抗血栓剂的制作方法

专利名称：抗血栓剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及与人凝固因子或辅因子相结合的单克隆抗体(mAbs)和其作为血栓形成抑制剂的用途。
背景技术：
在正常情况下，血管内膜血管内皮细胞的损伤，无论损伤大小，将通过通常称为凝血″级联反应(cascade)″的一系列事件而触发止血反应。该级联反应以使可溶性纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白而达到极点，不溶性纤维蛋白与血小板一起形成局部血凝块或者血栓，血凝块或血栓阻止血液组分外渗。然后，随着血凝块溶解和血管完整性修复以及血流恢复而出现伤口愈合。
在受伤和血凝块形成之间发生的事件，受到一系列反应的精细调节和联接。简言之，大量以无活性酶原形式的血浆凝血蛋白和辅因子在血液中循环着。活性酶复合物在受损伤位点装配起来，继而激活丝氨酸蛋白酶，伴随有各个连续的丝氨酸蛋白酶催化后续酶原成为活化蛋白酶。此酶级联反应导致每一步骤均放大后继步骤的效应。关于凝血级联反应的概述，参见″Thombosis and Hemorrhage″，J.Loscalzo和A.Schafer，编著，BlackwellScientific Publications，Oxford，England(1994)一书的第一章。
虽然有效的血凝限制了损伤部位的血液损失，但血栓在静脉或动脉的不适当形成是残障和死亡的常见原因。异常凝血活性可以导致和/或源自病理或治疗，诸如心肌梗塞、不稳定型心绞痛、房性纤颤、中风、肾脏损害、经皮冠状动脉腔内成形术、播散性血管内凝血、败血症、肺栓塞和深静脉血栓形成。血凝块在人造器官、分流器和假体如人工心脏瓣膜外表面的形成也是成问题的。
中风，是导致死亡的主要原因，是造成永久性残废的常见原因。导致中风神经缺陷的急性灶性脑缺血，最频见于由血栓栓塞引起。血栓可由心源性病变和动脉粥样斑产生。原位血栓形成可发生于大的、脑外的脑供血血管。研究提示，脑动脉闭塞后存在一个有限时间间期，超过该间期，则发生明显的不可逆的神经元损伤和持久的神经缺陷。参见Stroke TherapyBasic，Preclinical，and Clinical Directions，ed.L.P.Miller，Wiley-Liss，Inc.(1999)一书的第14章第355-381页。
目前，批准用于这些病理和其它血栓形成性及栓子性病症治疗的抗凝剂，包括硫酸化杂多糖肝素和低分子量(LMW)肝素。这些药物经胃肠外给药，通过激活凝血酶抑制剂、抗凝血酶III并使全部凝血因子失活而引起快速、完全的凝血抑制反应。
然而，由于潜伏期的存在，肝素和LMW肝素有其缺点。作为单纯压迫动作和伴随的与物理物体接触结果的失控性出血或者在手术部位的失控性出血，是主要的并发症，并在1～7％接受连续输液患者和8～14％接受间断快速浓注的患者中观察到了并发症。为了使这些风险降至最小，不断地采集血液样本以便能够持续监测体外凝血时间，这在实质上增加了治疗成本并且给患者带来不便。
另外，达到所需有效水平而不置患者于冒出血风险境地的治疗目标范围是狭窄的。该治疗范围是大约1至小于3(g肝素/ml血浆，它导致激活的部分凝血激酶时间(aPTT)测定时间约35至约100秒。将肝素浓度提高至超过目标范围3(g/ml和浓度大于4(g/ml，则测不到凝血活性。因此，必须给予密切关注以保证患者的血浆浓度在治疗范围之内。
另一获得批准的具有缓慢和长效作用的抗凝剂是华法令(warfarin)，是一种香豆素衍生物。华法令通过与凝血酶原维生素K依赖性翻译后修饰和其它维生素K-依赖性凝血因子竞争而发挥作用。
在抗凝作用的一般情形下，对于华法令、肝素及LMW肝素来说，在稍高于治疗范围的浓度时，可以见到血液表现为不凝结。
在急性心肌梗塞(MI)时，溶栓治疗的主要目标包括梗塞血管的早期和持久再灌注。急性MI的现行疗法，既包括纤溶酶原激活物如组织纤溶酶原激活物(tPA)或链激酶，也包括抗凝剂如未分级肝素、低分子量肝素或直接凝血酶抑制剂或者抗血小板剂如阿司匹林或血小板糖蛋白IIb/IIIa阻断剂。参见Topol，Am Heart J，136，S66-S68(1998)。这些治疗的联合，是基于这样的观察凝块形成和溶解是动态过程，而凝血酶活性和生成在闭塞性血栓形成之后以及在凝块溶解期间和之后仍在继续。见Granger等，J Am CollCardiol，31，497-505(1998)。
治疗急性MI的最适策略依然难以捉摸，可利用的制剂和治疗方案则显示出正负两方面的特性。举例来说，纤维蛋白-结合的凝血酶对于肝素所致的抑制作用不敏感(Becker等，″Chemistry and Biology of Serpins″，PlenumPress，New York(1997)一书的第6章)，而停止肝素治疗后凝血酶活性则表现出反弹性增加，于是观察到中止肝素后24小时内再梗塞增加。见Watkins等，Catheterization and Cardiovascular Diagnosis，44，257-264(1998)andGranger，Circulation，91，1929-1935(1995)。而且，抗血小板剂可能伴发出血或血小板减少症。
再有，大量临床试验业已证实，高剂量溶栓剂导致血浆止血标志(hemostatic marker)显著改变。见Rao等，J Clin Invest，101，10-14(1988)；Bovill等，Ann Int Med，115，256-265(1991)；Neuhaus等，J Am Coll Cardiol，19，885-891(1992)。尽管提高tPA浓度造成血凝块溶解增加，但是这些止血标志的改变反映出溶栓治疗不利之处的增大，特别是严重出血的发生。
在血栓栓塞性中风的情况下，在出现中风症状的早期(3小时内)实施溶栓治疗以预防不可逆损害。目前许可用于局部缺血和/或梗塞组织再灌注的溶栓剂，包括纤溶酶原激活物tPA、尿激酶和链激酶。然而，溶栓治疗与严重的出血倾向有关，在血栓栓塞性中风的溶栓治疗中，主要担心的是治疗将通过诱发出血而使局部缺血性损伤恶化。
很显然，存在着对在控制栓塞性病症中有效、同时又保持止血功能的抗血栓剂的需求。
发明概述本发明一方面，是治疗动物血栓栓塞后诱发的局部缺血的方法，包括施用抗-因子IX抗体或抗体片段。
本发明另一方面，是治疗动物血栓栓塞后诱发的局部缺血的方法，包括联合施用抗-因子IX抗体或抗体片段和纤溶酶原激活物。
本发明的再一方面，是在动物血栓栓塞后诱发局部缺血的治疗中降低所需溶栓剂剂量的方法，包括联合施用抗-因子IX抗体或抗体片段和溶栓剂。
本发明还一方面，是预防动物血栓栓塞性中风的方法，包括对具有发生血栓栓塞性中风风险的动物施用抗-因子IX抗体或抗体片段。
附图简述

图1是描述含有鼠抗-因子IX mAbs BC1和BC2的正常人血浆滴定实验结果的图。
图2是描述含鼠抗-因子IX mAbs 9E4(2)F4和11G4(1)B9的正常人血浆滴定的实验结果的图。
图3是描述含鼠抗-因子X mAbs HFXHC和HFXLC以及鼠抗-因子XImAb HFXI的正常人血浆滴定的实验结果的图。
图4是描述在大鼠颈动脉血栓形成模型中肝素、乙酰水杨酸和鼠因子IX mabs于60分钟时对激活的部分凝血激酶时间(aPTT)影响的实验结果的直方图。
图5是描述在大鼠颈动脉血栓形成模型中肝素、乙酰水杨酸和鼠因子IX mabs于60分钟时对凝血酶原时间影响的实验结果的直方图。
图6是描述大鼠颈动脉血栓形成模型中肝素、乙酰水杨酸和鼠因子IXmabs对颈动脉血流的闭塞影响的实验结果的直方图。
图7是描述在大鼠颈动脉血栓形成模型中肝素、乙酰水杨酸和鼠因子IX mabs对血栓重量影响的实验结果的直方图。
图8是描述在大鼠颈动脉血栓形成模型中肝素、鼠因子IX mab BC2、嵌合因子IX mab和人源化因子IX mAbs于60分钟时对aPTT影响的实验结果的直方图。
图9是描述在大鼠颈动脉血栓形成模型中肝素、鼠因子IX mab BC2、嵌合因子IX mab和人源化因子IX mAbs对血栓重量影响的实验结果的直方图。
图10是描述抗-因子IX mab和肝素对tPA-介导的再灌注影响的实验结果的直方图。
图11描述抗-因子IX mab和肝素对颈动脉脉管开放作用(patency)影响的实验结果的直方图。
图12是描述抗-因子IX mab和肝素对恢复血流时间影响的实验结果的直方图。
图13描述tPA对止血参数、纤维蛋白原、纤溶酶原和抗纤溶酶的影响。
图14描述tPA、肝素和抗-因子IX mab对aPTT的影响。
图15描述在血栓栓塞性中风中tPA、SB 249417、tPA与SB 249417联合对合计的(aggregate)平均梗塞体积的影响。
发明详述在本说明书中引证的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，均如前面那样引入本文作为参考。
本发明提供针对凝血因子的多种抗体、改变的抗体及其片段，它们以自限性中和活性(self-limiting neutralizing activity)为特征。优选地，凝血因子来自固有的或普通的凝血途径。更优选，抗-凝血因子抗体是抗-因子IX、抗-因子IXa、抗-因子X、抗-因子Xa、抗-因子XI、抗-因子XIa、抗-因子VIII、抗-因子VIIIa、抗-因子V、抗-因子Va、抗-因子VII、抗-因子VIIa、抗凝血酶或抗-凝血酶原。尤其优选的是抗-因子IX抗体。例举的抗-凝血因子抗体，是针对人因子IX的人源化单克隆抗体SB 249413、SB 249415、SB249416、SB 249417、SB 257731和SB 257732，针对人因子IX的嵌合单克隆抗体chαFIX、针对人因子IX和/或因子IXa的鼠单克隆抗体BC1、BC2、9E4(2)F4，和11G4(1)B9，或者分别针对人因子X和XI的小鼠单克隆抗体HFXLC和HFXI。尤其优选的是抗-人因子IX单克隆抗体SB 249417。
通过惯常的杂交瘤技术、噬菌体展示组合文库、免疫球蛋白链改组和人源化技术以产生新的自限性中和抗体，可以制备本发明抗体。还包括在内的是具有自限性中和活性的全长人mAbs。这些产物对于与下述有关的血栓性和栓子性病症的治疗和药物组合物非常有用心肌梗塞、不稳定型心绞痛、房性纤颤、中风、肾脏损害、肺栓塞、深静脉血栓形成、经皮腔内冠状血管成形术、播散性血管内凝血、败血症、人造器官、分流器或假体。
本文所用术语″自限性中和活性″，是指能与人凝血因子、优选是来自固有和普通途径的凝血因子相结合并以使得产生凝血的有限调变(limitedmodulation)之方式抑制血栓形成的抗体的活性，所述凝血因子包括因子IX/IXa、X/Xa、XI/XIa、VIII/VIIIa和V/Va、VII/VIIa和凝血酶/凝血酶原。″凝血的有限调变″定义为凝血时间增加(通过激活的部分凝血激酶时间(activated partial thromboplastin time，aPTT)延长测得)，尽管单克隆抗体浓度增加血浆却保持aPTT达到其最大值的可凝性。凝血的此种有限调变，与增加肝素浓度时血浆呈现不凝性并显示无限aPTT的情形形成对照。优选地，本发明方法的最大aPTT值落入肝素治疗范围之内。最优选地，最大aPTT在约35秒至约100秒范围内，此相当于正常对照aPTT值的约1.5～约3.5倍。在本发明一个实施方案中，aPTT延长而没有显著的凝血酶原时间(PT)延长。
术语″联合″，是指单个疗程中一种治疗剂在施用另一种治疗剂之前、之后或者与之一同施用。
″改变的抗体″，是指由改变了的免疫球蛋白编码区编码的蛋白，它可以通过在一个选择的宿主细胞中进行表达而获得。此类改变的抗体是基因工程抗体(例如，嵌合的或人源化抗体)或者缺少全部或部分免疫球蛋白恒定区的抗体片段，例如Fv、Fab、Fab′或F(ab′)2等。
″改变的免疫球蛋白编码区″，是指编码本发明改变的抗体的核苷酸序列。当改变的抗体是CDR-移植的或人源化抗体时，将编码非-人免疫球蛋白免疫球蛋白互补决定区(CDRs)的序列插入到含有人可变框架区序列的第一个免疫球蛋白配偶体(partner)中。任选地，第一个免疫球蛋白配偶体可操作地与第二个免疫球蛋白配偶体相连接。
″第一个免疫球蛋白配偶体″，是指编码人框架区或者人免疫球蛋白可变区的核苷酸序列，在所述区中，天然(或天然发生的)CDR-编码区被供体抗体的CDR-编码区所替换。人可变区可以是免疫球蛋白重链、轻链(或者重、轻二链)、其类似物或功能片段。此类位于抗体(免疫球蛋白)可变区内的CDR区，可以用本领域已知的方法予以测定。譬如，Kabat等在″Sequences ofProtein of Immunological Interest″，4th Ed.，U.S.Department of Health and人Services，National Institutes of Health(1987)中，公开了寻找CDRs的原则。另外，已知计算机程序对于确定CDR区/结构非常有用。
″第二个免疫球蛋白配偶体″，是指编码蛋白或肽的另一核苷酸序列，第一个免疫球蛋白配偶体就是与该第二个免疫球蛋白配偶体在框架融合或者通过任选的传统的接头序列相融合(即，可操作地联接)。优选地，它是免疫球蛋白基因。第二个免疫球蛋白配偶体可包括编码相同(即同源的，第一和第二改变的抗体来源相同)或另一(即异源的)目的(interest)抗体整个恒定区的核苷酸序列。它可以是免疫球蛋白重链或轻链(或者作为单个多肽一部分的重、轻二链)。第二个免疫球蛋白配偶体并不局限于具体免疫球蛋白种类或者同种型。而且，第二个免疫球蛋白配偶体可包括免疫球蛋白恒定区的一部分，诸如在Fab，或F(ab)2(即，适当人恒定区或框架区的不连续部分)中发现的那些。此免疫球蛋白配偶体也可包括编码暴露在宿主细胞外表面的膜内在蛋白的序列(例如作为噬菌体展示文库的一部分)，或编码分析或诊断检测所用蛋白的序列(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶)等。
术语Fv、Fc、Fd、Fab、Fab′或F(ab′)2使用其标准含义，参见Harlow等，in ″AntibodyA Laboratory Manual″，Cold Spring HarborLaboratory，(1988)。
如本文所用的那样，″基因工程抗体”描述一类改变的抗体，即全长合成抗体(例如与抗体片段相对的嵌合或人源化抗体)，其中所选受体抗体的轻链和/或重链可变域的一部分被来自一个或多个供体抗体的类似部分替换，所述供体抗体对所选抗原表位具有特异性。举例来说，此类分子可包括以人源化重链与未修饰轻链(或嵌合轻链)结合(或反之亦然)为特征的抗体。基因工程抗体也可以改变编码受体抗体轻链和/或重链可变域框架区的核苷酸序列以便保持供体的抗体结合特异性为特征。这些抗体可包括用来自本文所述供体抗体的CDRs替换来自受体抗体的一个或多个或CDRs(优选所有CDRs)。
″嵌合抗体″，是指一类含有与源自受体抗体轻链和重链恒定区相结合的源自供体抗体的天然存在可变区(轻链和重链)的基因工程抗体。
″人源化抗体″，是指一类具有源自非-人供体免疫球蛋白CDRs、分子的其余免疫球蛋白衍生部分来自一种或多种人免疫球蛋白的基因工程抗体。另外，框架支持残基可以改变以保存结合亲合性。参见例如Queen等，ProcNatl Acad Sci USA，86，10029-10032(1989)，Hodgson等，Bio/Technology，9，421(1991)。
术语″供体抗体″，是指为第一免疫球蛋白配偶体贡献其可变区、CDRs或其功能片段或其类似物的核苷酸序列，以便提供改变的免疫球蛋白编码区并导致表达具有供体抗体的抗原特异性和中和活性的改变抗体的单克隆或重组抗体。适用于本发明的一个供体抗体是命名为BC2的鼠自限性中和单克隆抗体。其它适宜供体抗体包括命名为BC1、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC和HFXI的鼠自限性中和单克隆抗体。
术语″受体抗体″，是指与供体抗体异源的的单克隆或重组抗体，它为第一免疫球蛋白配偶体提供编码其重链和/或轻链框架区和/或其重链和/或轻链恒定区的全部或部分的核苷酸序列。优选地，人抗体是受体抗体。
″CDRs″定义为抗体互补决定区氨基酸序列，它们是免疫球蛋白重链和轻链的超变区。参见例如Kabat等，″Sequences of Protein of ImmunologicalInterest″，4th Ed.，U.S.Department of Health and human Services，NationalInstitutes of Health(1987)。在免疫球蛋白的可变部分，有3个重链和3个轻链CDRs或CDR区。因此，本文中″CDRs″是指所有3个重链CDRs，或所有3个轻链CDRs或者所有的重链和轻链CDRs，如果合适的话。
CDRs为抗体与抗原或者抗原表位结合提供大多数接触残基。本发明目标CDRs来自于供体抗体可变重链和轻链序列，并包括天然存在CDRs的类似物，所述类似物也具有或者保持所衍自的供体抗体相同的抗原结合特异性和/或中和能力。
″具有抗原结合特异性或者中和能力″，是指例如，尽管mAb BC2以一定水平的自限性中和活性为特征，但是由适宜结构环境中BC2核苷酸序列编码的CDR可以具有低的或者高的活性。预计BC2的CDRs在该环境中仍然与BC2一样识别相同的表位(一个或多个表位)。
″功能片段″是保持与所来自的抗体相同抗原结合特异性和/中和活性的部分重链或轻链可变序列(例如，免疫球蛋白可变区氨基或羧基末端小的缺失)。
″类似物″是由至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，其中所述修饰可以是化学修饰或者是少数氨基酸(即不超过10个氨基酸)取代或重排，所述修饰允许氨基酸序列保持未修饰序列的生物学特性，例如抗原特异性和高亲合性。例举的类似物包括通过取代建构，从而在CDR-编码区内或编码区附近产生一定的核酸内切酶限制性酶切位点的沉默突变。
类似物也可以等位变异(allelic variations)的方式出现。″等位变异或修饰″是编码本发明氨基酸或肽序列的核苷酸序列的改变。此变异或修饰可以缘于遗传密码的简并或者是特意进行工程改造的，以提供所需的特性。这些变异或修饰可以致使或者不致使任何编码的氨基酸序列发生改变。
术语″效应剂″，是指非-蛋白载体分子，所述改变的抗体、和/或天然或合成的供体抗体轻链或重链或供体抗体的其它片段通过常规手段与之结合。此类非-蛋白载体可包括诊断领域中使用的常规载体，例如聚苯乙烯或其它塑料珠，多糖，例如BIAcore(Pharmacia)系统中所用的，或者在医疗领域中有用的和对人与动物施用安全的其它非-蛋白物质。其它效应剂可包括螫合重金属原子或放射性同位素的大环化合物(macrocycle)。此类效应剂对增加改变的抗体的半衰期是有用的，例如聚乙二醇。
为用于构建本发明抗体、改变抗体及片段，可使用非-人种属如牛、羊、猴、鸡、啮齿类(例如鼠和大鼠)以产生通过人凝血因子，优选因子IX/IXa、X/Xa、XI/XIa、VIII/VIIIa、V/Va、VII/VIIa或凝血酶/凝血酶原或来自它们的肽表位进行呈递所需的免疫球蛋白。使用常规的杂交瘤技术以提供将非-人mAb分泌为各自的凝血因子的杂交瘤细胞株。然后，如实施例部分所描述的那样，使用包被96-孔板的因子IX/IXa、X/Xa、XI/XIa、VIII/VIIIa、V/Va、VII/VIIa或凝血酶/凝血酶原，或者使用与抗生蛋白链菌素包被的板相结合的生物素酰化因子IX/IXa、X/Xa、XI/XIa、VIII/VIIIa、V/Va、VII/VIIa或凝血酶/凝血酶原，进行此类杂交瘤的结合筛选。或者，用本领域技术人员已知或本发明所用的技术产生全长人mAbs。
本发明一示范性、自限性中和mAb是mAb BC2，它是一种可用于发展嵌合或人源化分子的鼠抗体。BC2 mAb以对凝血时间的自限性抑制活性为特征。如aPTT试验测定的那样，BC2 mAb对凝血时间的作用显示出约100秒的最大值。BC2 mAb也结合因子IXa，抑制因子IX向IXa转变并抑制因子IXa活性。二价金属辅因子是活性所需的，mAb对于Ca2+显示出较Mn2+更大的偏爱。在aPTT试验中，观察到的IC50为约50nM。BC2 mAb显示出与大鼠的种属-交叉反应性而且是IgG2a同位型。
其它所需供体抗体是鼠mAbs，BC1、9E4(2)F4和11 G4(1)B9。这些mAbs以对凝血时间的自限性抑制活性为特征。如aPTT试验中测得的那样，这些mAbs对凝血时间作用显示出的最大值为对9E4(2)F4约90～100秒，对11G4(1)B9约80秒。BC1 mAb也结合因子IXa，抑制因子IXa活性但是不抑制因子IX向IXa的转变。其活性不需要金属辅因子。在aPTT试验中观察到BC1的IC50为约35nM。BC1 mAb是IgG1同位型。
另一种以对凝血时间自限性抑制活性为特征的所需的供体抗体是鼠mAb HFXLC。如aPTT试验测得的那样，HFXLC mAb对凝血时间的作用显示出约50～60秒的最大值。HFXLC mAb结合因子X轻链，并抑制因子X/Xa活性。aPTT试验中观察到的IC50是约20nM。
另一种以对凝血时间自限性抑制活性为特征的所需的供体抗体是小鼠mAb，HFXI。如aPTT试验测得的那样，HFXImAb对凝血时间的作用显示出约100秒的最大值。HFXLC mAb结合因子XI并抑制因子XI/XIa活性。在aPTT试验中观察到的IC50是约30nM。
尽管不意欲受到有关作用机理的任何具体理论的限制，但是这些mAbs看起来通过非竞争性或者变构机理来调节凝血，因而仅达到了部分抑制作用。
本发明不限于使用BC1、BC2、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC、HFXI或它们的超变(即CDR)序列。因而，任何其它以自限性中和活性为特征的适合的高亲和力抗体和相应的CDRs可被替换。在下面描述中，将BC1、BC2、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC或HFXI通称为供体抗体，这样做只是为了使说明和描述简明。
本发明也包括使用衍生自针对适合的人凝血因子或辅因子的mAbs的Fab片段或F(ab′)2片段。这些片段作为抗凝血因子，优选抗因子IX/IXa、X/Xa、XI/XIa、VIII/VIIIa、V/Va、VII/VIIa或凝血酶/凝血酶原的具有自限性中和活性的试剂是非常有用的。Fab片段包含整个轻链和重链的氨基末端部分。F(ab′)2片段由通过二硫键结合在一起的2个Fab片段所形成。mAbsBC1、BC2、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC和HFXI以及其它类似的高亲和力抗体，提供可用常规方法得到的Fab片段和F(ab′)2片段，所述常规方法例如用适当的蛋白水解酶，木瓜蛋白酶和/或胃蛋白酶裂解mAb，或采用重组方法。这些Fab和F(ab′)2片段本身作为治疗剂、预防剂或诊断剂非常有用，并且作为包括对于形成本文所述重组或人源化抗体有用的可变区和CDR序列的序列供体是非常有用的。
通过组合噬菌体文库(参见例如Winter等，Ann Rev Immunol，12，433-455(1994))或通过免疫球蛋白链改组(参见例如Marks等，Bio/Technology，10，779-783(1992)(涉及到的这两篇文献以其全部在此引入作为参考)，可以构建Fab和F(ab′)2片段，其中使来自选择抗体(例如BC2)的Fd或vH免疫球蛋白与轻链免疫球蛋白的所有组成成分vL(或vK)相结合，以形成新的Fabs。相反，使来自选择抗体的轻链免疫球蛋白与重链免疫球蛋白的所有组成成分vH(或Fd)结合，以形成新的Fabs。通过使mAbBC2的Fd与轻链免疫球蛋白的所有组成成分结合，可以得到自限性中和因子IX Fabs。因此，人们能够从链改组技术中回收(recover)具有独特序列(核苷酸和氨基酸)的中和Fabs。
上述mAb BC2或其它抗体可以捐献序列，如可变重链和/或轻链肽序列、框架序列、CDR序列、功能片段和它们的类似物，以及编码它们的在设计和得到以供体抗体抗原结合特异性为特征的各种改变抗体中有用的核苷酸序列。
本发明编码可变轻链和重链肽序列的核苷酸序列或其或片段，对于在编码CDRs或框架区的核苷酸序列内特异性变化的诱变引入，和对于使产生的修饰或融合的核苷酸序列整合入表达质粒中是非常有用的。例如，框架和CDR-编码区核苷酸序列的沉默取代，可用于产生便利于插入诱变的CDR和/或框架区的限制性酶切位点。这些CDR-编码区可用于构建本发明的人源化抗体。
BC2重链可变区的核酸和氨基酸序列列于SEQ ID NO5和7。来自此区的CDR序列列于SEQ ID NO8、9和10。
BC2轻链可变区的核酸和氨基酸序列列于SEQ ID NOs6和11。来自该区的CDR序列列于SEQ ID NOs12、13和14。
