专利名称：具有抗肿瘤活性的植物鞘氨醇衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及到一种含有植物鞘氨醇(4-羟双氢神经鞘氨醇)的抗肿瘤剂，具体的是，涉及到一种抗肿瘤剂，它含有一种植物鞘氨醇，是具有抗肿瘤活性的植物鞘氨醇衍生物，其结构式I作为一种活性成份。 其中R1，R2和R3分别代表一个氢原子或一个C1-C8烷基；X代表一个原子，或一个原子团，该原子团由一个卤素原子，一个羟基，一个烷基磺酸盐原子团或一个芳基磺酸盐原子团组成。
脂质体可通过使用一种或两三种上述脂类制备。脂质体公认的是药物传递系统中的一种良载体。当药剂结合到脂质体中时，药物的亲水部分被封闭在脂质体的内部水相中，而药物的疏水部分则插入到脂质体的双层之间。作为一种药物载体，脂质体可准确地把一种需要的药物传递到生病的部位，既便是少量的药物也可由脂质体传递。因此，脂质体可极大地减少副作用，例如在大剂量中的多药物阻力。近来脂质体作为一种药物载体已经广泛地应用到多种领域，例如抗原、基因、医药，包括阿霉素(一种抗肿瘤剂)，两性霉素B(一种抗真菌剂)，其他化学药物以及美容领域(M.Grunaug及其合伙人，欧洲医学研究杂志，1988年第21期，13-19页；D.S.Alberts，D.J.Garcia，药物杂志，1997年第54期，30-35页；F.Braun及其合伙人，移植方法，1988年第30期，1481-1483页；V.Heinemann及其合伙人，抗微生物制剂化学疗法，1997年第41期，1275-1280页；N.Weiner及其同伙，药物目标杂志，1994年第2期，405-410页)。
神经鞘脂基以植物鞘氨醇(PhytoS)，神经鞘氨醇(SPN)和二羟神经鞘氨醇的形式存在于人身中，它们分别是含有18个碳原子的氨基醇。这些化合物有几个立构中心，在位置3上排列有D-红细胞的是在自然界中发现的。神经鞘氨醇和二羟神经鞘氨醇是在人体所有的组织中发现的，而植物鞘氨醇只存在于人类皮肤的角质层。在90年代(二十世纪)早期便开始了对神经鞘氨醇及其衍生物的广泛研究，当发现这些化合物是蛋白激酶C(PKC)的强力抑制剂时，对它们的研究加快了步伐。此外，发现神经鞘氨醇既便是在低浓度下，也与大多数细胞活动有关(D.J.Bibel及其合伙人，临床实验皮肤病学，1995年第20期，395-400页；D.J.Bibel，皮肤病研究杂志，1992年第98卷，269-273页；Y.A.Hannun，科学杂志，1996年第274卷，1855-1859页)。这些活性最主要地在角质层中展示出来，人们对植物鞘氨醇的兴趣已经大大地提高了，然而，它们非常昂贵，并且对合成它们的衍生物及对它们的生物活性知之甚少。特别是，公认的N，N-二甲基神经鞘氨醇(DMS)和N，N，N-卤化三甲基鞘氨醇(简称为TMS·hal)，-神经鞘氨醇的衍生物—在它们抑制蛋白激酶方面要优于神经鞘氨醇，而且还已知它们在体内和在玻璃试管内都能抑制各种癌细胞的生长。此外，还发现TMS·hal在老鼠的B16/BL6黑素瘤细胞系中具有一种抗肿瘤活性和抗转移活性，在此实验中使用了脂质体三甲基鞘氨醇，其中卵磷脂(PC)∶胆固醇(chol)∶TMS·hal的克分子比是4.5∶4.5∶1。但是，需要相对大量的TMS·hal(例如每个老鼠大约0.1-0.3毫克)来展示上述作用，这往往导致副作用，例如血细胞溶解，血红蛋白尿和发炎反应。通过使用脂质体技术对解决这些毒性做了很大的努力，结果表明，脂质体的TMS·hal显示无毒性，并且与未使用脂质体的TMS·hal相比，在体内系统中，在抑制癌细胞的生长和抗转移方面更为有效(Y.S.Park，S.Hakomori，S.Kawa，F.Ruan，和Y.Igarashi，癌研究，1994年第54期，2213-2217页)。
