选择性PDE4抑制剂咯利普兰的临床研究表明，它具有亲精神活性并产生胃肠作用，例如胃灼热、恶心和呕吐。另据显示，另一种定向治疗多梗死性痴呆的PDE4抑制剂-登布茶碱的副作用也可包括胃灼热、恶心和呕吐。这些副作用的出现据认为是抑制了CNS和胃肠系统中特定区域中的PDE4的结果。
在1986年，Schneider和他的同事描述了大鼠脑匀浆中存在高亲和力的立体选择性[3H]-咯利普兰结合位点以及它们的特性。尽管假定这些结合位点代表了大鼠脑“非钙调蛋白依赖性cAMP磷酸二酯酶”(即PDE4)的催化位点，但数据中明显有惊人的反常情况。在类似的虽然不完全相同的实验条件下，数据显示咯利普兰的Kd＝1nM，而它以Ki＝1μM抑制了大鼠脑的PDE4活性。因此，在咯利普兰对结合位点的亲和力和其对催化活性的影响之间有1000倍的差异。尽管PDE抑制和对[3H]-咯利普兰结合的竞争的综合结构-活性关系(SAR)没有得到确认，但咯利普兰作为PDE4抑制剂的能力与其在结合位点的能力加以对比后的实质差别似乎对“这两种活性都包含在相同的分子部位”的假定的正确性提出了质疑。
由于这个难题，又开始了多项研究。一种探索是确定在相同蛋白质上存在的咯利普兰的高亲和力结合位点是否是cAMP催化位点。另一项研究是确定PDE4抑制的SAR与和高亲和力咯利普兰结合位点竞争的SAR是否相同。第三种研究是试图提炼并阐明在这些发现中可能有怎样的特别的生物有效性(如果有的话)，因为它可能涉及开发新的药物疗法。
正如从若干测定收集的数据所示，很显然在抑制剂结合的人单核细胞重组PDE4(hPDE4)上有至少两种结合形式。对这些观测结果的一种解释是hPDE4以两种不同形式存在。一种以高亲和力结合咯利普兰和登布茶碱的类似物，而另一种以低亲和力结合这些化合物。在此我们通过将它们称之为高亲和力咯利普兰结合形式(HPDE4)和低亲和力咯利普兰结合形式(LPDE4)而将这些形式区别开。
这一研究结果的重要性在于发现了能有效地竞争高亲和力咯利普兰结合形式(HPDE4)的化合物比更有效地竞争LPDE4(低亲和力咯利普兰结合形式)的那些化合物具有更多的副作用或更强的副作用。进一步的数据表明可以将化合物定向到PDE4的低亲和力结合形式且这种形式不同于咯利普兰是其高亲和力结合剂的结合形式。据发现在对高亲和力咯利普兰结合形式和低亲和力咯利普兰结合形式起作用的抑制剂中存在不同的SAR。此外，这两种形式看来具有不同的功用。因此与低亲和力咯利普兰结合形式相互作用的化合物可能具有抗炎活性，而与高亲和力咯利普兰结合形式相互作用的那些产生副作用或更强烈地显示出那些副作用。
对这些发现尚没有清楚的解释。不过，已提出PDE4可以两种不同的三级或四级状态存在。据信这两种形式都是催化活性的。咯利普兰以高亲和力结合一种形式的一个催化位点，在此处确定为具有小于10纳摩尔的Ki，和以低亲和力结合另一种形式，在此处确定为具有大于100纳摩尔的Ki。
这些发现的有用结果是现在有可能识别优先抑制cAMP催化活性的化合物，此时酶是以低亲和力与咯利普兰结合的形式，由此减少副作用，这明显与抑制了以高亲和力结合咯利普兰的形式有关。
慢性阻塞性肺部疾病(COPD)是常用于描述两种固定气管疾病-慢性支气管炎和肺气肿的病情的总括术语。慢性支气管炎和肺气肿最常由吸烟引起；大约90％的COPD病人是或者曾经是吸烟者。尽管有大约50％的吸烟者发生慢性支气管炎，但只有15％的吸烟者出现致残的气流梗阻。某些其他哺乳动物，特别是马，也会患COPD。
与COPD有关的气流梗阻是进行性的，可伴发气管反应性过度，并且可能是部分可逆的。非特异性气管过度响应也可在COPD的发展中起作用并可能是吸烟者肺功能加速衰退率的前兆。
COPD是死亡和病废的重要原因。它是当前美国和欧洲第四位的死亡原因。治疗准则主张早期检测和实施戒烟方案，以帮助减少发病率和疾病死亡率。但是，由于多种原因，早期检测和诊断是困难的。
COPD会持续发展数年，且吸烟者常常否认吸烟的任何有害作用，把喘不过气的现象增加这样的早期警告信号当作是年老的征兆。类似地，支气管炎的急性发作通常不被普通医师认为是COPD的早期征兆。许多病人显示出不止一种疾病的特征(例如慢性支气管炎或气喘性支气管炎)，使得精确的诊断难以作出，特别是在早期疾病中。并且，许多病人直到体验到与肺功能降低有关的更严重的症状，诸如呼吸困难、持续咳嗽和有痰时才去寻求医疗救助。结果，绝大多数病人直到处于更深入的疾病阶段才得到诊断或治疗。
本发明因此提供了COPD与副作用相比较的卓越的治疗指数。
发明概述本发明涉及预防或治疗COPD同时将胃肠和亲精神作用减至最小的方法，该方法包括对需要其的受治疗者给药有效量的以高亲和力结合咯利普兰的PDE4催化形式的IC50除以以低亲和力结合咯利普兰的形式的IC50的IC50比值为约0.1或更大的化合物。
