专利名称：类黄酮化合物及其制造方法
技术领域：
本发明涉及一种新颖的类黄酮(flavonoid)化合物及其制造方法。
背景技术：
以往，已知作为维生素P的橙皮苷(hesperidin)是一种橙皮素(hesperetin)的配糖体，为多含于如桔子或柠檬等的柑橘类、特别是未熟果实果皮中的类黄酮化合物。尽管橙皮苷多天然存在，并具有抗过敏作用、抗病毒作用及毛细血管强化作用等生理活性，但其利用范围有限。例如，由于橙皮苷难以被吸收至体内，因此所能得到的抗氧化作用极为低下，以往没有被作为抗氧化剂加以利用。从而，人们期待对橙皮苷进行有效的利用。
发明内容
本发明的目的在于将橙皮苷有效地利用于各个领域。本发明的另一目的在于，提供一种具有较高抗氧化作用的新颖的类黄酮化合物及其制造方法。
为达到上述目的，本发明的一实施形态中提供一种具有下述化学式所示结构的类黄酮化合物。
上述类黄酮化合物的特征在于，所述类黄酮化合物具有抗氧化性。
上述类黄酮化合物的特征在于，通过使用斋藤曲霉对橙皮苷进行微生物发酵处理制得。
本发明的另一实施形态中提供了一种类黄酮化合物的制造方法。该方法的特征在于，所述制造方法包括这样的工序为将橙皮苷进行微生物变换生成类黄酮化合物，用斋藤曲霉使橙皮苷作微生物发酵。
微生物发酵工序的特征在于，所述工序包括下述工序为了在斋藤曲霉的营养菌丝中使橙皮苷变换为橙皮素，对含有橙皮苷和斋藤曲霉的培养基作振荡培养的菌丝培养工序；以及一边在所述营养菌丝中进行孢子的形成，一边使得由上述培养基的橙皮素作微生物变换生成类黄酮化合物的孢子形成工序。
孢子形成工序可以直接作振荡培养，也可改换作静置培养，二者之一皆可。但是，在作静置培养的场合，为提高斋藤曲霉的微生物变换效率，理想地应减小培养基的深度，增大培养基的表面积与其体积之比(比表面积)，将整个培养基保持于需氧条件下。
在进行上述菌丝培养工序之前，理想地应进行将含有斋藤曲霉的培养基作振荡培养的预培养工序。
图1及图2是表示类黄酮化合物抗氧化活性测定结果的图表。
具体实施例方式
以下，就本发明一实施形态的类黄酮化合物及其制造方法进行详细说明。
该实施形态中的类黄酮化合物具有化学式1所示的结构。
…(化学式1)类黄酮化合物的组成式为C16H14O7，其分子量为318.27，名称为3′，5，7，8-四羟基-4′-甲氧基黄烷酮(3′，5，7，8-tetrahydroxy-4′-methoxyflavanone)，或2，3-二氢-5，7，8-三羟基-2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮(2，3-dihydro-trihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one)。类黄酮化合物如化学式所示，为在橙皮素(3′，5，7-4′-甲氧基黄烷酮；C16H14O7)的八位上具有羟基的化合物。
8-羟基橙皮素容易溶解于甲醇、乙醇及二甲基亚砜(DMSO)，也多少溶解于水。橙皮素几乎不显示抗氧化作用，相反，8-羟基橙皮素显示与α-生育酚(维生素E)同等的极高的抗氧化作用。在将8-羟基橙皮素加入例如食品或饮料等的场合，藉由8-羟基橙皮素的抗氧化作用，可以制得具有增进健康活性的健康食品及健康饮料(含有8-羟基橙皮素的组合物)。摄取的8-羟基橙皮素在体内消去活性氧，抑制过氧化类脂的生成，对起因于氧化应激反应的癌症、动脉硬化、糖尿病及其合并症等由生活习惯不良导致的疾病具有有效预防作用。
