专利名称：使用抗血管生成剂和TNFα的联合疗法的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于肿瘤和肿瘤转移治疗的联合疗法，此疗法包括施用抗血管生成剂和肿瘤坏死因子α(TNFα)或具有TNFα生物活性的分子，以及任选地与其它细胞毒性剂如干扰素γ(IFNγ)或化疗剂如顺氯氨铂、或ErbB受体抑制剂如抗EGFR抗体一起联合使用。本方法和含有所述药剂的药物组合物可协同地增加各单个治疗剂对肿瘤细胞增殖的抑制效果，得到比单组份单独使用时更有效的治疗效果。
背景技术：
血管生成也称作新血管发生，它是涉及到新生血管向组织内生长的组织血管化过程。这个过程由内皮细胞和平滑肌细胞的浸润介导。这个过程据信可以按照下面3个路径中的任何一个进行(1)从已经存在的血管中分生出血管；(2)由前体细胞开始血管的从头发育(血管发生)；或(3)已经存在的小血管扩增直径(Blood等，1990，Bioch.Biophys.Acta 1032，89)。已知血管内皮细胞至少含有5种RGD依赖性整合蛋白，其中包括玻连蛋白受体(αvβ3或αvβ5)、胶原蛋白I型和IV型受体、层粘连蛋白受体、纤连蛋白/层粘连蛋白/胶原蛋白受体和纤连蛋白受体(Davis等，1993，J.cell.Biochem.51，206)。已知平滑肌细胞含有至少6种RGD依赖性整合蛋白，其中包括有αvβ3和αvβ5。
虽然血管生成是新生期生长中的一个重要过程，但它在伤口愈合和大量临床重要疾病—包括组织炎症，关节炎，牛皮癣，癌症，糖尿病，视网膜病，黄斑变性和其它新血管眼病的病理中同样重要。这些伴有血管生成的临床病症称为生血管疾病(Folkman等，1987，Science 235，442)。
利用免疫特异性针对各种整合蛋白α或β亚基的单克隆抗体在体外抑制细胞粘连，提示玻连蛋白受体αvβ3参与了多种细胞类型(包括微血管上皮细胞)的细胞粘附(Davis等，1993，J.Cell.Biol.51，206)。
整合蛋白是一类细胞受体，已知这种细胞受体和细胞外基质蛋白结合，并介导细胞-细胞和细胞-细胞外基质间的相互作用，一般这种相互作用被称为细胞粘附事件。整合蛋白受体构成一个蛋白质家族，其共同结构特征是由α亚基和β亚基构成的非共价异二聚体糖蛋白复合物。玻连蛋白受体因其最初被发现的特征是它优先和玻连蛋白结合而得名。现已知玻连蛋白受体代表3种不同的整合蛋白，分别命名为αvβ1，αvβ3和αvβ5。αvβ1与纤连蛋白以及玻连蛋白结合。αvβ3与种类众多的配体结合，其中包括纤维蛋白，纤维蛋白原，层粘连蛋白，血小板反应蛋白，玻连蛋白和冯·维勒布兰德因子。αvβ5和玻连蛋白结合。很明显，有些不同的整合蛋白有不同的生物学功能，但是有些不同的整合蛋白和亚基却有共同的生物学特异性。对于很多整合蛋白，配体中的一个重要的识别位点是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)三肽序列。RGD在上述所有鉴定到的玻连蛋白受体整合蛋白的配体中都存在。
此RGD识别位点可以用含有RGD序列的线性和环形(多)肽模拟。已知这些RGD肽分别是整合蛋白功能的抑制剂或拮抗剂。然而，很重要的是应当注意到随RGD肽的序列和结构的不同，抑制的特异性可发生改变而靶向特异的整合蛋白。已描述过许多有不同整合蛋白特异性的RGD多肽，见比如，Cheresh，等，1989，Cell 58，945，Aumailley等，1991，FEBS Letts.291，50，以及数目众多的专利申请和专利(如美国专利4,517,686、4,578,079、4,589,881、4,614,517、4,661,111、4,792,525；EP 0770 622)。