发明详述COPD的特征是以肺泡巨噬细胞CD8+T细胞和嗜中性白细胞的活化和/或数目增加为标志的肺中的慢性炎症过程。关于COPD的治疗最显著的是改变嗜中性白细胞的通行和活化的能力。嗜中性白细胞据信在COPD的病理生理学中起中心作用。嗜中性白细胞的活化导致许多炎性介质和蛋白酶释放，最重要的是有助于进行性纤维变性、气管狭窄和肺实质破坏的嗜中性白细胞弹性蛋白酶的释放，从而导致气管功能加速衰退。嗜中性白细胞弹性蛋白酶也是有力的粘液促分泌剂，因此可有助于作为COPD特征的特征性粘液分泌过多。本发明的化合物对嗜中性白细胞的活性具有显著的作用，能抑制体外嗜中性白细胞的趋化性和脱粒。在动物模型中，本发明化合物减少了体内嗜中性白细胞从循环的外渗、肺分离和对大量炎性损伤的水肿反应。
可有助于PDE4抑制剂在COPD中的治疗活性的其他活性包括支气管扩张和对肺神经细胞活性的调制。尽管在COPD中下降的气管流量的可逆性程度低，但少量的增加就可具有强烈的正向作用，以及可逐渐减小衰退的斜率，这可对COPD病人的生命质量产生深刻的影响。吸入的蕈毒碱拮抗药在COPD中产生对肺功能的临床上有意义的改善的能力，至少尖锐地，提示这种疾病中的大量可逆的气管梗阻与肺神经的调节障碍有关。尽管还没有更详细的研究，但PDE4抑制剂也可调节气管上皮细胞的活性，气管上皮细胞是随着环境的损害(例如烟尘)释放的前炎性介质的丰富来源；并抑制血管平滑肌增生，这种增生是伴随右心力衰竭的COPD末期中的结构变化。
为了本发明的目的，以低亲和力结合咯利普兰的cAMP催化位点命名为“低亲和力”结合位点(LPDE4)，而以高亲和力结合咯利普兰的这种催化位点的另一种形式命名为“高亲和力”结合位点(HPDE4)。
进行一些初步实验来确立和验证[3H]-咯利普兰结合测定。在下面的实施例1中给出了这一工作的详细情况。
为了确定相同的基因产物中是否存在高亲和力结合活性和低亲和力结合活性，利用已知方法转化酵母，接着是重组PDE4经过6小时的发酵期进行表达。使用指向PDE4的抗体进行的蛋白质印迹分析显示表达的PDE4的量随着时间增加，经过3小时的生长后达到最大。此外，90％以上的免疫活性产物在酵母裂解液的高速(100,000xg)上清液中。[3H]R-(-)-咯利普兰的结合和PDE的活性同蛋白质的表达一起进行监测。PDE4活性与咯利普兰结合活性共同表达，表明在相同的基因产物上存在这两种功能。与蛋白质印迹分析的结果类似，85％以上的能抑制咯利普兰的PDE活性和[3H]-咯利普兰结合活性都发现存在于酵母的上清液部分中。
总的说来，在这种系统中表达的大多数重组PDE4作为LPDE4存在，只有少部分为HPDE4。所以，对重组PDE4催化活性的抑制主要反映了化合物对LPDE4的作用。PDE4催化活性的抑制因此可用作化合物对LPDE4的效能的指数。化合物对HPDE4的效能可以通过检验它们与[3H]R-(-)-咯利普兰竞争的能力来评定。为了发展低亲和力和高亲和力咯利普兰结合位点的结构-活性关系(SAR)，在两种测定系统中确定选出的化合物的效能。将从使用标准化合物进行的实验得到的结果制表。正如预期的那样，某些化合物在显示咯利普兰以高亲和力结合的位点上与[3H]-咯利普兰的竞争与咯利普兰对其是低亲和力结合剂的另一个位点相比明显更有力。高亲和力结合和低亲和力结合的SAR相互关系不佳，推断高亲和力[3H]-咯利普兰结合的抑制的SAR不同于与低亲和力咯利普兰结合位点的结合的SAR。表I提供了这项SAR研究的结果。
表I
登布茶碱是由SmithKline Beecham.生产的7-丙酮基，1，3-二丁基黄嘌呤。罂粟碱是1-[(3，4-二甲氧基苯基)甲基]-6，7-二甲氧基异喹啉。曲喹新是2，3，6，7-四氢-2-(基亚氨基)-9，10-二甲氧基-3-甲基-4H-嘧啶并[6，1-a]异喹啉-4-酮。双嘧达莫是[5，4-d]嘧啶-2-6-二基)二氮川]四乙醇。
这些结果说明有些化合物可选择性抑制与高亲和力形式相比的所谓的低亲和力形式，反之亦然。这一发现的重要性在于有可能通过设计或选取选择性(优先)抑制一个位点从而影响所需反应以排除另一个不希望的反应的化合物而将副作用减至最小，或者至少将非靶向反应减小至不会干涉预期治疗到不可接受的程度的程度。
虽然进行了这样的工作，但我们还没有明确PDE4同工酶中高亲和力咯利普兰结合和低亲和力咯利普兰结合的全然不同的SAR的基础。不过我们已发现如果化合物显示出约0.1或更大的IC50比值(用高亲和力咯利普兰结合形式的IC50除以以低亲和力结合咯利普兰的形式的IC50得到的比值)，则它将具有可接受的治疗指数。也就是说，现在可以成功地治疗多种免疫和炎性疾病，而根本不会影响其他的生理现象或影响其至不可接受的程度。此时作为治疗炎性和变应性疾病的方法，最优选的实施方案是抑制低亲和力咯利普兰结合位点。
