鹿血清活性多肽晶体制剂及制备方法

专利名称：鹿血清活性多肽晶体制剂及制备方法
技术领域：
本发明属生物制品技术领域。具体涉及一种鹿血清活性多肽晶体制剂及制备方法。
本发明提供了一种鹿血清活性多肽晶体制剂，该制剂是由鹿血清活性多肽晶体作为活性成份与药用载体组成的。
本发明制剂的活性成份是活性多肽晶体，包括全血清活性多肽晶体、白蛋白活性多肽晶体、球蛋白活性多肽晶体和γ球蛋白活性多肽晶体。
本发明的另一所要解决的技术问题是提供了上述一种鹿血清活性多肽晶体制剂的制备方法，该方法包括下列步骤①用无菌带针血袋(含抗凝剂)在健康马鹿空腹条件下，抽取雄性动脉血液，摇动均质，抗凝；②作病毒检测；③灭活处理，确保血液中无病毒；④作第二次病检测；⑤带袋离心分离，分离出全项马鹿血清；⑥在100度卫生环境超净工作台内，用无菌针管抽取全项马鹿血清，集中于无菌不锈钢容器内，封闭取出；⑦将全项马鹿血清放入超深冷冻装置，作-60℃24小时捕水达到99.8％干燥状态；
⑧将固态晶体粉碎至单晶体直径30A左右的状态；⑨将粉碎后的晶体放入超临界翌取装置内，以及指定规格大孔树脂媳妇配置条件下，提取分段或单体肽类物质；⑩用提取的肽类物质与作用明确的单味中药材流浸膏混合，均质，制成剂型；包装。
本发明的马鹿血清提取物经临床化验血清蛋白结果见

图1


I.用ICP-AES法测定鹿血及其产品中11种微量元素的结果如下1.实验部分1.1.仪器及工作条件岛津ICPQ-1000型光量计，M-20计算机，入射功率1.2kW，发射功率小于4W，冷却气流量11L/min，辅助气流量1.2L/min，载气流量1.0L/min，观测高度15mm，积分时间20s。
1.2.标准溶液及试剂各元素标准均采用优级纯或光谱纯试剂配制成1mg/ml的单标准贮备液，再根据需要分组制备混合标准工作溶液，其中均含3％的盐酸，所用酸为优级纯，水为二次去离子水。
1.3.试样制备方法一将试样吸取10ml(固体称取1.000g)移入100ml石英烧杯中，加入1.0ml硫酸置电热板上在70-80℃蒸发，待溶液粘稠时，慢慢旋转烧杯，使溶液粘在杯壁上，加热至形成脱水糖浆硬膜之后，升高温度除去过量的酸于500℃灰化1小时，取出，冷却，加入2ml(1+1)盐酸，加热溶解残渣，然后转入10ml比色管中，用水定容待测。
方法一将试样吸取5ml(固体称取0.5000g)于聚四氟乙烯高压溶样器中，加入5ml硝酸，放置一夜，加1ml高氯酸，盖盖后放入烘箱内，在100℃加热2小时后升温到150℃，再加热2小时，取出，放冷，慢慢开盖，将高压溶样器放在电热板上加热(200℃)以下近干，加1ml硝酸继续加热蒸至近1滴，趁热加入1ml(1+1)盐酸，加10ml二次定容待测。
2.结果与讨论2.1.样品制备的方法试验我们分别用湿法消化(硝酸-硫酸、硝酸-过氧化氢)，加硝酸振荡，硫酸炭化500℃灰化样品和高压溶样器内硝酸-高氯酸溶样等方法进行试验，由于鹿血制品中含大量蛋白及糖，使得在湿法消化时不易控制，温度稍高，溶液四溅或器起沫溢出，加硝酸振荡会由于反应剧烈而喷出，硫酸炭化500℃灰化之后盐酸提取和高压溶样器内硝酸-高氯酸溶样则安全、简便、不易损失。
2.2.对照试验方法一和方法二各有所长，方法一所需时间短，前处理快，而方法二由于消化后还需蒸干故所需时间长，但操作简单，省力，试剂空白低，可防止挥发性元素的损失，我们对鹿血、鹿胎冲剂分别用方法一和方法二处理，在ICP上测试，结果基本一致。