新血管发生或血管生成在恶性疾病的发展中起关键作用，并已在血管生成抑制剂研发上引起了极大的兴趣。(实例可参见Holmgren等，1995，Nature Medicine 1，149；Folkman，1995，Nature Medicine 1，27；O′Reilly等，1994，Cell 79，315)。已知用αvβ3整合蛋白拮抗剂抑制血管生成可以用于通过减少对实体肿瘤的血液供给而抑制实体肿瘤生长的方法中(实例可参见US 5,753,230以及US 5,766,591，其中描述了可与αvβ3受体结合并抑制血管生成的αvβ3拮抗剂-如αvβ3的合成多肽，单克隆抗体和模拟物-的使用)。在WO 97/45447中公开了用玻连蛋白受体αvβ5的拮抗剂抑制αvβ5介导的组织血管生成的方法和组合物。
血管生成的特征是内皮细胞的浸润、迁移和增殖，这些过程依赖于细胞与细胞外基质成分之间的相互作用。从这一点上讲，整合蛋白细胞-基质受体介导了细胞扩散和迁移。整合蛋白αvβ3的内皮粘附受体因为给抗血管生成治疗策略提供了脉管系统特异性的靶子而成为重要角色(Brooks等，1994，Science 264，569；Friedlander et.al.，1995，Science 270)。已经通过几个体内模型证明了在血管生成中需要血管整合蛋白αvβ3，所述模型中移植的人肿瘤的新血管发生完全被全身施用上面所述的整合蛋白αvβ3和αvβ5的肽拮抗剂或作为备选方案的抗αvβ3抗体LM609(Brooks等，1994，Cell 79，1157；ATCC HB 9537)所抑制。此抗体可阻断αvβ3整合蛋白受体被其天然配体激活(此激活作用可以抑制增生的生血管血管细胞的细胞凋亡)并由此破坏新生成血管的成熟(这是肿瘤增殖中的必要事件)。然而，据最近的报道，黑素瘤细胞即使在没有内皮细胞的情况下也能形成网状结构的血管(Barinaga，1999，Science 285，1475)，这暗示肿瘤可能能绕过一些只有在有内皮组织存在的情况下才有效的抗血管生成药物。
很多分子，包括VEGF，Ang1和bFGF，都能刺激内皮细胞的增殖、迁移和组装，它们是极其重要的存活因子。VEGF(血管内皮生长因子)经鉴定是一种选择性的生血管生长因子，它可以刺激内皮细胞的有丝分裂。特别是，VEGF被认为是原发性肿瘤和眼睛局部缺血疾病中血管生成的一个主要的介质。VEGF是同二聚体(分子量46,000)，它是一种内皮细胞特异性生血管因子(Ferrara等，1992，Endocrin.Rev.，13，18)和血管渗透因子(Senger等，1986，Cancer Res.，465629)，它与有酪氨酸激酶活性的高亲和性膜结合受体结合(Jakeman等，1992，J.Clin.Invest.，89，244)。人肿瘤的活体组织检查显示，恶性细胞中的VEGF mRNA和邻近的内皮细胞中的VEGF受体mRNA表达增强。VEGF的表达似乎在邻近血管坏死区域的肿瘤部位最高。(综述参见Thomas等，1996，J.Biol.Chem271(2)，603；Folkman，1995，Nature Medicine 1，27)。WO 97/45447中提示，αvβ5整合蛋参与了尤其是由VEGF、EGF和TGF-α诱导的新血管生成，并公开了αvβ5拮抗剂可抑制VEGF促进的血管生成。有效的抗肿瘤疗法也可通过单克隆抗体靶向VEGF受体来抑制血管生成(Witte等，1998，Cancer Metastasis Rev.17(2)，155)。已知单抗DC-101可用于抑制肿瘤细胞的血管生成。
酪氨酸激酶是一类酶，它催化腺苷三磷酸的末端磷酸向蛋白质底物中的酪氨酸残基转移。据信通过酪氨酸激酶的底物磷酸化，酪氨酸激酶在许多细胞功能的信号传导中起关键作用。虽然信号传导的确切机理仍不清楚，但是酪氨酸激酶在细胞增殖，癌发生和细胞分化中显示出是重要的起作用因子。
酪氨酸激酶可分为受体型和非受体型。受体型和非受体型两种酪氨酸激酶都参与细胞信号途径，这些途径可导致许多病理状况，包括癌症，牛皮癣和超免疫反应。许多酪氨酸激酶既参与细胞生长也参与血管生成。