把遗传密码的简并考虑进来，可以构建编码本发明可变重链和轻链氨基酸序列和CDR序列以及它们的功能片段和具有相同的供体抗体抗原结合特异性的类似物的各种编码序列。编码可变链肽序列或CDRs的本发明分离的核苷酸序列或其片段，可用于产生改变的抗体，例如本发明嵌合或人源化抗体或当与第二个免疫球蛋白配偶体可操作地结合时的其它基因工程抗体。
应当指出的是，除了编码本文所述改变抗体和抗体部分的核苷酸序列外，其它这样的核苷酸序列也在本发明考虑之中，诸如那些与天然CDR-编码序列互补的或与CDR-编码区附近修饰的人框架区互补的核苷酸序列。有用的DNA序列包括那些在严谨条件下与该DNA序列杂交的序列，见T.Maniatis等，″Molecular CloningA Laboratory Manual″，Cold Spring HarborLaboratory(1982)，pp.387-389。此种严谨杂交条件的一个实例是，65℃4XSSC，接着于65℃用0.1XSSC洗涤1小时。或者，示范性的严谨杂交条件是，50％甲酰胺，42℃ 4XSSC。优选地，这些杂交DNA序列长度上至少约18个核苷酸，即大约CDR的大小。
改变的免疫球蛋白分子可编码改变的抗体，后者包括基因工程抗体如嵌合抗体和人源化抗体。一种所期望的改变的免疫球蛋白编码区，包含编码具有因子IX/IXa、X/Xa、XI/XIa、VIII/VIIIa、V/Va、VII/VIIa或凝血酶/凝血酶原抗体，优选如本发明提供的高亲和力抗体的抗原特异性的肽的CDR-编码区，所述编码区插入到第一免疫球蛋白配偶体诸如人框架或人免疫球蛋白可变区。
优选地，第一免疫球蛋白配偶体可操作地与第二免疫球蛋白配偶体连接。第二个免疫球蛋白配偶体定义同上，并可包括编码有关第二抗体区的序列，例如Fc区。第二免疫球蛋白配偶体也可包括编码另一免疫球蛋白的序列，轻链或重链恒定区在读框内或者通过联结子序列而与所述另一免疫球蛋白序列融合。针对凝血因子的功能片段或类似物的基因工程抗体，也可被设计引出与相同抗体的结合性增强。
第二个免疫球蛋白配偶体也可与上述定义的包括非-蛋白载体的效应剂结合，第二个免疫球蛋白配偶体可以通过常规方式可操作地与效应剂相连接。
第二个免疫球蛋白配偶体(例如抗体序列)和效应剂之间的融合或连接可通过任何适宜方法来完成，例如通过常规的共价或离子键、蛋白质融合或异-双功能交联剂如碳二亚胺、戊二醛等。此类技术为本领域所熟知并描述在常用化学和生物化学课文中。
另外，只是为第二个免疫球蛋白配偶体和效应剂之间提供所需空间量的常规接头序列也可构建在改变的免疫球蛋白编码区中。此类联结子的设计也为本领域技术人员所熟知。
此外，可用本领域已知的技术修饰本发明分子的信号序列以增强表达。
优选的改变的抗体包含具有mAb BC2的抗原结合特异性的可变重链和/或轻链肽或蛋白序列，例如VH和VL链。本发明还期望的另一改变的抗体，是以含有鼠抗体分子BC2重链和/或轻链可变区至少一个，优选全部CDRs的氨基酸序列为特征的抗体，所述鼠抗体分子BC2的其余序列来自人来源或是其功能片段或类似物。
在另一个实施方案中，本发明改变的抗体已经附着上其它试剂。譬如，重组DNA技术用于产生本发明的改变的抗体，其中完全抗体分子的Fc片段或CH2 CH3结构域已被酶或其它可检测分子替换(即多肽效应子或者报导分子(reporter molecular))。
第二个免疫球蛋白配偶体也可以可操作地与异源于含CDR序列的非-免疫球蛋白肽、蛋白或其片段相连接，所述含CDR序列对凝血因子，优选因子IX/IXa、X/Xa、XI/XIa、VIII/VIIIa、V/Va、VII/VIIa或凝血酶/凝血酶原具有抗原特异性。产生的蛋白显示出非-免疫球蛋白抗原特异性和表达特征(characteristic)。融合配偶体特征可以是例如功能性特征，如另一结合或受体结构域，或治疗特征，如果融合配偶体本身是治疗性蛋白的话，或另外的抗原特征。
本发明另一期望的蛋白可包括完整抗体分子、具有全长重链和轻链或者它们的任何不连续片段如Fab或F(ab′)2片段、重链二聚体或它们的任何小的重组片段如FV、或者单链抗体(SCA)或者任何与所选供体mAb(例如mAb BC1、BC2、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC或HFXI)具有相同特异性的其它分子。此类蛋白可以改变的抗体形式使用或者以其未融合形式使用。
每当第二免疫球蛋白配偶体来自不同于供体抗体的抗体时，例如免疫球蛋白框架或恒定区的任何同位型或种类(class)，就产生基因工程抗体。基因工程抗体可包括来自一个来源(例如受体抗体)的免疫球蛋白(Ig)恒定区和可变框架区，来自供体抗体的一个或多个(优选所有的)CDRs，例如本文所述的抗-因子IX/IXa、X/Xa、XI/XIa、VIII/VIIIa、V/Va、VII/VIIa或凝血酶/凝血酶原抗体。另外，可以进行对受体mAb轻链和/或重链可变结构域框架区在核酸或氨基酸水平或者供体CDR区的改变，例如缺失、取代或添加，以保持供体抗体抗原结合特异性。
此类基因工程抗体设计使用凝血因子mAb(任选地如前所述进行修饰)可变重链和/或轻链的一个(或者二者均用)或者一个或多个重链或轻链CDRs。本发明基因工程抗体显示出自限性中和活性。
此基因工程抗体可包括人源化抗体或嵌合抗体，所述人源化抗体包含选择的人免疫球蛋白或亚型的框架区，所述嵌合抗体含有与凝血因子抗体功能片段融合的人重链和轻链恒定区。适合的人(或其它动物)受体抗体可以通过与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列同源性而选自常规数据库例如KABAT数据库、Los Alamos数据库和Swiss蛋白数据库。以与供体抗体框架区同源性(基于氨基酸)为特征的人抗体，可能适宜于为插入供体CDRs提供重链可变框架区。可按照类似方式选择能够贡献轻链可变框架区的适宜受体抗体。应当指出，受体抗体重链和轻链并非必需来自相同的受体抗体。
优选地，异源框架和恒定区选自人免疫球蛋白类(class)和同位型，如IgG(亚型1至4)、IgM、IgA和IgE。然而，受体抗体不必要仅包含人免疫球蛋白蛋白序列。举例来说，可以购建这样一个基因，其中编码人免疫球蛋白链一部分的DNA序列与编码非-免疫球蛋白氨基酸序列如多肽效应子或报导分子的DNA融合。
特别优选的人源化抗体包含插入到选择的人抗体序列框架区上的BC2s的CDRs。为中和人源化抗体，来自因子IX抗体重链和/或轻链可变区的一个、两个或优选三个CDRs被插入到选择的人抗体序列的框架区中，取代后者抗体的天然CDRs。
优选地，在人源化抗体中，人重链和轻链的可变域均已经通过一个或多个CDR替换而被基因工程改造。使用全部6个CDRs或小于6个CDRs的各种组合是可能的。优选6个CDRs被全部替换。使用来自人受体抗体未修饰的轻链作为轻链，仅仅在人重链替换CDRs是可能的。而且，依靠常用抗体数据库，相容性轻链还可以选自另一个人的抗体。基因工程抗体的其余部分可来自任何适宜的受体人免疫球蛋白。
因此，基因工程人源化抗体优选具有天然人抗体结构或其片段，并且具有对于有效治疗应用而言所需的结合特性，所述治疗例如治疗人血栓性和栓子性疾病。
最优选地，人源化抗体具有SEQ ID NO31、52、或89所列出的重链氨基酸序列。也最优选的是，人源化抗体具有SEQ ID NO44、57、62、74、78或99所示轻链氨基酸序列。特别优选人源化抗体SB 249413，其重链具有SEQ ID NO31所示的氨基酸序列而其轻链具有SEQ ID NO44所示氨基酸序列。也特别优选人源化抗体SB 249415，其重链具有SEQ ID NO52所示氨基酸序列而其轻链SEQ ID NO57所示氨基酸序列。还特别优选人源化抗体SB 249416，其重链具有SEQ ID NO52所示氨基酸序列而轻链具有SEQ ID NO62所示氨基酸序列。还特别优选人源化抗体SB 249417，其重链具有SEQ ID NO52所示氨基酸序列和轻链具有SEQ ID NO74所示氨基酸序列。还特别优选人源化抗体SB 257731，其重链具有SEQ ID NO52所示氨基酸序列和轻链具有SEQ ID NO78所示氨基酸序列。还特别优选人源化抗体SB 257732，其重链具SEQ ID NO89所示氨基酸序列和轻链具有SEQ ID NO99所示氨基酸序列。
本领域技术人员应当懂得，不必影响供体抗体(即类似物(analog))特异性和高亲和力，通过改变可变域氨基酸，可将基因工程抗体进一步修饰。可以预见，重链和轻链氨基酸可被可变域框架或CDRs或者框架和CDRs的其它氨基酸取代。这些取代可由来自特定亚组的供体抗体或共有序列提供。
另外，可改变恒定区以增强或降低本发明分子的选择特性。譬如，二聚化，与Fc受体结合，或结合并激活补体的能力(参见例如，Angal等，MolImmunol，30，105-108(1993)，Xu等，J Biol Chem，269，3469-3474(1994)，Winter等，EP 307434-B)。
改变的抗体是嵌合抗体的话，它有别于前述人源化抗体，因为它提供全部的非-人供体抗体重链和轻链可变区，包括框架区，与重链和轻链的人免疫球蛋白恒定区相结合。可以预见到，相对于本发明人源化抗体而言保留了另外的非-人序列的嵌合抗体将会在人体引发显著的免疫应答。
此类抗体在预防和治疗下面讨论的血栓和栓子性病症中特别有用。
优选地，通过下述过程，可变轻链和/或重链序列和mAb BC2或其它适宜供体mAbs(如BC1、9E4(2)F4、11G4(1)B9、HFXLC、HFXI)的CDRs以及它们的编码核苷酸序列，用于构建本发明的改变的抗体，优选人源化抗体。也使用相同或类似的技术以产生本发明的其它实施方案。
按照常规克隆产生选择供体mAb(例如小鼠抗体BC2)的杂交瘤，通过本领域已知的技术获得重链和轻链可变区的DNA，例如Sambrook等在″Molecular CloningA Laboratory Manual″，2nd edition，Cold Spring HarborLaboratory(1989)中描述的技术。使用多聚核苷酸引物和反转录酶，得到含有至少CDR-编码区的BC2的可变重链和轻链区和为保持供体mAb结合特异性以及保持来自人免疫球蛋白抗体链的免疫球蛋白-来自部分所需的受体mAb轻链和/或重链可变域框架区。使用已知数据库通过与其它抗体比较来鉴定CDR-编码区。
接着，制备小鼠/人嵌合抗体并分析结合能力。此嵌合抗体包含与人Ig两条链恒定区结合的全部非-人供体抗体VH和VL区。
使用计算机数据库(例如KABAT)鉴定来自人抗体重链可变区的同源性框架区，并选择与BC2具有同源性的人抗体作为受体抗体。采用在框架区中任选核苷酸取代以整合入限制性酶切位点的手段，设计人抗体框架内含有BC2 CDR-编码区的合成的重链可变区序列。然后，使用长的合成寡聚体来合成设计的序列。或者，设计的序列通过重叠寡核苷酸来合成、通过聚合酶链式反应(PCR)进行扩增并且矫正错误。可按类似方式设计适宜的轻链可变框架区。
人源化抗体可来自嵌合抗体，或优选地，通过将来自重链和轻链的供体mAb CDR-编码区适当地插入选择的重链和轻链框架内而合成得到。或者，使用标准诱变技术来制备本发明人源化抗体。因此，产生的人源化抗体含有人框架区和供体mAb CDR-编码区。接着可进行框架残基的操作。产生的人源化抗体可在重组宿主细胞例如COS、CHO或骨髓瘤细胞中表达。对其它适宜的因子IX-特异性或其它凝血因子-特异性、自限性、中和、高亲和力、非-人抗体使用该项技术，可以制得其它人源化抗体。
通过把改变抗体的编码序列与常规调节控制序列可操作地结合，产生常规的表达载体或重组质粒，所述常规调节控制序列能够控制在宿主细胞中复制和表达，和/或由宿主细胞的分泌。调节序列包括启动子序列(例如CMV启动子)和信号序列(可以来自其它已知抗体)。类似地，可以产生具有编码互补性抗体轻链或重链的DNA序列的第二个表达载体。优选地，为尽可能确保每一个多肽链被功能性表达，除有关的编码序列和选择标志之外，此第二个表达载体与第一个表达载体完全相同。或者，改变的抗体的重链和轻链编码序列存在于单个载体中。
使用常规技术，将选择的宿主细胞与第一和第二载体共转染(或仅用一个载体转染)以产生本发明的转染宿主细胞，其同时包含重组或合成的轻链和重链。然后，用常规技术培养转染细胞来产生本发明的基因工程抗体。通过适当的实验，例如ELISA或RIA，把包括重组重链和/或轻链相结合的人源化抗体从培养物中筛选出来。类似的常规技术可用于构建其它本发明的改变抗体和分子。
本发明方法和组分构建物中使用的适于克隆和亚克隆步骤的载体，可由本领域技术人员加以选择。譬如，可使用pUC克隆载体系列，如pUC19，可自供应商商购得到，所述供应商如Amersham或Pharmacia。另外，能够迅速复制、具有丰富克隆位点和选择性基因(例如抗生素抗性)并容易操纵的任何载体，均可用于克隆。因此，在本发明中，克隆载体的选择并不是限制因素。
类似地，用于表达本发明基因工程抗体的载体，可由本领域技术人员从任何常规载体中予以选择。载体也含有指导异源DNA序列在选择的宿主细胞中复制和表达的选择的调节序列(如CMV启动子)。这些载体含有上述DNA序列，其编码基因工程抗体或改变的免疫球蛋白编码区。另外，载体可以整合选择的为便于操作通过插入所需限制性酶切位点而修饰的免疫球蛋白序列。
表达载体也以适于扩增表达异源DNA序列的基因为特征(例如哺乳动物二氢叶酸还原酶基因(DHFR))。其它优选的载体序列包括聚腺苷酸信号序列，如来自牛生长激素(BGH)和β球蛋白启动子序列(betaglopro)。可用本领域熟知的技术合成对于本发明有用的表达载体。
通过已知的引导重组DNA产物在选择宿主中表达和/或分泌所用的方法，可以从商业或天然来源或合成得到此类载体的组分，例如复制子、选择基因、增强子、启动子，信号序列等。为了此目的，也可选择其它无数类型的为本领域所知的用于哺乳动物、细菌、昆虫、酵母和真菌表达的适宜表达载体。
本发明也包括用含有基因工程抗体或其改变的免疫球蛋白分子编码序列的重组质粒转染了的细胞系。对于此类克隆载体克隆和其它操作有用的宿主细胞，也是常规的。然而，最期望来自各种大肠杆菌株的细胞用于本发明构建改变的抗体中的克隆载体的复制和其它步骤。
表达本发明基因工程抗体或改变的抗体的适宜的宿主细胞或细胞系，优选哺乳动物细胞如CHO、COS(纤维母细胞(例如3T3))和髓样细胞，更加优选CHO或髓样细胞。可以使用人细胞，这样使得分子被用人糖基化模式予以修饰。或者，可以使用其它真核细胞系。适宜哺乳动物宿主细胞的选择，以及转化、培养、扩增、筛选、产物生产和纯化的方法，均为本领域所已知。参见例如Sambrook等，出处同上。
证明细菌细胞作为适宜表达本发明重组Fabs的宿主细胞是非常有用的(参见例如，Plückthun，A.，Immunol Rev，130，151-188(1992))。然而，由于在细菌细胞中表达的蛋白呈未折叠或不适当的折叠形式或呈非-糖基化形式的倾向，因此在细菌细胞中产生的任何重组Fab将不得不进行保留抗原结合能力的筛选。如果由细菌细胞表达的分子以正确折叠的形式呈现，那么该细菌细胞则是所需的宿主。譬如，表达所用各种E.coli株作为宿主细胞是生物工程领域众所周知的。也可使用各种枯草芽孢杆菌株、链霉菌属、其它细菌等。
如果需要，对于本领域技术人员已知的酵母株以及昆虫细胞(例如果蝇属(Drosophila)和鳞翅类(Lepidoptera))和病毒性表达系统也可用作宿主细胞。参见例如Miller等，Genetic Engineering，8，277-298，Plenum Press(1986)并在此引入作为参考。
构建本发明载体的一般方法、产生本发明宿主细胞所需的转染方法和从该宿主细胞产生本发明改变的抗体所需的培养方法，均是常规技术。同样，本发明改变的抗体一旦产生，则可以按照本领域的标准技术而从细胞培养物中纯化出来，所述技术包括硫酸铵沉降、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等。这些技术在本领域技术人员掌握范围之内并且不限制本发明。
另一表达人源化抗体的方法，可利用转基因动物中的表达，例如美国专利4,873,316所描述的方法。该方法涉及使用动物酪蛋白启动子的表达系统，所述酪蛋白启动子转基因性地整合进哺乳动物中，使雌性动物在其乳汁中产生所需的重组蛋白。
基因工程抗体一旦由所需方法产生，接着就要使用适当的试验检测抗体的体外活性。目前，传统的ELISA试验模式用于定性和定量评定基因工程抗体与因子IX或与其它适合凝血因子的结合。另外，其它体外试验也用于证实中和效力，继之后，进行人临床研究评价基因工程抗体在体内的持久性(不管通常的清除机制)。
按照所述的由BC2制备人源化抗体的方法，本领域技术人员也可由本文所述其它供体抗体、可变区序列和CDR肽构建人源化抗体。可以产生具有潜在可能性地被基因工程抗体受体识别为″自身″可变区框架的基因工程抗体。对可变区框架小的修饰，可以引起抗原结合的大的增加，而对受体没有可估量的增加的免疫原性。此类基因工程抗体可优选治疗人凝血因子-介导的病症。此类抗体对于诊断这些病症也是非常有用的。
本发明也涉及抑制动物特别是人血栓形成的方法，方法包括联合施用有效剂量的具有自限性中和活性的抗-凝血因子单克隆抗体与纤溶酶原激活物。联合治疗增加亚-最适浓度纤溶酶原激活物时的血栓溶解，减少恢复血流的时间和增加血管再灌注的频率和总持续时间。与肝素相反，联合治疗不显著扰乱正常的止血功能和节约(spare)纤维蛋白原、纤溶酶原和α-2-抗纤溶酶水平。因此，本发明也涉及减少在治疗动物血栓形成中所需溶栓剂剂量的方法，包括与溶栓剂联合施用特异靶向于固有凝血途径的组分的抗凝剂。
优选地，凝血因子来自固有的或普通的凝血途径。最优选地，抗-凝血因子单克隆抗体是抗-因子IX、抗-因子IXa、抗-因子X、抗-因子Xa、抗-因子XI、抗-因子XIa、抗-因子VIII、抗-因子VIIIa、抗-因子V、抗-因子Va、抗-因子VII、抗-因子VIIa、抗凝血酶或抗-凝血酶原。MAb可包括一种或多种本文所述基因工程抗体或改变的抗体或者它们的片段。
优选地，纤溶酶原激活物是tPA、链激酶、尿激酶。特别优选的是tPA。也优选在例如Tachias and Madison，J Biol Chem，272，14580-14585(1997)；Fujise等，Circulation，95，715-722(1997)；Coombs等，J Biol Chem，273，4323-4328(1998)；Van de Werf等，Am Heart J，137，786-791(1999)描述的tPA变体，和链激酶与尿激酶变体，如单链尿激酶纤溶酶原激活物、酰化的纤溶酶原链激酶激活剂复合物、葡萄球菌激酶和吸血蝠来源的纤溶酶原激活物。
或者，乙酰水杨酸与抗-凝血因子单克隆抗体联合施用。某些情况下，联合治疗降低抗-凝血因子单克隆抗体的治疗有效量。
通过与各自凝血因子结合并且继之自限性抑制凝血级联反应，从而产生使用本发明分子而诱发的治疗反应。因此，以适于治疗用的制剂和配制品形式存在的本发明分子，是易于患有或者体验过与下述疾病(但不限于此)有关的异常凝血活性的人群所高度期望的心肌梗塞、不稳定型心绞痛、房性纤颤、中风、肾脏损害、肺栓塞、深静脉血栓形成和人工器官以及假体性植入物。特别优选在心肌梗塞中使用。
另一优选的用途是在治疗血栓栓塞后诱发的局部缺血中使用。因此，本发明也涉及治疗动物血栓栓塞后诱发的局部缺血的方法，包括施用抗-因子IX抗体或抗体片段。该抗体或片段可在栓子后施用，即在无论起源于脉管系统何处的血凝块已经进入脑脉管系统并滞留、阻断和/或减少血流且引起局部缺血之后再施用。抗体或片段也可在中风后施用，即在个体或观察者识别到由栓子形成造成了神经功能损害后施用。而且，本发明涉及治疗动物血栓栓塞后诱发的局部缺血的方法，包括联合施用抗-因子IX抗体或抗体片段与纤溶酶原激活物。抗体或片段和纤溶酶原激活物在栓子后或中风后施用。这些治疗方法导致侧枝血管的持续灌注。本发明的损伤后治疗方法缓解延长局部缺血的后果，所述局部缺血如局部缺血床(bed)中持续性病理性血栓形成，后者可以造成梗塞组织扩大和神经缺损增大。
另外，本发明涉及在动物血栓栓塞后诱发的局部缺血治疗中减少所需溶栓剂剂量的方法，包括联合施用抗-因子IX抗体与溶栓剂。
另一优选的用途是向易于患血栓栓塞性中风的动物预防性给药。因此，本发明也涉及预防动物血栓栓塞性中风的方法，包括向具有血栓栓塞中风风险的动物施用抗-因子IX抗体。具有血栓栓塞中风风险的个体包括但不限于易患心房颤动或者接受外科手术或其它pro-促凝剂侵袭性技术的患者。
本发明改变的抗体、抗体及其片段也用于与其它抗体联接，特别是与负责本发明基因工程抗体所针对的病症标志物(表位)发生反应的其它人mAbs。
据信，本发明治疗剂治疗异常凝血病症需要约1天至约3周，或者根据需要而定。这较目前使用的抗凝剂肝素和华法令显示出相当大的优越性。剂量和治疗期间涉及本发明分子在人循环中的相对持续时间，并且可由本领域技术人员根据受治病症和患者的一般健康状况而加以调整。
本发明治疗剂的给药模式可以是将治疗剂投放给宿主的任何适宜途径。本发明的改变的抗体、抗体、基因工程抗体及其片段、纤溶酶原激活物、药物组合物，特别适于非胃肠给药，即皮下、肌内、静脉内或者鼻内给药。
本发明治疗剂可配制成在可药用载体中含有有效量本发明基因工程(例如人源化)抗体和纤溶酶原激活物作为活性成分的药物组合物。或者，本发明药物组合物也可含有乙酰水杨酸。在本发明的预防药中，优选的是含有基因工程抗体、呈备用(ready for)注射形式的含水悬浮液或者溶液，悬浮液或溶液优选在生理pH缓冲。非胃肠给药的组合物一般含有本发明基因工程抗体溶液或者基因工程抗体溶解在可药用载体优选含水载体中的混合物。可使用多种载体，例如0.4％盐液，0.3％甘氨酸等。这些溶液无菌并且一般不含微粒物。这些溶液可用常规的、众所周知的灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。组合物可含有为接近生理条件所需的可药用辅剂，如pH调节剂和缓冲剂等。药物制剂中本发明抗体浓度可以差异很大，即从小于约0.5％，通常为或至少约1％至高达15或20％重量，而且将依所选具体给药模式主要根据液体体积、粘度等加以选择。
因此，本发明肌内注射用的药物组合物可制成含有1mL无菌缓冲水和约1ng至约100mg(例如约50ng至约30mg或更多)、优选地约5mg至约25mg本发明基因工程抗体。类似地，本发明静脉输注用药物组合物可制成含有约250ml无菌Ringer′s溶液和约1mg至约30mg、优选5mg至约25mg本发明基因工程抗体。配制非胃肠给药组合物的实际方法为本领域技术人员所熟知或者对于本领域技术人员而言是显然的，并且表述在″Remington′s Pharmaceutical Science″，15th ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania中。
优选本发明治疗剂在作为药品制剂时是呈单位剂量形式。合适的治疗有效量可由本领域技术人员很方便地决定。为有效治疗人或动物的血栓或栓子性病症，应当非胃肠道施用单剂量大约0.1mg至约20mg/kg体重的本发明蛋白或抗体，优选静脉输注或者肌内注射。如果需要，在血栓响应期间可按照临床医师选择的适当的间歇重复施用此剂量。
为了贮存并于使用前在适宜载体中重悬，可以将本文描述的抗体、改变的抗体或其片段冷冻干燥。该项技术已被证实对于常规的免疫球蛋白是有效的，可以使用本领域熟知的冷冻干燥和重悬技术。
现在，参照下列具体但非限制性实施例来描述本发明。
实施例1制备和筛选抗-因子IX单克隆抗体给雌性Balb/C小鼠注射按照Jenny，R.等，Prep Biochem，16，227-245(1986)所述方法纯化的人因子IX。通常，每只小鼠接受的初始注射剂量为溶解在0.15mL磷酸缓冲盐液(PBS)中并与0.15mL完全Freund′s佐剂相混合的100(g蛋白。在2-3月的期间，每两周一次注射溶于0.15mL PBS和0.15mL不完全Freund′s佐剂中的50(g蛋白，以加强免疫。最后一次加强注射后，在脾/骨髓瘤细胞融合前3天小鼠接受溶于PBS的50(g因子IX。从免疫的小鼠中分离出脾细胞，并按照Oi，V.T.等在″Selected Methods inCellular Immunology，″Mishell，B.B.and Shigii，S.M.，eds.，Freeman Press，SanFrancisco一书中描述的方法，使用聚乙二醇使脾细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合(Kohler，G.等，Eur J Immunol，6，292-295(1976))。融合后，细胞重悬于含有10％胎牛血清的RPMI 1640介质中，将等量份的介质加到含有0.5mL腹腔灌洗细胞-条件培养介质的4块24-孔板的每一个孔中。第二天，每孔接受1.0mL溶于含10％胎牛血清RPMI 1640介质中的2×10-4M次黄嘌呤、8×10-7M氨蝶呤和3.2×10-5M胸苷。每3-4天去除一半的介质并代之以含有1×10-4M次黄嘌呤和1.6×10-5M胸苷的新鲜介质，由此营养细胞。