8-羟基橙皮素可通过对橙皮苷(hesperidin)用斋藤曲霉(Aspergi1lus saitoi)进行微生物发酵处理制得。详细地说，可如下所述地制得8-羟基橙皮素。首先，在含有作为橙皮素和芸香糖(L-鼠李糖-D-葡萄糖)的配糖体的橙皮苷(维生素P)的培养基中培养斋藤曲霉。培养的斋藤曲霉由微生物变换从橙皮苷生成8-羟基橙皮素。8-羟基橙皮素含于培养液的上清液中。为了良好地进行斋藤曲霉的生长及微生物变换，理想地斋藤曲霉应在20～40℃的培养温度、需氧条件下进行培养。
较好的培养基是，例如，含有马铃薯葡萄糖的培养基及如察氏培养基那样的丝状菌用培养基，或者是含有豆腐渣等有机物的各种液体培养基。为了阻止除从橙皮苷变换为8-羟基橙皮素以外的发酵，理想地应是含有最低限度营养素的最小培养基。例如，理想地，培养基应不含有单糖类或二糖类，以不使酒精(醇)发酵。为了改善斋藤曲霉的生长，开始培养时培养基的pH值理想地应在3～7的范围内。
为提高橙皮苷对培养基的溶解性能，较好的是，对培养基添加较低浓度的有机溶剂。作为有机溶剂可以举出甲醇、乙醇、DMSO。其中，以橙皮苷较易溶解的DMSO为最理想。培养基中的DMSO的浓度(含量)较好的是0.01～5容量％，更好的是在0.01～1容量％。培养基中的DMSO的浓度(含量)如不到0.01容量％，则橙皮苷不能充分地溶解于培养基中，而超过5容量％，则斋藤曲霉的生长显著受到阻碍。也可将有机溶剂和橙皮苷同时添加于培养基中，或可在橙皮苷的添加之前先添加于培养基中。
为有效获得8-羟基橙皮素，较好的是，尽可能地将橙皮苷高浓度地添加于培养基中。换言之，较好的是，培养基中的橙皮苷的含量为橙皮苷对于培养基的饱和浓度(溶解界限)。橙皮苷的饱和浓度可相应于添加于培养基中的有机溶剂量作相应变化，但大致在0.3重量％以下。
为在短时间内有效获得8-羟基橙皮素，在开始培养时，将斋藤曲霉以2×106cfu/mL以上的浓度添加于培养基中。
为提高斋藤曲霉的微生物的变换效率，首先，将斋藤曲霉的营养菌丝在培养基中作振荡培养(菌丝培养工序)。其后，较好的是，从营养菌丝形成孢子。
为充分形成营养菌丝，较好的是，在菌丝培养工序之前，预先对仅含有菌体(斋藤曲霉)的培养基进行振荡培养(预培养工序)。在进行预培养工序之时，由于避免了由有机溶剂进行的斋藤曲霉的培养的初期阶段(增殖初期阶段)的生长阻碍，因此，提高了橙皮苷的微生物变换效率。预培养工序理想地应进行至斋藤曲霉的营养菌丝占培养液表面的1/2程度为止。
在菌丝培养工序中，在含有橙皮苷的培养基中对斋藤曲霉进行振荡培养。藉由该振荡培养，使斋藤曲霉在需氧条件下进行微生物变换。具体地说，在菌丝培养工序中，营养菌丝通过切断橙皮苷中的橙皮素和芸香糖的结合键(链)而有效地进行生成橙皮素的糖苷酶反应。振荡培养的振荡速度理想地应在50～200rpm/分钟的范围。如振荡速度不到50rpm/分钟，则由于无法使含有斋藤曲霉的培养基整体维持处于充分的需氧条件，因而菌丝繁殖不充分。反之，如振荡速度超过200rpm/分钟，则由于培养基的摇动过于激烈，无法充分形成菌丝。