2.3.测定结果我们采用方法一分别对鹿血、鹿血双抗酒，鹿血口服液和鹿胎冲剂进行了5次测定，其平均值见表1表1 样品分析结果元素 Mg Cr Mn Fc Co N1Cu Zn Ti AlP鹿血双抗酒20.60 0.034 0.106 1.72 ＜0.01 ＜0.02 0.038 1.350.011 0.649 28.65鹿血口服液134.0 0.085 0.877 7.97 ＜0.01 ＜0.02 0.331 3.050.328.3449.32鹿血 16.60 0.041 0.024 345.0 ＜0.01 ＜0.02 0.463.240.017 0.19149.0鹿胎冲剂(μg/g) 109.0 0.26 0.67 32.24 ＜0.10 ＜0.20 ＜0.10 7.950.659.04162.6鹿胎冲剂(μg/g) 669.1 1.13 1.55 43.1 ＜0.01 0.54 0.6729.92 0.3354.42 43.59(加牛奶)2.4.方法的准确度和精密度我们对鹿血双抗酒进行了6次测定，冰加入标准进行了回收试验，得到回收率在86.6％-99.7％，相对标准偏差在2.23％-8.09％。
II.鹿血对小鼠肠道菌群及免疫功能的影响如下鹿血中医列为扶正固本，壮阳补肾药，入肾经。《本草纲目》记载“鹿血具有补虚、补血、益精和解毒的功效，不拘男女老少，服之终身无疾而寿的功效”，自古以来视为珍品。为获得鹿血具有抗衰老的理论依据，本发明旨在有关鹿血调整肠道菌群及增强免疫功能的研究。
1.材料与方法
1.1.动物昆明纯种小白鼠，由牡丹江医学院动物中心提供。体重20-22g，雌雄各半，共60只随机分为6组，每组10只。除设置正常对照组外，其它5组均用盐酸林可霉素造成菌群失调后，分别为模型组、阴性对照组(自然恢复组)、阳性对照组(丽珠肠乐治疗组)、实验组(中药鹿血治疗组)、免疫学阳性对照组(人参皂甙治疗)。
1.2.药物及试剂鹿血(新鲜无菌抗凝血)。由牡丹江市东宁县马鹿养殖场提供。丽珠肠乐胶囊由珠海经济特区丽珠医药集团股份有限公司提供，批号950732。人参皂甙由牡丹江医学院抗衰老研究所提供，RPM 11640培养基(GT IBCD试剂公司)。
1.3.培养基为分离肠道菌群的选择性培养基EMB、EC、BS、LBS、Bdb。
1.4.方法1.4.1.给药除对照组灌以等量的生理盐水，其它各组均以盐酸林可霉素灌胃，剂量5000mg/kg/日。连续三天达到抗生素脱污染菌群失调的程度。造型后第4天分别灌胃丽珠肠乐生理盐水稀释液，剂量为0.5ml/日(0.2亿/ml含菌量)。灌胃鹿血，剂量为0.6ml/日，分两次给药，腹腔注射人参皂甙0.3ml(25mg/kg)，每组持续给药7天。
1.4.2.肠道菌群检查标本采取除模型组，其它各组则在一个疗程后以及对照组均被迫采取小鼠新鲜粪便0.1克，置于含0.9ml稀释液和玻璃珠的无菌小瓶内(w/v1∶10)，均200次/分震荡15min。
标本的稀释，滴种与培养将匀质化的标本进行10倍稀释直至10x，选择相应培养基的三个稀释度，由高向低稀释滴种(每滴液体量为1/47ml)，每个稀释度滴三滴。EMB和EC培养基倒置放入37℃培养，24小时后观察结果，BS、LBS、Bdb培养基用厌氧灌法培养72小时后观察结果。
活菌计数CFU/g＝X×47×稀释倍数×1/g标本，结果取常用对数值LgCFU/g形式。
细菌生物型的鉴定根据菌落特征，涂片Gram染色，耗氧类型做为初步鉴定后，进行生化反应鉴定。
1.4.3.免疫学指标检测腹腔Mψ吞噬功能测定，溶血空斑试验淋巴细胞转化试验，NK细胞活性测定。
1.4.4.统计学处理标准统计程序处理。
2.结果2.1.各组小鼠粪标本菌群检测结果，见表2
