专利名称：平滑肌细胞增殖的调节的制作方法
技术领域：
本发明涉及平滑肌细胞增殖的调节，尤其是涉及血管内皮生长因子在增强平滑肌细胞增殖，及治疗与平滑肌细胞增殖减少相关疾病上的新应用。
PDGF/VEGF生长因子家族包含许多结构上相关的生长因子。该家族成员含有一个保守的富含半胱氨酸的区域，即半胱氨酸结(Sun，P.D.1995)，它通过链间二硫键共价连接，形成二聚体(Potgens et al.1994，Andersson et al.1992)。血小板来源的生长因子(PDGF)对包括成纤维细胞和平滑肌细胞在内的结缔组织细胞具有促有丝分裂活性(综述于Heldin et al.1999)。PDGF由相异的A链和B链的异二聚体组成，并激活两个受体酪氨酸激酶，PDGFR-α和PDGFR-β。PDGF mRNA在正常细胞类型范围内被表达，并可能涉及肿瘤发生及其它疾病过程(Heldin et al.1999)。此外，PDGF-B基因作为v-sis致癌基因由转化逆转录病毒携带(Devare et al.，1983)，表明其过度表达可致癌。
血管内皮细胞生长因子涉及新血管形成及血管通透性(综述于Ferrara&Davis-Smyth，1997，Neufeld et al.，1999)。到目前为止，五种内源VEGFs(VEGF-A，-B，-C，-D和胎盘生长因子(PLGF))已被描述过。VEGF的信号传递是通过一个受体酪氨酸激酶家族(Ferrara&Davis-Smyth，1997，Neufeld et al.，1999)进行的，尽管最近显示神经菌毛素1也是VEGF-A的一些同工型的受体(Soker et al.，1998)。
VEGF-A在若干包括心脏、胎盘和胰腺的正常组织中被表达(Berse etal.，1992)。在许多肿瘤中VEGF-A显示出被过度表达(Takahashi etal.，1995)，并且在动物模型中，VEGF-A作用的抑制显示出会导致肿瘤的消退(Kim et al.，1993)。VEGF-A也与其它涉及不恰当血管发生的疾病过程相关(Folkman 1995)。VEGF-B mRNA在正常组织中的表达与VEGF-A的表达重叠，但在中枢神经系统中也是可检测的(Lagercrantz et al.，1998)。VEGF-C以低于VEGF-A和VEGF-B的表达水平被表达(Lagercrantz et al.，1998)，但在一系列组织中可以检测到(Lee et al.1996，Fitz et al.，1997)。VEGF-D在肺、心脏和小肠中强表达，且在若干其它组织中也可以检测到(Yamada etal.，1997)。
通过检索EST数据库，结果鉴定了一个VBGF/PDGF家族新成员。所鉴定的多肽序列含一个N-末端CUB结构域和一个C-末端PDGF结构域，该多肽被命名为血管内皮生长因子-X(VEGF-X；专利WO 0037641；EMBL编号AX028032)。相同序列最近被公布，并显示具有PDGF活性(Lietal.，2000)，被命名为PDGF-C，这两种命名可交替使用。Li等人发现PDGF-C的C-末端PDGF结构域具有PDGFR结合活性，并刺激成纤维细胞增殖，反之，全长PDGF-C不显示该活性。他们提出一种模型，该模型中，CUB结构域的功能是作为PDGF结构域的抑制物激活作用是通过蛋白质水解以释放活性PDGF-C。
在尿道和膀胱壁中，平滑肌细胞在控制膀胱功能上起着重要作用。已证实平滑肌细胞数量的增加可治疗充溢性尿失禁和膀胱功能障碍(Yokoyama et al.，2000)。作为一种治疗方法，可直接注射平滑肌细胞(成肌细胞)于尿道和膀胱壁中，以增加细胞数量。
另一方面，已知动脉平滑肌细胞增生会导致多种疾病，且阻断这种不希望有的细胞水平事件的试剂可用于对这些疾病的药物定向治疗中。动脉粥样硬化，一种大动脉的疾病，是心脏病及中风的主要原因。在西方社会，它是大约50％死亡的基本原因。动脉粥样硬化症是一种进展性疾病，该病的特征是在大动脉中积累了脂类及纤维成分。血管壁细胞，尤其是平滑肌细胞(SMCs)的过度生长，促成了动脉粥样硬化症的发病(Lusis，AJ，2000)。一种可阻断平滑肌细胞增殖和迁移的治疗方法足以预防内膜增生，并也可促进血管愈合过程。在当前血管介入环境中，高的再狭窄率提高了对内膜增生，即一种在血管壁损伤后出现的慢性结构病变的重要性的注意，该结构病变可引起腔狭窄和血管闭塞。内膜增生被定义为血管平滑肌细胞的异常迁移和增殖，并伴随细胞外结缔组织基质的沉积(Hagen P.O.，et al.1994)。心脏移植动脉粥样硬化是限制受体长期存活的主要原因之一。其特征是由增殖的平滑肌细胞组成的内膜增厚，由于动脉壁的广泛损伤，这种内膜增厚可能发生在吻合位点(Suzuki J.et al.2000)。对平滑肌细胞病理性过度增殖的预防可被用于减少愈合微动脉吻合时的内膜增生，及移植动脉的内膜增生(Robert C.，et al.，1995)。抑制平滑肌细胞外膜细胞的生长将有助于减少由冠状动脉血管成形术引起的新内膜增生。在糖尿病受试者的膀胱病变中，膀胱或肾肥大和肾增生是公认的。平滑肌的过度增殖也能由于慢性和/或急性膀胱出口阻塞而引起膀胱和肾功能不可逆的改变(Mumtaz FH，et al 2000)。
现在已经令人惊讶地发现，重组的全长VEGF-X和CUB结构域蛋白质在体外都显示出对人动脉平滑肌细胞具有促有丝分裂活性，这表明CUB结构域除了维持PDGF结构域潜伏状态的作用外还具有一个功能。因此，VEGF-X及提高平滑肌细胞增殖的CUB结构域可能在治疗尿失禁、膀胱功能障碍与其它由平滑肌细胞组成的括约肌的功能障碍上具有优势。在重建骨盆底时，也可利用VEGF-X和CUB结构域以改善平滑肌功能。
因此，根据本发明的第一个方面，提供了编码VEGF-X多肽或其功能等同物、衍生物或变体的核酸分子在制造可于体内或体外刺激平滑肌细胞增殖的药物上的应用。优选地，VEGF-X多肽序列如
图1(a)所示。本发明也提供了VEGF-X的CUB结构域或功能等同物、衍生物或其变体于体内或体外刺激平滑肌细胞增殖的应用，该CUB结构域的优选由如图1(a)所示40-150位的氨基酸序列组成。上述多肽、CUB结构域和核酸分子也可被用作药物，或用于制备可治疗尿道功能障碍、膀胱功能障碍、括约肌功能障碍或其它与功能性VEGF-X或CUB结构域蛋白质表达降低相关的疾病或状况的药物，或用来制备用于骨盆底重建的药物。本发明的另一方面提供了VEGF-X或其CUB结构域在体内或体外组织工程应用中，用平滑肌细胞构成基质的用途。
本发明的DNA分子可被方便地包含在适合的表达载体中，以在适合的宿主中表达由其编码的VEGF-X。如Sambrook et al.，(1989)，Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold Spring HarbourLaboratory Press所提供的，将克隆DNA掺入适合的表达载体，以进行该细胞随后的转化和转化细胞的筛选的方法为本领域的技术人员所熟知。
本发明的表达载体包括具有一个本发明的核酸的载体，该核酸可操作地连接于能够影响所述DNA片段表达的调控序列上，例如启动子区。术语“可操作地连接”指一种并置关系，其中所描述的成分处于一种允许它们以其指定方式发挥功能的关系当中。这样的载体可被转化到适合的宿主细胞中，以表达本发明的多肽。
这种表达载体也可被用于刺激平滑肌细胞增殖，并也可被用在对本发明的包括尿道功能障碍、膀胱功能障碍或其它与功能性VEGF-X蛋白质表达减少相关疾病在内的疾病或状况的治疗中。
本发明的多肽可以是重组的、合成的或天然存在的，但优选是重组的。同样，可采用重组或合成技术，例如，采用PCR克隆原理，制备本发明的核酸序列。