化合物本发明涉及具有约0.1或更大的IC50比值(高/低结合)的那些化合物。这包括根据本文中列出的每项试验确定是PDE4抑制剂并且在这些或类似测定中证明比值在规定范围内的任何一种和所有化合物；其中特别令人感兴趣的是在本申请提交日之前不在公共域中和/或没有作为PDE4抑制剂进行过测试或已知是PDE4抑制剂的那些化合物。
优选的用于挑选有用的化合物的技术是使用1μM[3H]-cAMP作为底物，在抑制以低亲和力结合咯利普兰的形式的PDE4催化活性的IC50值内，确定一种用于与1nM的[3H]R-咯利普兰竞争对以高亲和力结合咯利普兰的PDE4形式的结合的、具有约0.1的IC50比值或更高的IC50比值的化合物。
在上表I以及美国专利5,448,686、5,605,923和5,552,438中给出了符合IC50比值标准的化合物的实例。这些申请都全文结合在此作为参考，就好象陈述在本文件中一样。
本发明的优选化合物是具有大于0.5的IC50比值的那些，特别是具有大于1.0的比值的那些化合物。优先与低亲和力结合位点结合并具有0.1或更大的IC50比值的结构的例子是化合物诸如顺-[4-氰基-4-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)环己烷-1-羧酸酯]、2-甲氧羰基-4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)环己-1-酮和顺-[4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)环己-1-醇]。
本发明化合物及其药学上可接受的盐可以用治疗指示疾病的标准方式给药，例如口服、胃肠外、舌下、皮肤、经皮、直肠、经吸入或经颊给药。也可以采用控释制剂。
当口服给药时具有活性的本发明化合物及其药学上可接受的盐可以配制成糖浆剂、片剂、胶囊剂、控释制剂或锭剂。糖浆制剂通常由化合物或盐在带有调味剂或着色剂的液体载体例如乙醇、花生油、橄榄油、甘油或水中的悬浮液或溶液组成。当组合物为片剂形式时，可以使用常用于制备固体制剂的任何药物载体。这类载体的实例包括硬脂酸镁、白土、滑石、明胶、阿拉伯胶、硬脂酸、淀粉、乳糖和蔗糖。当组合物为胶囊形式时，任何常规的胶囊化都是合适的，例如使用在硬明胶胶囊外壳中的前述载体。当组合物为软明胶外壳的胶囊形式时，可以考虑常用于制备分散体或悬浮液的任何药物载体，例如含水树胶、纤维素、硅酸盐或油类，并将它们掺入到软明胶胶囊外壳中。
典型的胃肠外组合物由化合物或盐在可选地含有非肠道可接受的油例如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、卵磷脂、花生油或芝麻油的无菌含水或无水载体中的溶液或悬浮液组成。
典型的用于吸入的组合物是可以作为干燥粉末给药的溶液、悬浮液或乳液形式，或者是使用常规推进剂诸如二氯二氟甲烷或三氯氟甲烷的气溶胶形式。
典型的皮肤和经皮制剂包含常规的含水或无水载体，例如膏霜、软膏、洗液或糊剂或者是加入药物的膏药、贴片或膜的形式。
优选组合物为单位剂型，例如片剂、胶囊剂或计量气溶胶剂，以便病人可以单剂投药。
用于口服给药的每剂量单位适当地含有0.3mg至60mg/Kg、优选1mg至30mg/Kg化合物或其药学上可接受的盐。用于治疗COPD的优选剂量包括10mg和15mg/Kg。用于胃肠外给药的每剂量单位适当地含有0.1mg至100mg/Kg化合物或其药学上可接受的盐。用于鼻内给药的每剂量单位适当地含有1-400mg、优选10-200mg/人。局部制剂适当地含有0.01至5.0％的本发明化合物。
活性成分可以一天给药1-6次，足以显示出所需活性。优选活性成分一天给药约1次或2次，更优选一天2次。
当本发明的化合物按照本发明给药时预期没有不可接受的毒理学作用。
提供下列实施例来说明如何构成和使用本发明。它们决不打算以任何方式或任何程度限制本发明的范围。请参阅发明人在下面保留在权利要求书中的内容。
实施例展开以下8项测定，其中5种用于发展支持约0.1或更大的IC50比值的选择的数据。这些测定是刺激兔分离体壁腺产生酸；抑制人嗜中性白细胞中FMLP诱导的脱粒(释放髓过氧化物酶)；抑制豚鼠嗜曙红细胞中FMLP诱导的O2形成；抑制人单核细胞中LPS诱导的TNFα产生；狗产生呕吐；抑制豚鼠的抗原诱导的支气管缩小；小鼠利血平诱导的低体温的逆转；和抑制小鼠的从过继转移的人单核细胞产生LPS诱导的TNFα。这些测定和数据如下所述。