大约2周后，从每个孔中取出1.0mL杂交瘤介质，使用Jenny，R.J.等在Meth Enzymol，222，400-416(1993)中所述的ELISA试验检测抗-因子IX抗体。简要讲，将因子IX固定到96-孔微滴定板的塑料孔上，接着，在孔中孵育杂交瘤上清液或纯化抗体的稀释液。洗涤孔，并用与辣根过氧化物酶和生色物质o-联茴香胺(dianisidine)相偶合的山羊抗-鼠免疫球蛋白第二抗体来检测抗体-抗原复合物的存在。
通过有限稀释将含有抗-因子IX抗体的孔亚克隆，并在96-孔板中生长。通过上述ELISA测定从克隆的杂交瘤细胞培养物的上清液中筛选因子IX的抗体，将来自阳性杂交瘤的细胞扩展(expand)、冷冻、贮于液氮中，然后在小鼠中作为腹水肿瘤生长。
实施例2抗-凝血因子抗体在凝血中的自限性作用在使用Baxter参考程序LIB0293-J，3/93版(Baxter Scientific，Edison，New Jersey)的fibrometer(Becton-Dickinson Microbiology Systems，Cockeysville，Maryland)中，测定增加抗-凝血因子抗体浓度对于人血浆激活的部分凝血激酶时间(aPTT)的影响。
开始本试验之前，盛有2～3mL 0.02M CaCl2的5mL试管放入fibrometer的加热室中。人血浆样本，要么来自新鲜采集血液并冰浴保存，要么按照制造商的介绍而由Hemostasis Reference Plasma(AmericanDiagnostics，Greenwich，Connecticut)重配。
来自猪肠粘膜的未分级的肝素(Sigma Chemical，St.Louis，Missouri)、来自肠粘膜的低分子量肝素(Lovenox，enoxaparin sodium，Rhone-PoulencRorer Pharmaceuticals，Collegeville，Pennsylvania)或mAb抗凝剂，均配制成大约50μM的储备溶液，并系列稀释直接成为检测血浆。含有血浆而不含抗凝剂的空白管作为对照。
两个fibro Tube fibrometer杯分别充满含有抗凝剂的100(1检测血浆和含有125μl肌动蛋白激活的cephaloplastin reagent(肌动蛋白试剂，来自鞣花酸中的兔脑脑磷脂，购自Baxter Scientific)的100μl检测血浆，将两个杯子放入到37℃的fibrometer井中。
1分钟后，将100μl肌动蛋白试剂转移到含有血浆的杯中，用吸量管混合内容物数次。孵育3分钟后，使用AutomaticPipette/Timer-trigger(Becton-Dickinson)将预热到37℃的100μl CaCl2加入到血浆-肌动蛋白试剂混合物中。记录凝血时间，结果以凝血时间作为在300μl总试验体积中抗凝剂终浓度的函数而呈示于图1。试验中因子IX表观浓度(nominal concentration)是30-40nM。
图1所示结果描述增加鼠抗-因子IX mAbs BC1和BC2浓度对aPTT凝血时间的影响。两种mAbs均通过延长aPTT而抑制凝血，并且两种mAbs均达到对aPTT的终极饱和效应。BC1和BC2分别为～35nM和～50nM时，IC50值类似，但是两种抗体在最大响应方面的差异是显著的。饱和浓度的BC1增加aPTT约50％，达到～40秒。另一方面，BC2增加aPTT 3.5倍，达到约90秒。在使用肝素的抗凝治疗中所用的治疗靶范围是突出的。结果表明这两种mAbs落入肝素治疗的aPTT范围。
mAbs BC1和BC2的特性总结于表I。每一个BC mAbs识别酶原、因子IX以及活性蛋白酶、因子IXa，但只有BC2能够阻断酶原激活和蛋白酶活性。发现BC1和BC2与Cynomologous猴因子IX有交叉反应。另外，BC2与大鼠因子IX也有交叉反应。
表I.抗-因子IX mAbs体外特性总结BC1 BC2结合因子IX 是 是结合因子IXa是 是抑制IX转变为IXa不 是抑制在Xase复合物中IXa的活性是 是需要辅因子 不需要 二价金属Ca2+＞Mn2+aPTTmax×100％150 350aPTT正常IC50，nM ～35～50种属交叉反应 猴 大鼠，猴同位型 IgG1IgG2a图2所示结果描述增加抗-因子IX mAbs 9E4(2)F4和11G4(1)B9浓度对aPTT凝血时间的影响。将试验用血浆稀释到正常浓度的一半，得到起始aPTT为45秒。两种mAbs均通过延长aPTT而抑制凝血，两种mAbs均达到对aPTT的终极饱和效应。9E4(2)F4和11G4(1)B9的饱和浓度增加aPTT，对于9E4(2)F4 aPTT增加到～90至100秒，而11G4(1)B9增加至～80秒。结果表明两种mAbs均处于肝素治疗aPTT范围的上末端。
图3所示结果描述增加抗-因子X mAbs HFXLC(相对轻链表位)，HFXHC(相对重链表位)和抗-因子XI mab HFXI的浓度对aPTT凝血时间的影响。这些mAbs得自Enzyme Research Laboratories(South Bend，IN)。mAbsHFXLC和HFXI通过延长aPTT而抑制凝血，两种mAbs均达到对aPTT的终极饱和效应。HFXLC的IC50值是～40nM；饱和浓度增加aPTT至～60秒。HFXI的IC50值是～20nM；饱和浓度增加aPTT至～100秒。结果表明，HFXLC落入肝素治疗aPTT范围，而HFXI落入肝素治疗范围的上末端。mAb HFXHC对于aPTT凝血时间无影响。
用因子VIII的抗体、因子IXa的辅因子，也观察到aPTT的自限性延长。例如，购自Affinity Biologicals，Inc.的抗-人因子VIII抗体、SAF8C-IG，增加aPTT至最大约65秒。用约100nM抗体，达到aPTT最大延长的一半。
实施例3鼠因子IX mAbs在大鼠血栓模型的效力为了评价抗-因子IX抗体在预防动脉血栓形成中的效力，采用了Schumacher等在J Cardio Pharm，22，526-533(1993)中报道的大鼠颈动脉血栓形成模型。该模型是如下构成的将FeCl3溶液产生的氧自由基(oxygenradicals)施用在颈动脉表面上，从而对颈动脉内皮造成局部(segmental)损伤。
简而言之，用戊巴比妥钠麻醉大鼠，颈静脉插套管以便进行静脉内注射，左股动脉插套管以便监测血压和心率。通过颈部手术切口无菌操作分离颈动脉，并装备上磁性流动探头以便测量血流。稳定一段时间后，建立下列各项变量的基线参数颈动脉血流、动脉压、心率、激活的部分凝血激酶时间(aPTT)和凝血酶原时间(PT)。此后，把用50％FeCl3溶液湿透的预测(premeasured)Whatman滤纸放到颈动脉上15分钟，以彻底损伤下面的内皮细胞。移走FeCl3浸湿的滤纸后，经过60分钟完成实验。实验末，从颈动脉中取出颈动脉血栓并称重。
所有试药均在开始颈动脉损伤前15分钟施用。检验下列治疗，并与因子IX mAb BC2进行比较。
1.肝素15、30、60或120U/kg快速浓注，接着在60分钟内分别输注0.5、1、2或4U/kg/min。
2.乙酰水杨酸(ASA，阿司匹林)5mg/kg快速浓注。
3.抗-因子IX mAb BC21、3或6mg/kg快速浓注，随后60分钟时间内分别输注0.3、1或2μg/kg/min。
4.肝素30U/kg快速浓注+1U/kg/min+5mg/kg的ASA。
5.抗-因子IX mAb BC21mg/kg+0.3μg/kg/min+5mg/kg的ASA。
图4和5通过显示肝素、ASA和因子IX mAb BC2对aPTT(图4)和PT(图5)的影响而描述抗-凝血剂/血栓形成样本的比较药理学。
出血素质关键指数-aPTT，用作评价本研究所用抗-凝血剂/血栓形成剂对出血倾向效力的主要标准。图4的结果证实，肝素使aPTT剂量依赖性延长，在两个较高剂量时凝血时间最大延长，超出检测限。单独的ASA不显著增加aPTT，但与肝素联合时，观察到明显的协同效应。因子IX mAbs对于aPTT具有中度作用，即使是最高剂量，凝血时间的增加也不超过临床实践所用标准抗-凝血剂的3倍界限。最显著的是，低剂量因子IX mAb BC2与ASA联合并不改变aPTT。
图5中，数据表明肝素在两个高剂量时和ASA+肝素联合时也使PT显著延长，但任何剂量的因子IX mAb单独时或者与ASA联合时均不使PT延长。
肝素、ASA和因子IX mAb对颈动脉闭塞的作用示于图6。结果表明，所有载体-治疗动物的颈动脉因对损伤发生响应而闭塞。肝素剂量依赖性地抑制颈动脉的闭塞。在最高剂量时，肝素完全预防颈动脉闭塞；然而，该剂量时不能引发凝血。单独ASA对于颈动脉闭塞仅有微小的作用。ASA与肝素联合也不能完全预防颈动脉闭塞。因子IX mAb在两个高剂量时完全中止颈动脉闭塞，而这两个剂量并不使凝血延长超过临床所需的目标。单独使用很多情况下不能保证开放的低剂量因子IX mAb，当与ASA联合给药时，完全抑制颈动脉闭塞。
肝素、ASA和因子IX mAb对血栓重量的影响示于图7。肝素剂量依赖性减小颈动脉血栓块。然而，尽管完全阻断凝血，但是仍在颈动脉中发现了一些残余的血栓。ASA单独使用或者与肝素(30 U/kg给药方案)联合给药仅部分影响血栓重量。因子IX mAb剂量依赖性减小血栓块，高剂量确实完全预防血栓形成。而且，低剂量抗-因子IX mAb和ASA联合，一个完全预防颈动脉闭塞而对凝固指标无不利影响的给药方案，完全预防血栓形成。
在大鼠颈动脉血栓形成模型进行的该项研究清楚地证明，因子IX mAb在高度形成血栓的动脉损伤模型中预防血栓形成的效力。最为突出的是，证实了因子IX mAb的效力落在aPTT限定的所期望的治疗抗凝目标内。而且，肝素-现行的标准抗凝剂，仅在严重影响凝固达到产生不可凝固血液程度的剂量时才能获得与因子IX mAb堪比的效力。有趣的是，观察到的ASA与肝素联合治疗所达到的提高效力的作用和协同作用，在ASA与抗-因子IX mAb联合给药时也得到了证实。然而，与肝素和ASA联合导致抗-血栓形成和抗-凝血剂作用均增强不同，因子IX mAb和ASA联合导致抗-血栓形成效力提高而与对体外血液凝固参数没有持续作用。一起考虑，数据显示，因子IX mAb卓越的抗血栓形成能力比得上肝素、ASA或肝素与ASA的联合。
实施例4大鼠血栓形成模型的扫描电镜应用氯化铁后15分钟，从假性对照(sham)、单用氯化铁、氯化铁+6mg/kg因子IX抗体的模型中采集大鼠颈动脉(3/组)片段。通过甲醛灌注并且结扎损伤区域的上下两端而固定动脉。将固定动脉脱水，六甲基二硅氮烷中温育并在干燥器中干燥。将干燥的动脉纵向切开，放置在扫描电镜(SEM)的支柱上并用金溅射涂膜。
假性对照动脉的SEM显示基本正常的内皮，伴有零星分散的血小板。内皮中有少数破裂处，可能是手术期间机械损伤的结果，下面的基底膜覆盖有一层血小板。在模型大鼠中未观察到血栓形成的证据。
用氯化铁处理的动脉SEM显示占据管腔大部分的大的壁血栓。血栓由聚集的血小板、红细胞和无定形及纤维性蛋白性材料。蛋白性材料由纤维蛋白组成。动脉内皮大部分被大的血栓遮盖。可以看到，用氯化铁处理过的区域下的内皮被无数附着的血小板和无定形蛋白性物质所覆盖。
取自大鼠的用氯化铁处理、也用因子IX抗体处理过的动脉的SEM，显示大部分管腔没有血栓。用氯化铁处理过区域下的内皮显示出广泛损伤，且一些区域被附着的血小板所覆盖和血小板聚集，但是没有或者很少有蛋白性物质。
实施例5抗-因子IX mAb BC2重链和轻链cDNA序列分析使用TriReagent(Molecular Research Center，Inc.，Cincinnati，OH)按照制造商的指导纯化总RNA。用异丙醇沉淀RNA并溶于0.5％SDS以及以0.5MNaCl调整。按照制造商的指导，使用Dynabeads Oligo(dT)25(Dynal A.S.，LakeSuccess，NY)分离聚腺苷酸化RNA。从珠粒中洗脱聚腺苷酸化RNA并将后者重悬于TE缓冲液。根据制造商的说明书(Boehringer Mannheim Cat.No.1483-188)，以dT寡聚物起始采用RT-PCR试剂盒将12等量份的100ng RNA进行反转录。对于重链，使用鼠IgG2a铰链引物(SEQ ID NO1)和重链信号序列引物(SEQ ID NO2)，将6 RNA/DNA杂化物进行25轮PCR扩增。类似地，对于轻链，使用小鼠κ引物(SEQ ID NO3)和简并轻链信号序列引物(SEQ ID NO4)，将6 RNA/DNA杂化物进行25轮PCR扩增。将12份扩增物中的每一份PCR产物联接PCR2000载体(TA cloning Kit，Invitrogen，Cat.No.K2000-01)。随机挑选重组克隆的集落，使用Birnboim和Doly在Nucl.Acids Res.7，1513(1979)中所述的碱性提取方法，小量制备质粒DNA。用EcoRI消化分离的质粒DNA，并在0.8％琼脂糖凝胶上进行分析。通过改进的Sanger法，对双链cDNA的适宜大小的插入片段(即对于重链是～700bp而对于轻链是～700bp)测序。比较所有12份产物的重链和轻链的序列，得到共有的BC2重链可变区序列(SEQ ID NO5)和共有的BC2轻链可变区序列(SEQ ID NO6)。
BC2重链可变区cDNA的序列分析揭示了编码121氨基酸序列的363核苷酸开放阅读框架(SEQ ID NO7)。重链CDR1、2和3序列分别列于SEQID NOs8、9和10。
BC2轻链可变区cDNA的序列分析揭示了编码107氨基酸序列的321核苷酸开放读框(SEQ ID NO11)。轻链CDR1、2和3序列分别列于SEQ IDNO12、13和14。
实施例6人源化抗体将称为SB 249413、SB 249415、SB 249416、SB249417、SB 257731和SB 257732的6个人源化抗体设计为在人抗体框架中含有上述鼠CDRs。
SB 249413SB 249413含有重链F9HZHC 1-0和轻链F9HZLC 1-0。使用得自免疫球蛋白RF-TS3′CL的重链的前3个框架区(Capra，J.D.等，J.Clin.Invest.86，1320-1328(1990)在Kabat数据库中标识为KabproHhc10w)和前述BC2重链CDRs，设计合成的可变区人源化重链F9HZHC 1-0。不进行影响CDR呈递的框架氨基酸取代。产生四个重叠的合成寡核苷酸(SEQ ID NOs15、16、17和18)，后者在退火和延伸时，编码代表重链可变区并包括CDR3(SEQ IDNOs19和20)的氨基酸。然后，使用PCR引物(SEQ ID NOs21和22)扩增该合成的基因，将该基因联接于pCR2000载体(TA cloning Kit，Invitrogen，Cat.No.K2000-01)并从SpeI、KpnI限制性消化中分离。使用2个引物(SEQID NOs26和27)经PCR扩增编码人源化抗-呼吸道合病毒重链(SEQ ID NO25)的构建物的适当区域，并用限制性内切酶EcoRI和SpeI进行消化，得到编码包括可变区(SEQ ID NOs23和24)前5个氨基酸的campath信号序列的第二个DNA片段。产生的2个片段联接进EcoR1、KpnI消化的含有人共有框架4和IgG1恒定区的pFHZHC2-6pCD哺乳动物细胞表达载体。含有单个氨基酸突变载体的pFHZHC2-3pCD载体描述在公布的国际专利申请WO94/05690中。用XbaI和EcoR5消化pFHZHC2-3pCD并插入得自2个合成的寡核苷酸(SEQ ID NOs28和29)的联接子，使框架2最后的残基(残基49)由丝氨酸突变为丙氨酸。F9HZHC 1-0插入物的序列示于SEQ ID NOs30和31。
使用得自免疫球蛋白LS8′CL(Carnack等，J.Exp.Med.169，1631-1643(1989)在Kabat数据库中标识为KabproHk1318)的人轻链的框架区和前述BC2轻链CDRs，设计合成的可变区人源化轻链F9HZLC 1-0。不进行可能影响CDR呈递的框架氨基酸取代。产生了两个重叠的合成的寡核苷酸(SEQ ID NOs32和33)，当后者退火和延伸时，编码代表轻链可变区(SEQ ID NOs34和35)的氨基酸。然后，使用PCR引物(SEQ ID NOs36和37)扩增该合成的基因，将该基因联接进pCR2000载体(TA cloning Kit，Invitrogen，Cat.No.K2000-01)并从ScaI、SacII限制性消化中分离。使用2个引物(SEQ ID NOs26和40)经PCR扩增编码人源化抗-呼吸道合病毒重链(SEQ ID NO25)的构建物的适当区域，并用限制性内切酶EcoRI和ScaI进行消化，得到编码包括可变区(SEQ ID NOs38和39)头2个氨基酸的campath信号序列的第二个DNA片段。将产生的2个片段联接进EcoR1、SacII消化的含有人框架4和κ恒定区的pFHzLC1-2pCN哺乳动物细胞表达载体中。含有单个氨基酸突变的载体的pFHZLC1-1pCN载体描述在公布的国际专利申请WO94/05690中。通过用SmaI和Kpn1消化pFHZLC1-pCN并插入得自2个合成的寡核苷酸(SEQ ID NOs41和42)的联接子，使框架2的一个残基由丝氨酸突变为脯氨酸。F9HZLC 1-0插入物的序列示于SEQ IDNOs43和44。
SB 249415SB 249415含有重链F9HZHC 1-1和轻链F9HZLC 1-1。这些重链和轻链构建物分别基于F9HZHC 1-0和F9HZLC 1-0，然而，它们具有影响CDR呈递的框架氨基酸取代。
F9HZHC 1-1具有可能影响CDR呈递的3个框架氨基酸取代。产生两个重叠的合成寡核苷酸(SEQ ID NOs45和46)，当后者退火和延伸时，编码代表重链可变区的可变部分的氨基酸发生改变(SEQ ID NOs47和48)。然后，使用PCR引物(SEQ ID NOs49和50)扩增合成的基因，将基因联接进pCR2000载体(TA cloning Kit，Invitrogen，Cat.No.K2000-01)并从EcoNI、KpnI限制性消化中分离。将该片段联接进EcoNI、KpnI消化的F9HZHC1-0(SEQ ID NO30)载体中。F9HZHC 1-1插入物的序列示于SEQ IDNOs51和52。
F9HZLC 1-1具有影响CDR呈递的4个框架氨基酸取代。产生两个合成的寡核苷酸(SEQ ID NOs53和54)，当后者退火时，具有KpnI和BamHI粘性末端，并编码代表轻链可变区(SEQ ID NO55)改变部分的氨基酸。用限制性内切酶KpnI和BamHI消化F9HZLC 1-0(SEQ ID NO43)并与合成的DNA联接。F9HZLC 1-1插入物的序列示于SEQ ID NOs56和57。
SB 249416SB 249416含有重链F9HZHC 1-1(上述)(SEQ ID NO52)和轻链F9HZLC 1-2。轻链构建物基于F9HZLC 1-1，然而，它具有影响CDR呈递的另外一个框架氨基酸取代。
产生了两个合成的寡核苷酸(SEQ ID NOs58和59)，当退火时，具有BamHI和XbaI粘性末端并编码代表轻链可变区可变部分的氨基酸(SEQ IDNO60)。用限制性内切酶BamHI和XbaI消化F9HZLC 1-1(SEQ ID NO56)载体并与合成的DNA相联接。F9HZLC 1-2插入物序列示于SEQ ID NOs61和62。
SB 249417SB 249417含有重链F9HZHC 1-1(上述)(SEQ ID NO52和轻链F9HZLC 2-0。使用得自免疫球蛋白REI(Palm and Hilschmann，Z.Phvsiol.Chem.354，1651-1654(1973)在Kabat数据库中标识为KabproHKL111)的人轻链框架区和前述BC2轻链CDRs，设计F9HZLC 2-0合成的可变区人源化轻链。引入5个氨基酸共有人取代基。进行影响CDR呈递的6个框架氨基酸鼠取代。产生两个重叠的合成寡核苷酸(SEQ ID NOs63和64)当后者退火并延伸时，编码代表轻链可变区的氨基酸(SEQ ID NOs65和66)。然后，使用PCR引物(SEQ ID NOs67和68)扩增该合成的基因，将该基因联接进pCR2000载体(TA cloning Kit，Invitrogen，Cat.No.K2000-01)并从ScaI、SacII限制性消化中分离。使用2个引物(SEQ ID NOs26和69)经PCR扩增编码人源化抗-呼吸道合病毒重链(SEQ ID NO25)的构建物的适当片段，并用限制性内切酶EcoRI和ScaI消化，得到编码包括可变区(SEQ ID NO38)头2个氨基酸的campath信号序列的第二个DNA片段。通过退火2个合成的寡核苷酸(SEQ ID NOs71和72)，产生编码人框架4(SEQ ID NO70)并具有SacII和NarI粘性末端的第三个DNA片段。用限制性内切酶EcoRI和NarI消化F9HZLC 1-0(SEQ ID NO43)，并联接到3个DNA片段。F9HZLC 2-0插入物的序列示于SEQ ID NOs73和74。
SB 257731SB 257731含有重链F9HZHC 1-1(SEQ ID NO52)和轻链F9HZLC 1-3，F9HZLC 1-2(SEQ ID NO62)的单个氨基酸突变。用2个引物(SEQ ID NOs26和69)经PCR扩增F9HZLC 1-2，并用限制性内切酶EcoRI和ScaI进行消化。分离出94bp片段(SEQ ID NOs75和76)。将该片段联接进EcoRI、ScaI消化的F9HZLC 1-2载体中产生轻链构建体F9HZLC 1-3。F9HZLC 1-3插入物的序列示于SEQ ID NOs77和78。
SB 257732SB 257732含有合成的可变区人源化重链F9HZHC 3-和轻链F9HZLC3-0。产生4个重叠的合成寡核苷酸(SEQ ID NOs79、80、81和82)，当后者退火并延伸时，编码代表被改变的重链可变区的氨基酸(SEQ ID NOs83和84)。然后，使用PCR引物(SEQ ID NOs85和86)扩增该合成的基因，将基因联接进pCR2000载体(TA cloning Kit，Invitrogen，Cat.No.K2000-01)中，并从StuI、KpnI限制性消化中分离。将分离的片段联接进StuI、KpnI消化的F9HZHC1-1(SEQ ID NO52)载体。然后，用EcoRI、SpeI消化该载体以除去信号序列。使用2个引物(SEQ ID NOs26和87)经PCR扩增F9HZHC1-0并用限制性内切酶EcoRI和SpeI消化，得到编码含有可变区头5个氨基酸的信号序列(SEQ ID NO23)的DNA片段。将产生的片段联接进载体中。F9HZHC3-0插入物的序列示于SEQ ID NOs88和89。
产生了4个重叠的合成寡核苷酸(SEQ ID NOs90、91、92和93)，当它们退火并延伸时，编码代表轻链可变区(SEQ ID NOs94和95)的氨基酸。然后，使用PCR引物(SEQ ID NOs96和97)扩增该合成的基因，将基因联接进pCR2000载体(TA cloning Kit，Invitrogen，Cat.No.K2000-01)并从ScaI、NarI限制性消化物中分离。将分离的片段联接进ScaI、NarI消化的F9HZLC1-3(SEQ ID NO77)载体中。F9HZLC3-0插物的序列示于SEQ IDNOs98和99。
人源化抗-子IX mAbs在CHO细胞表达。将适合在不含血清的介质中悬浮生长的DG-44细胞系接种到盛在250ml一次性无菌埃伦迈尔烧瓶(Corning)中的不含蛋白但含有1X核苷酸和0.05％F68的100ml介质中，所述埃伦迈尔烧瓶放在37℃5％C02、95％空气潮湿培养箱的Innova 2100型150rpm平台振动器(New Brunswick Scientific)上。这些细胞以4×105细胞/ml每周两次进行传代。通过用Not1消化，每15μg的pCN-Lc-轻链和pCD-Hc-重链载体线性化，无菌条件下共沉淀并重悬于50ul 1X TE缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，pH7.5)中。使用Hensley等在J.Biol.Chem.269，23949-23958(1994)中所述技术，利用Bio-Rad Gene Pulser(Bio-RadLaboratories)将DNA电传孔进Acc-098细胞中。1.2×107细胞在12.5ml冰浴PBS蔗糖溶液(PBS，272mM蔗糖，7mM pH7.4磷酸钠，1mM MgCl2)中洗涤一次，重悬于0.8ml PBS，加入50ul DNA溶液并在冰上培养15min。于380V和25微法脉冲(pulse)细胞，然后在冰上培养10min。筛选前24hr，将细胞以在维持介质中5×105细胞/板的密度铺板到96孔培养板中。在维持介质中，通过对400μg/ml G418(Geneticin，Life Technologies，Inc.)的抗性来筛选细胞。测定前24hr，用150μl维持介质营养细胞。