培养基中的橙皮苷的添加量也可超过所述溶解界限。超过溶解界限添加的橙皮苷在添加时并不溶解于培养基中。然而，通过振荡的搅拌作用，橙皮苷被适度溶解于培养基中，并利用于微生物发酵。此时，理想地，应以50rpm/分钟程度进行振荡至橙皮苷消失，使得橙皮苷难于沉淀至培养容器底部。其结果，生成更多的橙皮素。
孢子形成工序是在培养基中生成足够量的橙皮素后进行。在孢子形成工序中，不更换菌丝培养工序后的培养基，对斋藤曲霉进行静置培养或振荡培养。藉由孢子形成工序，使得斋藤曲霉的营养菌一边形成孢子，一边进行微生物变换。
在菌丝培养工序结束时期，斋藤曲霉的营养菌丝密集于培养基的表面(液面)。对此可由目视确认。从而，以培养基表面的营养菌丝密度为指标，可决定何时从菌丝培养工序向孢子形成工序进行切换。
在孢子形成工序中，斋藤曲霉的营养菌丝在一边进行孢子形成的同时，一边进行在橙皮素的8位上附加羟基的羟基化酶反应。由此，可以极大效率地生成8-羟基橙皮素。8-羟基橙皮素的生成反应在培养容器内的孢子形成工序的中期至后期最有效地进行。另一方面，在孢子形成结束的阶段，其生成效率较低。为此，为在短时间内高效地获得8-羟基橙皮素，理想地应在培养容器的液面整体为孢子所完全覆盖之前停止培养，提取出生成的8-羟基橙皮素。
在孢子形成工序中，在进行静置培养时，通过振荡之类的物理刺激可避免对孢子形成的抑制。又，在静置培养时，为增大培养基表面积对培养基体积的比例(表面积比)，理想地应使用底面积大的容器制作较薄(浅)的培养基。如果利用较薄的培养基，则由于可以保持整个培养基处于需氧条件下，因而可以使斋藤曲霉的活动活跃，微生物变换效率提高。
另一方面，在孢子形成工序中进行振荡培养时，由于无关于培养基的表面积比可容易地保持处于需氧条件下，因此可以藉由一次操作获得较大量的8-羟基橙皮素。
8-羟基橙皮素从培养液上清液，或从孢子形成工序后的培养基中提取后，提纯得到。例如，以不至于破坏斋藤曲霉细胞膜程度的速度(约3000rpm)对培养基作离心分离，得到上清液成分。上清液成分由使用十八烷基化学结合型硅(ODS)柱的反相液相色谱法提纯。
离心分离后的沉淀成分中因含有较多的8-羟基橙皮素，所以，也可从沉淀成分中提取出8-羟基橙皮素。例如，对沉淀成分添加甲醇或乙醇等的有机溶剂，充分洗净沉淀成分，同时，从有机溶剂中提取出8-羟基橙皮素。提纯的8-羟基橙皮素可藉由反相液相色谱法，从提取液中得到。
利用本实施形态，可以获得以下的优点。
该类黄酮化合物即本发明一实施形态的8-羟基橙皮素具有在橙皮素的8位上附加羟基的新颖的结构。8-羟基橙皮素与橙皮苷及橙皮素相比，能发挥显著高的抗氧化作用。从而，由于8-羟基橙皮素在活体内可消去活性氧而抑制过氧化类脂的生成，因此，对起因于氧化应激反应的癌症、动脉硬化、糖尿病及其合并症之类由生活习惯不良导致的疾病具有有效的预防作用。
本发明一实施形态的类黄酮化合物(8-羟基橙皮素)可藉由利用斋藤曲霉的微生物处理从橙皮苷制得。更具体地，橙皮苷在斋藤曲霉作用下微生物变换为具有增强的抗氧化性能的类黄酮化合物。由此，8-羟基橙皮素的制造比较容易。