表2 各族小鼠粪标本菌群检测结果的比较(Lg10n/g标本，X±SD)组别肠杆菌肠球菌 双歧杆菌 乳酸杆菌 类杆菌正常对照组8.18±0.787.11±0.859.04±0.449.35±0.439.05±0.50模型组6.15±0.436.49±0.428.07±0.168.16±0.208.12±0.27自然恢复组6.42±0.436.73±0.338.52±0.138.04±0.188.22±0.39丽珠肠乐治疗组8.16±0.307.04±0.359.36±0.299.41±0.239.07±.024鹿血治疗组8.20±0.527.01±0.409.25±0.459.32±0.619.04±0.56人参皂甙治疗组8.27±0.377.08±0.519.08±0.269.21±0.489.01±0.68从表2可以看出，鹿血调整肠道菌群失调的作用与丽珠肠乐的作用相符，人参皂甙亦有调整菌群失调的作用。
2.2.鹿血对小鼠腹腔Mψ吞噬功能的影响，见表3表3 鹿血对小鼠腹腔Mψ吞噬功能的影响X＝X±S组别N(只)剂量(ml/只)吞噬百分率正常对照组 10 0.5ml(NS) 36.3±2.68模型组 10 34.3±2.68自然恢复组 10 0.5ml(NS) 35.4±1.82丽珠肠乐治疗组 10 0.5ml 47.4±2.87*鹿血治疗组 10 0.6ml 58.6±2.35***人参皂甙治疗组 10 0.3ml 54.1±2.19***与正常对照组比较***P＜0.001*P＜0.052.3.血对抗体产生细胞的影响，见表4表4 鹿血对抗体产生细胞的影响X＝X±S组别 N(只)剂量(ml/只) 空斑均值正常对照组100.5ml(NS) 634.0±89.78模型组10 561.5±90.79自然恢复组100.5ml(NS) 608.2±101.37丽珠肠乐治疗组100.5ml 887.1±148.20***鹿血治疗组100.6ml 1307.9±220.93***人参皂甙治疗组100.3ml 1252.9±253.80***与正常对照组比较***P＜0.0012.4.鹿血对小鼠T淋巴细胞转化率的影响，见表5表5 鹿血小鼠T淋巴细胞的转化的影响X＝X±S组别N(只)剂量(ml/只)空斑均值正常对照组 100.5ml(NS) 44.7±6.90模型组 1040.6±4.56自然恢复组 10 0.5ml(NS) 42.2±4.37丽珠肠乐治疗组 10 0.5ml 60.5±5.10***鹿血治疗组 10 0.6ml 67.2±5.09***人参皂甙治疗组 10 0.3ml 65.3±6.00***与正常对照组比较***P＜0.0012.5.鹿血对小鼠NK细胞活性的影响，见表6表6 鹿血对NK细胞活性的影响X±SD％组别N(只) 剂量(ml/只) 空斑均值正常对照组 100.5ml(NS) 22.56±1.28模型组 10 20.57±2.05自然恢复组 100.5ml(NS) 20.69±1.39丽珠肠乐治疗组 100.5ml 30.90±1.48***鹿血治疗组 100.6ml 33.02±2.16***人参皂甙治疗组 100.3ml 32.40±1.24***与正常对照组比较***P＜0.0013.讨论本实验用大剂量盐酸林可霉素造成小鼠肠道菌群失调性腹泻，是因为破坏了正常菌群与其宿主的微生态平衡，使其肠道菌群生物屏障作用降低的结果。用中药鹿血治疗，控制和改善了小鼠的腹泻症状，使肠道菌群恢复至正常水平，同时机体的非特异性吞噬细胞免疫功能，B细胞产生抗体的免疫能力，T淋巴细胞转化率以及NK细胞活性试验均明显增强，与阳性对照组结果一致。这证明做为扶正固本的中药——鹿血能够促进机体正常菌群的生长发育，增强机体的免疫功能，达到扶正祛邪的目的。
