微生物感染防御剂的制作方法

专利名称：微生物感染防御剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物感染防御剂。更具体地说，本发明涉及可作为对防御大肠杆菌O-157等病原性大肠杆菌或幽门螺杆菌等微生物感染有效的药物、指定保健用食品、健康食品等使用的微生物感染防御剂。
背景技术：
通常病原性细菌对人的感染是通过识别并结合靶细胞、即存在于机体上皮表层的复合糖类的糖链结构(受体)而建立的。对于这样的病原性细菌对机体的感染，通常的治疗方法例如是使用抗生素。抗生素是通过杀死增殖的病原性细菌来治病的，因此是在病原性细菌感染过程的最后阶段起作用。作为对发病后机体的治疗方法，抗生素治疗感染症是非常有效的，但抗生素的各种副作用以及引发的变态反应症状等问题也很多。
另外，在治疗多种细菌感染症时，要使用多种多样的抗菌药，但因频繁使用这些抗菌药而出现耐药菌、尤其是MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)等，在临床上产生了深刻的问题，并与其他的条件感染菌共同作为院内感染菌产生了严重的问题。
从多种抗菌药中适当选择的抗菌药可用于治疗包括条件感染的细菌感染症。但是使用抗菌药会有休克症状、肾功能受损、肝功能受损、白细胞减少、神经紊乱、细菌重复感染等多种副作用。
如上所述，仍然需求开发对微生物感染的防御作用强，且副作用少的微生物感染防御剂。
根据以前的研究，报告了缩合度为3～20的环状和/或链状聚L-乳酸混合物可用作抗恶性肿瘤药(特开平9-227388号公报以及特开平10-130153号公报)。但对于缩合度为3～20的环状和/或链状聚乳酸混合物是否可发挥微生物感染防御作用的评价却未有报告。
发明的公开本发明要解决的课题是提供可用于防御例如大肠杆菌O-157等病原性大肠杆菌、幽门螺杆菌等微生物感染的新型微生物感染防御剂。本发明的另一个要解决的课题是提供利用上述微生物感染防御剂的用于防御微生物感染的食品。
本发明人为了进行以解决上述课题为目的的研究，将缩合度为3～20的环状和/或链状聚乳酸混合物给予无菌小鼠，对防御大肠杆菌O-157感染的效果，具体地说，对感染O-157小鼠的存活率以及抑制上述小鼠中O-157增殖的效果进行了研究。结果发现上述聚乳酸混合物可改善感染O-157小鼠的存活率，还显示了对O-157增殖的抑制。
本发明人还通过使沙鼠感染幽门螺杆菌(H.pylori)，饲养1个月，然后测定沙鼠胃和十二指肠中的活菌数，来研究缩合度为3～20的环状和/或链状聚乳酸混合物防御幽门螺杆菌感染的效果。结果发现上述聚乳酸混合物显示了防御幽门螺杆菌感染的效果。
本发明基于这些发现而完成。
即，根据本发明，提供包含缩合度为3～20的环状和/或链状聚乳酸混合物的微生物感染防御剂。
本发明的微生物感染防御剂优选是细菌感染防御剂，更优选作为病原性大肠杆菌感染防御剂(例如病原性大肠杆菌O-157感染防御剂等)或幽门螺杆菌感染防御剂使用。本发明的微生物感染防御剂例如可作为微生物感染症的治疗药或预防药使用。
优选聚乳酸中的重复单元乳酸实质上由L-乳酸构成。
优选缩合度为3～20的环状和/或链状聚乳酸混合物是如下制备的部分将乳酸在惰性气氛下进行脱水缩合，将得到的反应液可溶于乙醇和甲醇的部分进行反相柱层析，用pH为2～3的25～50％重量的乙腈水溶液洗脱后，用pH为2～3的90％重量以上的乙腈水溶液洗脱的部分。
优选在氮气气氛下，通过逐级减压和升温进行脱水缩合。
优选反相柱层析通过ODS柱层析进行。
根据本发明的另一方面，提供含有上述本发明的微生物感染防御剂的、用于防御微生物感染的食品。
