专利名称：N－乙酰－5，6－二甲氧基色胺用于制备抗氧化自由基药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种褪黑激素衍生物的生产方法，具体地说，是N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺用于制备抗氧化自由基药物。
褪黑激素(melatonin)，即N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺，其结构式是 褪黑激素在哺乳动物和人类主要由位于大脑正中部位的松果体腺生成。其合成和分泌呈现明显的昼夜节律性，并随年龄而变化。年龄越大，生成越少。这种节律性受机体内在的机制和环境的影响。最明显的环境因素是光照。当暴露于光线后，褪黑激素的合成与分泌立即被抑制。褪黑激素在进化过程中为一高度保守的分子，从最低等的单细胞生物藻类至人类都有这一化合物分子。褪黑激素有许多重要的生理机能如促进睡眠，调节机体的昼夜节律性及生殖功能，延缓衰老，抑制肿瘤细胞的生长，近年发现褪黑激素为目前最强的内源性自由基清除剂，能延长实验动物的寿命达30％，保护中枢神经系统对抗多种有毒物质的损伤，又发现对艾滋病有辅助治疗效果。其抗氧化作用的主要功能基团为其分子结构吲哚环上第5位碳原子上的甲氧取代基。褪黑激素在体内主要经肝脏代谢，由羟化酶将其分子结构中吲哚环上第6位碳原子羟基化，生成6-羟基褪黑激素而排出体外，所以其半衰期短(约40分钟)，需要反复多次给药才能维持所需要的治疗浓度。褪黑激素的抗氧化作用为直接清除自由基，其通过受体介导的作用就成了副作用，例如嗜睡等。因而褪黑激素具有半衰期短，有一定的副作用的缺点。
本发明的目的就是为了克服褪黑激素的半衰期短、存在一定的毒副作用的缺点，提供一种具有较强自由基清除作用、半衰期较长、毒副作用较低的化学物质、其制剂、生产工艺及该化合物在医用抗氧剂中的应用。
本发明是这样实现的。
本发明为以下化合物(I)， 名称为N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺，又即3-乙酰胺基乙基-5，6-二甲氧基吲哚。与褪黑激素相比，在吲哚环上第6位引入甲氧基取代原来的氢原子。化合物(I)分子量为262，为淡黄色结晶，微溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙腈等有机溶剂，溶于有机溶剂后其在水中的溶解度可增高1000倍以上。
本发明的化合物(I)以5，6-二甲氧基吲哚作为合成起始物，经四步合成而得。如采用直接在褪黑激素分子结构的基础上，定向在吲哚环第6位引入甲氧基，由于空间效应及电子效应，此基团更易在其它部位取代，而得不到目标物或其生产率极低。
该四步分述如下第一步3-二乙氨甲基-5，6-二甲基吲哚的合成
取5-6-二甲氧基吲哚，溶于醇中，在低温下配制醋酸与二乙胺溶液混合后呈微酸性，加入甲醛溶液，搅拌，将其倒入5，6-二甲氧基吲哚醇溶液中，搅拌，加入强碱水溶液，用有机溶剂提取，经洗脱、干燥，得油状物。
第二步3-乙腈，5，6-二甲氧基吲哚的合成 将第一步的合成物溶于甲醇，二甲基甲酰胺，水，氰化物(如氰化钠或氰化钾)混合液中，缓慢滴加一碘甲烷，静置，搅拌。有机溶剂抽提。干燥，重结晶，得结晶物。
第三步5，6-二甲氧基色胺的合成 采用液氨，130大气压下，采用镍-氢催化剂，在120～130℃合成；或采用钠+醇法，在3-乙腈，5，6-二甲氧基吲哚的乙醇或甲醇溶液中加入钠，合成；或者通过四氢铝锂还原法制备5，6-二甲氧基色胺，生成物用有机溶剂提取，结晶，干燥，得结晶物。
第四步N-乙酰-5，6-二甲基氧基色胺(化合物I)的合成采用胺的乙酰化反应，采用酸酐或酰卤(如酰氯)酰化法。生成物用有机溶剂溶解，用水溶液清洗，抽真空挥发掉有机溶剂，用苯纯化，即得终产物。