根据另一方面，本发明提供了含有治疗有效量的本发明多肽的药物组合物的应用，该组合物包含例如多肽的可溶解形态、或本发明的核酸分子、或掺入了与药学可接受载体或赋形剂结合的所述核酸分子的载体。这样的载体包括，但不仅限于盐水、缓冲盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇、及其组合。根据发明的这一方面，药物组合物可被用于刺激在组织和器官中的平滑肌细胞增殖，或可选地，治疗或预防尿道、膀胱或括约肌的功能障碍，或与发明的VEGF-X多肽的异常内源性活性相关的功能障碍中的任意一种。
本发明进一步涉及药物包装和试剂盒，二者含一个或多个充满一种或多种上述发明组合物的成分的容器。多肽及其它本发明的化合物可被单独应用或与其它化合物，例如治疗化合物联合应用。
本发明的蛋白质或多肽(此处两种术语可交替使用)此处被定义为包括由本发明的核酸分子编码的所有可能的氨基酸变体，包括被所述分子编码的多肽，且具有保守氨基酸改变。保守氨基酸取代指在一种蛋白质中的一个或多个氨基酸的替代，该替代并不影响蛋白质的功能或表达。本发明的蛋白质或多肽此处被进一步定义为包括这种序列的变体，包括天然存在、基本上与所述蛋白质或多肽同源的等位变体。在上下文中，基本同源性被看作是至少有70％、优选80％或90％和优选95％的氨基酸与本发明的核酸分子编码的蛋白质或多肽同源的序列。本发明的蛋白质或多肽的“功能等同物”包含所有如本发明方法和应用所要求的、上文中预见的显示VEGF-X活性的氨基酸和等位变体。本发明的蛋白质或多肽可以是重组体、合成物或天然存在的，但优选是重组的。
本发明的蛋白质或多肽此处也被定义为包括所述蛋白质或多肽的生物前体。该生物前体是能够在生物过程中被转化成具有如发明所要求的VEGF-X活性的蛋白质或多肽的分子。发明的核酸或蛋白质可被用作药物，或用于制备治疗癌症或其它与VEGF-X蛋白质表达相关疾病或状况的药物。
本发明的核酸分子或蛋白质可连同其药学可接受载体、稀释剂或赋形剂被方便地提供在药物组合物中。
本发明进一步涉及通过采用反义技术在体内抑制VEGF-X。通过反义DNA或RNA的三螺旋结构形成，反义技术可被用于控制基因表达，两种方法均基于多核苷酸与DNA或RNA的键合。例如，编码本发明蛋白质的5’编码部分或成熟DNA序列，可被用于设计一种长度为10-50个碱基对的反义RNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸被设计成与涉及转录的基因的一个区域互补(三螺旋-见Lee et al.Nucl.Acids Res.，63073(1979)；Cooney et al.，Science，241456(1988)；以及Dervanet al.，Science，2511360(1991))，从而阻止VEGF-X的转录及产生。
因此，本发明也提供了一种治疗或预防动脉粥样硬化症、因动脉吻合术或球囊导管导致的新内膜增生、因经皮经腔冠状血管成形术后的动脉扩张(stenting)导致的血管成形术后再狭窄中的任意一种的方法，该方法包括给予所述受试者一定量的与编码VEGF-X多肽的核酸分子反义的多核酸分子，例如可杂交与图1(a)的核酸，或其在高严格性条件下的互补序列杂交的反义多核苷酸分子，其浓度足够治疗或预防所述病症。
高严格性条件通常包括温度超过30C、典型地超过37℃、优选地超过45C。严格的盐条件通常低于1000mM，典型地低于500mM，优选地低于200mM。
根据给药途径，例如通过全身或口服途径可调整组成。全身给药的优选形式包括注射、典型地通过静脉注射。其它注射途径，如皮下、肌内或腹膜内也可被采用。
全身给药的可选方法包括采用渗透剂，如胆盐或梭链孢酸或其它去污剂，经粘膜和经皮给药。另外，如果本发明的多肽或其它化合物可被制剂化为肠道制剂或胶囊化制剂，口服给药也是可能的。这些化合物的给药也可是体表的和/或局部的，以药膏、糊剂、凝胶等形式。
所需的剂量范围取决于本发明的肽或其它化合物的选择、给药途径、制剂的性质、受试者状况的性质、及参与的实施者的判断。尽管如此，合适的剂量仍在0.1-100mg/kg受试者体重范围内。不过，鉴于可用化合物的多样性及不同给药途径的不同功效，仍然期望在需要剂量上有广泛的变化。
例如，口服给药预期需要的剂量高于静脉注射给药的剂量。正如本领域内所熟知的，这些剂量水平上的变化可采用标准经验程序调整优化。
此处所用的术语“治疗有效量”，意指本发明的VEGF-X、或其它活性物质的量，当根据预期治疗计划给药时，该剂量会得到预期的治疗效果或反应、或提供希望的益处。
优选的治疗有效量是可刺激平滑肌细胞增殖的量。
此处所用的“药学可接受的”意指从毒性或安全的角度出发，通常适合于对哺乳动物，包括人类给药。
本发明中，VEGF-X蛋白质典型地给药一段足够的时间，直到达到预期治疗效果。此处所用“直到达到预期治疗效果”，意指根据选择的给药方案，持续给予一种或多种治疗剂，直到临床医生或研究者观察到被调节的疾病或状况有寻求的临床或医学效果的时间为止。对本发明的治疗方法而论，化合物被持续给药直到在骨质或结构上观察到有预期的变化为止。在这些实例中，预期的目标是达到平滑肌细胞的增加。对降低疾病状态或状况危险的方法而论，只要需要就尽可能长时间地持续给药化合物，以预防不希望发生的状况。
两种或两种以上平滑肌细胞增殖的刺激物的联合也被认为在本发明的范围内。
“多核苷酸”通常指任何多聚核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，可以是未修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。“多核苷酸”不加限制地包括单链和双链DNA、单链和双链区混合物DNA、单链和双链RNA、及单链和双链区混合物RNA、杂交分子，该杂交分子包含可以是单链、或更典型的是双链、或单链与双链区域混合物的DNA或RNA。另外，“多核苷酸”指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。
术语“多核苷酸”也包括含有一个或多个已修饰碱基的DNAs或RNAs，及为了稳定性或其它原因而修饰过主链的DNAs或RNAs。“已修饰”碱基包括，例如，三苯甲基化的碱基、非常见碱基如次黄嘌呤核苷。对DNA和RNA可进行若干种修饰；这样，“多核苷酸”包括自然界中典型发现的多核苷酸的化学、酶学或代谢的修饰形式，也包括病毒和细胞的特征性的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”也包括相对短的多核苷酸，常常指寡核苷酸。
“多肽”指任何含有两种或两种以上，通过肽键或已修饰肽键彼此连接的氨基酸的肽或蛋白质，即，肽等排物。“多肽”指短链和长链，短链一般指肽、寡肽或寡聚物，长链通常指蛋白质。多肽可含有除了20个基因编码氨基酸以外的氨基酸。