使用电化学发光(ECL)检测法在Origen分析器(IGEN，Inc.)上测定来自各个集落的条件培养基，参见Yang等，Biotechnology，12，193-194(1994)。
进行测定(测定缓冲剂)和操作分析器(细胞清洁剂)所需的所有溶液均来自IGEN。使用TAG-NHS-酯(IGEN，Inc.)按照TAG∶蛋白为7∶1的摩尔比标记抗体(抗-人IgG(g-链特异性)，Sigma化学品和人IgG(H+L)的F(ab′)2片段，Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.)，同时用生物素-LC-Sulfo-NHS-酯(IGEN，Inc.)以生物素∶蛋白为20∶1的摩尔比对蛋白A(Sigma)加以标记，两种标记均按照IGEN′的推荐进行。抗生蛋白链菌素-涂层的磁珠(M-280)购自Dynal。
使用下述步骤进行免疫测定每份样本，50μl抗生蛋白链菌素-涂层的磁珠(用吐温1.25％稀释成在pH7.8 PBS中的终浓度为600(g/ml)与50μl生物素-蛋白A(用1.25％吐温在pH7.8 PBS中稀释为终浓度1μg/ml)混合，并于室温搅拌状态下孵育15分钟，加入50μl TAG抗体(终浓度1.25(g/ml人IgG(H+L)的F(ab′)2片段与用1.25％吐温在pH7.8 PBS中稀释的0.25(g/ml抗-人IgG(g-链特异性)的混合物)，然后，将溶液加入到50μl条件培养介质中，于室温搅拌状态下孵育1hr。200μl测定缓冲液加入到反应混合物中，在Origen I型分析器上分析样本以测定ECL。结果表明，约20-37％的被测定集落分泌超过15ng/ml的抗体，平均表达约150ng/ml。
使用Procep A捕获步骤(step)接着进行离子交换色谱以减少DNA负担，从条件培养介质中纯化人源化抗-因子IX mAbs。Procep A吸着剂材料(Bioprocessing Ltd.，Durham，England)用于制备直径与高度比为1∶1的柱。把澄清的条件培养介质以150cm/hr的速度装载到柱上。用磷酸缓冲盐液(PBS)、含有1M NaCl的PBS、最后用PBS顺次洗柱。结合的物质用0.1M乙酸洗脱液收获。将洗脱液调整至pH5.5并用水稀释(1∶4)。以80cm/hr的速度将稀释液装载到预先用pH5.5 20mM乙酸钠平衡过的S-琼脂糖凝胶柱(2.5×13cm)上。用乙酸缓冲液洗柱直至得到稳定的基线，并用pH7.4的20mM磷酸钠以25cm/hr速度洗脱结合的蛋白。洗脱下来的物质用0.4微米的膜过滤并贮于4℃。
实施例7小鼠-人嵌合抗体按照制造商(Boehringer Mannheim Cat.No.1483-188)的指示，使用dT寡聚物引发，用RT-PCR试剂盒对100ng BC2 RNA进行反转录，用合成的ScaI(SEQ ID NO100)和NarI(SEQ ID NO101)引物扩增PCR，以产生带有Sca1、Nar1末端(SEQ ID NOs102和103)的BC2轻链可变区。该DNA联接进ScaI、NarI消化的F9HZHC1-3(SEQ ID 77)中，并用ScaI、NarI进行消化以产生小鼠-人嵌合轻链F9CHLC(SEQ ID NOs104和105)。
按照制造商(Boehringer Mannheim Cat.No.1483-188)的指示，使用dT寡聚物作为引物，用RT-PCR试剂盒对100ng BC2 RNA进行反转录，用合成的SpeI(SEQ ID NO106)和NheI(SEQ ID NO107)引物扩增PCR，以产生带有Spe1、Nhe1末端(SEQ ID NOs108和109)的BC2重链可变区。用EcoRI(SEQ ID 26)和SpeI(SEQ ID 87)引物从RSVHZ19重链(SEQ ID NO25)中PCR扩增campath信号序列。把这两个DNA片段联接进EcoRI、NheI消化的公布的国际专利申请WO95/07301所述的IL4CHHCpcd载体中，用BC2因子IX小鼠可变区代替IL4可变区，从而产生小鼠-人嵌合的重链F9CHHC(SEQ ID Nos110和111)。
按照上述人源化构建物的共转染和纯化方法，完成小鼠-人嵌合抗体chαFIX的共转染和纯化。
实施例8
人源化因子IX mAbs在大鼠血栓模型的效力为了评价人源化抗-因子IX抗体预防动脉血栓形成的效力，使用了实施例3所述的大鼠颈动脉血栓形成模型。建立颈动脉血流、动脉压、心率、血管开放和激活的部分凝血激酶时间(aPTT)的基线参数。此后15分钟，损伤颈动脉10分钟。发生颈动脉损伤后60分钟，测定这些参数。也从颈动脉中取出颈动脉血栓并称重。
所有试药均在发生颈动脉损伤前15分钟经静脉施用。检验下述治疗并与抗-因子IX mAb BC2进行比较。
1.载体2.chαFIX3mg/kg快速浓注3.SB 2494133mg/kg快速浓注4.SB 2494153mg/kg快速浓注5.SB 2494163mg/kg快速浓注6.SB 2494173mg/kg快速浓注7.SB 2577313mg/kg快速浓注8.肝素60units/kg快速浓注+2单位/kg/min输注aPTT用作评价本研究所用抗-凝血剂/血栓剂效力对出血倾向的主要标准。图8的结果证实，人源化因子IX mAbs SB 249413、SB 249415、SB249416、SB 249417和SB 257731在3.0mg/kg时对aPTT具有中度的作用，所用剂量在临床可接受范围之内。
因子IX mAbs对血栓块的作用示于图9。结果表明，所有人源化mAbs在减小血栓块方面同等有效。
该项在大鼠颈动脉血栓形成模型进行的研究清楚地证明，人源化因子IX mAbs在高度形成血栓的动脉损伤模型中预防血栓形成的效力。最突出的是，所有人源化因子IX mAbs的效力落入所期望的由aPTT限定的治疗抗凝目标范围之内。
实施例9抗体的生物化学和生物物理学特性用MALD-MS测定SB 249417的分子质量为148,000Da。SB 249417的分析性超速离心得到完全相同的值。在因子IX和Ca2+存在时，得自BC 2沉淀的抗体具有248,000Da的质量，相当于mAb和两个因子IX合起来的质量。存在或不存在因子IX时，未观测到更高数量级聚集物的证据。
用与固定的蛋白A表面相结合的抗体，使用BIAcore分析法评定了因子IX与SB 249417结合的动力学。使用49nM重组人因子IX(rhFIX，GeneticsInstitute)并在5mM Ca2+存在条件下进行测定。相互作用以快速结合和相对缓慢的解离速度为特征，结合kass＝2.0×105M-1s-1，而解离kdiss＝4.1×10-4s-1。计算出因子IX结合的Kd为1.9nM。
表1总结SB 249417的生物物理学特性。
表1SB 249417的生物物理学特性总结同位型 IgG1，kappa由SDS-PAGE的纯度＞95％(还原条件下)分子量质谱测量法 148,000Da分析性超速离心法148,000Da因子IX结合的化学计量学等温滴定测热法 1.5摩尔因子IX∶1摩尔mAb因子IX结合亲合性等温滴定测热法 Kd＝4nM，25℃生物传感器 Kd＝2nM因子IX结合动力学生物传感器 kass＝2.0×105M-1s-1kdiss＝4×10-4s-1表2总结本发明mAbs的因子IX结合特性。计算的解离常数基本上相同，在试验误差之内。
表2因子IX与抗-因子IX mAbs结合的动力学mAbkass(M-1s-1)kdiss(s-1) calc.KD(nM)SB 2494172.0×1054.1×10-41.9BC2 4.8×1059.1×10-41.9Chf9 2.4×1053.0×10-41.3SB 2494136.5×1052.8×10-33.7-5.1SB 2494157.5×1051.8×10-41.1-2.3SB 2494165.2×1054.1×10-40.8SB 2577319.2×1059.9×10-41.1SB 2577321.1×1061.2×10-31.5用滴定微量量热法描述rhFIX和SB 249417，BC2和其它人源化构建物之间相互作用的特征，微量量热法测量溶液中来自结合固有热的结合相互作用。将106(M FIX 9次注射入含有2μM mAb SB 249417的热量计中。以发出的热量检测头4次注射的结合。最后5次注射时，用FIX饱和mAb结合位点，仅仅观测到混合的基础(background)热量。结果表明，如预期的那样，等位点发生在FIX/mAb的摩尔结合比接近2。非线性最小平方分析这些数据得到结合亲合力。
在34-44℃温度范围内，在pH 7.4的10mM HEPES、10mM CaCl2、150mM NaCl中，测定mAbs的rhFIX亲和力。这些数据使得直接测定37℃的亲和力，从van′t Hoff方程中计算25℃时的亲和力。表3中的数据表明，SB 249417、BC2和它的其它人源化构建物的亲和力相同，在误差之内(因子2)。
表3抗-FIX mAbs滴定测热法的结果mAb Kd，nM(25℃)Kd，nM(37℃)摩尔结合比FIX/mAbBC2 10 20 1.4SB 2494136 12 1.9SB 2494153 7 1.7SB 2494174 12 1.5SB 2577324 9 1.8通过差式扫描测热法测定，mAbs SB 249413、SB 249415、SB 249417和SB 257732均显示出极类似的热稳定性。它们的未折叠(unfolding)Tms范围为70-75℃，表明对抗热诱导变性的高稳定性。
实施例10抗体-介导的抑制因子IX的机制构建由因子IX序列剪接进同源蛋白因子VII框架而构成的嵌合构建物文库，并用于绘制因子IX BC2 mAb的表位。见Cheung等，Thromb.Res.80，419-427(1995)。使用BiaCore 2000表面胞质团共振装置，测定结合。BC2抗体利用NHS/EDC反应直接与芯片(chip)偶合。在pH7.4，25mM MOPS、0.15M NaCl、5mM CaCl2中，以20μL/min的量与200nM每种给定构建物进行接触，接触两分钟测定结合。使用相同但不含蛋白质的缓冲液，监测3分钟的解离情况。在存在50mM EDTA的条件下，未检测到野生型构建物。数据示于表4。
表4因子IX构建物与BC2抗体结合的总结
这些数据表明，下列构建物表现出与BC2结合含有因子IX轻链和因子VII重链(IX LC/VII HC)的构建物；含有因子IX gla和芳族堆叠结构域(IX-A/VII)的构建物；含有在因子VII gla结构域(VII gla(IX 3-11)/IX)之内的因子IX gla结构域的残基3-11的构建物；和含有在残基5(IX K5A)处具有赖氨酸取代为丙氨酸的因子IX的构建物。VII gla(IX 3-11)/IX构建物显示出等同于野生型因子IX(血浆IXa and r-IX)的BC2结合性。因此，BC2抗体与含在因子IX gla结构域残基3-11之内的表位相结合。
实施例11用抗-因子IX抗体和组织纤溶酶原激活物治疗动脉血栓形成在颈动脉完全闭塞后开始施用tPA，伴有或不伴有辅助治疗。持续监测动脉的血流。
用戊巴比妥钠(55mg/kg，i.p.)麻醉体重300-490gm的雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River，Raleigh，NC)。把大鼠仰位置于加热的(37℃)手术板上，在颈部制造切口；分离气管，用PE-240 Intramedic tube进行气管插管。然后分离左颈动脉和颈静脉。将Parafilm M垫(4mm2，AmericanNational Can)放置在颈动脉下，在动脉上放置电磁血流探针(Carolina Medical)以测量血流。为了给药，将插管(Tygon，0.02″×0.04″，Norton PerformancePlastics)插入颈静脉中。接下来，分离左股动脉并进行插管以测量血压和采集血液样本。
按照实施例3的方法，把用FeCl3溶液(50％)饱和过的直径6.5mm的玻璃微滤纸环状片放置在颈动脉流速探针下游10分钟，引发颈动脉中的血栓形成。在该特性得到清楚描述的模型中，血栓通常在15分钟内完全形成。
抗-因子IX抗体、SB 249415以快速浓注方式施用而与tPA(Genentech，South San Francisco，CA)联合给药，而以快速浓注方式施用肝素(Elkins-SinnInc.，Cherry Hill，NJ)，然后输注。所有药物输注持续到实验期间末-自血管闭塞时间起60分钟。于0、30和60min(实验末)时自股动脉采集血液样本1mL，加入3.8％柠檬酸溶液并离心，用于aPTT和PT测定。用带有标准程序的fibrometer(BB1L，Baxter Dade或MLA Electra 800自动凝固计时器)监测aPTT和凝血酶原时间(PT)。实验末时，从颈动脉取出血栓并称重。
所有数据用平均组值(SEM表示以表明各组大鼠的只数。组间分析使用多项比较目的的ANOVA和Bonferoni检验，p＜0.05则认为有显著性。
通过将FeCl3处理过的片敷贴到大鼠颈动脉而造成动脉开始损伤后约15min，发生闭塞血栓形成。如图10所示，单用tPA，在60min实验方案期间，仅在施用剂量为9mg/kg tPA后67％受治疗血管显示出重新得到血流时才观察到闭塞血管再灌注。该剂量的tPA，包括60U/kg肝素或3mg/kg抗-因子IX抗体，SB 249415，会导致再灌注发生率的进一步增加，提示在FeCl3损伤模型中大约30％血栓对于溶解而言是难治疗的。
图10的结果表明，低剂量tPA，再灌注发生率显著依赖于与溶栓剂一同给药的抗凝剂。当施用60U/kg肝素时，显示再灌注的血管百分比急剧下降，用3和6mg/kg tPA时，分别仅观察到12.5％和40％再灌注。然而，当3mg/kg SB 249415与tPA一同给药时，3mg/kg tPA达到大于60％再灌注，6mg/kg tPA时，大于79％再灌注。因此，抗-因子IX抗体显著位移溶栓剂量响应曲线，使得低剂量溶栓剂即可再灌注。
血栓溶解和血凝块形成是动态过程，有时观察到再闭塞后的开放期间。既然在60min实验方案期间持续监测颈动脉血流，那么也就可能定量颈动脉开放(patency)的总时间。如图11所示，血管开放的总期间大体上因3mg/kg抗-因子IX抗体和tPA的联合施用而增加。这在最低剂量和中等剂量tPA即分别为3和6mg/kg时尤为明显。联合施用剂量为3mg/kg SB 249415和3mg/kg tPA时，总开放时间为30.6±9.2min，与之相对，联合施用60U/kg肝素和3mg/kg tPA时，总开放时间为7.1±7.1min。单用3mg/kg tPA，开放时间为0。剂量为6mg/kg的tPA与肝素联合施用，仅使开放时间轻微增加至12.9±6.0min。而与tPA-SB 249415联合，则达到最大开放时间38.7±8.4min。仅在最高剂量tPA(9mg/kg)时，与肝素的联合才接近与SB 249415联合时达到的开放时间，分别为31.9±4.8min和38.0±8.4min。
动脉梗塞后血流的快速恢复对于使局部缺血组织的损害降至最小而言是决定性的。图12的结果表明，抗-因子IX抗体与tPA联合相对于单用tPA或者肝素加用tPA来说，使再灌注时间减少，使用低剂量tPA即可达到这一效果。当3mg/kg SB 249415与3mg/kg tPA联合施用来造成血栓溶解时，血栓溶解时间是29.4±9.2min。单用3mg/kg tPA，未观察到再灌注。用60U/kg肝素与3mg/kg tPA联合，血栓溶解时间是52.8±7.1min。更高剂量的tPA，6和9mg/kg，抗体与tPA联合治疗方案取得分别在19.4±6.3和20.8±8.7min开始血栓溶解的效果。在不加抗凝剂的情况下，6和9mg/kg tPA的血栓溶解时间分别是60min(即实验方案的界限)和27.5±6.4min。加入60U/kg肝素，相应的血栓溶解时间是44.0±7.1和27.0±4.9min。因此，使用SB 249415总是能够较肝素或者单用tPA更早取得再灌注。
实施例12抗-因子IX抗体对止血功能的影响在用单独tPA、tPA与肝素联合以及tPA与SB 249415联合对大鼠治疗的治疗期末，通过监测纤维蛋白原、纤溶酶原和α-2-抗纤溶酶的水平测定了抗-因子IX或作为辅助剂的肝素对维持止血功能的影响，并与使用载体治疗动物的结果进行比较。如图13所示，增加tPA的剂量导致每一种所测止血标志物的水平下降。随着tPA剂量增加至9mg/kg，α-2-抗纤溶酶水平从未用tPA治疗动物的约90％降至约20％。在9mg/kg治疗组，纤溶酶原水平从未用tPA治疗的约100％平均值降至约40％。类似地，在高剂量tPA组，纤维蛋白原水平从约150mg/dL降至约90mg/dL。有趣的是，辅剂的选择并不显著影响其中的任何一种标志物。在施用载体、30或60U/kg肝素或者1或3mg/kg SB 249415的动物中，每一剂量的TPA均观察到相似水平的α-2-抗纤溶酶、纤溶酶原和纤维蛋白原；观察到的止血标志物的降低只是溶栓剂剂量，tPA的函数，而且这些降低特别是纤维蛋白原的降低，似乎在tPA剂量大于6mg/kg，即在最高剂量组9mg/kg时尤其明显。
也监测了不同治疗方案对标准aPTT凝固试验aPTT的影响(图14)。随着tPA剂量增加，aPTT分别由对使用载体和9mg/kg tPA的19.3s±0.6s增至30.0s±1.6s。施用3mg/kg SB 249415，对照动物aPTT的有限增加，增至49.6s±6.4s。当SB 249415与tPA联合给药时，观察到aPTT稍有增加，并取决于tPA剂量。SB 249415与3mg/kg tPA联合时，aPTT为58.3s±5.2s，而SB 249415与9mg/kg tPA联合，则使aPTT增至77.3s±19.7s。施用30U/kg或60 U/kg剂量的肝素，导致aPTT大幅度增加。没有tPA时，30和60U/kg剂量的肝素，其aPTT分别为约300s到600s。tPA治疗的动物，aPTT为约800s。
肝素提高aPTT，特别是与干扰止血参数的药剂配伍时，由于需要高剂量tPA以达到有效再灌注，因而很容易造成出血倾向。相反，SB 249415并不引起aPTT明显提高并且能够使用低剂量tPA，从而带来在心肌梗塞和中风的溶栓治疗中的显著优势。
实施例13SB 249417提高中风时组织纤溶酶原激活物的溶解的潜力在这些研究中使用的大鼠血栓栓塞中风模型基本上如Busch等在BrainResearch，778，16-24(1997)中所描述的那样。按照模型的三个主要步骤进行制备栓子，栓子形成后准备大鼠，进行药理干预。
将取自供体大鼠的全血盛入柠檬酸化的空白管(vacutainer tube)中。将柠檬酸化(citrated)的血液(500ul)快速地加入含有1单位人凝血酶和5μl 1MCaCl2测试管中，CaCl2终浓度为10mM。5-10秒钟内，将小部分的混合物取出装入～15cm长的PE50导管中，使之在室温下凝结1小时。1小时结束时，从管中挤出凝块放入盛有盐水的佩氏培养皿中，切成1.5mm长的切片。将12块切片(血凝块)转移到含有0.04mg/ml大鼠白蛋白的盐溶液中，并以～60μl体积灌回PE50导管中。在导管中首尾相接的血凝块用于大鼠的栓子形成。
对体重350-400g的雄性Sprague Dawley大鼠进行手术，以备接受皮下剂量的阿托品(0.5mg/kg)，然后用5％异氟烷麻醉，维持剂量使用2％异氟烷。体温保持在37-38℃。在无菌条件下，在颈部制造saggital正中切口，暴露右侧颈总动脉(CCA)，右侧内端颈动脉(ICA)，右侧外端的颈动脉(ECA)，以及翼腭动脉。给翼腭动脉打结(tied off)。分离出一段ECA后结扎并切断。用血管钳夹住CCA和ICA，将含有栓子的PE50导管插入ECA残端并延伸到分叉处。去除ICA的血管钳，在松开CCA血管钳的同时将血栓缓慢注入ICA。在栓子形成后5分钟，开始通过尾静脉输注载体(盐液)、SB249417(2.0mg/kg)和/或t-PA(5.0mg/kg)。SB 249417以单一快速浓注剂量输注，而t-PA的5mg/kg剂量则以10％快速浓注，接着在30分钟时间内将剩余的90％输注。闭合手术切口，使大鼠苏醒。
血栓形成后24小时，麻醉并处死大鼠。取出脑，并从前脑干开始切出每个2mm厚的7个横断面切片。在1％2，3，5-氯三苯四唑中温育20分钟，接着进行甲醛固定。对染色的脑切片摄像，使用图象分析系统(Optimus Inc.，Bothell，Wash)进行分析。由不知实验情况的操作者通过描计计算机屏幕上的梗塞来计算以mm2为单位的梗塞面积。每种处理情况下合起来的平均梗塞示于图15(对照(n＝20)，tPA(n＝7)和SB 249417(n＝6))。栓塞后给大鼠施用tPA(5.0mg/kg)使平均梗塞体积减少～33％。单独施用SB 249417使梗塞体积减少～70％。tPA(5.0mg/kg)和SB 249417(2.0mg/kg)联合施用，提供进一步的保护作用，使平均梗塞体积减少～88％(P＝0.126)。该模型中，梗塞以类似频率出现在纹状体和新皮质。基于梗塞组织的部位，闭塞最频发生部位是大脑中脑动脉(MCA)。尽管频率小，但是证据提示脉络膜、大脑前动脉和大脑脑后动脉也偶尔发生闭塞。通过冠状切面(未提供数据)观察时，在治疗基础上出现的梗塞体积减少大部分在中央MCA灌注区域。治疗后，几乎不改变梗塞组织分布。
结果表明，栓塞后施用抗-因子IX抗体如SB 249417作为单剂治疗或者作为溶栓剂如tPA的辅剂时，可以减少梗塞脑组织的形成。期望抗-因子IX抗体如SB 249417作为单剂药物或者作为溶栓剂的辅剂在治疗血栓栓塞中风中具有临床实用性。联合治疗使得溶栓剂剂量减小并由此而减少了促发出血性中风的风险。
本发明可以其它并不背离本发明精神或者基本特性的具体形式实施，因此，表明本发明保护范围应当参照本发明权利要求书而不是前述的说明书。
序列表序列表(1)一般信息(i)申请人迈克尔，布莱克本(Blackburn，Michael)乔拉，福伊尔斯坦(Feuerstein，Giora)弗兰克.C.巴龙(Barone，Frank C.)约翰.R.图米(Toomey，John R.)(ii)发明名称抗血栓剂(iii)序列数量111(iv)相关地址(A)地址史密丝克莱恩比彻姆公司(SmithKline Beecham Corporation)(B)街道709 Swedeland Road(C)城市King of Prussia(D)州PA(E)国家美国(F)ZIP19406(v)计算机可读形式(A)介质类型磁盘(B)计算机IBM相容机(C)操作系统DOS(D)软件FastSEQ Version 1.5(vi)现申请数据(A)申请号未知(B)申请日期herewith(C)分类(vii)优先权项(A)申请号09/571,434(B)申请日期15-MAY-2000(viii)代理人/代理信息(A)姓名EBaumeister，Kirk(B)登记号33,833(C)参考/文档号码P50438-2(ix)联系信息(A)电话610-270-5096(B)传真610-270-5090(C)TELEX(2)序列信息SEQ ID NO1(i)序列特征
(A)长度20个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO1CATCCTAGAG TCACCGAGGA 20(2)序列信息SEQ ID NO2(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO2AGCTGCCCAA AGTGCCCAAG C21(2)序列信息SEQ ID NO3(i)序列特征(A)长度36个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO3CTAACACTCA TTCCTGTTGA AGCTCTTGAC AATGGG36
(2)序列信息SEQ ID NO4(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO4GATTTTCARG TGCAGATTTT C 21(2)序列信息SEQ ID NO5(i)序列特征(A)长度363个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO5CAGATCCAGT TGGTGCAGTC TGGACCTGAG CTGAAGAAGC CTGGAGAGAC AGTCAAGATC 60TCCTGCAAGG CTTCTGGGTA CACCTTCACA AACTATGGAA TGAACTGGGT GAAGCAGGCT120CCAGGAAAGG GTTTAAAGTG GATGGGCTGG ATAAACACCA GAAATGGAAA GTCAACATAT180GTTGATGACT TCAAGGGACG GTTTGCCTTC TCTTTGGAAA GCTCTGCCAG CACTGCCAAT240TTGCAGATCG ACAACCTCAA AGATGAGGAC ACGGCTACAT ATTTCTGTAC AAGAGAAGGG300AATATGGATG GTTACTTCCC TTTTACTTAC TGGGGCCAAG GGACTCTGGT CACTGTCTCT360GCA 363(2)序列信息SEQ ID NO6(i)序列特征(A)长度321个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA
(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO6CAAATTGTTC TCTCCCAGTC TCCAGCAATC CTGTCTGCAT CTCCAGGGGA GAAGGTCACA 60ATGACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTAAAT TACATGCACT GGTACCAGCA GAAGCCAGGA120TCCTCCCCCA AACCCTGGAT TTATGCCACA TCCAACCTGG CTTCTGGAGT CCCTGCTCGC180TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCAGCAGAGT GGAGGCTGAA240GATGCTGCCA CTTATTACTG CCAGCAGTGG AGTATTAACC CACGGACGTT CGGTGGAGGC300ACCAAGCTGG AAATCAAACG G 321(2)序列信息SEQ ID NO7(i)序列特征(A)长度121氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO7Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe50 55 60Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn65 70 75 80Leu Gln Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115 120(2)序列信息SEQ ID NO8(i)序列特征(A)长度5氨基酸
(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO8Asn Tyr Gly Met Asn15(2)序列信息SEQ ID NO9(i)序列特征(A)长度17氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO9Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys1 5 10 15Gly(2)序列信息SEQ ID NO10(i)序列特征(A)长度12氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO10
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Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His1 5 10(2)序列信息SEQ ID NO13(i)序列特征(A)长度7氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO13Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser1 5(2)序列信息SEQ ID NO14(i)序列特征(A)长度9氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO14Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr1 5(2)序列信息SEQ ID NO15(i)序列特征(A)长度104个碱基对(B)类型 核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无
(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO15CAACTAGTGC AATCTGGGTC TGAGTTGAAG AAGCCTGGGG CCTCAGTGAA GGTTTCCTGC 60AAGGCCTCTG GATACACCTT CACTAACTAT GGAATGAACT GGGT 104(2)序列信息SEQ ID NO16(i)序列特征(A)长度108个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO16TTGAAGTCAT CAACATATGT TGACTTTCCA TTTCTGGTGT TTATCCATCC CATCCACTCG 60AGCCCTTGTC CAGGGGCCTG TCGCACCCAG TTCATTCCAT AGTTAGTG 108(2)序列信息SEQ ID NO17(i)序列特征(A)长度107个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO17GTCAACATAT GTTGATGACT TCAAGGGGCG GTTTGTCTTC CCTCTGTCAG CACGGCATAT 60CTACAGATCA GCAGCCTAAA GGCTGACGAC ACTGCAGTGT ATTACTG 107
(2)序列信息SEQ ID NO18(i)序列特征(A)长度91个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO18GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGCACA60GTAATACACT GCAGTGTCGT CAGCCTTTAG G 91(2)序列信息SEQ ID NO19(i)序列特征(A)长度337个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(ix)特点(A)NAME/KEY编码序列(B)位置2...337(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO19A CTA GTG CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC TCA GTG AAG49Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys1 5 10 15GTT TCC TGC AAG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT GGA ATG AAC 97Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn20 25 30TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC GAG TGG ATG GGA TGG ATA145Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile
35 40 45AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC AAG GGG CGG193Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg50 55 60TTT GTC TTC TCC TTG GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTA CAG ATC241Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile65 70 75 80AGC AGC CTA AAG GCT GAC GAC ACT GCA GTG TAT TAC TGT GCG AGA GAA289Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu85 90 95GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC CAG GGT ACC337Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110(2)序列信息SEQ ID NO20(i)序列特征(A)长度112氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO20Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys1 5 10 15Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn20 25 30Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile35 40 45Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg50 55 60Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile65 70 75 80Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu85 90 95Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110(2)序列信息SEQ ID NO21
(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO21GCTACTAGTG CAATCTGGGT CTGAGTTGAA GCC 33(2)序列信息SEQ ID NO22(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO22TGGGTACCCT GGCCCCAGTA AGTAAAAGGG 30(2)序列信息SEQ ID NO23(i)序列特征(A)长度97个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(ix)特点(A)NAME/KEY编码序列
(B)位置27...95(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO23GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC53Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe1 5TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG GTC CAA CTA GT 97Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Val Gln Leu10 15 20(2)序列信息SEQ ID NO24(i)序列特征(A)长度23氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO24Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Val Gln Leu20(2)序列信息SEQ ID NO25(i)序列特征(A)长度110个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源
(xi)序列描述SEQ ID NO25GGAGACGCCA TCGAATTCTG AGCACACAGG ACCTCACCAT GGGATGGAGC TGTATCATCC 60TCTTCTTGGT AGCAACAGCT ACAGGTGTCC ACTCCCAGGT CCAACTGCAG 110(2)序列信息SEQ ID NO26(i)序列特征(A)长度21个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO26GGAGACGCCA TCGAATTCTG A 21(2)序列信息SEQ ID NO27(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO27GATTGCACTA GTTGGACCTG GGAGTGGACA 30(2)序列信息SEQ ID NO28(i)序列特征(A)长度77个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无
(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO28CTAGAGTGGG TCGCAGAGAT CTCTGATGGT GGTAGTTACA CCTACTATCC AGACACTGTG60ACGGGCCGGT TCACGAT 77(2)序列信息SEQ ID NO29(i)序列特征(A)长度73个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO29ATCGTGAACC GGCCCGTCAC AGTGTCTGGA TAGTAGGTGT AACTACCACC ATCAGAGATC60TCTGCGACCC ACT 73(2)序列信息SEQ ID NO30(i)序列特征(A)长度363个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(ix)特点(A)NAME/KEY编码序列(B)位置1...363(D)其它信息F9HZHC 1-0(xi)序列描述SEQ ID NO30CAG GTG CAA CTA GTG CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC 48
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT 96Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30GGA ATG AAC TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC GAG TGG ATG144Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45GGA TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC192Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe50 55 60AAG GGA CGG TTT GTC TTC TCC TTG GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT240Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80CTA CAG ATC AGC AGC CTA AAG GCT GAC GAC ACT GCA GTG TAT TAC TGT288Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95GCG AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC336Ala Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly100105 110CAG GGT ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA363Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120(2)序列信息SEQ ID NO31(i)序列特征(A)长度121氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO31Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe50 55 60Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120(2)序列信息SEQ ID NO32(i)序列特征(A)长度165个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO32AGTACTGACA CAGTCTCCAG CCACCCTGTC TTTGTCTCCA GGGGAAAGAG CCACCCTCTC 60CTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT GCACTGGTAC CAACAGAGAC CTGGCCAGGC120TCCCAGGCTC CTCATCTATG CCACTAGTAA CCTGGCTTCT GGCAT165(2)序列信息SEQ ID NO33(i)序列特征(A)长度146个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO33CCGCGGGTTA ATACTCCACT GCTGACAGTA ATAAACCGCA AAATCTTCAG GCTCTAGACT 60GCTGATGGTG AGAGTGAAAT CTGTCCCAGA CCCGGATCCA CTGAACCTGG CTGGGATGCC120
AGAAGCCAGG TTACTAGTGG CATAGA 146(2)序列信息SEQ ID NO34(i)序列特征(A)长度280个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(ix)特点(A)NAME/KEY编码序列(B)位置2...280(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO34A GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA 49Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg1 5 10 15GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG 97Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp20 25 30TAC CAA CAG AGA CCT GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT GCC ACT145Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Thr35 40 45AGT AAC CTG GCT TCT GGC ATC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC GGG TCT193Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser50 55 60GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTA GAG CCT GAA GAT TTT241Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe65 70 75 80GCG GTT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG280Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg85 90(2)序列信息SEQ ID NO35(i)序列特征
(A)长度93氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO35Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg1 5 10 15Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp20 25 30Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Thr35 40 45Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser50 55 60Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe65 70 75 80Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg85 90(2)序列信息SEQ ID NO36(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO36TCGAGTACTG ACACAGTCTC CAGCCAC 27(2)序列信息SEQ ID NO37(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO37GACCGCGGGT TAATACTCCA CTGCTGA27(2)序列信息SEQ ID NO38(i)序列特征(A)长度94个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(ix)特点(A)NAME/KEY编码序列(B)位置27...92(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO38GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC53Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe1 5TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC GAG ATA GTA CT 94Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Glu Ile Val10 15 20(2)序列信息SEQ ID NO39(i)序列特征(A)长度22氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无
(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO39Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly15 10 15Val His Ser Glu Ile Val20(2)序列信息SEQ ID NO40(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO40GACTGTGTCA GTACTATCTC GGAGTGGACA30(2)序列信息SEQ ID NO41(i)序列特征(A)长度55个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO41GGGCAGCCTC CTAAGTTGCT CATTTACTGG GCGTCGACTA GGGAATCTGG GGTAC55(2)序列信息SEQ ID NO42(i)序列特征(A)长度51个碱基对