有一份关于植物鞘氨醇——其结构非常类似于神经鞘氨醇—的报告，揭示了由于一种辅助脂质在结构上的差异，导致了在体内系统KK-1，COS-7和MSC-1细胞中DNA转变感染效率的差异(T.Paukku及其同伙，化学物理疗法的脂类，1997年第87期，23-29页)。另外，还已知植物鞘氨醇对于广泛的微生物具有优异的抗微生物活性，并且通过分泌白细胞介素作为一种蛋白激酶的抑制剂来减轻对皮肤的刺激。N，N，N-卤化三甲基植物鞘氨醇(TMP·hal)是植物氨醇的一种衍生物，这是最近公布的(韩国未经检验的专利号1999-78610)，其中的衍生物是作为一种美容组分描述的，其用途局限于保护皮肤。然而没有先例表明TMP·hal是一种抗肿瘤剂。
本发明的目的是这样实现的，所涉及到的一种抗肿瘤剂，它含有一种如下面结构式(I)的植物鞘氨醇衍生物作为活性成份。
在上面的结构式I中，R1，R2和R3分别代表一个氢原子或一个C1-C8烷基；X代表一个原子或一个原子团，它含有一个卤素原子，一个羟基，一个烷基磺酸盐原子团或一个芳基磺酸盐原子团。
本发明的抗肿瘤剂含有以脂质体或一种乳化液形式存在的上述植物鞘氨醇衍生物，除了植物鞘氨醇衍生物以外，也可含有其他成份，例如抗血管生成剂或阿霉素，—一种具有细胞毒素的抗肿瘤剂。
本发明涉及到一种抗肿瘤剂，它含有如以上结构式(I)的一种植物鞘氨醇衍生物(以下简称为TMP)，这种衍生物是以一种脂质体或一种乳化剂的形式制造的。作为本发明的一种TMP，择优的是使用N，N，N-卤化三甲基植物鞘氨醇(TMP·hal)，更择优的是使用N，N，N-碘化三甲基植物鞘氨醇(TMP·I)。
在本发明中以各种成份制备了抗转移脂质体。结果表明脂质体的DPPC/Chol/TMP或DPPC/Chol/PEGPE/TMP成份在与一种抗血管生成剂结合使用时，具有优异的抗转移活性，并且在抗转移活性中还有一种协同作用效果。脂质体的DPPC/Chol/TMP成份不仅能抑制向肺部的转移，而且它们也抑制LLC(路易斯肺癌)癌细胞的生长。
在本发明中，把细胞毒性抗癌药物与抗转移脂质体结合使用，则抗转移的作用得到加强。例如当阿霉素与TMP脂质体一起使用时，要比单独使用阿霉素具有更强的抗转移作用。
在本发明中，使用了人类的肝脏瘤细胞系和老鼠黑素瘤细胞系检验TMP脂质体的细胞毒性作用，结果表明TMP在人类肝脏肿瘤细胞中有细胞毒性，而在老鼠黑素瘤细胞中无细胞毒性。在老鼠中做了急性毒性实验，并未观察到毒性效果。
本发明的抗肿瘤剂含有一种如结构式I的植物鞘氨醇衍生物作为一种活性剂，最终的制剂可以是下列形式粉末，颗粒，胶囊，以及把它与配药可接受的载体，一种赋形剂和一种稀释剂混合起来注射。可以口服投药，也可以胃肠外投药，如果把药剂制成一种乳化液或脂质体型以后投药，则生物有效性更为有效。
本发明的抗肿瘤剂的剂量可根据身体吸收率、体重、年龄、性别、健康状况、饮食、投药间隔、投药方法、排泄率、疾病严重程度及类似情况的变化而变化。择优的剂量是大约每公斤体重0.5-1毫克。抗肿瘤剂的制备应考虑剂量的有效范围，这样制备的单位制剂可以在一定的时间间隔内投药几次，或根据一个专家的决定，以一种特殊的剂量方法制备，该专家是根据受治疗者(或受实验者)的要求，负责医疗的监视和观察的。