根据本发明的又一个方面，提供缩合度为3～20的环状和/或链状聚乳酸混合物在微生物感染防御剂或用于防御微生物感染的食品生产中的应用。
根据本发明的又一个方面，提供用于防御微生物感染的方法，该方法包括将有效量的缩合度为3～20的环状和/或链状聚乳酸混合物给予人等哺乳动物。
图面简述

图1显示制备例1得到的聚乳酸化合物的质谱。
图2为显示CPL影响感染O-157小鼠存活率的效果的图。
图3为显示CPL影响感染O-157小鼠粪便中活菌数的效果的图。
图4为显示CPL给予组和对照组的胃(前胃、后胃)以及十二指肠中幽门螺杆菌活菌数的测定结果的图。白色条柱表示对照组(n＝5)，黑色条柱表示CPL组(n＝6)。
图5显示制备例2得到的产物的正离子模式FABMS谱的全图。范围m/z 10.0000～1305.5900图6显示制备例2得到的产物的负离子模式FABMS谱的全图。范围m/z 10.0000～2000.0000图7显示制备例2得到的产物的负离子模式FABMS谱的放大图。范围m/z 10.0000～501.9260图8显示制备例2得到的产物的负离子模式FABMS谱的放大图。范围m/z 490.2980～1003.7700图9显示制备例2得到的产物的负离子模式FABMS谱的放大图。范围m/z 999.9500～1504.3400图10显示制备例2得到的产物的负离子模式FABMS谱的放大图。范围m/z 1484.5300～2000.0000图11显示制备例2得到的产物的NMR谱的全图。
图12显示CPL影响感染O-157小鼠存活率的效果的图。
图13为显示CPL影响感染O-157小鼠粪便中活菌数的效果的图。
实施发明的最佳方式下面，对本发明的实施方案和实施方法进行详细说明。
本发明的微生物感染防御剂含有缩合度为3～20的环状和/或链状聚乳酸混合物作为有效成分，例如可作为大肠杆菌O-157等病原性大肠杆菌或幽门螺杆菌感染的防御剂使用。本发明的微生物感染防御剂可以作为各种微生物感染的治疗药和预防药使用。
本说明书中所说的微生物具有最广义的含义、包括细菌和真菌等全部的微生物。
微生物具体可例举有大肠杆菌(包括O-157等)、肠球菌、葡萄球菌、金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等)、绿脓杆菌、肠炎菌(肠炎沙门氏菌)、肺炎杆菌、枯草芽孢杆菌、念珠菌、幽门螺旋杆菌等，它们有些除了使肠内腐败或产生致癌物质和其他有害毒素之外，也是引发各种自发性感染症的原因。
本发明的微生物感染防御剂具有防御上述病原性细菌等微生物感染的功能，因此，可以用于预防感染病原性细菌引起的疾病，或治疗疾病的用途。这样的疾病可以例举由大肠杆菌等食物中毒病原菌类引起的腹泻和食物中毒、变异链球菌等引起的龋齿、幽门螺杆菌引起的胃溃疡和胃癌等。
即，本发明的微生物感染防御剂可以抑制作为条件感染病因的大肠杆菌(Escherichia coli)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)等；假单胞菌属(Pseudomonos)菌；病原性大肠杆菌及其亲缘菌的沙门氏菌(Salmonella)等的细菌感染，可以抑制作为条件感染病因的细菌和肠道感染病原菌的增殖，从而可以预防肠道内感染和条件感染。
其中的大肠杆菌是构成健康人体的肠内菌丛的1个菌种，获得了产生部分特殊致病因子的能力的大肠杆菌会引起人体的肠道感染症。在全国各地，自肠出血性大肠杆菌(EHEC)O-157H7感染症集体发病多发的1996年以来，集体发病的件数正在减少，但散发病例依然持续。EHEC产生vero毒素作为主要致病因子，该vero毒素对来源于非洲绿猴肾细胞的vero细胞显示强的细胞毒性，感染时，有约5％的病例并发溶血性尿毒症综合征，以及偶尔并发脑病，多后果严重。本发明的微生物感染防御剂可以特别用于预防和治疗病原性大肠杆菌O-157引发的感染症。