统计学分析为了检验“低亲和力位点PDE4的抑制与这类化合物的抗炎作用有关，而高亲和力位点的抑制与某些副作用的产生有关”这一假设，我们测定了各种PDE4抑制剂在体外和体内阻断炎性细胞功能的能力以及这些化合物在体外和体内模型中产生副作用的能力。为了对比PDE4抑制剂以它们抑制低亲和力结合位点的能力比它们抑制PDE4的高亲和力位点的能力而引起所给治疗作用或副作用的能力，我们通过线性相关(r2)或级系相关(Spearman′s Rho)比较了这些化合物在测定它们针对分离酶催化活性或高亲和力位点的效能的体外或体内测定中的效能。线性相关探索的是化合物在抑制低亲和力位点或高亲和力位点上的效能是否可用于预报引起所给抗炎作用或副作用的能力。级系相关测试的是产生所给抗炎或副作用的级系效能是否与抑制低亲和力或高亲和力位点中的级系效能类似。r2和Spearman′s Rho都使用Macintosh计算机用的STATViewII计算机程序进行计算。
PDE4与咯利普兰高亲和力结合实施例1--磷酸二酯酶和咯利普兰结合测定实施例1A确定分离的人单核细胞PDE4和hrPDE(人重组PDE4)主要以低亲和力形式存在。因此，测试化合物针对低亲和力形式的PDE4的活性可以使用以1μM[3H]cAMP作为底物的有关PDE4催化活性的标准测定来评定(Torphy等，生物化学杂志，第267卷，第3期，1798-1804页，1992年)。
将大鼠脑高速上清液用作蛋白质的来源。将[3H]-咯利普兰的对映体制成比放射性为25.6Ci/mmol。标准测定条件是从公开的与PDE测定条件相同的步骤改进的，只是cAMP的最后50mM Tris HCl(pH7.5)、5mMMgCl2和1 nanoM [3H]-咯利普兰(Torphy等，生物化学杂志，第267卷，第3期，1798-1804页，1992年)。测定在30℃下进行1小时。将反应终止，使用Brandel细胞收获器从游离配体分离出束缚配体。对高亲和力结合位点的竞争在与用于测量低亲和力PDE活性的相同的条件下评定，只是不存在[3H]-cAMP和[3H]5′-AMP。显示在第8页表I中的数据使用实施例1A中描述的方案产生。
实施例1B测量磷酸二酯酶活性PDE活性使用[3H]cAMP闪烁接近测定(SPA)或[3H]cGMP SPA酶测定按照供应商(Amersham Life Sciences)的描述进行测定。反应在室温下在96孔平板中进行，在0.1ml反应缓冲液中进行，该反应缓冲液含有(终浓度)50mM Tris-HCl，pH7.5，8.3mM MgCl2，1.7mM EGTA，[3H]cAMP或[3H]cGMP(大约2000dpm/pmol)，酶和不同浓度的抑制剂。使该测定进行1小时并通过在硫酸锌的存在下加入50μl SPA硅酸钇玻珠使反应终止。摇动平板并使其在室温下静置20分钟。利用闪烁光谱测定法评定放射性标记产物的形成。PDE3和PDE7的活性使用0.05μM[3H]cAMP进行评估，而PDE4使用1μM[3H]cAMP底物进行评估。PDE1B、PDE1C、PDE2和PDE5的活性使用1μM[3H]cGMP底物进行评估。R-咯利普兰结合测定[3H]R-咯利普兰结合测定利用Schneider与合作者的方法的改进方法进行，参见Nicholson等，药物科学趋势，第12卷，19-27页(1991)和McHale等，分子药物学，第39卷，109-113页(1991)。R-咯利普兰与PDE4的催化位点的结合参见Torphy等，分子药物学，第39卷，376-384页(1991)。所以，对[3H]R-咯利普兰结合的竞争提供了对未标记的竞争者的PDE4抑制剂效能的独立的确认。该测定在30℃下在0.5μl缓冲液中进行1小时，该缓冲液含有(终浓度)50mM Tris-HCl，pH7.5，5mMMgCl2，0.05％牛血清白蛋白，2nM[3H]R-咯利普兰(5.7×104dpm/pmol)和不同浓度的非放射性标记的抑制剂。反应通过加入2.5ml冰冷的反应缓冲液(没有[3H]-R-咯利普兰)终止，并通过已用0.3％聚乙烯亚胺浸透的Whatman GF/B滤器进行快速真空过滤(Brandel细胞收获器)。滤器用另外7.5ml的冷缓冲液洗涤，干燥，并经由液体闪烁光谱测定法计数。