终产物经质谱分析以及核磁共振结构分析，结果见
图1、图2，其中图1为终产物的电子轰击质谱图，图2为终产物的H1核磁共振图谱，证实其结构式为化合物(I)。
本发明的化合物(I)在褪黑激素分子结构的基础上，在其关键性的吲哚环第6位碳原子上引入了一个甲氧基，从而导致了整个吲哚环电负性增加，使其捕获自由基的能力大大加强，并由于吲哚环第6位已被甲氧基所占领，推测专一性强的羟化酶的作用被阻断，从而代谢减慢，半衰期延长。同时由于关键部位结构的改变，推测其与受体的亲和力下降，其副作用也相应地减少。因而化合物(I)与褪黑激素相比，具有显著的优点。
本发明考察了化合物(I)的羟基自由基清除实验及神经系统保护的动物实验。
N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺羟基的自由基清除实验羟基自由基(OH)为生物体内反应最剧烈、毒性最大的氧化自由基。许多疾病如神经系统退行性病变、老年性痴呆(帕金森综合症)、心血管系统的疾病、肿瘤、爱滋病及衰老都与其有直接和间接的关系。OH·的半衰期非常短，大约10-9秒左右，目前还无法直接测定OH·，但可用电子自旋捕获剂，例如5，5-dimethylpyrroline N-oxide(DMPO)来捕获OH·，形成较稳定的DMPO与OH·的加成物(DMPO-OH)。然后可用高压液相及电-化学检测器来测定DMPO-OH的量，用以推测OH·的生成量，为了测定N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺羟基自由基清除能力，采用了下述的OH·生成系统，即用短波紫光(波长254nm)光解双氧水，使一个分子的双氧水光解成两个分子的OH·，其化学表达式如下
在此羟基自由基系统中加入等量的DMPO以及不同浓度的N-乙酰-5，6-二甲基氧基色胺，然后测定DMPO-OH的生成，结果显示N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺显著地抑制DMPO-OH的生成，即具有显著的羟自由基清除作用(图3)，其抑制作用呈剂量依赖性(图4)。半数抑制剂量IC50为17微摩尔浓度，其自由基清除作用优于目前所公认的内源性的自由基清除剂褪黑激素(IC5021微摩尔浓度)。
神经系统保护作用的动物实验Kainic Acid(KA)是一种神经毒素，能过度地激活脑细胞兴奋性氨基酸受体，产生自由基，导致神经原的损伤与死亡。所以KA常被用于诱导脑细胞损伤模型，为了探讨N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺(化合物I)对神经细胞保护作用，设计并完成了如下的实验实验方法40只CD2-F1小鼠，雄性，体重26～28克，喂养在标准动物房，自由进食与饮水，室温22℃左右，光照条件为白天12小时，黑夜12小时，即清晨7时开灯，下午19时关灯，由电脑控制室温与光照。
将小鼠随机分为3组，第1组(即KA组)小鼠15只，给予皮下注射KA 40mg/kg体重。第2组[即KA+化合物(I)]小鼠15只，预先腹腔注射化合物(I)乙醇、水溶液(乙醇∶水比例为1∶500)5mg/kg体重，10分钟后再皮下注射KA 40mg/kg体重，剂量与第1组相同。第3组(即空白对照组)10只小鼠仅皮下注射等容积的生理盐水作为正常对照观察。
各组动物观察指标均为强直性痉挛、抽搐和死亡数，并用生化的方法测定脑组织脂质过氧化物(LPO)的形成。
实验结果第1组小鼠15只全部出现了强直性痉挛及抽搐，其中6只死亡。第2组仅3只动物出现强直性痉挛，6只动物出现抽搐，但无一死亡(图5)。