另外，已知幽门螺杆菌引发胃炎，同时还作为胃·十二指肠溃疡的复发和延缓治愈因子发挥作用，另外也有人指出了该菌与胃癌的相关性。本发明的微生物感染防御剂可以用于防御幽门螺杆菌的感染。
本发明的微生物感染防御剂对于防御病原性细菌感染有效，因此如果预先在感染之前摄取，则具有细菌难以感染，即使感染也容易治愈的预防性作用。从而，本发明的微生物感染防御剂也优选作为健康食品和药物日常摄取。
在本发明的微生物感染防御剂和用于防御微生物感染的食品中，使用缩合度为3～20的环状和/或链状聚乳酸混合物作为有效成分。
本说明书中所说的“聚乳酸混合物”是指缩合度为3～20的环状和/或链状聚乳酸以任意的比例存在的混合物。即，“混合物”的用语是指具有缩合度为3～20其中的任意一个的聚乳酸混合物，同时也作为包含环状和链状聚乳酸的混合物的概念应用。如本说明书中以下所述的，这样的“聚乳酸混合物”可以通过将乳酸进行脱水缩合，以适当的方法提纯而得到。本说明书中为了方便，使用了“聚乳酸混合物”的用语，但其中也包含由具有一定缩合度的环状聚乳酸或具有一定缩合度的链状聚乳酸这样单一成分构成的聚乳酸。
缩合度是指聚乳酸中的重复单元即乳酸单元的数量。例如推测环状聚乳酸有下述的结构式，式中的n即表示缩合度(即n＝3～20)。
本说明书中，如果称为“乳酸”，则该乳酸中包含L-乳酸、D-乳酸或它们的任意比例的混合物的全部。本发明中，优选乳酸实质上由L-乳酸构成。这里所说的“实质上”是指聚乳酸混合物中的L-乳酸单元的比例[即，(L-乳酸单元数/L-乳酸单元数+D-乳酸单元数)×100]例如为70％以上，优选80％以上，更优选85％以上，进一步优选90％以上，特别优选95％以上。聚乳酸混合物中L-乳酸单元的比例与作为原料使用的乳酸中存在的L-乳酸和D-乳酸的比例相关。
缩合度为3～20的环状和/或链状聚乳酸混合物的制备方法并没有特别限定，例如可通过特开平9-227388号公报、特开平10-130153号公报、或者特愿平11-39894号说明书(这些专利说明书中记载的内容的通过引用全部包括在本文中，作为本说明书的发明的公开内容。)等记载的制备方法来获得。
更具体地说，例如缩合度为3～20的环状和/或链状聚乳酸混合物可根据下述方法A获得。
方法A首先，使乳酸(优选实质上由L-乳酸构成的乳酸)在惰性气氛下进行脱水缩合。惰性气氛可以例举氮气、氩气等，优选使用氮气。
脱水缩合反应在常压～约1mmHg减压下，在110～210℃，优选130～190℃的温度下进行，特别优选通过逐级减压和逐级升温来进行。反应时间可以适当设定，例如可以进行1～20小时的反应。采用逐级减压和逐级升温时，将反应时间分为2部分以上的反应时间，对每部分分别设定压力和温度进行反应。采用逐级减压时，例如可以按照常压→150mm Hg→3mm Hg减压，采用逐级升温时，例如可以按照145℃→155℃→185℃升温。实际上也可以将其组合，例如按照145℃常压下3小时、145℃150mm Hg下3小时、155℃3mm Hg下3小时，然后185℃3mm Hg下1.5小时进行反应。
接着，向脱水缩合反应得到的反应混合物中加入乙醇和甲醇，过滤，干燥滤液，得到可溶于乙醇和甲醇的部分。即，本说明书中所述的“可溶于乙醇和甲醇的部分”是指可溶于乙醇和甲醇的混合液的部分。得到可溶于乙醇和甲醇的部分时，是将脱水缩合反应的反应混合物与乙醇和甲醇混合，但此时的乙醇和甲醇的比例可以适当设定，例如乙醇∶甲醇＝1∶9。向反应混合物中添加乙醇和甲醇的顺序、方法等并没有特别限定，可以适当选择，例如可以先向脱水缩合反应的反应混合物中添加乙醇，然后添加甲醇。