实施例2--氨基比林积聚某些甲基黄嘌呤和其他非选择性PDE抑制剂会增加各种物种中的酸分泌。某些选择性PDE4抑制剂，例如咯利普兰和Ro 201724，可增强大鼠体内的酸分泌，特别是当与腺苷酸环化酶的激活剂诸如组胺联合给药时。这种酸分泌的增加伴有组胺诱导的cAMP积聚的上升。对报道的这种信息进行测试以确定是否存在这种现象。化合物诱导酸分泌的能力与它们针对低亲和力位点或高亲和力位点的能力有关系。在这项工作中所用的测定是弱碱-放射性标记的氨基比林的积聚，氨基比林已报道可充当酸分泌增加的生化标记。测定如下进行胃腺制备性别各异的兔子通过颈脱位术处死并将胃取出。从本体上切开粘膜；将胃的颅和窦部分抛弃。胃腺通过Berglindh和Obrink(1976)描述的方法以及Sack和Spenney(1982)描述的方法的改进方法分离。然后将粘膜切碎并用胶原酶消化以分离胃腺。将经过消化的胃腺过滤，洗涤，并再悬浮于1∶15(vol∶vol)的组分如下的培养基中NaCl，132.4mM；KCl，5.4mM；Na2HPO4，5.0mM；NaH2PO4，1.0mM；MgSO4，1.2mM；CaCl2，1.0mM；NaHCO3，12.0mM；兔血清白蛋白，2mg/ml；葡萄糖，2mg/ml；pH为7.4。
氨基比林积聚为了测定酸分泌，将与[14C]-氨基比林、不同浓度的选择性PDE4抑制剂和临界浓度的组胺(0.3-1.0μM)混合的胃腺按照Sack和Spinney(1982)的方法在37℃下在水平摇动器(110循环/分钟)上培养20分钟。然后将样品离心，测定上清液部分和颗粒部分中的放射性。按照Sack和Spenney(1982)的描述计算氨基比林的比例。数据表示为利用最大浓度的组胺(100μM)产生的反应的百分数。通过线形内推法使用所得到的最大反应确定每种化合物的EC50值。
实施例3--评估选择性PDE抑制剂对狗的催吐潜力从动物群得到性别各异的杂种狗(对于每个研究来说n＝5)。禁食过夜后，至少在研究前30分钟给狗喂食1/2罐狗食(Big Bet)。将插管置于一只前腿的头侧静脉中用于给药。在给药实验化合物之前，插管用1ml等渗盐水(0.9％)冲洗。将化合物溶于聚乙二醇和盐水的混合物中，或者溶于100％聚乙二醇，并以1.0-2.0ml/10kg的体积给药。为了确保全部剂量都进入循环，插管用另外的0.5-1.0ml的盐水冲洗。将动物放回到笼中经过1小时的观测期。观测每只狗的干呕或呕吐征兆并记录给药化合物后出现这种行为的时间。在观测期结束时，将动物送回到自己的笼中。每个研究日隔开7天。每种化合物以递增剂量在连续的研究日中对每只狗给药直到观测到催吐作用。此时，将这样的狗退出研究，并仅对仍未有反应的那些狗用更高的剂量进行评估。
按照有关量子剂量应答曲线的文献的记载，数据表示为狗在每种剂量下的反应的累积百分数。使用机率分析计算ED50值。
实施例4--豚鼠嗜曙红细胞测定嗜曙红细胞的分离和纯化雄性(Hartley，Hazelton Labs)豚鼠在使用前每周注射1ml马血清，持续4-6周。注射马血清至少24小时后动物用氯胺酮/赛拉嗪混合物(88mg；12mg/ml；0.4ml/kg)麻醉。导致麻醉后，腹腔用50ml温热的无菌盐水(0.9％)灌洗。灌洗液使用14G导管收集到50ml圆锥形塑料离心试管中。使豚鼠从麻醉中恢复并可在2周的休息期后再次使用。
细胞通过离心(400xg，10分钟)从灌洗液中分离并再悬浮于35ml磷酸缓冲盐水(PBS)并用10ml等渗珀可(1.075g/ml)作为基底。该悬浮液以300xg离心30分钟。主要含有嗜曙红细胞和红细胞的颗粒状物用PBS洗涤，将红细胞裂解。将这些细胞再悬浮于含有20％FBS的RPMI 1640培养基中并在37℃下在湿润的5％CO2培养箱中培养过夜。第二天，将细胞洗涤并再悬浮于PBS中用于测定细胞活力(台盼蓝分离)和纯度。
过氧化物阴离子的产生(O2)将纯化的嗜曙红细胞(活力＞95％，纯度＞90％)以1-2×106细胞/ml的浓度再悬浮于带有20mM HEPES缓冲液(pH7.4)和0.1％明胶的PBS中。将嗜曙红细胞(1×105)加入到96孔平板中，并在37℃下培养大约1小时。在反应开始之前10分钟加入PDE4抑制剂。反应通过在不存在或存在60单位的超氧化物歧化酶(SOD)的条件下加入细胞色素C(160μM)和甲酰Met-Leu-Phe(fMLP)(30nM)引发。在Dynatech MR 7000平板阅读器上在不同时期以630nm参照在550nm处监测细胞色素C的减少。O2-产生率利用线性回归分析使用在不存在或存在SOD时在若干个时间点的各孔的净吸收度测定。结果表示为对基础释放进行了修正的O2-的对照产生百分数。观测到的正弦最大抑制为60％，log IC30使用浓度的线形内推法和括号中括入30％来计算。
实施例5--豚鼠的支气管缩小雄性Hartley豚鼠(200-250g/4周，Hazelton Research，Denver，PA)通过在第1天和第4天向每条大腿中I.M.注射0.35ml 5％(w/v)的卵清蛋白/盐水溶液(共0.7ml)致敏。25天后可以使用这些豚鼠。