(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO42CCCAGATTCC CTAGTCGACG CCCAGTAAAT GAGCAACTTA GGAGGCTGCC C51(2)序列信息SEQ ID NO43(i)序列特征(A)长度321个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(ix)特点(A)NAME/KEY编码序列(B)位置1...321(D)其它信息F9HZLC1-0(xi)序列描述SEQ ID NO43GAA ATA GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG 48Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30CAC TGG TAC CAA CAG AGA CCT GGC CAG GCT CCC AGG CTC CTC ATC TAT144His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr35 40 45
GCC ACT AGT AAC CTG GCT TCT GGC ATC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC192Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60GGG TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTA GAG CCT GAA240Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu65 70 75 80GAT TTT GCG GTT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG288Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGA321Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105(2)序列信息SEQ ID NO44(i)序列特征(A)长度107氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO44Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr35 40 45Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105(2)序列信息SEQ ID NO45(i)序列特征(A)长度134个碱基对
(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO45CCTGGACAAG GGCTCAAGTG GATGGGATGG ATAAACACCA GAAATGGAAA GTCAACATAT 60GTTGATGACT TCAAGGGACG GTTTGTCTTC TCTCTAGACT CCTCTGTCAG CACGGCATAT120CTACAGATCA GCAG 134(2)序列信息SEQ ID NO46(i)序列特征(A)长度134个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO46GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGTACA 60GTAATACACT GCAGTGTCGT CAGCCTTTAG GCTGCTGATC TGTAGATATG CCGTGCTGAC120AGAGGAGTCT AGAG 134(2)序列信息SEQ ID NO47(i)序列特征(A)长度225个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(ix)特点
(A)NAME/KEY编码序列(B)位置1...225(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO47CCT GGA CAA GGG CTC AAG TGG ATG GGA TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA 48Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly1 5 10 15AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GTC TTC TCT CTA 96Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu20 25 30GAC TCC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTA CAG ATC AGC AGC CTA AAG GCT144Asp Ser Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala35 40 45GAC GAC ACT GCA GTG TAT TAC TGT ACG AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT192Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly50 55 60TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC CAG GGT ACC225Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr65 70 75(2)序列信息SEQ ID NO48(i)序列特征(A)长度75氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO48Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly1 5 10 15Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu20 25 30Asp Ser Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala35 40 45Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly50 55 60
Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr65 70 75(2)序列信息SEQ ID NO49(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO49TTTCCTGGAC AAGGGCTCAA GTGGATG 27(2)序列信息SEQ ID NO50(i)序列特征(A)长度24个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO50TTTGGTACCC TGGCCCCAGT AAGT 24(2)序列信息SEQ ID NO51(i)序列特征(A)长度363个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型
(vi)来源(ix)特点(A)NAME/KEY编码序列(B)位置1...363(D)其它信息F9HZHC 1-1(xi)序列描述SEQ ID NO51CAG GTG CAA CTA GTG CAA TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC 48Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT 96Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30GGA ATG AAC TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC AAG TGG ATG144Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met35 40 45GGA TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC192Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe50 55 60AAG GGA CGG TTT GTC TTC TCT CTA GAC TCC TCT GTC AGC ACG GCA TAT240Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Ser Ser Val Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80CTA CAG ATC AGC AGC CTA AAG GCT GAC GAC ACT GCA GTG TAT TAC TGT288Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95ACG AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC336Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly100 105 110CAG GGT ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA363Gln Glv Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120(2)序列信息SEQ ID NO52(i)序列特征(A)长度121氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质
(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO52Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala1 5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe50 55 60Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Ser Ser Val Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120(2)序列信息SEQ ID NO53(i)序列特征(A)长度82个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO53CAACAGAGAC CTGGCCAGGC TCCCAAGCCC TGGATCTATG CCACGAGTAA CCTGGCTAGC60GGCGTCCCAG CCAGGTTCAG TG 82(2)序列信息SEQ ID NO54(i)序列特征(A)长度90个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO54GATCCACTGA ACCTGGCTGG GACGCCGCTA GCCAGGTTAC TCGTGGCATA GATCCAGGGC60TTGGGAGCCT GGCCAGGTCT CTGTTGGTAC 90(2)序列信息SEQ ID NO55(i)序列特征(A)长度27氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO55Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser1 5 10 15Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser20 25(2)序列信息SEQ ID NO56(i)序列特征(A)长度321个碱基对(B)类型 核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(ix)特点(A)NAME/KEY编码序列(B)位置1...321(D)其它信息F9HZLC 1-1
(xi)序列描述SEQ ID NO56GAA ATA GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG 48Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30CAC TGG TAC CAA CAG AGA CCT GGC CAG GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT144His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45GCC ACG AGT AAC CTG GCT AGC GGC GTC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC192Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60GGG TCT GGG ACA GAT TTC ACT CTC ACC ATC AGC AGT CTA GAG CCT GAA240Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu65 70 75 80GAT TTT GCG GTT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG288Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGA321Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105(2)序列信息SEQ ID NO57(i)序列特征(A)长度107氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO57Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100(2)序列信息SEQ ID NO58(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO58GATCCGGGTC TGGGACAGAT TACACTCTCA CGATATCCAG T 41(2)序列信息SEQ ID NO59(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO59CTAGACTGGA TATCGTGAGA GTGTAATCTG TCCCAGACCC G 41(2)序列信息SEQ ID NO60(i)序列特征(A)长度13氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser1 5 10(2)序列信息SEQ ID NO61(i)序列特征(A)长度321个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(ix)特点(A)NAME/KEY编码序列(B)位置1...321(D)其它信息F9HZLC 1-2(xi)序列描述SEQ ID NO61GAA ATA GTA CTG ACA CAG TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG 48Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15GAA AGA GCC ACC CTC TCC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30CAC TGG TAC CAA CAG AGA CCT GGC CAG GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT144His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45GCC ACG AGT AAC CTG GCT AGC GGC GTC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC192Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60
GGG TCT GGG ACA GAT TAC ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA GAG CCT GAA240Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu65 70 75 80GAT TTT GCG GTT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG288Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95TTC GGC GGA GGG ACC AAG GTG GAG ATC AAA CGA321Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105(2)序列信息SEQ ID NO62(i)序列特征(A)长度107氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO62Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu65 70 75 80Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105(2)序列信息SEQ ID NO63(i)序列特征(A)长度165个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO63AGTACTCACC CAGAGCCCAA GCAGCCTGAG CGCCAGCGTG GGTGACAGAG TGACCATCAC 60CTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT GCACTGGTAC CAGCAGAAGC CAGGTAAGGC120TCCAAAGCCT TGGATCTACG CCACTAGTAA CCTGGCTTCT GGTGT165(2)序列信息SEQ ID NO64(i)序列特征(A)长度161个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO64CCGCGGGTTA ATACTCCACT GCTGGCAGTA GTAGGTGGCG ATATCCTCTG GCTGGAGGCT 60GCTGATGGTG AAGGTGTAGT CTGTACCGCT ACCGGATCCG CTGAATCTGC TTGGCACACC120AGAAGCCAGG TTACTAGTGG CGTAGATCCA AGGCTTTGGA G161(2)序列信息SEQ ID NO65(i)序列特征(A)长度280个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(ix)特点(A)NAME/KEY编码序列(B)位置2...280(D)其它信息
(xi)序列描述SEQ ID NO65A GTA CTC ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC AGC GTG GGT GAC AGA 49Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg1 5 10 15GTG ACC ATC ACC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG 97Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp20 25 30TAC CAG CAG AAG CCA GGT AAG GCT CCA AAG CCT TGG ATC TAC GCC ACT145Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr35 40 45AGT AAC CTG GCT TCT GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGA TCC GGT AGC193Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser50 55 60GGT ACA GAC TAC ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG GAT ATC241Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile65 70 75 80GCC ACC TAC TAC TGC CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG280Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg85 90(2)序列信息SEQ ID NO66(i)序列特征(A)长度93氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO66Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg1 5 10 15Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp20 25 30Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr35 40 45Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
50 55 60Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile65 70 75 80Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg85 90(2)序列信息SEQ ID NO67(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO67TTTAGTACTC ACCCAGAGCC CAAGCAG 27(2)序列信息SEQ ID NO68(i)序列特征(A)长度27个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO68TTCCGCGGGT TAATACTCCA CTGCTGG 27(2)序列信息SEQ ID NO69(i)序列特征(A)长度33个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA
(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO69CTCGAGCAGT ACTATCTGGG AGTGGACACC TGT 33(2)序列信息SEQ ID NO70(i)序列特征(A)长度17氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型肽(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型N-末端(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO70Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala1 5 10 15Ala(2)序列信息SEQ ID NO71(i)序列特征(A)长度48个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO71GGACGTTCGG CCAAGGGACC AAGGTGGAAA TCAAACGGAC TGTGGCGG 48(2)序列信息SEQ ID NO72(i)序列特征(A)长度52个碱基对