每组余下的小鼠各取6只，在3天后断头处死，处死后立即取出整个脑组织于-80℃低温冰冻保存，然后用整个脑组织均浆，按常规的方法检测脑组织脂质过氧化物的生成量。结果第1组(KA组)动物脑组织脂质过氧化物含量显著增加，此增加与对照组比较，具有显著统计学意义(P＜0.05)。而第2组动物预先注射化合物(I)，其脑组织脂质过氧化物的含量维持在与对照组相同的水平(图6)。实验结果再一次显示KA皮下注射40mg/kg体重可使实验小鼠大脑海马CA3区椎体神经原细胞(与短期记忆有关的细胞)全部坏死，而预先10分钟腹腔注射化合物(I)5mg/kg体重，可使95％的CA3区的椎体神经原细胞得以保存。N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺[化合物(I)]通过抗氧化作用达到了对神经细胞强大的保护作用，也提示了这一化合物(I)存在着巨大的、潜在的临床应用价值。
通过上述化学法和初步实验结果，得出化合物(I)具有强大的羟基自由基清除作用，因而，推测在临床上对于延缓衰老、预防和治疗中枢神经系统退行性病变，包括老年性痴呆、帕金森综合症、心脏病、肿瘤的辅助治疗、艾滋病的辅助治疗等与自由基有关的疾病具有良好的疗效及未见明显的毒副作用，且半衰期长。
图面说明图3为高压液相(HPLC)图谱，说明N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺对DMPO-OH·加成物形成的影响。峰1，2为溶剂前沿，峰3为DMPO-OH·信号。
A为双氧水在短波紫外线辐射下光解形成OH·后于DMPO作用，形成加成物后的HPLC图谱。
B为与A相同的条件下加入了60微摩尔浓度的N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺后的HPLC图谱。DMPO-OH·形成被明显抑制。
图4为N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺对DMPO-OH·形成抑制作用量效反应曲线，资料均从HPLC-电化学检测器测定DMPO-OH·所得，数据表示为均值±标准误，样本数为6。
图5为N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺对KA小鼠神经保护作用的实验结果。
图6为N-乙酰-5，6-二甲基色胺对KA诱导的脑脂质过氧化物形成的影响，数据表示为均值±标准误，样本数为6。
本发明所说的化合物(I)可加工成口服剂型，包括片剂、缓释片剂、胶囊剂、冲剂、口服液，也可加工成注射剂型，包括粉针、注射液，还可加工成外用剂型，如透皮吸收膜剂、膏剂、霜剂。采用本技术领域普通技术人员熟知的技术，加工成上述剂型。通过动物实验的结果估计人体的有效剂量为2～10mg/人/天，每天1～4次。
本发明的化合物(I)也可加工成外用自由基清除剂，添加入化妆品中，作为防晒剂。
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1，化合物(I)的合成第一步3-二乙氨甲基5，6-二甲氧基吲哚的合成1克5，6-二甲氧吲哚，溶于2ml EtOH，冷却至15℃备用。配制1.4ml 60％的乙酸与0.48克Et2NH溶液，冷却至5℃，然后加入0.51ml37％的福尔马林，在5℃温度下搅拌10分钟，将其倒入配制好的5，6-二甲氧基吲哚EtOH溶液中。当温度上升至室温23℃左右，搅拌一小时，再将此混合液倒入20ml冷却的一个当量的NaOH溶液中，然后用3份Et2O抽提。抽提物用饱和的NaCl溶液洗脱三次，用Na2SO4干燥，Et2O挥发后留下油状的3-二乙氨甲基，5，6-二甲氧基吲哚。
第二步3-乙腈，5，6-二甲氧基吲哚的合成第一步的合成物溶于20ml MeOH，1ml DMF，1ml水与1.4克NaCN混合液中，缓慢滴入2.1ml MeI，静置1小时，再搅拌1小时。将此混合物倒入大量的冷却的双蒸水中(400m1)。再用CH2Cl2抽提，抽提物水洗3次，Na2SO4干燥，抽真空除去溶剂，然后用benzene-hexane(1∶1苯-正己烷)再结晶。产量为0.5克(基于合成起始物产量约为50％)。