实验步骤对卵清蛋白非常敏感的雄性Hartley豚鼠(600-800g Hazelton)在手术前大约10-15分钟用戊巴比妥钠(40mg/kg I.P.)麻醉。在颈静脉、颈动脉和气管插管(分别是Deseret Intracath Vialon聚合物树脂不透射线的导管(Deseret Medical公司，Sandy，UT)22GA和19GA，以及PE管260)用于给药、监控血压和换气。实施两侧迷走神经切断术以将胆碱能干涉减至最小。动物经由哈佛大学啮齿动物呼吸罩(Harvard Rodent Respirator)(683型，Harvard Apparatus，South Natick，MA)麻痹(泮库溴铵，0.1mg/kgi.v.)和换气(45次呼吸/分钟)。气管压力变化经由带有Elcomatic传感器(Buxco Electronics，Sharon，CT)的气管插管的侧臂进行测量。设定换气冲击体积使产生8cm H2O的侧臂压力(大约5cc室内空气)。血压用StathamP23XL身体压力传感器(Viggo-Spectramed，Oxnard，CA)测量。压力记录在Grass 7D型多种波动描记器(Grass Instrument Co.，Quincy，MA)上。整个实验中动物在热工作台上保暖以维持体温。
测试化合物或载体在抗原刺激前10分钟经i.v.途径给药。在0时，经i.v.途径给药0.1mg/kg卵清蛋白。在抗原反应达到最高点时，再i.v.给予另外的抗原0.2mg/kg卵清蛋白。当达到对累积0.3mg/kg卵清蛋白的最高抗原反应后，i.v.给药饱和KCl溶液1cc/kg，产生最大支气管缩小。
实施例6--在体外研究中人单核细胞中LPS诱导的TNFα的抑制为了确定TNFα抑制是否与LPDE4或HPDE4的抑制有关，就一系列具有对LPDE4和HPDE4的一定范围的效能的PDE4抑制剂在体外在用脂多糖类(LPS)刺激的人单核细胞中抑制TNFα产生的能力进行筛选。用于这种筛选的初生人细胞据信是非常重要的，不同的物种在LPDE4和HPDE4对炎性细胞中cAMP水解的相对贡献方面似乎有很大的不同。
方法TNFα抑制在人外周血液单核细胞中评定，该单核细胞是从新得到的来自正常人供体的血液的暗黄色膜或血浆-移动残余物纯化(Collata)的。将单核细胞以1×106细胞/ml培养基/孔的密度铺在24孔多用途培养皿中。使细胞附着1小时，之后吸出上清液并加入1ml新鲜培养基(含有1％胎牛血清和10U/ml青霉素/链霉素的RPMI-1640)。细胞在有或没有1nM至1mM浓度的测试化合物的条件下培养45分钟，之后加入LPS(大肠埃希氏菌055B5，Sigma Chemicals)使终浓度为100ng/ml。将测试化合物溶解并用50∶50浓度的二甲亚砜/乙醇稀释，使单核细胞培养基中最后的溶剂浓度为0.5％二甲亚砜和0.5％乙醇。在37℃/5％CO2下培养14-16小时后从单核细胞得到培养物上清液，并以100xG离心以除去细胞碎片。立即进行细胞因子测定，或者将培养物上清液在-70℃下储存直至用于测定。
TNFα的浓度使用以鼠单克隆抗人TNFα抗体(参见下文)作为捕捉抗体并以多克隆兔抗人TNFα作为次级抗体的ELISA(Winston)进行测量。对于检测，加入过氧化物酶缀合山羊抗兔(Boehringer Mannheim，Cat.#605222)后接着加入过氧化物酶的底物(带有0.1％过氧化脲的1mg/ml邻苯二胺)。样品中的TNFα浓度从用在大肠埃希氏菌中产生的重组人TNFα生成的标准曲线进行计算。人TNFα的单克隆抗体利用Kohler和Millstein方法(自然，第256卷，495-497页，1975年)的改进方法从用重组人TNFα免疫的BALB/c小鼠的脾制备。多克隆兔抗人TNFα抗体通过用在完全弗氏佐剂中乳化的重组人TNFα反复免疫的新西兰白兔制备。
过继腹膜炎模型中人TNFα产生的体内抑制方法从未服用任何一种药物的健康志愿者抽取二分之一单位的肝素化静脉全血。多形核白细胞通过将血液在25℃下以800xg离心30分钟而在Histopaque-1077上分层来分离。收获淋巴细胞/单核细胞部分并用没有Ca2+和Mg2+的DPBS(Dulbecco磷酸缓冲盐水)在25℃下以1000rpm离心10分钟洗涤2次。将颗粒再悬浮于5ml没有Ca2+和Mg2+的DPBS，在25℃下在用没有血清的RPMI 1640培养基制备的5ml珀可溶液上分层，并在25℃下以550xg离心30分钟。取出单核细胞的上浮层并用没有Ca2+和Mg2+的DPBS在25℃下以1000rpm离心10分钟洗涤2次。将最后经过洗涤的分离的单核细胞以6-10×106细胞/ml在25℃下悬浮于没有Ca2+和Mg2+的DPBS中。还利用相同的步骤从Source Leukocytes包装分离单核细胞。单核细胞制剂的浓度范围是从65至90％单核细胞，且细胞的活力大于97％(台盼蓝分离)。