受体型酪氨酸激酶包括细胞外，跨膜和细胞内部分，而非受体型酪氨酸激酶完全是细胞内的。受体连接的酪氨酸激酶是跨膜蛋白，它包含细胞外配体结合域，跨膜序列，以及胞质酪氨酸激酶功能域。受体型酪氨酸激酶由大量具有不同生物活性的跨膜受体组成。事实上，已经鉴定出了不同亚家族的受体型酪氨酸激酶。涉及的酪氨酸激酶包括成纤维细胞生长因子(FGF)受体，ErbB主要类型家族中的表皮生长因子(EGF)受体和血小板衍生生长因子(PDGF)受体。还涉及神经生长因子(NGF)受体，脑衍生的神经营养因子(BDNF)受体，以及神经营养蛋白-3(NT-3)受体和神经营养蛋白-4(NT-4)受体。
一个受体型酪氨酸激酶亚家族，被命名为HER或ErbB亚家族，由EGFR(ErbB1)，HER2(ErbB2或p185neu)，HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4或tyro2)组成。此亚家族受体的配体包括表皮生长因子(EGF)，TGF-a，双调蛋白(amphiregulin)，HB-EGF，β-细胞调节素(betacellulin)和heregulin。PDGF亚家族包括由激酶插入域受体(KDR)组成的FLK家族。
EGFR，由erbB1基因编码，它与人类恶性肿瘤因果相关。特别是，在乳腺，膀胱，肺，头，颈和胃部癌症以及成胶质细胞瘤中已经观察到EGFR的表达增强。EGFR受体表达的增强通常伴随有同一肿瘤细胞中EGFR配体-即转化生长因子α(TGF-α)的产生增加，从而经自分泌刺激途径引起受体激活(Baselga和Mendelsohn，Pharmac.Ther.64127-154(1994))。EGF是一种分子量为170,000的跨膜糖蛋白，并发现它存在于许多上皮细胞类型上。它可以被至少三种配体-EGF，TGF-α(转化生长因子α)和双调蛋白激活。经证明表皮生长因子(EGF)和转化生长因子α(TGF-α)都能与EGF受体结合进而引起细胞增殖和肿瘤生长。这些生长因子不能与HER2结合(Ulrich and Schlesinger，1990，Cell 61，203)。与借助自身二聚化性质诱导受体二聚化的几个生长因子家族(如PDGF)不同，单体生长因子如EGF具有2个受体结合位点，因此，它可以交联两个邻近的EGF受体(Lemmon等，1997，EMBO J.16，281)。受体二聚化对激活生长因子受体的内在催化活性以及对生长因子受体的自磷酸化是必需的。应当指出的是受体蛋白酪氨酸激酶(PTK)既能进行同二聚化，也能进行异二聚化。
已经证明抗EGF受体的抗体在阻断EGF和TGF-α与受体结合的时候，显示出对肿瘤细胞增殖的抑制。考虑到这些发现，已经研制出很多小鼠和大鼠单克隆抗EGF受体抗体，并在体内和体外检测了它们对肿瘤细胞生长进行抑制的能力(Modjtahedi和Dean，1994，J.Oncology 4，277)。人源化单克隆抗体425(hMAb 425，US 5,558,864；EP 0531 472)和嵌合型单克隆抗体225(cMAb 225，US 4,943,533和EP 0359282)都是针对EGF受体的，而且在临床试验中均显示有效。已经证明C225抗体可在体外抑制由EGF介导的肿瘤细胞生长，以及在裸鼠体内抑制人肿瘤的形成。而且，最重要的是，该抗体在异种移植小鼠模型中还显示出可与某些化疗剂(即阿霉素(doxorubicin，adriamycin)，紫杉醇和顺氯氨铂)协同作用根除人肿瘤。Ye等(1999，Oncogene 18，731)报道通过联合应用cMAb225和针对HER2受体的人源化MAb 4D5对人卵巢癌细胞进行了成功地治疗。
ErbB家族的第二个成员-HER2(ErbB2或p185neu)，它最初被鉴定为来自经化学处理的大鼠的成神经细胞瘤的转化基因产物。neu原癌基因的激活形式是由编码蛋白的跨膜区中的点突变(缬氨酸变成谷氨酸)产生的。可在乳腺和卵巢癌症中观察到neu人同系物的扩增，其与预后不良有关(Slamon等，Science，235177-182(1987)；Slamon等，Science，244707-712(1989)；US 4,968,603)。ErbB2(HER2)的分子量为大约185,000，虽然至今对HER2的特异性配体尚未明确确定，但ErbB2(HER2)与EGF受体(HER1)有相当高的同源性。