尽管结合本发明具有一定程度特殊性的择优方案对本发明做了描述，但擅长工艺的人应理解只有通过下面例子的方法才能得到本发明的择优产品，并且在成份的结构、组合和排列方面的细节可以采取多种变化而不离开本发明的精神和范围。
图2示出TMP·I脂质体和TMP·I乳化液的抗转移活性的照片，其中的TMP·I脂质体和TMP·I乳化液均含有抗血管生成的化合物。
图3示出TMP·I脂质体和一种抗肿瘤剂—阿霉素之间的关系的照片。
图4是一张示出一种含有TMP·I的阳离子脂质体的细胞毒素的图。
图5是一张示出在4℃的温度下储存的含有TMP衍生物的乳化液和各种脂质体的稳定性的图。
例1N，N，N-碘化三甲基植物鞘氨醇(TMP·I)的合成向3毫升甲醇中加入0.30克植物鞘氨醇(0.946毫升)，0.523克K2CO3(3.79毫克分子)和0.298毫升碘代甲烷(4.73毫克分子)，在50℃的温度下搅拌反应混合物达4小时。在减压下对溶剂进行蒸发，并向所得到的混合物中加入4毫升蒸馏水。用8毫升乙酸乙酯对溶液进行萃取，然后干燥(Na2SO4)，过滤。蒸发乙酸乙酯，得到0.26克白色固体产品。
成品率76％熔点210-213℃IR(KBr)ν最大3309(OH)，2918，2850(C-H)cm-11H NMR(600MHz，DMSO-d6)δ3.95(dd，1H，CH2O，J＝14.4Hz)，3.89(dd，1H，CH2O，J＝14.4Hz)，3.76(d，1H，J＝8.7Hz)，3.6(dd，1H)，3.11(s，9H，N+CH3)，1.68(m，1H，CH2)，1.48(m，1H，CH2)，1.23(s，24H，CH2)，0.84(t，3H，CH3)ppm13C NMR(600MHz，DMSO-d6)δ76.80，71.01，55.69，52.18，33.21，31.21，30.60，29.15，29.03，28.99，28.93，28.62，24.87，22.00，13.84ppmMS(FAB，甘油，m/z)361(M+)。
例2N，N，N-三甲基植物鞘氨醇对一甲基磺酸盐的合成向5毫升甲醇中加入0.5克植物鞘氨醇(1.575毫克分子)，1.612克K2CO3(9.449毫克分子)和1.188毫升甲基对一甲苯磺酸盐(对一甲苯磺酸甲酯)(7.874毫克分子)，在50℃的温度下搅拌混合物达3个小时。在减压下对溶剂进行蒸发，在所得到的混合物中加入5毫升蒸馏水。用10毫升乙酸乙酯萃取溶液，然后干燥(Na2SO4)，过滤。蒸发掉乙酸乙酯，得到0.46克白色固体产品。
成品率55％熔点185-186℃IR(KBr)ν最大3326(OH)，2920，2852(C-H)cm-11H NMR(500MHz，CD3OD)δ7.70(d，2H，arom H，J＝8.2Hz)，7.23(d，2H，arom H，J＝8.0Hz)，4.16(dd，1H，CH2O，J＝14.4Hz)，4.09(dd，1H，CH2O，J＝14.4Hz)，3.89(d，1H，J＝8.7Hz)，3.73(dd，1H)，3.44(t，1H)，3.21(s，9H，N+CH3)，2.37(s，3H，PhCH3)，1.81(m，1H，CH2)，1.58(m，1H，CH2)，1.29(s，24H，CH2)，0.90(t，3H，CH3)ppm13C NMR(500MHz，CD3OD)δ142.07，140.16，128.31，125.45，76.73，71.56，56.09，52.21，33.25，31.56，29.28，29.26，28.96，25.03，22.22，19.81，12.93ppm例3脂质体的制备(1)多层囊泡(MLV)和小型单层囊泡(SUV)的制备把磷脂加入到玻璃瓶中，并用有机溶剂(CHCl3)溶解。使用一种氮气或一种旋转蒸发器把溶剂完全除掉，在玻璃瓶内形成一种脂质薄膜。然后加入磷酸盐缓冲盐水(PBS)，在室温下轻轻地摇动，以便达到足够的水合程度，然后剧烈地旋转混合物(使之成旋涡状)，以便使磷脂的脂质薄膜扩散，最终形成多层囊泡(MLV)。