将上述得到的可溶于乙醇和甲醇的部分进行反相柱层析，特别是使用十八烷基硅烷(ODS)柱的层析，首先除去用pH为2～3的25～50％重量的乙腈水溶液洗脱的部分，然后收集用pH为2～3的90％重量以上的乙腈水溶液、优选99％重量以上的乙腈水溶液洗脱得到的部分，这样可得到缩合度为3～20的环状和/或链状聚乳酸混合物。
如上所述得到的环状和/或链状聚乳酸混合物可用氢氧化钠等碱中和，减压干燥，然后通过常规方法制成如下所述的所需形式的制剂。
作为制备本发明中使用的缩合度为3～20的环状和/或链状聚乳酸混合物的另一个方法，可以例举特愿平11-265715号说明书中记载的方法(方法B)或特愿平11-265732号说明书中记载的方法(方法C)(这些专利说明书中记载的内容通过引用全部包括在本文中，作为本说明书的发明的公开内容。)。下面对方法B和方法C进行具体说明。
方法B该方法是通过使丙交酯在以RYLi(式中，R表示脂族基或芳族基，Y表示氧原子或硫原子)表示的锂化合物存在下聚合，制备环状乳酸低聚物的方法。进行聚合反应时，锂化合物(RYLi)的使用比例为1摩尔丙交酯使用1～0.1摩尔，优选0.2～0.3摩尔的比例。反应温度为-100～0℃，优选-78～-50℃。优选反应以-78～-50℃的温度开始，慢慢升温至室温。优选反应在反应溶剂存在下进行。反应溶剂除四氢呋喃等环醚之外，可以使用二乙醚、二甲氧基乙烷等。反应气氛采用氮气、氩气等惰性气体气氛。反应压力并无特别限制，优选常压。
如上所述得到的乳酸低聚物的组成(即环状乳酸低聚物和链状乳酸低聚物的混合比例)随着作为反应助剂使用的锂化合物而变动。使用碳原子数为1～3烷基醇的锂化合物(ROLi)(式中，R为碳原子数1～3的烷基)作为锂化合物时，可得到环状乳酸低聚物和链状乳酸低聚物的混合物(环状乳酸低聚物的比例80～85％重量)。而使用叔丁醇等碳原子数为4以上的烷基醇的锂化合物和苯硫酚化合物作为锂化合物时，可以实质上选择性地得到环状乳酸低聚物。
方法C该方法的特征是包含(i)第1加热步骤，在350～400mm Hg的压力条件下，将乳酸加热到120～140℃范围的温度，使之进行脱水缩合反应，同时，并不馏出丙交酯，只馏出并除去副产物水；(ii)第2加热步骤，该第1加热步骤结束后，将反应产物加热到150～160℃的温度，将该反应压力以0.5～1mm Hg/分钟的减压速度降到15～20mm Hg，在减压的同时一边避免馏出丙交酯，一边只馏出并除去副产物水，该反应压力降到15～20mm Hg后，在同压力条件和150～160℃反应温度下，再继续反应，使之生成以链状乳酸低聚物为主要成分的脱水缩合物。
(iii)第3加热步骤，该第2加热步骤结束后，在0.1～3mm Hg的压力条件下以150～160℃加热，使该链状乳酸低聚物环化，生成环状低聚物。
该方法首先在第1加热步骤中在减压下加热乳酸，使之进行脱水缩合反应。此时的反应时间为3～12小时，优选5～6小时。为了使该第1加热步骤下进行的反应顺利进行，要馏去乳酸脱水缩合而生成的副产物水，但此时并不馏去2分子乳酸的脱水缩合物丙交酯。因此，要使反应压力减压，优选300～500mm Hg，更优选保持350～400mmHg，在该压力条件下，可以加热到100～140℃，优选130～140℃的范围。通过该第1加热步骤的反应，主要生成以乳酸的3～23分子脱水缩合物为主要成分的反应产物。
上述第1加热步骤结束后，在第2加热步骤中，为了得到平均聚合度更高的低聚物，要加热到比上述第1加热步骤中的反应温度高的温度，优选145～180℃，更优选150～160℃，同时使反应压力降到10～50mm Hg，优选15～20mm Hg的压力，再继续进行脱水缩合反应。