进一步发现针对HER2受体的抗体4D5使过表达ErbB2的乳腺肿瘤细胞系对TNFα的细胞毒性效应敏感(US 5,677,171)。鼠抗-ErbB2抗体4D5的人源化重组体(huMAb4D5-8，rhuMAb HER2或HERCEPTIN；US 5,821,337)在已进行过大量抗癌前期治疗的患有ErbB2-过表达转移性乳腺癌的患者中具有临床活性(Baselga等，J.Clin.Oncol.14737-744(1996))。HERCEPTIN在1988年被正式批准上市用于治疗患有转移性乳腺癌—即肿瘤过表达ErbB2蛋白—的患者。
TNFα属于一个分子大家族，此家族包括重要的细胞因子如Fas配体，CD40配体，TRAIL，淋巴毒素等(Locksley等，2001，Cell 104487-501)。TNFα除了可以从多种细胞中释放，还可以以细胞膜结合的高分子量形式存在于细胞上，并且此形式还似乎可介导多种生物效应。TNFα据认为在正常发育和生理学中几乎不起作用；然而，在多种疾病状态下它对许多组织有害并具有破坏作用(Tracey等，Ann.Rev.Med 1994；45491)。TNFα显示能在其中发挥主要作用的疾病包括脓毒性休克综合征，癌性恶病质，类风湿性关节炎等。
人TNFα在1985年被首次纯化出来(参见Aggarwal等，J Biol.Chem.1985，260，2345-2354)。之后不久，完成了TNF cDNA的分子克隆和人TNF的基因座克隆(Pennica等，Nature 1984，312，124-729；Wang等，Nature 1985，313，803-806)。TNFα是一个可三聚化的17KDa多肽，主要由巨噬细胞产生。此肽链最初表达为26Kda的跨膜蛋白，经蛋白酶剪切从中断裂和释放出17Kda亚基。TNFα一般可由各种细胞产生，举例来说，有激活的巨噬细胞和成纤维细胞。据报道TNFα可以诱导多种不同的因子。TNFα据报道还直接或间接地参与到不同的疾病中，如传染性疾病，自身免疫疾病-如系统性红斑狼疮(SLE)和关节炎，AIDS，败血病，以及一些传染病。
TNFα和炎症反应传染病和组织损伤可以引起一系列生化变化，进而触发免疫系统复杂反应的发作，这统称为炎症反应。此反应的进展，至少部分地，基于局部血管扩张或血管通透性的增加和血管内皮的活化，这就使白细胞能高效循环并迁移到达受损位点，从而增加了白细胞和任意抗原结合并破坏抗原的机会。然后血管内皮据认为被激活或发炎。通常，发炎对多种意外刺激来说是一种良性的免疫反应，并且它发作快且持续时间短(急性发炎)。然而，发炎的持续的或不受控制的活性(慢性发炎)对身体有害，并成为几种免疫疾病-如脓毒性休克，类风湿性关节炎，炎性肠病，充血性心力衰竭的发病机理(参见“细胞因子和细胞因子受体”(Cytokines and cytokine receptors)中的“TNF和TNF受体超家族”，Bona和Revillard(Eds.)，Harvard Academic Publishers，Amsterdam 2000，118-148页)。
TNFα以及许多其它细胞因子在炎症反应启动后不久由巨噬细胞分泌，并引起凝血，增加血管渗透性并激活粘附分子在血管内皮细胞上的表达。
对宿主来说，TNFα既不是完全有益的也不是完全破坏性的。因此，TNFα是内皮细胞功能的有力调节器。在不同血管背景下，TNFα通过诱导内皮细胞活化和存活促使发炎，或者通过诱导内皮细胞的凋亡和血管破坏引起组织坏死(Pober，J.S.，Pathol Biol(Paris)46，159-163.(1998)；Aggarwal，& Natarajan，Eur.Cytokine Netw.7，93-124(1996))。虽然已经对介导这两种相异反应的许多细胞内信号途径进行了表征(Wallach等，Annual Review of Immunology 17，331-367(1999))，但是对决定接触TNFα的内皮细胞是否存亡的细胞外信号尚不了解。