“多肽”包括通过自然方法，如翻译后加工，或通过本领域内已熟知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。这些修饰方法在基础课本、更为详细的专著、及大量文献中有很好的描述。修饰可以发生在多肽的任何位置，包括肽主链，氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应当理解在特定多肽的若干位点上，相同类型的修饰可能表现相同或不同的程度。同样，特定多肽可含有许多修饰类型。多肽可由于遍在蛋白化作用而有分支，且可为具有或无分支的环状。环状、分支和分支的环状多肽可由翻译后自然加工产生，或通过合成方法制成。修饰包括乙酰化作用、酰化作用、ADP核糖基化作用、酰胺化作用、黄素的共价连接、亚铁原卟啉部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂类或脂类衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化作用、二硫键形成、脱甲基作用、共价交联形成、半胱氨酸键形成、焦谷氨酸盐形成、甲酰化作用、γ羧化作用、糖基化作用、GPI锚形成、羟基化作用、碘化作用、甲基化作用、豆蔻酰化作用、氧化、蛋白水解加工、磷酸化作用、异戊二烯化作用、外消旋作用、硒化作用、硫酸化作用、转运RNA介导的氨基酸添加到蛋白质，例如精氨酰化作用、及遍在蛋白化作用(见，例如，PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULARPROPERTIES，2nc Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，NewYork，1993；Wold，F.，Post-translational Protein ModificationsPerspectives and Prospects，pages.1-12 in POSTTRANSLATIONALCOVALENT MODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，Ed.，AcademicPress，New York，1983；Selfter et al.，“Analysis for proteinmodifications and nonprotein cofactors”，Meth Enzymol(1990)182626-646和Rattan et al.，“Protein SynthesisPost-translational Modifications and Aging”，Ann NYAcad Sci(1992)66348-62)。
含有任何上述修饰的多肽可被描述为本发明的蛋白质或多肽的“衍生物”。
本发明进一步涉及用于鉴定VEGF-X生物学活性的抑制剂的筛选方法。这些抑制剂包括中和性VEGF-X抗体、反义VEGF-X序列或与VEGF-X生物学活性竞争的非蛋白拮抗剂。适合的抗体可由适当的免疫原，例如分离的和/或重组抗原，或其部分(包括合成分子，如合成肽)，或表达重组抗原的宿主细胞刺激产生。另外，表达重组抗原的细胞，如转染细胞，可被用作免疫原，或用于对结合受体的抗体进行筛选(举例见，Chuntharapai et al，J Immunol.，159.-17831-1789(1994)。
抗体产生细胞，优选的是脾或淋巴结的那些抗体产生细胞，可获得自经感兴趣的抗原免疫过的动物。融合细胞(杂交瘤)可采用选择性培养条件进行分离，并通过有限稀释进行克隆。可通过适合的分析方法(例如ELISA)选择出产生具有期望特异性的抗体的细胞。
因此，本发明也提供了治疗或预防动脉粥样硬化症、因动脉吻合术或球囊导管导致的新内膜增生、因经皮经腔冠状动脉血管成形术后动脉扩张导致的血管成形术后再狭窄中的任何一种的方法，该方法包括给予上述受试者一定量的能结合于如图1(a)中所示VEGF-X多肽，或其表位的抗体，其浓度足够治疗或预防上述病症。
适用于本发明的抗VEGF-X抗体的特征在于高亲和力结合于VEGF-X受体。抗VEGF-X的抗体可通过吸入法给药(如，加入吸入剂或喷雾剂中，或作为喷雾的薄雾)。其它给药途径包括鼻内、口服、包括输注和/浓注(bolus)的静脉内、真皮下、经皮的(如，在缓释聚合物中)、肌内、腹膜内、皮下、局部的、硬膜外、颊等途径。也可采用其它适合的给药途径，例如，通过上皮、或粘膜皮肤衬细胞达到吸收的目的。抗体也可通过基因疗法给药，其中编码特定治疗蛋白质或肽的DNA分子可通过，例如载体的方法给予病人，该载体可引起特定蛋白质或肽在体内于治疗水平被表达和分泌。另外，抗VEGF-X抗体可连同其它生物学活性试剂的成分给药，如药学可接受表面活性剂(例如，甘油酯)，赋形剂(例如，乳糖)，载体、稀释剂和运载体。抗VEGF-X抗体可在其它治疗方案或试剂(如，多药物方案)之前、同时或序贯地，预防性或治疗性地给个体用药。与其它治疗剂同时给药的抗VEGF-X抗体，可以在相同或不同组合物中给药。抗VEGF-X抗体可与药学可接受肠胃外运载体一起被制剂化成溶液、悬液、乳剂或冻干粉。
VEGF-X抗体的治疗有效量可根据症状性质和范围、同时进行的治疗、及预期效果等因素以单次或分开剂量给药(如，按日、周或月的时间间隔分成系列剂量)，或以持续释放形式给药。
另一方面，提供了激动剂和拮抗剂的筛选检验方法，该方法包括测定候选化合物对本发明的VBGF-X或CUB结构域多肽结合于VEGF-X受体的效果。特别地，该方法包括将VEGF-X受体与本发明的VEGF-X或CUB结构域多肽和候选化合物接触，并且确定VEGF-X或CUB结构域多肽与VEGF-X受体的结合是否由于候选化合物的存在而增加或减少。在这个测定方法中，VEGF-X或CUB结构域多肽的结合超过标准结合的增加，表明候选化合物是VEGF-X或CUB结构域的激动剂。与标准相比，VEGF-X或CUB结构域多肽结合的减少表明化合物是VEGF-X或CUB结构域的拮抗剂。
从下列实施例，并参考附图，可以更清晰地理解本发明。其中图1(a)是PDGF-C的cDNA序列说明。预测的PDGF-C翻译产物示于序列上方，预测信号序列加有下划线。预测的mRNA剪接剪切事件实心发生部位以实心三角形指示。通过对分离的BAC克隆直接测序，或者通过与EMBL数据库中的部分BAC序列比较的方法推断mRNA剪切事件的位置(来自AC0015837的nt.1-374的区域，公布日期2000年4月7日，来自AC009582的nt.375-571的区域，公布日期2000年4月5日)。对斜体指示的nt.900-957区域而论，目前为止还没有关于剪切事件的资料。从通过PCR分离的变异序列推断，隐蔽剪切供体/受体位点位于nt.719/720和988/989(空心三角形)。多肽序列中的潜在N连接糖基化位点于方框中表示，且从小于预期长度的PCR片段预测(b)变异PDGF-C蛋白质序列-多肽序列。克隆并测序覆盖该区域的PCR片段，以展现如图1(a)所示的隐蔽剪切供体/受体位点。
图2是PDGF-C结构域与数据库序列比较说明(A)用其它的人类PDGFs和VEGFs的PDGF结构域与PDGF-C的PDGF结构域进行比对。
(B)用BMPs和神经菌毛素的CUB结构域与PDGF-C的CUB结构域进行比对；蛋白质如指示所示，来自X.laevis，小鼠或小鸡。
所有结构域序列来自PFAMA数据库(Rocchigiani，M.et al.，(1998)Genomics 47，204-216)，并采用CLUSTALW比对程序进行比对(EMBL，Heidelberg，Germany)。表1总结了图2显示的蛋白质区域的比较结果。从这些比较中，可以清楚地看出CUB结构域与其它数据库序列的相似程度高于PDGF结构域与其它数据库序列的相似程度。
图3是从PDGF-C的mRNA表达获得的结果图示说明(A)组织和癌细胞系中的PDGF-C mRNA分布的RNA印迹分析。采用β肌动蛋白cDNA探针进行的对照杂交表明在每一泳道中有等量的mRNA。PDGF-C mRNA的位置已指示出。
(B)来自组织和癌细胞系的cDNA的PCR分析。对照采用设计用于扩增部分甘油醛-3-磷酸脱氢酶cDNA的引物，表明在扩增反应中存在等量的每种cDNA(未显示)。
图4是从PDGF-C(VEGF-X)基因座的FISH图谱获得的结果的图示说明-显示了一个实例左边显示的是在人类染色体上的FISH信号，右边显示的是用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色的相同有丝分裂图，以鉴定人类染色体4。同时还显示了图解总结每一圆点代表在染色体4上检测到的双FISH信号。