我们将机体与体内的正常菌群视为不可分割的完整的统一体，正是由于正常菌群体的存在才使机体得到以在自然环境中抗争、生存，祖国医学的精髓“正气存内，邪不可干”即包含了正常菌群和免疫功能对体机体的保护作用，而正常菌群对免疫功能又有促进作用。人和动物体内存在复杂的相互密切联系的神经——内分泌——代谢——微生态——免疫交叉网络，众所周知机体的免疫功能受其整体状态的影响，机体内环境稳定及平衡与否与免疫功能的强弱有着必然的内在联系。对Mψ非特异性吞噬消化功能增强，亦可增强其处理和呈递抗原及产生细胞因子的作用，从而启动一系列免疫应答。NK细胞活性增强无疑在机体抗病毒、抗肿瘤和免疫调节方面起着重要作用。补益中药能抗疾病、延缓衰老是以扶持正常菌群及增强调节免疫功能为理论的。我们的实验结果表明鹿血除扶持正常菌群，调整微生态失调的作用外，尚具有增强免疫功能的作用。鉴于所得结果有待我们进一步深入研究鹿血扶持正常菌群增强免疫功能的作用机理，为《本草纲目》的“鹿血服之终身无疾而寿”提出更加充分的科学根据。
III.梅花鹿血液药用机理初步研究如下1.材料来源被测血清标本均来自石家庄市陆生野生动物繁育研究基地饲养场圈养的8只雄性健康梅花鹿，鹿龄3-4a，体重60-80kg。
2.检测标本的采集1998-06-05，1400-1730，空腹鹿颈静脉采血，放于两支经无菌处理的干净试管中，一支试管肝素抗凝，另一支干管分离血清。
3.实验方法3.1.血象的检查红细胞数目用改良组巴氏血球计数板在显微镜下计数。其它项目检查取肝素抗凝血25μl稀释至6ml，在Hemacellplus(法国产)血球计数仪上测定。
3.2.生化项目的检查取鹿血清50μl用日立7150型自动生化分析仪(日本产)进行测定。
3.3.微量元素的检查锌、铜、铁、锰、镁的测定取血清30μl用美国产IL VIDE022型原子吸收分光光度计测定。
3.4.总蛋白及蛋白组分的检查总蛋白含量用双缩脲比色法测量。组分蛋白含量用醋酸纤维薄膜电泳法测量。
4.试验结果4.1.血象检查结果8只梅花鹿10项血象检查结果见表7。
表7 3只梅花鹿血象检查结果(标本数＝8)检查项目 平均值人生理值红细胞总数(万mm3) 1250(1150-1550) 450-500白细胞总数(万mm3) 2000(1800-2500) 1000-10000嗜中性白细胞(％)35(31-45) 50-70淋巴细胞(％)51(40-56) 20-40单核细胞(％)13(9-16) 3-8血红蛋白(％)13.5(11.5-15.5) 12-16胞平均厚度(％) 11.8(10.2-13.5) 37-49红细胞平均容积(Fl) 40(37-47) 82-92红细胞平均Hb容量(Pg)38.7(35.2-40) 72-31红细胞平均Hb浓度(g/L)970(900-1100) 320-360从表7可知鹿血红细胞数、红细胞平均Hb含量、红细胞平均Hb浓度都大大高于人正常生理值，而白细胞却低于人正常生理值。高倍显微镜下观察红细胞呈双面的圆盘状，用测微器测量直径6.8-4.2μm。
4.2.梅花鹿血清中7种微量元素检查结果见表8表8梅花鹿血清中7种微量元素检查结果(检测数＝8)元素名称 平均值人生理值Ca(mmol/L)2.02(2.12-1.92) 2.18-2.75P(mmol/L) 2.68(2.82-2.46) 0.97-1.62Zn(μmol/L) 51.3(49.1-55.2) 7.65-22.97Cu(μmol/L) 21.4(19.2-23.1) 14.2-20.5Fe(μmol/L) 255.6(230.2-268.3) 10.7-26.9Mn(μmol/L) 0.16(0.15-0.18) 0.12-0.2Mg(μmol/L) 7.97(7.25-8.15) 0.78-1.0从表8可见，梅花鹿血清中的磷、锌、铜、铁、锰5种微量元素均大大高于人血清正常值。