通过使用一个超声波降解器把得到的MLV转变成小型单层囊泡。此外，使用一台挤出机(此机在以后的实验中还要用到)，在高压下使SUV通过一个适合的聚碳酸盐薄膜过滤器，可以制出所需要规格的脂质体。
(2)抗转移脂质体的制备按下述方法制备含有各种磷脂和TMP—一种抗转移化合物——的脂质体。
把TMP和DOPE—一种自然的类脂体—以1∶1(重量/重量)的比率混合起来，溶解在一个装有有机溶剂的20毫升的玻璃瓶中，然后，在存在氮气的情况下，在减压下进行蒸发，在生成脂质薄膜时，把薄膜完全干燥，用蒸馏水或5％的葡萄糖进行水合，通过旋转或超声波降解制备出阳离子脂质体。把TMP加入到含有70％的卵磷脂(PC)；一种1∶1克分子比率的100％卵磷脂和胆固醇(Chol)的混合物；一种1∶1克分子比率的二棕榈酰卵磷脂(DPPC)和胆固醇(Chol)的混合物；一种克分子比率为5∶5∶1的DPPC，Chol和PE-PEG(磷脂酰乙醇胺—聚乙二醇)的混合物组成的混合组份中，溶解在一种有机溶剂中，通过使用一台旋转蒸发器完全除掉有机溶剂，在玻璃瓶内形成一种脂质薄膜。然后加入磷酸盐缓冲盐水(PBS)，在室温下使薄膜足够地水合，使磷脂的薄膜扩散，然后通过旋转或超声波降解得到抗转移的脂质体。
例4具有抗转移活性的乳化液的制备及其物理性质的测量。
(1)乳化液的制备把70％的卵磷脂和TMP扩散到橄榄油中，加入丙三醇和少许非离子活性剂20(吐温20)，加入蒸馏水，并用超声波降解，得到一种乳化液。把这样得到的乳化液通过一个0.2微米的薄膜过滤器，待用。
(2)脂质体和乳化液稳定性的实验制备出含有TMP的各种组成成份的脂质体和乳化液，并在4℃的温度下储存。通过使用一个分粒器测量脂质体规格的变化，并根据磷脂的组份测量脂质体和乳化液的稳定性。
例5体内抗转移的分析使用B16F10黑素瘤细胞在一个C57/BL6老鼠身上观察在体内系统中的直接肺转移。从一个老鼠尾部的静脉注入各种浓度的黑素瘤细胞(磷酸盐缓冲盐水，2×104，2×105和2×106)，以便确定对老鼠投放的合适的黑素瘤细胞的浓度。在注射后的15天，在麻醉之后取出它的肺，检查到在肺部存在着癌的菌落。
进一步，把从上面的实验中确定的合适的黑素瘤细胞浓度注入到C57/BL6老鼠的尾部静脉中，以便检验上述含TMP的抗转移脂质体和乳化液的抗转移作用。在注射肿瘤细胞60-90分钟之后，把制备的含有250微克TMP的脂质体投给每个老鼠，然后，分别在注射黑素瘤细胞后的第3天和第6天进行第2次和第3次投药。在需要的时候，在注射后的第9天进行第4次投药。在15天后将肺取出，检验出肺部的癌菌落。
例6细胞毒性和体内TMP脂质体的毒性的测量使用人类的肝脏肿瘤细胞系SNU398和老鼠的黑素瘤细胞系B16F10检验了TMP脂质体对癌细胞的细胞毒性作用。把SNU398和B16F10进行胰酶消化，然后用无血清的介质(RPMI-1640)清洗。再用锥虫兰把它们染色，然后以1×105个细胞/毫升的浓度涂在一个有48个凹坑的板上，然后用各种浓度的含有TMP的阳离子脂质体进行处理。在3天之后，再次把它们用锥虫兰染色，检验到能生存的细胞减少了。