图5是PDGF-C重组蛋白质特性的图示说明(A)糖基化&链间二硫化物形成。用表达全长PDGF-C的杆状病毒感染T.ni Hi5细胞。杆状病毒感染的昆虫细胞培养基样本处理如下泳道1-酶缓冲液+N-糖苷酶F；泳道2-酶缓冲液，无N-糖苷酶F；泳道3-还原的；泳道4-非还原的。蛋白质印迹后的检测采用抗His6抗体，以检测导入的C-末端表位标记。
(B)肝素结合。已纯化的大肠杆菌来源的全长MBP融合蛋白经过SDS-PAGE，并用考马斯蓝染色凝胶。泳道1-用于肝素柱的上样部分，泳道2-洗柱，泳道3-高盐洗脱。
(C)全长和CUB结构域-由大肠杆菌制备的PDGF-C全长融合蛋白(泳道1)和CUB结构域(泳道2)样品经考马斯染色的SDS-PAGE。通过不溶物质的重折叠制备CUB结构域在采用抗-His6抗体的蛋白质印迹实验中，20和25kDa的主带均被检测到，因此推断25kDa类型含有未剪切信号肽。分子量标准以kDa为单位指示于左侧。
图6是PDGF-C(VEGF-X)或PDGF-C CUB结构域对人类冠状动脉平滑肌细胞增殖的效果图示。细胞经所示浓度的大肠杆菌来源的CUB或全长PDGF-C蛋白质处理。
材料及方法VEGF-X的cDNA和部分基因组克隆化基于已知VEGF序列(VEGF-A、B、C和D)中的PDGF样结构域对图形显影(Lee et al.，1996)，并将之用于检索LifeSeqTM人类EST数据库(Incyte Genomics Inc.Palo Alto，CA，USA)，检索显示出VEGF家族的潜在新成员的部分序列。为延伸cDNA序列，采用Marathon-Ready胎盘和骨骼肌cDNAs进行5’RACE(Clontech，Palo Alto，CA，USA)。然后采用标准聚合酶链式反应方法扩增全长编码序列(Fitz etal.，1997)。将PCR片段克隆进载体pCR2.1(Invitrogen，Carlsbad，CA.USA)或pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA.USA)中。测序多个克隆以确定编码序列；所有的亚克隆也同样通过DNA测序进行验证。为获得部分基因组克隆，通过与来源于PDGF-C cDNA序列的寡核苷酸进行杂交，以筛选人类染色体组BAC基因库(Genome Systems，Inc.，StLouis，MI，USA)。为确定内含子/外显子边界，直接采用基于已知cDNA序列的20-mer测序引物对BAC DNA进行测序。采用Qiagen质粒midi试剂盒制备BAC DNA(Qiagen GmbH，Düsseldorf，Germany)。
VEGF-X基因的染色体定位染色体图谱的研究由See DNA Biotech Inc.(Toronto，Canada)采用如以前描述的生物素化的2.7kb探针(Yamada et al.，1997；Gribsteor et al.，1987，Ausabel et al.，1997)的FISH分析进行。
通过RNA印迹和RT-PCR对VEGF-X mRNA表达的分析将含有来源自不同人类组织的2μg富含poly(A)+的RNA的RNA印迹(Clontech Laboratories；MTNTMblot，MTNTMblot II和癌细胞系MTNTMblot)与a-[32P]-dCTP随机引物标记的(Multiprime labelling试剂盒，Roche Diagnostics)293bp的特异性PDGF-C片段(包括PDGF-C的3’末端编码区的9 2bp和3’非翻译区的201bp的PinAI-StuI片段)杂交。将印迹于68℃杂交过夜，并在68℃于0.1xSSC/0.1％SDS中进行高严格性的最终洗涤。用增强屏将膜进行1-3天的放射自显影。就RT-PCR分析而论，采用寡核苷酸引物GTTTGATGAAAGATTTGGGCTTG和CTGGTTCAAGATATCGAATAAGGTCTTCC对来自PDGF-C的350bp片段进行特异性PCR扩增。PCR扩增是在人类多组织cDNA(MTCTM)板(Clontech人MTC板I和II以及人肿瘤MTC板)上进行，该板标准化为6种不同管家基因的mRNA表达水平。另外，cDNA由不同肿瘤细胞培养物制得(Caco-2结直肠腺癌；T-84结肠直肠癌；MCF-7乳腺腺癌；T-47D乳腺导管腺癌；HT1080骨纤维肉瘤；SaOS-2骨肉瘤；SK-N-MC成神经细胞瘤；HepG2肝胚细胞瘤；JURKAT T细胞白血病和THP-1髓单核细胞白血病)。为制备肿瘤细胞cDNA，将细胞匀浆化，并采用RNeasy Mini试剂盒制备总RNA(Qiagen GmbH，Hilden，Germany)。采用寡(dT)15为引物，及50U的ExpandTM逆转录酶(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)对1μg的总RNA进行逆转录。然后用PDGF-C特异性或甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)特异性引物对1μl该cDNA进行PCR反应。对所有cDNAs，用PDGF-C特异性引物进行的PCR反应于50μl总体积中进行。加热样品至95℃，持续30s，并且完成25、30或35个循环操作，每循环包括于95℃ 30s，68℃ 30s。同时进行对照反应，该反应采用了用于扩增管家基因G3PDH的1kb片段的特异引物。
重组蛋白质的表达、纯化和检测对哺乳动物细胞表达而论，扩增全长编码序列，并将其克隆进载体pcDNA6/V5-His(Invitrogen，Leek，Netherlands)以添加一个C末端His6肽标记，以便辅助检测与纯化。对大肠杆菌表达而论，PCR扩增预测的成熟蛋白质(Glu23-Gly345)的编码区，以添加一个C末端His6肽标记，然后将其克隆进载体pMAL-p2(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)。将得到的MBP融合蛋白质首先在镍螯合树脂(Ni-NTA，Qiagen GmbH，Düsseldorf，Germany)上，然后于直链淀粉树脂(New England Biolabs，Beverly，MA)上进行纯化。PCR扩增编码了PDGF-C(Glu23-Val171)的CUB结构域片段的DNA序列，以添加一个C末端His6肽标记，并将其克隆进pET22b(Novagen，Madison，WI)中，用于在大肠杆菌中的分泌。通过标准方法(Fitz et al.，1997)从诱导培养物的周质或不合细胞培养基中制备CUB结构域蛋白质。通过用20％饱和的硫酸铵沉淀初步纯化蛋白质。用20mM Tris pH8.0，300mMNaCl透析过夜，以去除硫酸铵，然后采用前述的镍螯合树脂进一步纯化蛋白质。采用N-糖苷酶F(Roche Molecular Biochemicals，Brussels，Belgium)进行蛋白质糖基化分析。根据制造商使用说明使用肝素琼脂糖柱(HiTrap，Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)。在其用于基于细胞的分析前，采用可商购试剂盒(COATESTEndotoxin，Chromogenix AB，Sweden)检验蛋白质样品的内毒素污染。