4.3.生化检测结果用生化自动分析仪对梅花鹿血清中酶类及其他生化项目检测结果见表9。
表9 梅花鹿血清生化检测结果(标本数＝8)检查项目平均值人生理值谷草转氨酶(μ/L) 128(100-148) 6-37谷丙转氨酶(μ/L) 65(55-75) 45乳酸脱氢酶(μ/L) 620(600-760) 114-240碱性磷酸酶(μ/L) 62.7(50.2-70.1)15-112磷酸肌酸激酶(μ/L) 327(292-365) 25-200α-羟丁酸脱氢酸(μ/L)639(580-690) 72-182磷酸计算激酶辅酶(μ/L) 772(710-820) 0-24胆固醇(mmol/L) 1.99(1.7-2.1) 2.53-5.4肌酐(μmol/L)123(100-156) 62-133尿素(mmol/L) 7.9(6.82-8.02) 2.9-7.1从表9可见鹿血血清中7种主要酶类的含量都远远高于人正常生理值。4.4.血清总蛋白、白蛋白、球蛋白和各组分蛋白检测结果见表10。表10 梅花鹿血总蛋白及各组分蛋白测定结果(标本数＝8)检查项目 平均值 人生理值总蛋白(g/L) 70.4(66.5-72.5) 60-80白蛋白(g/L) 34.9(32-45.5)10-55球蛋白(g/L) 35.5(31.5-40.5) 20-30α1-球蛋白(％) 2(1.8-2.2) 0.9-3.0α2-球蛋白(％) 9.4(9.0-9.8) 1.0-4.0β-球胆白(％) 13.8(12.2-14.2) 6.0-14γ-球蛋白(％) 25.2(24.4-26)8.0-2.0从表10可见，梅花鹿血总蛋白含量与人血清正常值一致，但白蛋白水平较低，而球蛋白水平较高。特别是γ球蛋白是人血清正常值的3倍。
5.讨论历代本草均记述生鲜梅花鹿血有大补虚损、益精血、解豆毒药毒、止腰痛、治肺痿、吐血及崩中带下等奇效。本文通过对8只平原圈养梅花鹿血象、生化指标、微量元素和蛋白组分检测证实平原圈养梅花鹿与其它方式饲养的梅花鹿的血象、生化指标、微量元素和蛋白组分方面无明显差别，故其药理作用是相同的。
红细胞是血液中最多的细胞，其主要功能是运输氧气和二氧化碳，血液中98％的氧是和红细胞中血红蛋白以化学结合的形式被运输的。检测结果证实梅花鹿红细胞数是人体红细胞数的3倍，体积只有4μm左右，是人红细胞体积的1/2。鹿血中红细胞数目比人血的多和体积小，势必扩大了红细胞的膜面积，使血液流经氧分压高的肺部时氧能大量的进入红细胞。鹿血中的氧含量是否有助于其药理作用应进一步探讨。
酶是具有胶体性质的有机催化剂，由活性细胞产生，能在细胞内和细胞外起着催化作用，故称生物催化剂。机体代谢活动中的各种化学变化，都是由酶所催化。本试验中检测的7种酶，鹿血清中的含量都远远高于人血清，尤以磷酸肌酸激酶(CPK)、α-羟丁酸脱氢酶(HBD)、磷酸肌酸激酶辅酶(CK-MB)含量更为显著。因此采用鹿血作原料药应考虑如何保持酶活性。否则将影响药用价值。
据世界卫生组织报导在众多的微量元素中，现在认为人体必需的有15种，其中以铜、铁、锰、锌、钙对生物体的生长发育，新陈代谢起着重要作用。一方面它们可以成为与生命有关的生物分子的组成成分，另一方面它们既可为酶系统的成分，亦可在许多酶促反应中作为辅基发挥作用。