更确切地说，保持TNFα合成和调节的平衡可以确保宿主能够有效地与入侵的微生物进行反应，而且在此反应中不会危及宿主的健康。TNFα作为炎症的介质，通过加强适当的免疫反应来协助机体对抗细菌感染和组织损伤。然而，过量产生的TNFα却导致慢性炎症，这对机体有害并在几种疾病的发病机理中起主要作用。
IFNγ是TNFα的有效增强剂(Dealtry等，Eur J Immunol 17，689-693，(1987))。在TNFα引起细胞凋亡的情况下，NF-κB(一种促使细胞存活的转录因子)的激活可以抑制TNFα诱导的细胞凋亡(Van Antwerp等，Science 274，787-789(1996))。
TNFα可引发各种各样的细胞信号，不仅导致细胞反应如增殖，激活，分化而且可导致程序化细胞凋亡。针对TNFα的细胞信号可分为早期反应(如激酶，磷酸酯酶，脂肪酶，蛋白酶和转录因子的激活)和晚期反应，以及因此更间接的反应(如干扰线粒体中的电子传递链，自由基产生，氧化物产生以及各种底物的释放)。许多早期细胞反应-如募集含死亡结构域的衔接蛋白，NFκB的激活或caspase激活，也可以通过TNF配体家族的其它成员与其各自受体的结合而被启动。因此，诸如淋巴毒素，Fas配体或TRAIL等分子能够与TNF具有重复作用(Grell和Clauss上述引文)。
整合蛋白介导的对细胞外基质(ECM)的粘附对于包括内皮细胞在内的大多数细胞的生存是必需的。例如，血管整合蛋白aVβ3促进生血管内皮细胞的增殖和存活而aVβ3拮抗剂诱导生血管内皮细胞的凋亡并抑制血管生成(Brooks等，Cell 79，1157-1164(1994)。已经鉴定了几个与整合蛋白-介导的细胞存活相关的生化事件，包括PI 3-K/AKT(Khwaja等，EmboJoumal 16，2783-2793(1997))和NF-κB(Scatena等，J Cell Biol 141，1083-1093(1998))信号途径的激活。除整合蛋白之外，细胞-细胞粘附分子PECAM-1和VE钙粘着蛋白也促进内皮细胞存活(Bird等J Cell Sci112，1989-1997(1999)；Carmeliet等Cell 98，147-157(1999))。
虽然TNF对某些肿瘤细胞系是有细胞毒性的，但是大多数肿瘤细胞在生长中几乎不受TNF的影响。因此TNF在某些动物模型中表现的抗肿瘤作用(Balkwill等，Cancer Res.463990-3993(1986))不可能是由于该细胞因子对肿瘤细胞的直接作用而引起的。一些研究显示宿主介导的机制参与了TNF引发的肿瘤消退(Manda等，Cancer Res.473707-3711(1987))。累积的数据指出由TNF引起的肿瘤出血性坏死是在肿瘤内血管的内皮细胞水平上发起的(Havell等，J.Exp.Med.1671967-1985(1988)).。
癌症患者的临床TNF研究结果基本上来说是令人失望的(参见综述Haranaka，J.Biol.Response Mod.7525-534(1988))。通常，TNF的抗肿瘤作用受到大量副作用的限制。减少TNF的副作用的一个方法是制备表现出TNF1型受体特异性活性或具有不同的药物动力学性质的TNF突变体(Brouckaert等，Circ.Shock 43185-190(1994)；Eggermont，AnticancerRes.183899-3905(1998)；Lucas等，Int.J.Cancer 15543-549(2001)).最近在四肢黑素瘤或肉瘤患者的治疗上已经取得了进展。利用分离灌注技术可以获得显著的有益疗效。将高达4mg的TNF极端剂量与细胞生长抑制剂或IFN结合施用(Lienard等，J.Clin.Oncol.1052-60(1992))。局部反应包括肿瘤的急性软化和发红并伴随有强烈的炎症反应，这类似于TNF在鼠系统中介导的抗肿瘤作用。