细胞培养于EGM-2生长培养基(Clonetics，San Diego，CA)中维持人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)(Clonetics，San Diego，CA)，并于骨骼肌生长培养基(Clonetics，San Diego，CA)中培养人类骨骼肌细胞(SkMC)(Clonetics，San Diego，CA)。于补充有10％胎牛血清(FBS)(HyClone，Logen，UT)，6mM Hepes，50I.U./ml青霉素和50μg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(Gibco，Gaithersburg，MD)中维持包括HCASMs(Clonetics，San Diego，CA)、大鼠心脏心肌H9c2(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)、及人类新生儿皮肤成纤维细胞(39-SK)(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)在内的细胞。采用4-6代的细胞。于补充有10％FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM中维持人类成骨细胞(MG 63)(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)。如以前描述的方法(Masure etal.，1998)，将原代软骨细胞从牛肩分离。于补充有10％FBS、10mMHEPES、0.1mM非必需氨基酸、20μg/ml L-脯氨酸、50μg/ml抗坏血酸、100μg/ml青霉素、100μg/ml链霉素和0.25μg/ml两性霉素B(软骨细胞生长培养基)的DMEM(高葡萄糖)中培养原代牛软骨细胞。所有细胞培养均于37℃、湿化培养箱中、5％CO2和95％空气的环境中进行。
细胞增殖分析用0.05％胰蛋白酶/0.53mM EDTA(Gibco，Gaithersburg，MD)消化HUVECs，并按5,000细胞/孔将其分配于96孔组织培养板中。在细胞贴壁并形成单层(16小时)后，用含有0.5％-2％FBS的DMEM中如所示的不同浓度的VEGF-X刺激细胞。对人类皮肤成纤维细胞而论，生长培养基用含有0.1％BSA、有或无不同浓度VEGF-X的DMEM替代。对MG63、人类SkMC，H9c2或HCASMC而论，培养基用含有0.5％FBS的DMEM替代。将牛软骨细胞按5,000细胞/孔接种于补充有10％FBS的高葡萄糖DMEM培养基的96孔组织培养板中，并让其贴壁72h。培养基用含有2％BSA的DMEM替代，进行或不进行处理两天。对所有的测试细胞而论，经过处理的孵育后，培养基用100ml含有5％FBS和3μCi/ml的[3H]-胸苷替代。脉冲标记后，用甲醇/乙酸(3∶1，体积比)于室温固定细胞1h。以250ml/孔，用80％甲醇洗涤细胞两次。将细胞先于0.05％胰蛋白酶(100ml/孔)中处理30min，然后于0.5％SDS(100ml/孔)中再处理30min，以溶解细胞。细胞裂解物的等分物(180ml)与2ml闪烁混合物结合，并用液体闪烁计数器(Wallac 1409)测定细胞裂解物的放射性。
PDGF-C基因的染色体定位及内含子/外显子结构通过FISH分析将VEGF-X定位于人类染色体4，q31-q32区的长臂上(图2)。对该探针而论，杂交效率为约70％。数据库检索鉴定了两种携有VEGF-X序列的基因组BAC克隆(EMBL编号AC009582和AC015837)。这些BAC克隆来源自染色体4，支持FISH数据。分离含有cDNA的3’部分的BAC克隆。通过对该克隆直接测序，可推断在cDNA的PDGF结构域中剪切事件的位置(图1中nt.位置1179/1180)。就VEGF-A和VEGF-D而论，剪切位点的位置是保守的(Heng et al.，1993，Hagen et al.，1994)。图1中所示的其它剪切位点的位置，可从上述数据库BAC克隆AC009582和AC015837的序列推断出。
VEGF-X和CUB结构域的测试总结VEGF-X和CUB结构域均不增加人类皮肤成纤维细胞、人类脐内皮细胞、牛软骨细胞或人类成骨细胞(MG63)的增殖。然而，全长和CUB结构域结构均能够以剂量依赖方式刺激人类冠状动脉平滑肌细胞的增殖(图3)。最佳刺激浓度范围为1-10μg/ml。全长或CUB结构域结构的效果，于测试的最高浓度，均超过对照水平的四倍(图2)。我们没有观察到CUB结构域对其它肌细胞类型，例如人类骨骼肌细胞或大鼠心肌(数据未显示)的促有丝分裂活性。去除第三个半胱氨酸或将其突变为一个丝氨酸残基，我们发现CUB结构域对人类冠状动脉平滑肌细胞的促有丝分裂活性降低到大约为最高浓度下的一半(10μg/ml)(数据未显示)。
表1.PDGF-C和相关蛋白质同一性和相似性的成对比较％同一性％相似性CUBNRP_XENLA 35 50NRP_MOUSE 33 46NRP_CHICK 32 48BMP1_XENLA28 44BMP1_HUMAN24 41％同一性％相似性PDGFVEGFB 29 47VEGFD 29 44PDGFB 29 40PDGFA 29 39VEGFA 25 51VEGFC 24 43PLGF 23 42VEGF-Avs VEGF-C 38 51比较在图2所示的蛋白质区域间进行，用Genedoc程序(http//www.cris.com/~Ketchup/genedoc.shtml)计算。参考文献Li，X.，Ponten，A.，Aase，K.，Karlsson，L.，Abramsson，A.，Uutela，M.，Backstrom，G.，Bostrom，H.，Li，H.，Soriano，P.，Betsholtz，C.，Helding，C-H.，Alitalo，K.，Ostman，A.&Eriksson，U.(2000)PDGF-C is a new protease-activated ligandforthe PDGF -receptor.Nature Cell Biology 2，302-309.Sun，P.D.(1995)The cystine-knot growth factor superfamily.Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24，269-291.Potgens，A.J.，Lubsen，N.H.，van Altena，M.C.，Vermeulen，R.，Bakker，A.，Schoenmakers，J.G.，Ruiter，D.J.&de Waal，R.M.(1994)Covalent dimerisation of vascular permeabilityfactor/vascular endothelial growth factor is essential for itsbiological activity.Evidence from Cysto Ser 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序列表<110>詹森药业有限公司<120>平滑肌细胞增殖的调节<130>JAB 1687<150>US 60/274901<151>2001-03-09<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>345<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Met Ser Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Thr Ser Ala Leu Ala Gly Gln1 5 10 15Arg Gln Gly Thr Gln Ala Glu Ser Asn Leu Ser Ser Lys Phe Gln Phe20 25 30Ser Ser Asn Lys Glu Gln Asn Gly Val Gln Asp Pro Gln His Glu Arg35 40 45Ile Ile Thr Val Ser Thr Asn Gly Ser Ile His Ser Pro Arg Phe Pro50 55 60His Thr Tyr Pro Arg Asn Thr Val Leu Val Trp Arg Leu Val Ala Val65 70 75 80Glu Glu Asn Val Trp Ile Gln Leu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Gly Leu85 90 95Glu Asp Pro Glu Asp Asp Ile Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu100 105 110