雄性梅花鹿鹿血中钙、锌、铜、铁、锰都远远高于正常人血清值，其中锌元素高于人的3倍。国内外研究结果已经公认，锌是人体80多种酶的组成成分和激活因子。它对人和动物的生精细胞的发生、发育、生殖功能的调节都有重要作用。故有人认为锌是与生命攸关的必需元素。特别是缺锌可导致不育的研究，缺锌对学习记忆活动影响的研究愈来愈受人们关注。各种补充锌的食品应运而生。梅花鹿血中含有高含量的锌，而且为有机锌可直接吸收利用。
锰元素也是维持生物活动的重要元素。动物试验证实锰元素缺乏可导致睾丸变性，性腺萎缩，性功能低下和不育，而目前还没有补锰办法。
有人报道补肾益精药中钙、铜、铁、锌、锰的含量都比较丰富。鹿血作为补肾益精药将会更好发挥作用。
从鹿血血清蛋白检测结果看，鹿血总蛋白与人血是一致的，但球蛋白特别是γ-球蛋白明显高于人血清正常值，这可能与梅花鹿抗病能力强有关。
用本发明方法提取得到的活性多肽晶体可制成胶囊、口服液、外用涂剂或膏剂、滴眼液、全血清针剂包括皮下或肌肉注射的全血清注射液、白蛋白注射液和球蛋白注射液；也能制成面膜、营养霜、营养液或口红化妆品。
制法干燥粉碎，过两次80-120目筛，使晶体均匀，送检合格，填入空胶囊中，即得。
其他晶体以此类推。
(2)软胶囊剂处方全鹿血清活性多肽晶体500gPEG 400 500g明胶100份甘油50份水 100份制成软胶囊剂1000个制法自动旋转模压法制囊机完成其他晶体以此类推。
(1)营养霜全血清活性多肽晶体 100g硬脂酸 90g氢氧化钾 5g丙二醇 50g羊毛脂 20g鲸蜡醇 10g蒸馏水 加至1000g(2)面膜全血清活性多肽晶体 100g30％人参浸出液 加至500g蒸馏水 再加至100g实施例6 针剂皮下用、肌肉、静脉全血清活性多肽晶体 100g注射液用水 加至500g制法全程无菌、去热源，去过敏源，过滤灌装即可。
其他活性多肽晶体以此类推。
权利要求
1.一种鹿血清活性多肽晶体制剂，其特征在于该制剂是由鹿血清活性多肽晶体作为活性成分与药用载体组成的，其中活性成分包括白蛋白活性多肽晶体、球蛋白活性多肽晶体和γ球蛋白活性多肽晶体。
2.一种如权利要求1所述的一种鹿血清活性多肽晶体制剂的制备方法，其特征在于该方法包括下列步骤①用无菌带针血袋(含抗凝剂)在健康马鹿空腹条件下，抽取雄性动脉血液，摇动均质，抗凝；②作病毒检测；③灭活处理，确保血液中无病毒；④作第二次病检测；⑤带袋离心分离，分离出全项马鹿血清；⑥在100度卫生环境超净工作台内，用无菌针管抽取全项马鹿血清，集中于无菌不锈钢容器内，封闭取出；⑦将全项马鹿血清放入超深冷冻装置，作-60℃24消失捕水达到99.8％干燥状态；⑧将固态晶体粉碎至单晶体直径30A左右的状态；⑨将粉碎后的晶体放入超临界翌取装置内，以及指定规格大也树脂符吸配置条件下，提取分段或单体肽类物质；⑩用提取的肽类物质与作用明确的单味中药材流浸膏混合，均质，制成剂型；包装。
3.一种如权利要求1所述的一种鹿血清活性多肽晶体可制成胶囊、口服液、外用涂剂或膏剂、滴眼液、全血清针剂包括皮下或肌肉注射的全血清注射液、白蛋白注射液和球蛋白注射液；也能制成面膜、营养霜、营养液或口红化妆品。
全文摘要
本发明属生物制品技术领域。具体涉及一种鹿血清活性多肽晶体制剂及制备方法。本发明的制剂中的活性成分包括全血清活性多肽晶体、白蛋白活性多肽晶体、球蛋白活性多肽晶体和γ球蛋白活性多肽晶体。用本发明方法取得的活性多肽晶体可制成各种口服及外用或注射剂，也可制成化妆品。
文档编号A61P1/00GK1429842SQ01145708
公开日2003年7月16日 申请日期2001年12月30日 优先权日2001年12月30日
发明者杨彦鹏, 杨卫民 申请人:上海天亦医学科技有限公司, 苏州市红冠庄国药饮片有限公司