第三步5，6-二甲氧基色胺的合成将4ml含有0.52ml 100％H2SO4的THF溶液滴入预先配制的0.76克LiALH4与20ml THF混合液中，不要移除所沉淀的Li2SO4，缓慢滴入4ml含有0.5g的3-乙腈，5，6-二甲氧基吲哚(30分钟加完)，搅拌1小时，加入冰块破坏过度的氢化物。倾掉大部分的THF上清液(目的是减少在抽提过程中乳化形成)，沉淀的铝盐与20％的NaOH起反应，形成云雾状的溶液，由CHCl3抽提，抽提物中仍含有部分THF溶液，用饱和NaCl溶液洗脱3次，Na2SO4干燥，抽真空除去溶剂。剩余物由Et2O-Pentane(1∶1乙醚∶正戊烷)结晶，然后水洗，干燥后可获得0.4g纯的5，6-二甲氧基色胺(产量约80％)。
第四步N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺的合成将含有0.4g 5，6-二甲氧基色胺的3.2ml C6H6和0.8ml吡啶的混合液冰浴，然后加入0.4ml Ac2O，移除冰浴，搅拌3小时，抽真空挥发掉有机溶剂。用1∶1的CHCl3和EtOAc再溶剩余物，然后用5％的NaHCO3的饱和NaCl溶液交替清洗3次，抽真空挥发掉有机溶剂，然后用煮沸的C6H6纯化，即得到0.35g化合物(I)(产量约87％)。
制剂的制备取化合物(I)，以1mg/ml的浓度过滤，溶于注射用水中，分装，灭菌，制备成注射剂。
实施例2，化合物(I)的合成第一步、第二步同实施例1。
第三步5，6-二甲氧基色胺的合成取3-乙腈，5，6-二甲氧基吲哚，溶于乙醇中，加入金属钠，反应1小时，加入水，除去多余的钠，加三氯甲烷(氯仿)抽提，用饱和NaCl溶液洗脱，无水硫酸钠干燥，除去溶剂，重结晶，即得。
第四步化合物(I)的合成采用 (乙酰氯)取代乙酸酐，其余同实施例1。
制剂的制备取化合物(I)，加入淀粉或糊精或糖粉或微晶纤维素作稀释剂，以水或淀粉浆或胶类或羟甲基纤维素作润湿剂，以干淀粉或羧甲基淀粉钠或低取代羟丙基纤维素作为崩解剂，以硬脂酸镁、滑石粉作润滑剂、助流剂，通过湿法制粒，干燥，加入润滑剂、助流剂，压片，即得片剂。剂量为每片含1mg化合物(I)。
实施例3，化合物(I)的合成。
第一步、第二步同实施例1。
第三步5，6-二甲氧基吲哚取3-乙腈，5，6-二甲氧基吲哚，在130大气压，120～130℃情况下，采用镍氢催化剂，催化加成，经抽提，净化，制得5，6-二甲氧基色胺。
第四步同实施例1。
制剂的制备取化合物(I)适量，加聚乙烯醇，加热，混匀，加氮酮作为透皮吸收促进剂，制备成透皮吸收膏剂。
本发明的化合物(I)的合成的每一步之间相互独立，如第三步，即可采用催化加氢法，也可采用钠加醇法，也可采用四氢铝锂还原法，第四步，即可以采用乙酰酐酰基化反应，又可以采用酰氯的酰基化反应制备。而不限于上述实施例。
本发明的化合物(I)的制剂的制备，采用本技术领域普通技术人员熟知的技术，制备成各种剂型，不限于上述实施例。
权利要求
1.N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺用于制备抗氧化自由基药物。
2.根据权利要求1所述的N-乙酰-5，6-二甲氧基色胺用于制备抗氧化自由基药物，其特征在于将其添加入化妆品中，作为防晒剂。
全文摘要
一种褪黑激素衍生物N－乙酰－5，6－二甲氧基色胺的用于制备抗氧化自由基药物，其合成分四步，以5，6－二甲氧基吲哚为起始原料，该化合物在制药上作为医用抗氧化剂使用，其半衰期长，未发现明显毒副作用。
文档编号A61P39/00GK1411808SQ0112502
公开日2003年4月23日 申请日期1998年3月18日 优先权日1998年3月18日
发明者谭敦宪, 雷特, 颜美婷 申请人:谭敦宪, 雷特, 颜美婷