Glu Pro Ser Asp Gly Thr Ile Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr115 120 125Val Pro Gly Lys Gln Ile Ser Lys Gly Asn Gln Ile Arg Ile Arg Phe130 135 140Val Ser Asp Glu Tyr Phe Pro Ser Glu Pro Gly Phe Cys Ile His Tyr145 150 155 160Asn Ile Val Met Pro Gln Phe Thr Glu Ala Val Ser Pro Ser Val Leu165 170 175Pro Pro Ser Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Asn Asn Ala Ile Thr Ala180 185 190Phe Ser Thr Leu Glu Asp Leu Ile Arg Tyr Leu Glu Pro Glu Arg Trp195 200 205Gln Leu Asp Leu Glu Asp Leu Tyr Arg Pro Thr Trp Gln Leu Leu Gly210 215 220Lys Ala Phe Val Phe Gly Arg Lys Ser Arg Val Val Asp Leu Asn Leu225 230 235 240Leu Thr Glu Glu Val Arg Leu Tyr Ser Cys Thr Pro Arg Asn Phe Ser245 250 255Val Ser Ile Arg Glu Glu Leu Lys Arg Thr Asp Thr Ile Phe Trp Pro260 265 270Gly Cys Leu Leu Val Lys Arg Cys Gly Gly Asn Cys Ala Cys Cys Leu275 280 285His Asn Cys Asn Glu Cys Gln Cys Val Pro Ser Lys Val Thr Lys Lys290 295300
Tyr His Glu Val Leu Gln Leu Arg Pro Lys Thr Gly Val Arg Gly Leu305 310 315 320His Lys Ser Leu Thr Asp Val Ala Leu Glu His His Glu Glu Cys Asp325 330 335Cys Val Cys Arg Gly Ser Thr Gly Gly340 345<210>2<211>111<212>PRT<213>人<400>2Gly Val Gln Asp Pro Gln His Glu Arg Ile Ile Thr Val Ser Thr Asn1 5 10 15Gly Ser Ile His Ser Pro Arg Phe Pro His Thr Tyr Pro Arg Asn Thr20 25 30Val Leu Val Trp Arg Leu Val Ala Val Glu Glu Asn Val Trp Ile Gln35 40 45Leu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Gly Leu Glu Asp Pro Glu Asp Asp Ile50 55 60Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu Glu Pro Ser Asp Gly Thr Ile65 70 75 80Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr Val Pro Gly Lys Gln Ile Ser85 90 95Lys Gly Asn Gln Ile Arg Ile Arg Phe Val Ser Asp Glu Tyr Phe100 105 110
<210>3<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PDGF-C正向引物<400>3gtttgatgaa agatttgggc ttg 23<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PDGF-C反向引物<400>4ctggttcaag atatcgaata aggtcttee 29<210>5<211>282<212>PRT<213>人<400>5Met Ser Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Thr Ser Ala Leu Ala Gly Gln1 5 10 15Arg Gln Gly Thr Gln Ala Glu Ser Asn Leu Ser Ser Lys Phe Gln Phe20 25 30Ser Ser Asn Lys Glu Gln Asn Gly Val Gln Asp Pro Gln His Glu Arg35 40 45Ile Ile Thr Val Ser Thr Asn Gly Ser Ile His Ser Pro Arg Phe Pro50 55 60
His Thr Tyr Pro Arg Asn Thr Val Leu Val Trp Arg Leu Val Ala Val65 70 75 80Glu Glu Asn Val Trp Ile Gln Leu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Gly Leu85 90 95Glu Asp Pro Glu Asp Asp Ile Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu100 105 110Glu Pro Ser Asp Gly Thr Ile Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr115 120 125Val Pro Gly Lys Gln Ile Ser Lys Gly Asn Gln Ile Arg Ile Arg Phe130 135 140Val Ser Asp Glu Tyr Phe Pro Ser Glu Pro Gly Phe Cys Ile His Tyr145 150 155 160Asn Ile Val Met Pro Gln Phe Thr Glu Ala Val Ser Pro Ser Val Leu165 170 175Pro Pro Ser Ala Leu Pro Leu Asp Leu Leu Asn Asn Ala Ile Thr Ala180 185 190Phe Ser Thr Leu Glu Asp Leu Ile Arg Tyr Leu Glu Pro Glu Arg Trp195 200 205Gln Leu Asp Leu Glu Asp Leu Tyr Arg Pro Thr Trp Gln Leu Leu Gly210 215 220Lys Ala Phe Val Phe Gly Arg Lys Ser Arg Val Val Asp Leu Asn Leu225 230 235 240Leu Thr Glu Glu Val Leu Gln Leu Arg Pro Lys Thr Gly Val Arg Gly245 250 255