该反应也与上述第1加热步骤的反应情形相同，为使反应顺利进行，要在馏去副产物水而不馏去丙交酯的条件下进行。为了避免馏去丙交酯，且提高反应效率，通常需要将反应压力降至上述范围的压力时的速度(减压速度)保持在0.25～5mm Hg/分钟，优选0.5～1mm Hg/分钟的范围。如果是比上述范围低的减压速度，则减压到规定压力所需的时间就延长，因而不优选，另一方面，如果使比上述范围高的减压速度，则丙交酯会与副产物水一同馏去，因而不优选。
反应压力下降到规定压力后，在该反应压力下再继续反应。此时的加热时间为3～12小时，优选5～6小时。
通过上述第2加热步骤的反应，可得到平均聚合度为3～30，优选3～23的乳酸低聚物，此时低聚物中的环状低聚物的比例通常为70～80％重量左右。
上述第2加热步骤结束后，在第3加热步骤中，将反应压力保持在0.25～5mm Hg，优选0.5～1mm Hg，以145～180℃，优选150～160℃的温度再继续反应。反应时间为3～12小时，优选5～6小时。此时也要馏去副产物水。此时也优选避免丙交酯的馏去，但由于反应产物中几乎不含丙交酯，因此无需特别降低减压速度。
通过上述第3加热步骤的反应，可生成平均聚合度为3～30，优选3～23，且环状低聚物的比例为90％重量以上，优选99％重量以上的乳酸低聚物。
上述方法A、B和C只是表示本发明所采用的聚乳酸混合物的制备方法的部分具体实例，在本发明中，也可使用以其他方法制备的聚乳酸混合物。
在上述必需成分之外，可以根据需要，在无损本发明效果的范围内，任意选择、同时使用药物类、准药物类等制剂中使用的成分和添加剂来制造本发明的微生物感染防御剂。本发明的微生物感染防御剂除可单独作为药物类使用之外，也可以混合到药物类、准药物类等中使用。
本发明的微生物感染防御剂的形式并无特别限定，可以从经口给药或非经口给药用的剂型中选择最符合目的的适当的形式。
适合经口给药的剂型可以例举片剂、胶囊剂、散剂、口服液、颗粒剂、细粒剂、糖浆剂、溶液剂、乳剂、混悬剂、咀嚼剂等，适合非经口给药的剂型可以例举注射剂(皮下注射、肌内注射或静脉注射)、外用剂、输液、吸入剂、喷雾剂等，但并不限于这些。
适合经口给药的液体制剂例如溶液剂、乳剂或糖浆剂等可以用水、蔗糖、山梨醇、果糖等糖类，聚乙二醇、丙二醇等甘醇类，芝麻油、橄榄油、豆油等油类，对羟基苯甲酸酯类等防腐剂，草莓香料、薄荷等香料类等来制造。另外胶囊剂、片剂、散剂或颗粒剂等固体制剂的制造可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇等赋形剂，淀粉、褐藻酸钠等崩解剂，硬脂酸镁、滑石粉等润滑剂，聚乙烯醇、羟丙基纤维素、明胶等粘合剂，脂肪酸酯等表面活性剂，甘油等增塑剂等。
适合非经口给药的注射用或输液用的制剂优选将作为有效成分的上述物质以溶解或悬浮状态包含在与受药者的血液等渗的无菌水性介质中。例如，如果是注射剂，则可用由盐溶液、葡萄糖溶液、或盐水与葡萄糖溶液的混合物构成的水性介质等配制溶液。用于肠内给药的制剂可以用例如可可脂、氢化脂或氢化羧酸等载体来配制，作为栓剂提供。另外，在喷雾剂的制备中，可以将作为有效成分的上述物质分散为微粒，可以使用不刺激受药者的口腔和气道粘膜，且容易吸收有效成分的载体。作为载体，可具体例举乳糖或甘油等。可根据有效成分物质和使用的载体的性质，配制成气雾剂或干粉等形式的制剂。在这些非经口给药用的制剂中可以添加选自甘醇类、油类、香料类、防腐剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、粘合剂、表面活性剂、增塑剂等的1种或多种的饮食品。