已证实，这种针对患有肢体转移性黑素瘤的患者的治疗方法可选择地破坏肿瘤的脉管系统而让静止的血管保持完整。此作用与TNF和IFNγ-诱导的体外内皮细胞中整合蛋白αVβ3的功能抑制及在体内诱导的内皮细胞凋亡有关(Ruegg et al，Nature Med 4，408-414(1998))。这些结果证实倘若系统性毒性能够得到控制，那么TNF与其它治疗药剂联合在临床上能够非常有效地治疗某些肿瘤。
本发明目前描述了有助于血管生成的分子(如整合蛋白)在调节TNFα活性的同时可以对TNFα作为抗肿瘤剂的临床应用有直接影响。抗血管生成药剂，优选整合蛋白拮抗剂与TNFα一起联合施用可以选择性地使带有血管生成受体的内皮细胞对TNF的细胞凋亡活性敏感，从而导致对肿瘤血管的破坏增强。因此，此联合疗法可有助于减少TNF剂量，避免TNF引起的全身副作用。
发明概述本发明首次描述这一肿瘤治疗新概念，即给个体施用阻断或抑制血管生成的药剂以及TNFα，TNF突变体或TNF样分子。本发明的组合物还可任选地包含其他有治疗活性的化合物，这些化合物优选选自细胞毒性剂、化疗剂和ErbB受体酪氨酸激酶家族的抑制剂或拮抗剂，如下文更详细描述的。因此，本发明涉及药物组合物，其以治疗有效量包含作为优选的抗血管生成剂的整合蛋白(受体)拮抗剂和TNFα、TNF突变体或TNF样分子。更特别地是，本发明涉及药物组合物，其包含线性或环状RGD肽和TNFα以及任选地IFNγ。本发明优选的组合物包含环肽—环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMe-Val)、TNFα和IFNγ。本发明所述的治疗活性剂也可以以包含如下包装的药物试剂盒的形式提供，此包装中包含独立包装的或在单独容器内的一种或多种抗血管生成剂、TNFα及任选地一种或多种细胞毒性剂/化疗剂/抗ErbB剂。
更具体地，本发明涉及这样的联合疗法，其包括分别地应用和施用两种或多种分子，其中至少一种分子具有血管生成抑制活性而另一种是TNFα。但是，本发明还涉及这样的联合疗法，其包括施用仅一种既有抗血管生成活性又有TNFα活性的(融合)分子，及任选地还施用一种或多种细胞毒性剂/化疗剂。例如，可以给患者施用主要由直接或通过连接分子与TNFα融合的环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMe-Val)组成的融合蛋白。另一个例子是通过Fc部分的C末端与TNFα融合的抗整合蛋白抗体，如下文所述的LM609。再例如，与TNFα融合的双特异性抗体，此抗体中一个特异性针对整合蛋白受体或VEGF受体而另一个针对EGF受体。
大抵上，此药物施用可与放射治疗伴随进行，其中放射治疗可与药物施用基本上同时，或在之前，或在之后进行。本发明联合疗法中的各种药剂的施用也可以基本上同时进行或相继进行。细胞表面上有参与肿瘤血管形成的受体的肿瘤可用本发明联合疗法成功地治疗。
已知肿瘤的发育和生长有多条可替换的路线。如果一条路线被阻断，则它们常能通过表达和使用其他受体和信号途径而转换到另一条路线上。因此，由于本发明的药物联合可以阻断几种这样的可能肿瘤发育策略，因而具有多种优点。本发明的联合可用于治疗和预防如下文详述的肿瘤、肿瘤样和瘤形成性疾病以及肿瘤转移。本发明的不同组合药剂优选以低剂量联合应用，即，低于常规的临床条件下使用的剂量。在给个体施用本发明的化合物、组合物、药剂和治疗的时候，降低剂量的优点包括降低了高剂量所带来的负反应的发生率。比如，通过降低化疗剂如氨甲蝶呤的剂量，和高剂量条件下观察到的效果相比，恶心和呕吐的频率和严重程度都得到降低。预期降低负反应发生率将能改善癌症患者的生活质量。降低负反应发生率的优点还包括改善患者的依顺性，降低因负反应产生的需要住院治疗的次数，减少在医治负反应带来的疼痛时所需止痛剂的使用。另外，本发明的方法和联合还能使高剂量时的治疗效果最大化。
本发明的联合治疗显示出令人惊异的协同效应。临床研究显示使用此药物联合可使肿瘤出现真实的萎缩和解体，同时没有可检测的明显的药物副作用。