Leu His Lys Ser Leu Thr Asp Val Ala Leu Glu His His Glu Glu Cys260 265 270Asp Cys Val Cys Arg Gly Ser Thr Gly Gly275 280<210>6<211>167<212>PRT<213>人<400>6Met Ser Leu Phe Gly Leu Leu Leu Leu Thr Ser Ala Leu Ala Gly Gln1 5 10 15Arg Gln Gly Thr Gln Ala Glu Ser Asn Leu Ser Ser Lys Phe Gln Phe20 25 30Ser Ser Asn Lys Glu Gln Asn Gly Val Gln Asp Pro Gln His Glu Arg35 40 45Ile Ile Thr Val Ser Thr Asn Gly Ser Ile His Ser Pro Arg Phe Pro50 55 60His Thr Tyr Pro Arg Asn Thr Val Leu Val Trp Arg Leu Val Ala Val65 70 75 80Glu Glu Asn Val Trp Ile Gln Leu Thr Phe Asp Glu Arg Phe Gly Leu85 90 95Glu Asp Pro Glu Asp Asp Ile Cys Lys Tyr Asp Phe Val Glu Val Glu100 105 110Glu Pro Ser Asp Gly Thr Ile Leu Gly Arg Trp Cys Gly Ser Gly Thr115 120 125Val Pro Gly Lys Gln Ile Ser Lys Gly Asn Gln Ile Arg Ile Arg Phe
130 135 140Val Ser Asp Glu Tyr Phe Pro Ser Glu Pro Ser Asn Arg Gly Gly Lys145 150 155 160Ile Ile Gln Leu His Thr Ser16权利要求
1.下列任意一种物质在制造用于刺激组织和器官中的平滑肌细胞增殖的药物中的应用编码包含图1(a)的氨基酸序列的VEGF-X多肽、或其功能等同物、衍生物或生物前体的核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体、包含图1(a)的氨基酸序列的VEGF-X多肽、或其功能等同物、衍生物或生物前体、或包含所述核酸分子、载体或所述VEGF-X多肽中任意一种物质的药物组合物。
2.下列任意一种物质在制造用于治疗或预防尿道功能障碍、膀胱功能障碍、括约肌功能障碍、或与VEGF-X多肽的异常内源活性相关的功能障碍中的任意一种、或用于骨盆底重建的药物中的应用编码包含图1(a)的氨基酸序列的VEGF-X多肽、或其功能等同物、衍生物或生物前体的核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体、包含图1(a)的氨基酸序列的VEGF-X多肽、或其功能等同物、衍生物或生物前体、或包含所述核酸分子、载体或VEGF-X多肽中任意一种物质的药物组合物。
3.下列任意一种物质在制造用于刺激组织和/或器官中的平滑肌细胞增殖的药物中的应用包含图1(a)的氨基酸序列的VEGF-X多肽、或其功能等同物或衍生物的CUB结构域、或编码所述CUB结构域或其功能等同物、衍生物或生物前体的核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体。
4.根据权利要求3的用途，其中所述CUB结构域包含图1(a)所描述的氨基酸序列的40-150位的多肽。
5.下列任意一种物质在制造用于治疗或预防尿道功能障碍、膀胱功能障碍、括约肌功能障碍、或与VEGF-X多肽的异常内源活性相关的功能障碍中的任意一种、或用于骨盆底重建的药物中的应用图1(a)的VEGF-X多肽的CUB结构域、或编码所述CUB或其功能等同物或衍生物的核酸分子、包含所述核酸分子或所述CUB结构域中任意一种物质的药物组合物。
6.一种刺激组织或器官中的平滑肌细胞增殖、或刺激受试者中的组织修复的方法，该方法包括给予所述受试者一定量的下列任意一种物质编码包含图1(a)的氨基酸序列的VEGF-X多肽的VEGF-X核酸分子、或图1(a)的VEGF-X多肽或其功能等同物、衍生物或生物前体，其浓度足够刺激平滑肌细胞增殖。
7.一种治疗或预防尿道功能障碍、膀胱功能障碍、骨盆底重建、括约肌功能障碍、或与VEGF-X多肽的异常内源活性相关的功能障碍中的任意一种的方法，该方法包括给予所述受试者一定量的下列任意一种物质包含图1(a)的氨基酸序列的VEGF-X多肽或其功能等同物、衍生物或生物前体、编码该多肽或其功能等同物、衍生物或生物前体的核酸分子、包含该核酸分子的表达载体，和包含所述核酸分子或所述多肽中任意一种物质的药物组合物。
8.一种通过施用治疗有效量的下列任意一种物质治疗尿道功能障碍、膀胱功能障碍、或用于骨盆底重建、治疗括约肌功能障碍、或与VEGF-X多肽的异常内源活性相关的功能障碍的方法包含图1(a)的氨基酸序列的VEGF-X多肽、或其功能等同物、衍生物或生物前体、包含该多肽连同其药学可接受载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
9.一种刺激组织或器官中的平滑肌细胞增殖、或刺激受试者中的组织修复的方法，该方法包括给予所述受试者一定量的包含图1(a)描述的核苷酸序列的40-150位的序列的VEGF-X多肽、或其功能等同物或衍生物的CUB结构域，其浓度足够刺激平滑肌细胞增殖。
10.一种治疗或预防尿道功能障碍、膀胱功能障碍、骨盆底重建、括约肌功能障碍、或与VEGF-X多肽的异常内源活性相关的功能障碍中的任意一种的方法，该方法包括给予所述受试者一定量的下列任意一种物质编码包含图1(a)描述的氨基酸序列的40-150位的序列的CUB结构域或其功能等同物或衍生物的核酸分子、包含该核酸分子的表达载体，和包含意所述核酸分子和所述CUB结构域中任意一种物质的药物组合物。
11.一种治疗尿道功能障碍、膀胱功能障碍、或用于骨盆底重建、治疗括约肌功能障碍、或与CUB结构域多肽的异常内源活性相关的功能障碍的方法，该方法包括施用治疗有效量的包含图1(a)描述的氨基酸序列的40-150位的多肽的CUB结构域多肽或其功能等同物或衍生物、包含该CUB结构域及其药学可接受载体、稀释剂或其赋形剂的药物组合物中的任意一种物质。
12.一种可结合于包含一个图1(a)的氨基酸序列的VEGF-X多肽或其表位的抗体在制造用于治疗或预防动脉粥样硬化、因动脉吻合术或球囊导管引起的新内膜增生、因经皮经腔冠状动脉血管成形术后动脉扩张引起的血管成形术后再狭窄中的任意一种的药物中的应用。
13.一种治疗或预防动脉粥样硬化、因动脉吻合术或球囊导管引起的新内膜增生、因经皮经腔冠状动脉血管成形术后动脉扩张引起的血管成形术后再狭窄中的任意一种的方法，该方法包括给予所述受试者一定量的在高严格性条件下，可杂交于编码图1(a)的VEGF-X多肽的核酸分子、或其互补序列的反义多核苷酸分子，其浓度足够治疗或预防所述病症。
14.一种治疗或预防动脉粥样硬化、因动脉吻合术或球囊导管引起的新内膜增生、因经皮经腔冠状动脉血管成形术后动脉扩张引起的血管成形术后再狭窄中的任意一种的方法，该方法包括给予所述受试者一定量的图1(a)的VEGF-X多肽的拮抗剂，其浓度足够治疗或预防所述病症。