(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO72CGCCGCCACA GTCCGTTTGA TTTCCACCTT GGTCCCTTGG CCGAACGTCC GC 52(2)序列信息SEQ ID NO73(i)序列特征(A)长度321个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(ix)特点(A)NAME/KEY编码序列(B)位置1...321(D)其它信息F9HZLC 2-0(xi)序列描述SEQ ID NO73CAG ATA GTA CTC ACC CAG AGC CCA AGC AGC CTG AGC GCC AGC GTG GGT 48Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15GAC AGA GTG ACC ATC ACC TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30CAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGT AAG GCT CCA AAG CCT TGG ATC TAC144His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45GCC ACT AGT AAC CTG GCT TCT GGT GTG CCA AGC AGA TTC AGC GGA TCC192Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60
GGT AGC GGT ACA GAC TAC ACC TTC ACC ATC AGC AGC CTC CAG CCA GAG240Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80GAT ATC GCC ACC TAC TAC TGC CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG288Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95TTC GGC CAA GGG ACC AAG GTG GAA ATC AAA CGG321Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105(2)序列信息SEQ ID NO74(i)序列特征(A)长度107氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO74Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly15 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu65 70 75 80Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg100 105(2)序列信息SEQ ID NO75(i)序列特征(A)长度94个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(ix)特点(A)NAME/KEY编码序列(B)位置27...94(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO75GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC53Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe1 5TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG ATA GTA CT 94Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Ile Val Leu10 15 20(2)序列信息SEQ ID NO76(i)序列特征(A)长度23氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO76Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Ile Val Leu20(2)序列信息SEQ ID NO77(i)序列特征(A)长度401个碱基对(B)类型核酸(C)链单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(ix)特点(A)NAME/KEY编码序列(B)位置27...401(D)其它信息F9HZLC 1-3(xi)序列描述SEQ ID NO77GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC53Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe1 5TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG ATA GTA CTG ACA CAG101Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln10 15 20 25TCT CCA GCC ACC CTG TCT TTG TCT CCA GGG GAA AGA GCC ACC CTC TCC149Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser30 35 40TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG TAC CAA CAG AGA197Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Arg45 50 55CCT GGC CAG GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT GCC ACG AGT AAC CTG GCT245Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala60 65 70AGC GGC GTC CCA GCC AGG TTC AGT GGA TCC GGG TCT GGG ACA GAT TAC293Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr75 80 85ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA GAG CCT GAA GAT TTT GCG GTT TAT TAC341Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr90 95 100 105TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG TTC GGC GGA GGG ACC AAG389Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys110 115 120GTG GAG ATC AAA401Val Glu Ile Lys125
(2)序列信息SEQ ID NO78(i)序列特征(A)长度125氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO78Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu20 25 30Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val35 40 45Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Lys Pro50 55 60Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe65 70 75 80Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu85 90 95Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn100 105 110Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys115 120 125(2)序列信息SEQ ID NO79(i)序列特征(A)长度81个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO79AGGCCTCTGG ATACACCTTC ACTAACTATG GAATGAACTG GGTGCGACAG GCCCCTGGAC60
AAGGGCTCGA GTGGATGGGA T 81(2)序列信息SEQ ID NO80(i)序列特征(A)长度99个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO80TGTCTAGAGA GAAGACAAAC CGTCCCTTGA AGTCATCAAC ATATGTTGAC TTTCCATTTC60TGGTGTTTAT CCATCCCATC CACTCGAGCC CTTGTCCAG 99(2)序列信息SEQ ID NO81(i)序列特征(A)长度87个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO81GGTTTGTCTT CTCTCTAGAC ACCTCTGTCA GCACGGCATA TCTACAGATC AGCAGCCTAA60AGGCTGAGGA CACTGCAGTG TATTTCT87(2)序列信息SEQ ID NO82(i)序列特征(A)长度86个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无
(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO82GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAGGGAA GTAACCATCC ATATTCCCTT CTCTCGTACA 60GAAATACACT GCAGTGTCCT CAGCCT86(2)序列信息SEQ ID NO83(i)序列特征(A)长度278个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(ix)特点(A)NAME/KEY编码序列(B)位置3...278(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO83AG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT GGA ATG AAC TGG GTG CGA 47Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg1 5 10 15CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC GAG TGG ATG GGA TGG ATA AAC ACC AGA95Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg20 25 30AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GTC TTC 143Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe35 40 45TCT CTA GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTA CAG ATC AGC AGC CTA 191Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu50 55 60AAG GCT GAG GAC ACT GCA GTG TAT TTC TGT ACG AGA GAA GGG AAT ATG 239Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met65 70 75GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC CAG GGT ACC 278
Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr80 85 90(2)序列信息SEQ ID NO84(i)序列特征(A)长度92氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO84Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln1 5 10 15Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn20 25 30Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser35 40 45Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys50 55 60Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp65 70 75 80Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr85 90(2)序列信息SEQ ID NO85(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO85AGGCCTCTGG ATACACCTTC ACTAACTATG 30(2)序列信息SEQ ID NO86
(i)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO86GGTACCCTGG CCCCAGTAAG TAAAAG26(2)序列信息SEQ ID NO87(i)序列特征(A)长度37个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO87CCAGACTCGA CTAGTTGGAT CTGGGAGTGG ACACCTG37(2)序列信息SEQ ID NO88(i)序列特征(A)长度446个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(ix)特点(A)NAME/KEY编码序列
(B)位置27...446(D)其它信息F9HZHC 3-0(xi)序列描述SEQ ID NO88GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC53Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe1 5TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG ATC CAA CTA GTG CAA101Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln10 15 20 25TCT GGG TCT GAG TTG AAG AAG CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC149Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys30 35 40AAG GCC TCT GGA TAC ACC TTC ACT AAC TAT GGA ATG AAC TGG GTG CGA197Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg45 50 55CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTC GAG TGG ATG GGA TGG ATA AAC ACC AGA245Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg60 65 70AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC AAG GGA CGG TTT GTC TTC293Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe75 80 85TCT CTA GAC ACC TCT GTC AGC ACG GCA TAT CTA CAG ATC AGC AGC CTA341Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu90 95 100 105AAG GCT GAG GAC ACT GCA GTG TAT TTC TGT ACG AGA GAA GGG AAT ATG389Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met110 115 120GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC CAG GGT ACC CTG GTC ACC437Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr125 130 135GTC TCC TCT446Val Ser Ser140(2)序列信息SEQ ID NO89(i)序列特征(A)长度140氨基酸(B)类型氨基酸
(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO89Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys20 25 30Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45Thr Asn Tyr Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val65 70 75 80Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser85 90 95Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val100 105 110Tyr Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr115 120 125Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser130 135 140(2)序列信息SEQ ID NO90(i)序列特征(A)长度90个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO90AGTACTGACA CAGTCTCCAT CCTCCCTGTC TGCATCTGTT GGGGACAGAG TCACCATCAC60TTGCAGGGCC AGCTCAAGTG TAAATTACAT 90(2)序列信息SEQ ID NO91
(i)序列特征(A)长度108个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO91CTTGATGGGA CGCCGCTAGC CAGGTTACTC GTGGCATAGA TCCAGGGCTT GGGAGCTTTG 60CCAGGTTTCT GTTGGTACCA GTGCATGTAA TTTACACTTG AGCTGGCC 108(2)序列信息SEQ ID NO92(i)序列特征(A)长度108个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO92TAACCTGGCT AGCGGCGTCC CATCAAGGTT CAGTGGATCC GGGTCTGGGA CAGATTACAC 60TCTCACGATA TCCAGTCTAC AACCTGAAGA TTTTGCGACT TATTACTG 108(2)序列信息SEQ ID NO93(i)序列特征(A)长度102个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO93
GGCGCCGCCA CAGTTCGTTT GATCTCCAGC TTGGTCCCTC CGCCGAACGT CCGCGGGTTA 60ATACTCCACT GCTGACAGTA ATAAGTCGCA AAATCTTCAG GT 102(2)序列信息SEQ ID NO94(i)序列特征(A)长度330个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(ix)特点(A)NAME/KEY编码序列(B)位置2...328(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO94A GTA CTG ACA CAG TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTT GGG GAC AGA 49Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg1 5 10 15GTC ACC ATC ACT TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG 97Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp20 25 30TAC CAA CAG AAA CCT GGC AAA GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT GCC ACG 145Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr35 40 45AGT AAC CTG GCT AGC GGC GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGA TCC GGG TCT 193Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser50 55 60GGG ACA GAT TAC ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA CAA CCT GAA GAT TTT 241Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe65 70 75 80GCG ACT TAT TAC TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG TTC GGC 289Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly85 90 95GGA GGG ACC AAG CTG GAG ATC AAA CGA ACT GTG GCG GCG CC 330