具体的，本发明涉及·药物组合物，其包含治疗有效量的至少(i)一种抗血管生成剂和(ii)肿瘤坏死因子α(TNFα)或具有TNFα生物活性的分子，及任选地药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂；·相应的药物组合物，其中所述的抗血管生成剂是整合蛋白(受体)抑制剂/拮抗剂或VEGF(受体)抑制剂/拮抗剂；·相应的药物组合物，其中所述的整合蛋白受体抑制剂/拮抗剂是含RGD的线性或环状肽；·相应的药物组合物，其中所述的含RGD的肽是环-(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMe-Val)；·相应的药物组合物，其中所述的抗血管生成剂是可以与整合蛋白受体或VEGF受体结合的抗体或此抗体的免疫治疗活性片段；·相应的药物组合物，其中所述的抗血管生成剂和TNFα连接在一起形成一个融合分子；·相应的药物组合物，其还包含至少一种细胞毒性剂和/或化疗剂；·相应的药物组合物，其中所述的细胞毒性剂是干扰素γ(IFNγ)和/或另一有效的细胞因子；·相应的药物组合物，其中所述的化疗化合物选自顺氯氨铂、阿霉素、吉西他滨、多烯紫杉醇、紫杉醇、博来霉素；·相应的药物组合物，其还包含ErbB受体酪氨酸激酶家族的抑制剂或拮抗剂；·相应的药物组合物，其中所述的抑制剂是抗EGFR抗体，抗HER2抗体或它们的免疫活性片断；·药物试剂盒，其包含如下包装，该包装含有(i)至少一种抗血管生成剂，优选整合蛋白受体抑制剂/拮抗剂，(ii)TNFα以及任选地(iii)另外的细胞毒性剂和/或化疗剂；·相应的优选药物试剂盒，其包含(i)环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMe-Val)；(ii)TNFα和(iii)IFNγ以及任选地(iii)另外的细胞毒性剂和/或化疗剂和/或ErbB受体酪氨酸激酶家族的抑制剂或拮抗剂；·相应的药物试剂盒，其中所述药物活性剂在所述包装中于分开的单独容器中提供；·上文及权利要求书中定义的药物组合物在制备用于治疗肿瘤和肿瘤转移的药物或药物组合物中的用途；以及·治疗个体的肿瘤和肿瘤转移的方法，其包括同时或相继给所述个体施用上文定义的治疗有效的药物组合物；
发明详述本发明中使用的术语和短语，如果没有另行指明，则具有下面给定的含义和定义。而且，这些定义和含义更详细地描述了本发明，包括优选实施方案。
“生物分子”包括天然或合成分子，通常其分子量大于约300，并且优选是多聚-和寡聚糖类，寡肽和多肽，蛋白质，肽，多聚-和寡聚核苷酸以及它们的糖基化脂类衍生物。最典型地是，生物分子包括免疫治疗药剂，最重要的是抗体或抗体片断，或这些抗体或片断的功能性衍生物，包括融合蛋白。
“受体”或“受体分子”是指可溶的或膜结合/连结的蛋白或糖蛋白，其含有一个或多个可与配体结合以形成受体-配体复合物的结构域。通过与可能是激动剂或拮抗剂的配体结合，受体可以被激活或者失活，由此可以启动或阻断信号通路。
“配体”或“受体配体”是指这样的天然的或者合成的化合物，它可以和受体分子结合形成受体-配体复合物。术语配体包括激动剂、拮抗剂以及具有部分激动剂/拮抗剂活性的化合物。根据本发明的特定领域，本术语尤其包括TNF样配体。
此处的术语“TNFα”，如果没有特殊限制，包括所有种类的TNF分子和具有TNFα生物活性的分子，其中包括天然和合成的、肽或非-肽的TNF突变体，变体或TNF样配体。本术语优选表示天然TNFα肽。
“激动剂”或“受体激动剂”是指这样的天然的或者合成的化合物，它和受体结合形成受体-激动剂复合物，通过分别激活所述受体和受体-激动剂复合物而启动信号通路及进一步的生物学过程。
“拮抗剂”或“受体拮抗剂”是指和激动剂有相反的生物学效应的天然的或者合成的化合物。拮抗剂和受体结合，通过和激动剂竞争受体而阻断受体激动剂的作用。拮抗剂是根据它阻断激动剂的作用的能力来定义的。受体拮抗剂也可以是抗体或是其具有免疫治疗活性的片段。下面将举出并论述本发明优选的拮抗剂。