为了检验TMP脂质体的体内毒性，通过静脉注射或腹膜内注射的方法把它们注入到老鼠身上，然后检验老鼠的致死率。
例7抑制癌细胞在体内生长的分析使用路易斯肺癌(LLC)细胞在BDF1老鼠身上检验了在体内系统中对癌细胞生长的抑制。所使用的路易斯肺癌细胞的浓度是这样的给每个老鼠皮下注射1,000,000个癌细胞，以便诱发癌症。在注射上述的LLC细胞后的第1天、第3天、第6天和第9天分别通过静脉注射和腹膜注射的方法注入100毫升TMP脂质体(TMP100微克)。作为一种正控制，使AG3340(美国阿古龙医药有限公司产品)—已知的一种MMP-2抑制剂(matrix metaloproteinasse-2)—悬浮在0.2％非离子活性剂/0.5％羧甲基纤维素的混合液中，得到2毫克悬浊液每天进行腹膜内注射。在注射LLC细胞后的21天，将每个老鼠以颈椎骨错位的方法杀死，然后检查癌体积的变化，并拍摄照片。
例8片剂的制备活性成份……1克乳糖……7克晶体纤维……1.5克硬脂酸镁……0.5克总计……10克在把上述组份捣成碎片之后，再把它们混合起来，通过直接制成片剂的方法把它们制成片剂，每片的总量为500毫克，其中活性成份为50毫克。
例9散剂(粉末)的制备活性成份……1克玉米淀粉……5克羧基纤维……4克总计 ……10克在把它们捣成碎片之后，再把它们混合起来，然后制成粉末状的散剂，把500毫克粉末装入一个软胶囊中，便可制成胶囊制剂。实验例1首先，检验在体内系统中TMP·I的抗转移活性。对癌症转移的检验是在不同的4组老鼠中进行的，这4组老鼠具有不同的B16F10黑素瘤细胞浓度，分别是2×104，2×105，2×106和PBS(磷酸盐缓冲盐水)，以便确定适合于观察癌转移的癌细胞数目。在老鼠的尾部静脉内注射后的15天，取出老鼠的肺并加以检验。结果发现从注射2×106B16F10黑素瘤细胞浓度的一组老鼠身上得到的肺的尺寸长大了，最后形成了大量的菌落。相反，从以2×104和PBS处理的一组中得到的肺在尺寸上未显示出明显的变化，同时也未显示出癌菌落的生成，而从以2×105处理的一组得到的肺显示出少量的菌落存在着，并且菌落的数目持续地增加，直到处理后的第21天之后为止。因此，对于TMP·I抗转移的实验来说，黑素瘤细胞的适合浓度确定为2×105。
在注射B16F10之后的第1天、第3天和第6天分别给每组实验的老鼠投300微克的TMP·I衍生物。在注射后的第15天得到的肺比一个控制组中的老鼠的肺小，并且菌落数也显著地减少(表1)。
表1.DOPE/TMP脂质体抗转移活性的结果
实验例2根据不同的组分检验了TMP·I的抗转移活性。把TMP·I加入到70％卵磷脂和100％卵磷脂/胆固醇(Chol)(1∶1克分子比)的混合物中，用于抗转移实验。从C57BL老鼠的尾部静脉注入2×105浓度的B16F10黑素瘤细胞。在注射黑素瘤细胞后的1小时用250微克含有TMP·I的脂质体对老鼠进行处理，在第二次注射黑素瘤细胞后的第3天用250微克含TMP·I的脂质体对老鼠进行处理，在第3次注射黑素瘤细胞后的第7天以250微克含脂质体的TMP·I对老鼠进行处理。在第一次注入黑素瘤细胞后的第15天，通过把老鼠的颈椎骨错位的方法把老鼠杀死，然后从每组老鼠身上取出肺，并比较菌落数(表2)。表2.含有70％卵磷脂和含有100％卵磷脂的TMP·I脂质体的抗转移活性的结果
实验例3使用含70％卵磷脂的脂质体组份检验TMP·I浓度的抗转移活性。除了70％的卵磷脂外，还加入了胆固醇，以便增加脂质体的稳定性。以含有70％卵磷脂、胆固醇和TMP·I混合物的脂质体进行抗转移活性的实验。