本发明一实施形态的类黄酮化合物(8-羟基橙皮素)的原料为含于柑橘类中的天然成分，即橙皮苷。橙皮苷可由烧酒之类酒类酿造中所利用的斋藤曲霉作微生物处理。因此，类黄酮化合物可几乎没有问题地被人体所吸收。
新颖的类黄酮化合物(8-羟基橙皮素)在斋藤曲霉作用下通过橙皮苷的微生物发酵处理制得。因此，根据本发明一实施形态的类黄酮化合物的制造方法，可以扩大橙皮苷的利用范围。
根据本发明一实施形态的类黄酮化合物的制造方法，可利用微生物极为容易地制得该新颖的类黄酮化合物。
根据本发明一实施形态的制造方法，在将含有橙皮苷和斋藤曲霉的培养基作振荡培养之后，可以进行孢子形成工序。因此，8-羟基橙皮素可以一个极为简单的操作工序极为高效地制得。
在菌丝培养工序之前进行预培养工序的场合，由于可避免在斋藤曲霉培养初期的生长阻碍，因此橙皮苷的微生物变换效率提高。
实施例以下，关于对上述实施形态具体化后的实施例及比较例进行说明。
「橙皮苷变换物的制造方法」利用从财团法人应用微生物学研究奖励会(IAM)进行次培养得到的斋藤曲霉菌株(IAMNo.2210)，配制斋藤曲霉的孢子悬浮液，使斋藤曲霉的孢子浓度达到2×108个/mL以上。将马铃薯葡萄糖肉汤培养基(DIFCO公司制)各100mL分别装入多个三角烧瓶(容积500mL)中。烧瓶置于高压灭菌器中，在121℃下维持15分钟，进行培养基的灭菌。冷却后，在各个烧瓶中接种孢子悬浮液1.0mL。在30℃的恒温室(与大气同样的需氧条件)内，以100rpm/分钟进行振荡培养，培育成营养菌丝体。
持续10天进行振荡培养，充分生成营养菌丝。将橙皮苷(SIGMA公司制)溶解于DMSO中，配制得10重量％的橙皮苷稀释液，接着用高压灭菌器杀菌(105℃，5分钟)。各烧瓶分别加入5mL的橙皮苷液。为从营养菌丝形成孢子，继续在相同需氧条件下进行振荡培养。监视孢子形成的经时变化，结果发现投入橙皮苷约1周后，开始形成孢子，3周后，培养基的整个液面为孢子所覆盖。
在被认为是孢子形成的中期至后期的时期，具体地，在孢子形成完全结束之前，且自投入橙皮苷起经过2周后，从各个烧瓶采取试样培养液。采取的试样培养液进行离心分离(3000rpm，15分钟)，沉淀出杂质。由高速液相色谱法(HPLC)分析上清液，调查类黄酮的组份变化。HPLC装置使用型号LC10A(岛津制作所制)，色谱柱使用ODS柱A303(YMC公司制)。其结果，橙皮苷变换物占整个类黄酮组合物的比例(峰值面积比)约为8.3％。
在HPLC分析后剩余的试样中，蒸发浓缩含有橙皮苷变换物的试样。浓缩的试样由分离用的HPLC(HPLC装置利用LC8A(岛津制作所制)，色谱柱使用ODS柱353-151A，SH343-5(YMC公司制))进行分级分离，分离、提纯橙皮苷变换物。
「结构确定」以下，就精制的橙皮苷变换物的结构确定作一说明。
测定橙皮苷变换物的1H NMR、13C NMR及FAB-MS光谱。测定NMR时，使用溶解于DMSO-d6的四甲基硅烷(TMS)作为内部标准。NMR装置使用JNM-EX-400(JEOL公司制)(1H NMR时为400MHz，13C NMR时为100MHz)。FAB-MS测定装置使用MNS-DX-705L(JEOL公司制)。测定结果示于表1及表2。根据对测定结果的分析，橙皮苷变换物为具有化学式1结构的8-羟基橙皮素。
表1
表2