本发明的微生物感染防御剂的给药量和给药次数可根据包括给药目的、给药形式、摄取者年龄、体重或性别等条件的各种因素而适当设定，通常有效成分的给药量为每天1～10,000mg/kg，优选10～2000mg/kg，更优选10～200mg/kg。优选将上述给药量的制剂分为每天1～4次左右给药。
本发明的微生物感染防御剂的给药时间并没有特别限定，在微生物感染前或后均可。
本发明还涉及包含缩合度为3～20的环状和/或链状聚乳酸混合物、用于防御微生物感染的食品。即，本发明中使用的缩合度为3～20的环状和/或链状聚乳酸混合物不仅以上述单独剂型使用，还可以混合到食品中使用。
本发明的用于防御微生物感染的食品只要混合后不使聚乳酸混合物分解即可，对混合形式并没有特别限定。
本发明的用于防御微生物感染的食品制品可具体例举清凉饮料、口服液、健康食品、指定保健用食品、功能食品、活性功能食品、营养辅助食品、增补剂、饲料、饲料添加剂等通常称为健康食品或辅助食品(包括饮料)的制品。
食品的具体例子有香口胶、巧克力、糖果、糖片、果冻、曲奇饼、饼干、酸乳酪等糖果点心类；雪糕、果汁冰棍等的冰点类；茶软饮料(包括果汁、咖啡、可可等)、营养口服液、美容口服液等饮料；面包、火腿、汤、果酱、意大利粉、冷冻食品类等任何的食品。或者，也可以将本发明中使用的聚乳酸混合物添加于调味料或食品添加剂中使用。通过摄取本发明的用于防御微生物感染的食品，能够发挥防御微生物感染的效果，可以提供未显示实质的有害副作用的、安全的食品。
本发明的用于防御微生物感染的食品可以通过将聚乳酸混合物直接混合、分散到食品所使用的通常的原料中，通过公知的方法加工成所需的形式而获得。
本发明的用于防御微生物感染的食品包含所有形式的食品，其种类并无特别限定，可以将本发明的微生物感染防御剂混合到如上所述的各种食物或各种营养组合物，例如各种经口或经肠营养剂、饮料等中，作为食品提供。这样的食品的组成中除了缩合度为3～20的环状和/或链状聚乳酸混合物之外，还可以包含蛋白质、脂质、糖类、维生素和/或矿物质类等。食品的形式并无特别限定，只要是容易摄取的形式即可，可以是固体、粉末、液体、胶状、浆状等任何形式。
食品中的聚乳酸混合物的含量并无特别限定，通常为约0.1～20％重量，更优选约0.1～10％重量。
食品中含有的聚乳酸混合物的量优选含有可发挥作为本发明目的的防御微生物感染作用的量，优选在摄取的食品中含有约0.1g至10g，更优选含有约0.5g至3g。
作为本申请所要求的优先权的基础即日本专利申请特愿2001-4823号的说明书中所记载的全部内容引用到本说明书中，作为本说明书的发明公开的一部分。
通过以下实施例更具体地说明本发明，但本发明的任何一点均不受实施例限制。
实施例制备例1聚乳酸混合物(以下称为CPL)的制备将500ml L-乳酸(混有D-乳酸)加入置于加热套中的分离式烧瓶中。通入300ml/分钟的氮气并进行搅拌，一边将馏出的水通过保温的下行连接管导入具回流冷凝器的烧瓶，一边以145℃加热3小时。再减压至150mm Hg，在同一温度下加热3小时，然后减压至3mm Hg，在155℃温度下加热3小时，最后在3mm Hg减压下185℃加热1.5小时，得到反应产物聚乳酸。
将得到的聚乳酸保持在100℃，先后加入100ml乙醇和400ml甲醇，然后冷却。将该液加入500ml甲醇中，充分搅拌、静置，然后过滤、提纯。将该滤液减压干燥，溶解于乙腈，配制为200ml(原液)。
将该原液通过预先已平衡的反相ODS柱(TSK gel ODS-80TM)，用含0.01M盐酸的30％、50％和100％乙腈(pH 2.0)逐级洗脱，得到100％乙腈洗脱的部分即聚乳酸(缩合度3～20)。得到的物质的质谱显示在图1中。从图1中有规律的碎片离子峰可知得到的聚乳酸混合物为环状缩合物为主体，混有少量直链缩合物的状态。