结果表明含有50微克TMP·I的脂质体具有60％以上的抗转移活性(
图1和表3)。相反，含有250微克TMS(三甲基神经鞘氨醇)的常规TMS脂质体显示出大约50％的抗转移活性(Y.S.Park及其同伙，癌症研究，1994年第54期，2213-2217页)。这样，结果证明含TMP·I脂质体的抗转移作用优于TMS脂质体。
表3.根据不同的TMP·I含量确定的抗转移活性
实验例4根据不同的组份检验了各种抗转移脂质体的抗转移活性，并检验了加抗血管生成剂(AG3340，美国阿古龙医药公司产品)的脂质体的抗转移活性(表4)。通过以4∶4∶1的重量比混合卵磷脂/胆固醇/植物鞘氨醇制成控制脂质体。脂质与药物的比保持在20∶1的重量比。在下面的表4中示出脂质体的组份和作用。投药的TMP·I和药物(抗血管生成药)的浓度都定在100微克。在给定的脂质体中，不管药物(抗血管生成药)的存在与否，TMP·I的浓度都保持相同。
除了在注射黑素瘤细胞之后的第1小时，第3天、第6天和第9天分4次投脂质体外，实验的进行与例5中的方法相同。结果表明在含有植物鞘氨醇的脂质体的控制组内，菌落数稍有减少，然而，作用并不明显。当投用DPPC脂质体加上一种药物(一种抗血管生成药)时，显示出几乎很小的抗转移效果。但是，当投用含有TMP·I的脂质体加上一种药物(一种抗血管生成药)时，菌落数明显地减少到少于15个计数。当投用(TMP·I加上PEG)脂质体时，这种脂质是将10％的PEG-PE加入到含TMP·I的脂质体中制成的，这样投用增加了脂质体在血液中的滞留时间，观察到了类似的优越性(图2)。
表4.含TMP·I脂质体加入抗血管生成剂的协同抗转移活性的检验
实验例5使用一种乳化液测量抗转移活性，这种乳化液是由具有抗转移活性的一种TMP·I衍生物制成的。除了抗转移乳化液是以腹膜内投药外，实验按实验例4的方法进行。从未经处理的一组(一个控制组)得到的肺与那些经TMP·I乳化液处理的老鼠的肺相比较。结果示出在控制组中的老鼠的菌落数为250，而以TMP·I乳化液处理过的组的菌落数为70±20。这个值的含义是抗转移活性大于70％(图2)。实验例6把含有转移活性的TMP·I脂质体(DPPC/Chol/TMP·I＝5∶5∶1克分子比投给接种了路易斯肺癌(LLC)细胞的BDF1老鼠，观察到了它们对癌肿瘤生长的抑制效果。所使用的LLC癌细胞的浓度是每个老鼠一百万个癌细胞，通过皮下注射诱发肿瘤。皮下注射后的第1天，给每个老鼠静脉注射和腹膜内注射TMP·I脂质体(TMP·I含量100微克)。在皮下注射后的第3天、第6天和第9天，给每个老鼠重复地皮下注射相同的剂量，在注射后的第21天用把老鼠颈椎骨错位的方法杀死每个老鼠，用下面的公式测量癌的体积，在下面的表5中示出测量的结果。[公式1](癌的长轴)×(癌的短轴)2/2表5.TMP·I脂质体和AG3340(一种正控制)的投药途径和剂量数，以及对癌生长的抑制结果
如上表所示，在一个控制组中，癌生长的体积非常大，并显示出在癌区周围有一种活动的血管生成进程。在腹膜内注射TMP·I脂质体的组中，癌的体积显著地减小，血管生成的进程也大大地恶化。同时，在另一个组中，把2000微克的AG3340—一种MMP-2抑制剂—悬浮到非离子活性剂/羧甲基纤维混合液中，然后在20天内，每天都给老鼠注射，癌的体积并未大大缩小；也就是说，当AG3340，一种正控制，做腹膜内注射时，癌的体积只减小了大约30％。相反，当TMP脂质体做腹部注射时，癌的体积减小大约85％，而将TMP脂质体做静脉注射时，癌的体积减小大约60％。