「抗氧化活性的测定-1」就橙皮苷(HE)及分离的8-羟基橙皮素(8OH-HE)，测得在亲水性溶剂中的抗氧化活性。又，抗氧化活性是按照Yamaguchi等人在Biosci.Biotechno1.Biochem.，62，1201-1204，1998上所记载的游离基捕集能测定方法进行测定的。
具体地，首先，将8OH-HE或HE溶解于乙醇中，藉此配制得到0.1μM、1μM、及10μM浓度的8OH-HE试样溶液及HE试样溶液。将各试样溶液200μL混合于0.1M的三盐酸缓冲液(pH7.4)800μL中。各混合液中加入500μM的DPPH(1，1-二苯基-2-苦基偕腙肼(picrylhydrazyl))的乙醇溶液1mL，配制反应液。反应液充分混合后，在室温下在暗处反应20分钟。
其次，使用微量注射器将各反应液20μL注入分析用的HPLC(LC-10A)中以分析DPPH浓度。DPPH的浓度从DPPH的峰值面积算出。又，HPLC分析中使用内径4.6mm、长度为150mm的柱(YMC公司制的TSKgel Octyl-8OTS)。溶出溶剂为蒸馏水/甲醇＝30/70，流速为1mL/分钟，检出波长为517nm。
作为对照，使用仅含乙醇的溶液200μL，以取代上述试样溶液。同样，由HPLC分析，测得对照的DPPH的峰值面积。根据式1所示的计算式求得8OH-HE及HE的游离基捕集能(％)。
游离基捕集能＝100-试样的DPPH峰值面积/对照DPPH峰值面积×100 …(1)又，游离基捕集能的数字越高，其抗氧化性能越强。结果示于图1。由图1的结果可以明白，由发酵处理从HF生成的8OH-HE在亲水性溶剂中可以发挥显著高于HE的抗氧化活性。
「抗氧化活性的测定-2」就橙皮苷(HE)、分离的8-羟基橙皮素(8-OH-HE)及作为具有较高抗氧化活性的化合物已知的α-生育酚(Toc)，测得其在疏水性溶剂中的抗氧化活性。又，抗氧化活性是按照Tetrao J等人在Lipids，21(4)，255-260，1986上所记载的、使用亚油酸甲酯的HPLC分析方法进行测定的。
具体地，首先将8OH-HE、HE或Toc溶解于乙醇中，藉此配制得到具有100μM浓度的8OH-HE试样溶液、HE试样溶液及Toc试样溶液。在内径14mm的3根小型试管中分别精确称得亚油酸甲酯89mg(100μL)。3根试管中分别加入试样溶液100μL，充分混合，配制得到混合液。
其次，将各试管收容于用真空泵减压的减压干燥器中，由此，将溶剂从各混合液中完全除去，干燥。各个试管静置于40℃下的暗处18小时。其后，各试管中加入0.08％的BHT(丁基羟基甲苯)。计算出由亚油酸甲酯生成的13-氢过氧化物和9-氢过氧化物的HPLC峰值面积的总和。
再有，作为对照，仅使用乙醇溶液100μL，取代上述试样溶液，进行HPLC分析。测定对照的HPLC的峰值面积总和。各试样的类脂过氧化度(％)由式2求得。类脂过氧化度的数值越低，显示抗氧化活性越高。其结果示于图2。
类脂过氧化度＝试样的峰值面积/对照的合计峰值面积×100 …(2)由图2所示结果可知，藉由发酵处理从HE生成的8OH-HE在疏水性溶剂中可以发挥显著高于HE的抗氧化活性，可以发挥几乎同等于α-生育酚的抗氧化活性。