15.一种治疗或预防动脉粥样硬化、因动脉吻合术或球囊导管引起的新内膜增生、因经皮经腔冠状动脉血管成形术后动脉扩张引起的血管成形术后再狭窄中的任意一种的方法，该方法包括给予所述受试者一定量的可结合于图1(a)的VEGF-X多肽或其表位的抗体，其浓度足够治疗或预防所述病症。
16.一种诊断受试者中病理学状况或对病理学状况易感性的方法，该方法包括(a)测定生物样品中图1(a)的VEGF-X多肽或其受体的突变的存在与否；及(b)基于VEGF-X多肽或其受体的表达程度，诊断病理学状况或对病理学状况的易感性。
17.一种鉴定抑制或增强平滑肌细胞增殖的化合物的方法，该方法包括在图1(a)的VEGF-X多肽的存在下，使表达VEGF-X受体的细胞接触该化合物，并监测与没有和所述化合物接触的细胞相比，所述化合物对所述细胞的作用。
18.一种用于直接递送图1(a)的VEGF-X多肽的拮抗剂，或编码所述多肽的核酸分子的反义分子，或可结合于所述VEGF-X多肽或其表位的中和抗体的方法，该方法包括经由栓子切除术导管的球囊尖端给予所述拮抗剂、反义分子或抗体，以限制牵张损伤后的新内膜增生。
19.下列任意一种物质在制造用于刺激组织和器官中的平滑肌细胞增殖的药物中的应用编码VEGF-X多肽、或其功能等同物、衍生物或生物前体的核酸分子、包含该核酸分子的表达载体、VEGF-X多肽或其功能等同物、衍生物或生物前体、或者包含所述核酸分子、或所述VEGF-X多肽中任意一种物质的药物组合物。
20.下列任意一种物质在制造用于治疗或预防尿道、膀胱或括约肌功能障碍、或与VEGF-X多肽的异常内源活性相关的功能障碍中的任意一种、或用于骨盆底重建的药物中的应用编码VEGF-X多肽、或其功能等同物、衍生物或生物前体的核酸分子、包含该核酸分子的表达载体、VEGF-X多肽或其功能等同物、衍生物或生物前体、或者包含所述核酸分子、或所述VEGF-X多肽中任意一种物质的药物组合物。
21.下列任意一种物质在制造用于刺激组织和/或器官中的平滑肌增殖的药物中的应用VEGF-X多肽的CUB结构域、或编码该CUB结构域、或其功能等同物、或衍生物的核酸分子、包含该核酸分子的表达载体、包含该CUB结构域、核酸分子或表达载体中的任意一种物质的药物组合物。
22.根据权利要求21的应用，其中所述CUB结构域包含图1(a)描述氨基酸序列的40-150位的多肽。
23.下列任意一种物质在制造用于治疗或预防尿道、膀胱或括约肌功能障碍、或与VEGF-X多肽的异常内源活性相关的功能障碍、或用于骨盆底重建的药物中的应用VEGF-X多肽的CUB结构域、或编码该CUB结构域、或其功能等同物、或衍生物的核酸分子、包含该核酸分子的表达载体、包含该CUB结构域、核酸分子或表达载体中的任意一种物质的药物组合物。
24.一种刺激组织或器官中的平滑肌细胞增殖、或刺激受试者中组织修复的方法，该方法包括给予所述受试者一定量的编码VEGF-X多肽的核酸分子、或VEGF-X多肽或其功能等同物、衍生物或生物前体，其浓度足够刺激平滑肌细胞增殖。
25.一种治疗或预防尿道功能障碍、膀胱功能障碍、骨盆底重建、括约肌功能障碍、或与VEGF-X多肽的异常内源活性相关的功能障碍的方法，该方法包括给予所述受试者一定量的下列任意一种物质VEGF-X多肽、编码该多肽或其功能等同物、衍生物或生物前体的核酸分子、包含该核酸分子的表达载体和包含该核酸分子或该多肽中的任何一种物质的药物组合物。
26.通过施用治疗有效量的下列任意一种物质治疗尿道功能障碍、膀胱功能障碍、括约肌功能障碍、或与VEGF-X多肽的异常内源活性相关的功能障碍或者用于骨盆底重建的方法VEGF-X多肽或其功能等同物、衍生物或生物前体、一种包含该多肽连同其药学可接受载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
27.一种刺激组织或器官中的平滑肌细胞增殖，和所述受试者中组织修复的方法，该方法包括给予所述受试者一定量的VEGF-X多肽或其功能等同物或衍生物的CUB结构域，其浓度足够刺激平滑肌细胞增殖。
28.一种治疗或预防尿道功能障碍、膀胱功能障碍、骨盆底重建、括约肌功能障碍、或与VEGF-X多肽的异常内源活性相关的功能障碍中的任意一种的方法，该方法包括给予所述受试者一定量的下列任意一种物质编码CUB结构域或其功能等同物、衍生物或生物前体的核酸分子、包含该核酸分子的表达载体、和包含该核酸分子和该CUB结构域中的任意一种物质的药物组合物。
29.一种治疗尿道功能障碍、膀胱功能障碍、括约肌功能障碍、或与CUB结构域多肽的异常内源活性相关的功能障碍，或者用于骨盆底重建的方法，该方法包括施用治疗有效量的下列任意一种物质CUB结构域、包含该CUB结构域多肽或其功能等同物、或其衍生物及药学可接受载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物。
30.一种可结合于VEGF-X多肽或其表位的抗体在制造用于治疗或预防动脉粥样硬化、因动脉吻合术或球囊导管引起的新内膜增生、因经皮经腔冠状动脉血管成形术后动脉扩张引起的血管成形术后再狭窄中的任何一种的药物中的应用。
31.一种治疗或预防动脉粥样硬化、因动脉吻合术或球囊导管引起的新内膜增生、因经皮经腔冠状动脉血管成形术后动脉扩张引起的血管成形术后再狭窄中的任何一种的方法，该方法包括给予所述受试者一定量的编码VEGF-X多肽的核酸分子的反义分子，其浓度足够治疗或预防所述病症。
32.一种治疗或预防动脉粥样硬化、因动脉吻合术或球囊导管引起的新内膜增生、因经皮经腔冠状动脉血管成形术后动脉扩张引起的血管成形术后再狭窄中的任意一种的方法，该方法包括给予所述受试者一定量的VEGF-X多肽的拮抗剂，其浓度足够治疗或预防所述病症。
33.一种治疗或预防动脉粥样硬化、因动脉吻合术或球囊导管引起的新内膜增生、因经皮经腔冠状动脉血管成形术后动脉扩张引起的血管成形术后再狭窄中的任意一种的方法，该方法包括给予所述受试者一定量的可结合于VEGF-X多肽或其表位的抗体，其浓度足够治疗或预防所述病症。
34.一种诊断受试者中的病理学状况或对病理学状况的易感性的方法，该方法包括(a)测定生物样品中VEGF-X多肽或其受体的突变的存在与否；及(b)基于VEGF-X多肽或其受体的表达程度，诊断病理学状况或对病理学状况的易感性。
35.一种鉴定抑制或增强平滑肌细胞增殖的化合物的方法，该方法包括在VEGF-X多肽的存在下，使表达VEGF-X受体的细胞接触该化合物，并监测与没有和所述化合物接触的细胞相比，所述化合物所述细胞的作用。
36.一种用于直接递送VEGF-X多肽的拮抗剂，或编码所述多肽的核酸分子的反义分子，或可结合于所述VEGF-X多肽或其表位的中和抗体的方法，该方法包括经由栓子切除术导管的球囊尖端给予所述拮抗剂、反义分子或抗体，以限制牵张损伤后的新内膜增生。
全文摘要
本发明提供了血管内皮生长因子，此处命名为VEGF－X，和VEGF－X的序列中的CUB结构域的一种新应用，它们增强平滑肌细胞增殖，并且可用于治疗与平滑肌细胞增殖减少相关的疾病。VEGF－X和CUB结构域也可被用于组织工程应用，增加特定组织内部平滑肌细胞数量，以恢复该组织功能或结构。本发明也公开了用于确定VEGF－X生物活性抑制剂的筛选方法，这些抑制剂包括中和性VEGF－X抗体，反义VEGF－X序列，或与VEGF－X生物活性竞争的非蛋白拮抗剂。本发明也提供了与平滑肌细胞过度增殖相关病症的治疗方法，及对与平滑肌细胞过度增殖相关的病理学状况、或与平滑肌细胞过度增殖相关的病理学状况易感性的诊断方法。
文档编号A61K48/00GK1568194SQ02806185
公开日2005年1月19日 申请日期2002年3月7日 优先权日2001年3月9日
发明者J·C·格辛, A·戈西夫斯卡, J·徐, R·戈尔顿, J·约恩, S·N·哈纳拉, I·哈里斯 申请人:詹森药业有限公司