4或5组BALB/c小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)保持在持久屏障的实施中。年龄相同且重达18-25g的小鼠使用带有23ga针头的注射器以轻微压力向腹膜中注射0.5ml 6-10×106单核细胞/ml，以使单核细胞受到最小的剪切力和应力。在接受单核细胞的2分钟内，小鼠通过口服给药15分钟载体或化合物进行处理。然后给动物腹膜内注射(i.p.)溶解在没有Ca2+和Mg2+的DPBS中的0.2ml 125mg/ml内毒素(大肠埃希氏菌，W型，Difco)。2小时后，动物利用二氧化碳窒息处死并i.p.注射1.5ml没有Ca2+和Mg2+的DPBS(4℃)。轻轻按摩腹膜，取出洗涤物并置于在冰浴中的聚丙烯试管中。样品通过离心(12,500xg，4℃下5分钟)使澄清。将上清液移到新的试管中(可以储存在-20℃下)并通过ELISA测定人和小鼠的TNFα。ED50值利用标准方法计算。
实施例7--人嗜中性白细胞方法分离和纯化嗜中性白细胞(PMN)使用菲可(Histopaque 1077)通过梯度离心从肝素化血液分离，接着进行葡聚糖沉降以除去红细胞。任何残余的红细胞用水溶解30秒钟并使用10X DB-PBS(w/o Ca2+或Mg2+)恢复等渗性。PMN通过离心分离并再用1X DB-PBS洗涤1次，之后测定细胞数和活力(台盼蓝染料分离)。细胞数根据个体供体调节至0.75-1.5×106细胞/ml。
脱粒(释放髓过氧化物酶)上述细胞悬浮液样品(0.1ml)在含有20mM HEPES缓冲液(pH＝7.4)和0.1％明胶的Earles平衡盐溶液中在5μg/ml细胞松弛素B的存在下在摇动水浴中在37℃下培养5分钟。细胞在加入fMLP(30nM)之前用不同浓度的选择性PDE4抑制剂和PGF2(3-10nM)再预先处理5分钟。加入fMLP并继续再培养30分钟。通过将样品置于冰上使反应终止，之后进行离心。取出上清液部分并冷冻储存(-30℃)直到用于测定髓过氧化物酶活性。
髓过氧化物酶活性的测定髓过氧化物酶活性使用邻联茴香胺作为底物、辣根过氧化物酶作为标准物来测定。上清液样品(50μl)用存在于50mM磷酸钠缓冲液(pH6.0)中的100μl底物(o-联茴香胺，0.53mM；H2O2，0.147mM；终浓度)培养。通过加入50μL 4M H2SO4使反应终止。产物的形成通过测量410nm下的吸收度来测定，使用辣根过氧化物酶通过与标准曲线对照测定活性。数据表示为控制百分数(在单独的PGF2的存在下释放的髓过氧化物酶的量)。由于对于大多数化合物来说观测到的最大抑制为30％，所以log(IC15)值使用括号中括入15％的浓度的线形内推法计算。
实施例8--小鼠的利血平诱导的低体温的逆转将雄性CF-1或BALB/c小鼠单独地分离在铁丝笼中。在用利血平预处理(10mg/kg，i.p.)前记录每只小鼠的直肠温度。注射利血平4小时后记录直肠温度，每只动物给药不同剂量(口服)的测试化合物、载体或咯利普兰(10mg/kg)。然后每30分钟记录一次直肠温度，记录2小时。数据表示为从在注射利血平后4小时观测的温度开始出现的温度变化(温度下降到低于基础水平大约10-15℃)。使用在治疗90或120分钟时记录的温度变化构建剂量-应答曲线。ED50值通过6-9只动物的均值的机率分析或线性回归确定。为了比较化合物逆转利血平诱导的低体温的能力和它们抑制低亲和力结合或高亲和力结合的能力，将ED50和IC50值表示为-log(值)。
实施例9--生物功能和PDE4抑制之间的关系为了确定PDE4抑制的某些生物作用是否与LPDE4或HPDE4的抑制有关，使用线性相关和级系相关对化合物产生作用的能力与化合物抑制LPDE4或HPDE4的能力进行比较。这些相关性可以受到几种因素的影响1)化合物的稳定性；2)化合物进行细胞的能力；3)在体内研究中，化合物的生物利用度；4)相关性值，尤其是线性相关对效能的差异敏感，效能值的范围越大，就越容易测量到明显的线性相关。当分析和汇总各种测定系统中LPDE4或HPDE4的抑制与生物功能之间的相关性时，要对这些警告加以考虑。
使用分离的炎性细胞，在豚鼠嗜曙红细胞中单核细胞TNFα产生的抑制和过氧化物产生的抑制与LPDE4的抑制而不是HPDE4的抑制更相关。另外，体内抗原诱导的支气管缩小的预防与LPDE4抑制的相关性好于与HPDE4抑制的相关性。在这种体内模型中，PDE4抑制剂似乎通过阻止肥大细胞脱粒起作用(Underwood等，正在印刷)。但是，炎性细胞功能的抑制并不总是与LPDE4的抑制有关，因为现已发现嗜中性白细胞脱粒的抑制与HPDE4抑制的相关性优于与LPDE4抑制的相关性。因此，看来有些而不是全部炎性细胞活性的抑制与LPDE4的抑制相关。与此对照，酸分泌的增强、呕吐的产生和利血平诱导的低体温的逆转(PDE4抑制剂亲精神潜力的量度)与HPDE4的抑制而不是LPDE4的抑制更好地相关。因此，这类化合物的大多数潜在的副作用与HPDE4的抑制相关联。