试验例1(材料和方法)实验动物使用5～12周龄的无菌BALB/c系小鼠(CLEA JAPANINC)。对于CPL组，预先将混入了1％CPL(由制备例1制备的)的标准固体饵料(CE-2)进行高压蒸汽灭菌(121℃、10分钟)，与灭菌自来水同时供其自由摄取。另外，对于对照组，将放射线灭菌(钴60)的标准固体饵料(CE-2)与灭菌自来水同时供其自由摄取。试验用的所有小鼠均在乙烯隔离笼内饲养管理。
自开始给予CPL后的第3天，用胃管经口给予EHEC(8.5×106cfu/只)，观察存活以及每天测定粪便中的菌数。
菌数测定如下进行取粪便，称量粪便重量，加入10倍量的磷酸缓冲液(PBS)进行匀浆，逐级稀释，将0.1ml逐级稀释液涂布于普通琼脂培养基(Defco，USA)上，计数菌落数。
(结果及讨论)(1)CPL对感染EHEC小鼠存活的效果图2显示了CPL给予组和对照组的存活观察(存活率)结果。从给予EHEC之前3天开始给予混入了CPL的标准固体饵料的无菌小鼠中，从给予EHEC后的第6天死亡，第11天的存活率为50％。与自第3天死亡，第11天的存活率为30％的CPL未摄取组的感染小鼠相比，可见CPL摄取组对于EHEC的抗性高。
(2)粪便中的活菌数图3显示了测定CPL给予组和对照组的粪便中活菌数的结果。在存活观察期间，持续检出了粪便中排出的EHEC。EHEC定居于无菌小鼠肠道内，并且，与CPL非摄取组相比，可知在测定期间内CPL摄取组的1g湿粪便的活菌数略少。
由上述结果可以证实，感染小鼠的死亡是由于EHEC感染引起的，摄取混入了CPL的标准固体饵料的小鼠对于EHEC感染显示了抗性。
试验例2(材料和方法)实验动物使用9～12周龄的沙鼠(SEYAKKU)。对于CPL组，将混入了0.2％的CPL的标准固体饵料(CE-2)与灭菌自来水同时供其自由摄取，另外对于对照组，将放射线灭菌(钴60)的标准固体饵料(CE-2)与灭菌自来水同时供其自由摄取。用胃管连续3天经口给予幽门螺杆菌(1.5～3.0×106cfu/只)，然后给予混入饵料中的CPL，第30天处死，取胃和十二指肠，测定活菌数。活菌数的测定如下进行称量胃(分割为前胃和后胃)和十二指肠的重量，加入10倍量的磷酸缓冲液(PBS)进行匀浆，逐级稀释，将0.1ml逐级稀释液涂布于螺杆菌琼脂培养基(日水制药)上，计数菌落数。
(结果及讨论)感染幽门螺杆菌沙鼠的胃和十二指肠中的活菌数图4显示了CPL给予组和对照组的胃(前胃和后胃)以及十二指肠中的幽门螺杆菌活菌数的测定结果。CPL给予组的前胃(102cfu)、后胃(102cfu)以及十二指肠(102cfu)中的活菌数与对照组的前胃(103cfu)、后胃(104cfu)以及十二指肠(104cfu)中的活菌数相比显示减少的倾向。
上述结果显示机体内CPL本身或其代谢产物抑制了幽门螺杆菌的增殖，给予CPL可以防御幽门螺杆菌的感染。
制备例2乳酸低聚物混合物(以下也称为X03)的制备制备例2的反应图如下所示。
在氮气气氛、0℃下，向含0.101g(1mmol)二异丙胺的5mlTHF溶液中加入0.63mL(1mmol)正丁基锂(1.6M己烷溶液)，搅拌10分钟，生成二异丙基氨基化锂(LDA)，然后加入含0.577g(4mmol)L-(-)-丙交酯的4mL THF溶液，搅拌15分钟使其反应。向该反应混合物中加入20mL饱和氯化铵水溶液，处理反应，再加入10mL水。用THF(50mL)萃取5次，用无水硫酸钠干燥有机层。滤除无水硫酸钠，然后减压浓缩有机溶剂，得到0.53g粗产物。向得到的粗产物中加入6mL乙醚，在超声波清洗仪中浸渍10分钟，过滤，得到0.39g熔点为125～129℃的白色固体产物。