产业上的可利用性根据本发明，提高一种类黄酮化合物及其制造方法，上述类黄酮化合物在亲水性及疏水性溶剂中具有较高的抗氧化活性。根据该方法，可从橙皮苷中制得比橙皮苷更有效地被活体内吸收的新颖的类黄酮化合物。由于含有该类黄酮化合物的组合物发挥了抗氧化活性，因此，比如可利用于营养食品，从而扩大了橙皮苷的利用范围。
权利要求
1.一种具有如下述化学式1所示结构的类黄酮化合物。 …(化学式1)
2.如权利要求1所述的类黄酮化合物，其特征在于，所述类黄酮化合物具有抗氧化性。
3.如权利要求1或2所述的类黄酮化合物，其特征在于，所述类黄酮化合物通过使用斋藤曲霉对橙皮苷进行微生物发酵处理制得。
4.一种具有如下述化学式1所示结构的类黄酮化合物的制造方法， …(化学式1)其特征在于，所述制造方法包括下述工序为使橙皮苷生成类黄酮化合物，用斋藤曲霉使橙皮苷作微生物发酵。
5.如权利要求4所述的类黄酮化合物的制造方法，其特征在于，所述微生物发酵工序包括用于培养含有橙皮苷和斋藤曲霉的培养基，通过使斋藤曲霉的营养菌丝成长，使所述橙皮苷进行微生物变换形成橙皮素的菌丝培养工序，和通过使得从所述斋藤曲霉的营养菌丝形成孢子，由所述橙皮素进行微生物变换生成类黄酮化合物的孢子形成工序。
6.如权利要求5所述的类黄酮化合物的制造方法，其特征在于，所述类黄酮化合物的制造方法还包括在进行上述菌丝培养工序之前，进行将含有斋藤曲霉的培养基作振荡培养的预培养工序。
7.如权利要求4至6的任一项所述的类黄酮化合物的制造方法，其特征在于，所述培养基含有0.01～5容量％的二甲基亚砜。
8.如权利要求4至6的任一项所述的类黄酮化合物的制造方法，其特征在于，所述制造方法还包括在上述发酵工序之后，籍由使用ODS柱的反相液相色谱法提纯所述类黄酮化合物的工序。
9.一种组合物，所述组合物含有具有如下述化学式1所示结构的抗氧化性类黄酮化合物。 …(化学式1)
10.一种具有如下述化学式1所示结构的抗氧化性类黄酮化合物的制造方法， …(化学式1)其特征在于，所述制造方法包括下述工序配制斋藤曲霉的孢子悬浮液的工序；将上述孢子悬浮液接种于经灭菌的培养液的工序；将上述培养液在需氧条件下进行振荡培养，使所述斋藤曲霉的营养菌丝成长的工序；将含有橙皮苷的二甲基亚砜液添加于所述培养液的工序；为了在上述斋藤曲霉中使所述橙皮苷作微生物变换为所述类黄酮化合物，将所述培养液在需氧条件下作振荡培养，从所述营养菌丝形成孢子的工序；从所述培养液的上清液收集所述类黄酮化合物的工序。
11.如权利要求10所述的类黄酮化合物的制造方法，其特征在于，添加所述二甲基亚砜，使其在所述培养基中的浓度在0.01～5容量％。
12.如权利要求10所述的类黄酮化合物的制造方法，其特征在于，所述收集工序包括籍由使用ODS柱的反相液相色谱法，从所述上清液中提纯所述类黄酮化合物的工序。
全文摘要
本发明提供一种具有高抗氧化作用的新颖的类黄酮化合物的制造方法。所述类黄酮化合物通过使用斋藤曲霉对橙皮苷进行微生物发酵处理制得。
文档编号A61P37/08GK1496407SQ0280618
公开日2004年5月12日 申请日期2002年3月14日 优先权日2001年3月15日
发明者大泽俊彦, 凑健一郎, 郎, 三宅义明, 明 申请人:科学技术振兴事业集团, 名古屋大学校长代表的日本国, 百佳株式会社