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105(2)序列信息SEQ ID NO95(i)序列特征(A)长度109氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO95Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg1 5 10 15Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp20 25 30Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr35 40 45Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser50 55 60Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe65 70 75 80Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly85 90 95Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105(2)序列信息SEQ ID NO96(i)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO96
CAAGTACTGA CACAGTCTCC ATCCTC 26(2)序列信息SEQ ID NO97(i)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO97AGGGCGCCGC CACAGTTCGT TTGATC 26(2)序列信息SEQ ID NO98(i)序列特征(A)长度412个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(ix)特点(A)NAME/KEY编码序列(B)位置27...412(D)其它信息F9HZLC 3-0(xi)序列描述SEQ ID NO98GAATTCTGAG CACACAGGAC CTCACC ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC53Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe1 5TTG GTA GCA ACA GCT ACA GGT GTC CAC TCC CAG ATA GTA CTG ACA CAG101Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val His Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln10 15 20 25TCT CCA TCC TCC CTG TCT GCA TCT GTTGGG GAC AGA GTC ACC ATC ACT 149
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr30 35 40TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG CAC TGG TAC CAA CAG AAA197Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys45 50 55CCT GGC AAA GCT CCC AAG CCC TGG ATC TAT GCC ACG AGT AAC CTG GCT245Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala60 65 70AGC GGC GTC CCA TCA AGG TTC AGT GGA TCC GGG TCT GGG ACA GAT TAC293Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr75 80 85ACT CTC ACG ATA TCC AGT CTA CAA CCT GAA GAT TTT GCG ACT TAT TAC341Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr90 95 100 105TGT CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCG CGG ACG TTC GGC GGA GGG ACC AAG389Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys110 115 120CTG GAG ATC AAA CGA ACT GTG GC 412Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Val125(2)序列信息SEQ ID NO99(i)序列特征(A)长度129氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO99Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly1 5 10 15Val His Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala20 25 30Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val35 40 45Asn Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro50 55 60
Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe65 70 75 80Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu85 90 95Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn100 105 110Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val115 120 125Val(2)序列信息SEQ ID NO100(i)序列特征(A)长度26个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO100CAAATAGTAC TCTCCCAGTC TCCAGC26(2)序列信息SEQ ID NO101(i)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO101GGATAAGCTT GGCGCCGCAA CAGTCGGTTT GATTTCCAGC T 41(2)序列信息SEQ ID NO102(i)序列特征(A)长度335个碱基对(B)类型核酸
(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(ix)特点(A)NAME/KEY编码序列(B)位置1...335(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO102CAG ATA GTA CTC TCC CAG TCT CCA GCA ATC CTG TCT GCA TCT CCA GGG 48Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15GAG AAG GTC ACA ATG ACT TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30CAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AAA CCC TGG ATT TAT144His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45GCC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GCT CGC TTC AGT GGC AGT192Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAA240Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu65 70 75 80GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCA CGG ACG288Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA CGG ACT GTT GCG GCG CC 335Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro100 105 110(2)序列信息SEQ ID NO103(i)序列特征(A)长度112氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链
(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO103Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro100 105 110(2)序列信息SEQ ID NO104(i)序列特征(A)长度318个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(ix)特点(A)NAME/KEY编码序列(B)位置1...318(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO104CAG ATA GTA CTC TCC CAG TCT CCA GCA ATC CTG TCT GCA TCT CCA GGG48Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15
GAG AAG GTC ACA ATG ACT TGC AGG GCC AGC TCA AGT GTA AAT TAC ATG 96Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30CAC TGG TAC CAG CAG AAG CCA GGA TCC TCC CCC AAA CCC TGG ATT TAT144His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45GCC ACA TCC AAC CTG GCT TCT GGA GTC CCT GCT CGC TTC AGT GGC AGT192Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60GGG TCT GGG ACC TCT TAC TCT CTC ACA ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAA240Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu65 70 75 80GAT GCT GCC ACT TAT TAC TGC CAG CAG TGG AGT ATT AAC CCA CGG ACG288Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr85 90 95TTC GGT GGA GGC ACC AAG CTG GAA ATC AAA318Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105(2)序列信息SEQ ID NO105(i)序列特征(A)长度106氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO105Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly1 5 10 15Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met20 25 30His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr35 40 45Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser50 55 60Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu65 70 75 80Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ile Asn Pro Arg Thr
85 90 95Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys100 105(2)序列信息SEQ ID NO106(i)序列特征(A)长度30个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO106CAGATCCAAC TAGTGCAGTC TGGACCTGAG 30(2)序列信息SEQ ID NO107(i)序列特征(A)长度32个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO107TTAAGCTTGC TAGCTGCAGA GACAGTGACC AG 32(2)序列信息SEQ ID NO108(i)序列特征(A)长度369个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无
(v)片段类型(vi)来源(ix)特点(A)NAME/KEY编码序列(B)位置1...369(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO108CAG ATC CAA CTA GTG CAG TCT GGA CCT GAG CTG AAG AAG CCT GGA GAG 48Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15ACA GTC AAG ATC TCC TGC AAG GCT TCT GGG TAC ACC TTC ACA AAC TAT 96Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30GGA ATG AAC TGG GTG AAG CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTA AAG TGG ATG144Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45GGC TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC192Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe50 55 60AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAA AGC TCT GCC AGC ACT GCC AAT240Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn65 70 75 80TTG CAG ATC GAC AAC CTC AAA GAT GAG GAC ACG GCT ACA TAT TTC TGT288Leu Gln Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95ACA AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC336Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly100 105 110CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA GCT AGC369Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser115 120(2)序列信息SEQ ID NO109(i)序列特征(A)长度123氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性
(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO109Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe50 55 60Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn65 70 75 80Leu Gln Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser115 120(2)序列信息SEQ ID NO110(i)序列特征(A)长度363个碱基对(B)类型核酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型(vi)来源(ix)特点(A)NAME/KEY编码序列(B)位置1…363(D)其它信息(xi)序列描述SEQ ID NO110CAG ATC CAA CTA GTG CAG TCT GGA CCT GAG CTG AAG AAG CCT GGA GAG48Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15
ACA GTC AAG ATC TCC TGC AAG GCT TCT GGG TAC ACC TTC ACA AAC TAT 96Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30GGA ATG AAC TGG GTG AAG CAG GCT CCA GGA AAG GGT TTA AAG TGG ATG144Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45GGC TGG ATA AAC ACC AGA AAT GGA AAG TCA ACA TAT GTT GAT GAC TTC192Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe50 55 60AAG GGA CGG TTT GCC TTC TCT TTG GAA AGC TCT GCC AGC ACT GCC AAT240Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn65 70 75 80TTG CAG ATC GAC AAC CTC AAA GAT GAG GAC ACG GCT ACA TAT TTC TGT288Leu Gln Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95ACA AGA GAA GGG AAT ATG GAT GGT TAC TTC CCT TTT ACT TAC TGG GGC336Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly100 105 110CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC TCT GCA363Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115 120(2)序列信息SEQ ID NO111(i)序列特征(A)长度121氨基酸(B)类型氨基酸(C)链单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(iii)假拟无(iv)反义无(v)片段类型内部的(vi)来源(xi)序列描述SEQ ID NO11lGln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu1 5 10 15Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr20 25 30Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Arg Asn Gly Lys Ser Thr Tyr Val Asp Asp Phe
50 55 60Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Ser Ser Ala Ser Thr Ala Asn65 70 75 80Leu Gln Ile Asp Asn Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95Thr Arg Glu Gly Asn Met Asp Gly Tyr Phe Pro Phe Thr Tyr Trp Gly100 105 110Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala115 120
权利要求
1.治疗动物血栓栓塞后引发的局部缺血的方法，包括施用抗-因子IX抗体或抗体片段。
2.权利要求1所述方法，其中抗-因子IX抗体或抗体片段在栓塞后施用。
3.权利要求1所述方法，其中抗-因子IX抗体或抗体片段是在中风后施用。
4.权利要求1所述方法，其中抗-因子IX抗体或抗体片段具有SB249413、SB 249415、SB 249416、SB 249417、SB 257731或SB 257732的鉴定特征。
5.权利要求4所述方法，其中抗-因子IX抗体或抗体片段具有SB249417的鉴定特征。
6.治疗动物血栓栓塞后引发的局部缺血的方法，包括施用SB 249417。
7.治疗动物血栓栓塞后引发的局部缺血的方法，包括联合施用抗-因子IX抗体或抗体片段和纤溶酶原激活物。
8.权利要求7所述方法，其中抗-因子IX抗体或抗体片段和纤溶酶原激活物是在栓塞后施用。
9.权利要求7所述方法，其中抗-因子IX抗体或抗体片段和纤溶酶原激活物是在中风后施用。
10.权利要求7所述方法，其中抗-因子IX抗体或抗体片段具有SB249413、SB 249415、SB 249416、SB 249417、SB 257731或SB 257732的鉴定特征。
11.权利要求10所述方法，其中抗-因子IX抗体或抗体片段具有SB249417的鉴定特征。
12.权利要求7所述方法，其中溶栓剂是tPA、尿激酶、链激酶或它们的变体。
13.权利要求12所述方法，其中溶栓剂是tPA。
14.治疗动物血栓栓塞后引发的局部缺血的方法，包括联合施用SB249417和tPA。
15.在治疗动物血栓栓塞后引发的局部缺血中减少所需溶栓剂剂量的方法，包括联合施用抗-因子IX抗体或抗体片段与溶栓剂。
16.权利要求15所述方法，其中抗-因子IX抗体或抗体片段具有SB249413、SB 249415、SB 249416、SB 249417、SB 257731或SB 257732的鉴定特征。
17.权利要求16所述方法，其中抗-因子IX抗体或抗体片段具有SB249417的鉴定特征。
18.权利要求15所述方法，其中溶栓剂是tPA、尿激酶、链激酶或它们的变体。
19.权利要求18所述方法，其中溶栓剂是tPA。
20.预防动物血栓栓塞性中风的方法，包括向具有发生血栓栓塞中风风险的动物施用抗-因子IX抗体或抗体片段。
21.权利要求20所述方法，其中抗-因子IX抗体或抗体片段具有SB249413、SB 249415、SB 249416、SB 249417、SB 257731或SB 257732的鉴定特征。
22.权利要求20所述方法，其中抗-因子IX抗体或抗体片段具有SB249417的鉴定特征。
23.预防动物血栓栓塞中风的方法，包括向具有发生血栓栓塞中风风险的动物施用SB 249417。
全文摘要
公开了针对凝固因子IX的单克隆抗体以及它们在抑制血栓形成中的用途。
文档编号A61P7/02GK1501812SQ00819723
公开日2004年6月2日 申请日期2000年10月5日 优先权日2000年5月15日
发明者弗兰克·C·巴龙, 弗兰克 C 巴龙, N 布莱克本, 迈克尔·N·布莱克本, Z 福伊尔斯坦, 乔拉·Z·福伊尔斯坦, R 图米, 约翰·R·图米 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司