图5-图11显示得到的产物的物理性质数据。由图5-图11所示的FABMS和NMR数据可知固体产物中存在从3聚体到21聚体的环状乳酸低聚物和从3聚体到27聚体的链状乳酸低聚物。
试验例3(材料和方法)实验动物使用5～6周龄的无菌BALB/c系小鼠(CLEA JAPANINC)。对于CPL组，预先将混入了0.1％的X03(由制备例2制备的)的标准固体饵料(CE-2+X03)进行高压蒸汽灭菌(121℃、10分钟)，与灭菌自来水同时供其自由摄取。另外，对于对照组，将放射线灭菌(钴60)的标准固体饵料(CE-2)与灭菌自来水同时供其自由摄取。试验用的所有的小鼠均在乙烯隔离笼中饲养管理。
自开始给予CPL后的第7天，用胃管经口给予EHEC(5.0×106cfu/只)，观察存活以及每天测定粪便中的菌数。
菌数测定如下进行取粪便，称量粪便重量，加入10倍量的磷酸缓冲液(PBS)进行匀浆，将0.1ml该匀浆涂布于普通琼脂培养基(Defco，USA)上，计数菌落数。
(结果及讨论)(1)CPL对存活率的效果图12显示CPL给予组和对照组的存活观察(存活率)结果。15天观察期间的感染EHEC小鼠的存活率为对照组为20％(2/10)、CPL给予组为88.9％(2/18)。
(2)粪便中的活菌数图13显示测定CPL给予组和对照组的粪便中活菌数的结果。对照组和CPL给予组的粪便中的活菌数均为1g湿粪便中含有109-10cfu。
工业应用性本发明的微生物感染防御剂可用于治疗和预防微生物(例如O-157等病原性大肠杆菌和幽门螺杆菌等)感染症。
另外，本发明中作为有效成分使用的聚乳酸混合物是来源于机体成分的乳酸低缩合物，因此生物体适合性高，副作用少。
权利要求
1.一种微生物感染防御剂，所述微生物感染防御剂含有缩合度为3～20的环状和/或链状聚乳酸混合物。
2.权利要求1的微生物感染防御剂，所述微生物感染防御剂是细菌感染防御剂。
3.权利要求1或2的微生物感染防御剂，所述微生物感染防御剂是病原性大肠杆菌感染防御剂。
4.权利要求1或2的微生物感染防御剂，所述微生物感染防御剂是病原性大肠杆菌O-157感染防御剂或幽门螺杆菌感染防御剂。
5.权利要求1～4的任一项所述的微生物感染防御剂，所述微生物感染防御剂作为微生物感染症的治疗药或预防药使用。
6.权利要求1～5的任一项所述的微生物感染防御剂，其中所述聚乳酸中的重复单元乳酸实质上由L-乳酸构成。
7.权利要求1～6的任一项所述的微生物感染防御剂，其中所述缩合度为3～20的环状和/或链状聚乳酸混合物是如下制备的部分将乳酸在惰性气氛下进行脱水缩合，将得到的反应液可溶于乙醇和甲醇的部分进行反相柱层析，用pH为2～3的25～50％重量的乙腈水溶液洗脱后，用pH为2～3的90％重量以上的乙腈水溶液洗脱的部分。
8.权利要求7的微生物感染防御剂，其中所述脱水缩合在氮气气氛下，通过逐级减压和升温进行。
9.权利要求7或8的微生物感染防御剂，其中所述反相柱层析通过ODS柱层析进行。
10.一种用于防御微生物感染的食品，所述食品包含权利要求1～9的任一项所述的微生物感染防御剂。
全文摘要
本发明的目的是提供可用于防御例如O－157等病原性大肠杆菌和幽门螺杆菌感染的新型微生物感染防御剂。根据本发明，可提供包含缩合度为3～20的环状和/或链状聚乳酸混合物的微生物感染防御剂。
文档编号A61P1/00GK1496267SQ0280619
公开日2004年5月12日 申请日期2002年1月10日 优先权日2001年1月12日
发明者村上正裕, 田爪正气, 气 申请人:天藤制药株式会社