于是这些发现提示优先抑制LPDE4的化合物将产生有益的抗炎作用同时减少了引起不希望的副作用的可能性。因此，用以高亲和力结合咯利普兰的PDE4催化形式的IC50除以以低亲和力结合咯利普兰的PDE4催化形式的IC50值得到IC50比值(HPDE4/LPDE4)，选择IC50比值约为0.1或更大的化合物应当导致它们的治疗指数增加，即有益健康的作用最大化而有害作用最小化。
为了确定这种选择方式是否的确能鉴别出治疗指数提高的化合物，对比较治疗作用与副作用的三种模型进行评估。这包括在体外对比化合物抑制从分离的人单核细胞产生TNFα的能力和它们刺激分离的兔体壁腺中酸分泌的能力，以及两个在体内对比检验化合物阻止豚鼠的抗原诱导的支气管缩小的能力和引起狗呕吐的能力以及对比化合物在过继转移小鼠模型中抑制TNFα产生的能力和它们逆转小鼠的利血平诱导的低体温的能力。
选择性比值(HPDE4/LPDE4)等于或大于0.1的PDE4抑制剂显示出明显提高的治疗指数。例如，顺-[4-氰基-4-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)环己烷-1-羧酸酯]、2-甲氧羰基-4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)环己-1-酮和顺-[4-氰基-4-(3-环丙基甲氧基-4-二氟甲氧基苯基)环己-1-醇]都具有≥0.1的选择性比值，与原型PDE4抑制剂R-咯利普兰相比，它们的治疗指数提高了100倍。因此，这证明了使用HPDE4IC50/LPDE4 IC50≥0.1这样的选择方式在体外对比中鉴别出了具有提高的治疗指数的化合物。
至于治疗COPD，对患有COPD的人给药化合物顺-[4-氰基-4-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)环己烷-1-羧酸酯]。这些受治疗者表现出炎症减少、支气管扩张和肺神经调节。
权利要求
1.通过给药优先抑制以低亲和力结合R-咯利普兰的PDE4催化形式的PDE4特异性抑制剂来预防或治疗人COPD的方法，该方法包括对需要其的受治疗者给药有效量的除顺-[4-氰基-4-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)环己烷-1-羧酸酯]以外的IC50比值为约0.1或更大的化合物，所述比值由以高亲和力结合R-咯利普兰的PDE4催化形式的IC50除以以低亲和力结合R-咯利普兰的催化形式的IC50得到。
2.权利要求1的方法，其中抑制剂具有约0.1或更大的IC50比值，所述比值为与1nM[3H]R-咯利普兰竞争结合以高亲和力结合咯利普兰的PDE4形式的IC50值和使用1μM[3H]-cAMP作为底物抑制以低亲和力结合咯利普兰的形式的PDE4催化活性的IC50值的比值。
3.权利要求1或2的方法，其中所述IC50比值为0.5或更大。
4.权利要求1-3任何一项所述的方法，其中所述IC50比值为1.0或更大。
5.PDE4特异性抑制剂在制备用于预防或治疗COPD的药物中的用途，其中该抑制剂为除顺-[4-氰基-4-(3-环戊氧基-4-甲氧基苯基)环己烷-1-羧酸酯]以外的IC50比值为约0.1或更大的化合物，所述比值由以高亲和力结合R-咯利普兰的PDE4催化形式的IC50除以以低亲和力结合R-咯利普兰的催化形式的IC50得到。
6.按照权利要求5的用途，其中该抑制剂具有约0.1或更大的IC50比值，所述比值为与1nM[3H]R-咯利普兰竞争结合以高亲和力结合咯利普兰的PDE4形式的IC50值和使用1μM[3H]-cAMP作为底物抑制以低亲和力结合咯利普兰的形式的PDE4催化活性的IC50值的比值。
7.按照权利要求5或6的用途，其中所述IC50比值为0.5或更大。
8.按照权利要求5-7任何一项所述的用途，其中所述IC50比值为1.0或更大。
全文摘要
本发明涉及通过给药具有确定治疗比率的PDE4抑制剂来预防或治疗COPD的方法。
文档编号A61K31/519GK1349403SQ00806912
公开日2002年5月15日 申请日期2000年3月1日 优先权日1999年3月1日
发明者S·B·克里斯滕森四世, M·S·巴尼特, T·J·托尔菲 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司