实验例7用B16F10黑素瘤细胞，检验TMP·I脂质体和阿霉素—具有细胞毒性剂的常规抗肿瘤剂—对老鼠癌细胞转移的作用。给每个老鼠静脉注射2×105个黑素瘤细胞，在注射后，立即投用33微克阿霉素，并且在静脉注射黑素瘤细胞后的第3天、第6天和第9天也分别投入相同剂量的阿霉素，在另一组中投用25微克阿霉素加上TMP·I脂质体。结果表明，投用TMP·I脂质体加阿霉素要比单独投用阿霉素在抗转移方面更有效，即使使用的阿霉素的量少一些也是如此(图3)实验例8制备两种不同类型的TMP·I脂质体，以便检验体内毒性和细胞毒性。两种含TMP·I阳离脂质体—DOPE/TMP和DPPC/Chol/TMP脂质体用来检验它们对癌细胞的细胞毒性作用。所使用的肝脏肿瘤细胞系是人类的肝脏肿瘤细胞系SNU398和老鼠黑素瘤细胞系B16F10。以不同的浓度制备出阳离子脂质体(TMP·I∶DOPE＝1∶1重量比)，然后检验了它们对癌细胞的细胞毒性作用(图4)。结果表明在老鼠黑素瘤细胞系内未观察到细胞毒性作用(高达200微克)，当肝脏肿瘤细胞系经12.5微克的TMP·I脂质体处理过后，观察到一些癌细胞的死亡，当用100微克的TMP·I脂质体处理之后，几乎所有的癌细胞均死亡。在SNU癌细胞的情况下，LD50是25微克(图4)。
当对老鼠腹膜内注射2000微克的含TMP·I阳离子脂质体，并且在第一次注射后的第3天和第6天分别重复地进行相同的注射时，在第一次注射后的第15天进行检验，观察到老鼠仍然活着。此外，当按上面的方式以1000微克的DPPC/Chol/TMP·I脂质体给老鼠做静脉注射时，在第一次注射后的第15天进行检验，它们也仍然活着(表6)。
表6.含TMP·I脂质体的体内毒性实验
实验例9使用一个台分粒器3000，根据脂质体和乳化液的规格的变化，检验了保持在4℃的抗转移脂质体和抗转移乳化液的稳定性。结果示出阳离子TMP·I脂质体在蒸馏水和5％的葡萄糖溶液中稳定。如果是PC基的脂质体，含DPPC和PEG-PE的脂质体最稳定，乳化液在两个月的期间内也显示稳定(图5)。
如上所示，本发明提供了含有TMP的多功能脂质体，如结构式I的一种植物鞘氨醇衍生物，它不仅能抑制癌细胞的转移和生长，并且当与另一种抗肿瘤剂结合使用时，还能使抗转移作用达到最佳程度。和常规的脂质体不同的是，这些抗转移脂质体可单独展示出抗转移活性，因而，它们在抗肿瘤剂的传递系统中将是非常有用的，而且也能够减少给定的抗肿瘤剂的剂量水平。
权利要求
1.一种具有抗肿瘤活性的植物鞘氨醇衍生物，含有一种结构式(I)的植物鞘氨醇衍生物作为一种活性成份。 其中R1，R2和R3分别代表一个氢原子或一个C1-C8烷基；X代表一个原子或一个原子团，该原子团含有一个卤素原子，一个羟基，一个烷基磺酸盐原子团或一个芳基磺酸盐原子团。
2.按照权利要求1所述的植物鞘氨醇衍生物，其特征是该植物鞘氨醇衍生物是N，N，N-卤化三甲基植物鞘氨醇。
3.按照权利要求1所述的植物鞘氨醇衍生物，其特征是该植物鞘氨醇衍生物含在脂质体或乳化液中。
4.按照权利要求1所述的植物鞘氨醇衍生物，其特征是含有一种抗血管生成活性的物质或一种细胞毒性癌药物加上该植物鞘氨醇衍生物。
全文摘要
本发明涉及一种具有抗肿瘤活性的植物鞘氨醇衍生物，更具体的是，涉及到一种含有结构式I的一种植物鞘氨醇衍生物作为活性成分的抗肿瘤剂。其中R
文档编号A61K31/21GK1403439SQ01125299
公开日2003年3月19日 申请日期2001年8月31日 优先权日2001年8月31日
发明者南宫成键, 朴宣怡 申请人:蝉真有限公司