术语“治疗有效的”或“治疗有效量”指的是有效治疗哺乳动物的疾病或病症的药物量。对癌症而言，药物的治疗有效量可减少癌细胞的数量；降低肿瘤的大小；抑制(即，一定程度地减缓且最好终止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即，一定程度地减缓且最好终止)肿瘤的转移；在一定程度上抑制肿瘤的生长；和/或将癌症相关的一种或多种症状减轻到一定程度。如果药物可以阻止已存在癌细胞的生长而且/或杀死已存在的癌细胞，则该药物可能具有细胞抑制性和/或细胞毒性。对于癌症的治疗，疗效可以比如通过估计疾病进展时间(TTP)和/或测定反应率(RR)来确定。
术语“免疫治疗活性”指的是引起哺乳动物免疫反应的生物分子。更具体地，此术语指的是可以识别和结合抗原的分子。典型地，抗体、含有其抗原结合位点(互补决定区，CDRs)的抗体片断和抗体融合蛋白具有免疫治疗活性。
本申请中所用的术语“前体药物”指的是药物活性物质的前体或衍生物，同亲本药剂相比，它对肿瘤细胞的细胞毒性较小并且能够被酶促激活或转变成更具活性的亲本形式(实例参见“癌症化疗中的前体药物”，Biochemical Society Transactions，14，pp.375-382，615th Meeting Belfast(1986))。
“抗血管生成剂”指的是天然的或合成的化合物，它可在一定程度上阻断或干扰血管的发育。抗血管生成分子可以是，例如，和生血管生长因子或生长因子受体结合并将其阻断的生物分子。本处优选的抗血管生成分子可以与受体结合，优选与整合蛋白受体或与VEGF受体结合。本发明中此术语还包括所述抗血管生成剂的前体药物。
有很多结构和来源不同的分子都可以引起抗血管生成性质。本发明中适宜的血管生成抑制剂或阻断剂的大多数相关类型是，例如(i)抗有丝分裂剂，例如氟尿嘧啶，丝裂霉素C，紫杉醇；(ii)雌激素代谢物如2-甲氧基雌二醇；(iii)抑制锌金属蛋白酶的基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂(例如，betimastat，BB16，TIMPs，二甲胺四环素，GM6001，或在“基质金属蛋白酶的抑制治疗应用”中论及的那些(物质)(Golub，Annals of the New YorkAcademy of Science，Vol.878a；Greenwald，Zucker(Eds.)，1999)；(iv)抗血管生成的多功能药剂和因子，如IFNα(US 4,530,901；US4,503,035；5,231,176)；制管张素和纤溶酶原片段(例如kringle 1-4，kringle5，kringle 1-3(O′Reilly，M.S.等，Cell(Cambridge，Mass.)79(2)315-328，1994；Cao等，J.Biol.Chem.27129461-29467，1996；Cao等，J.BiolChem 27222924-22928，1997)；内皮生长抑素(endostatin)(O′Reilly，M.S.等，Cell 88(2)，277，1997和WO 97/15666)，血小板反应蛋白(TSP-1；Frazier，1991，Curr Opin Cell Biol 3(5)792)；血小板因子4(PF4)；(v)纤溶酶原激活物/尿激酶抑制剂；(vi)尿激酶受体拮抗剂；(vii)肝素酶；(viii)烟曲霉素类似物如TNP-470；(ix)酪氨酸激酶抑制剂如SUI 01(上面和下面提到的很多ErbB受体拮抗剂(EGFR/Her 2拮抗剂)也是酪氨酸激酶抑制剂，因此它们分别可以显示出抗EGF受体阻断活性从而导致肿瘤生长受抑制，及显示出抗血管生成的活性从而导致血管发育和内皮细胞发育受抑制)；(x)苏拉明和苏拉明类似物；(xi)制管张性(angiostatic)类固醇；(xii)VEGF和bFGF拮抗剂；(xiii)VEGF受体拮抗剂如抗VEGF受体抗体(DC-101)；(xiv)flk-1和flt-1拮抗剂；(xv)环加氧酶-II抑制剂如COX-II；(xvi)整合蛋白拮抗剂和整合蛋白受体拮抗剂如αv拮抗剂和αv受体拮抗剂，例如，抗αv受体抗体和RGD肽。本发明优选整合蛋白(受体)拮抗剂。
术语“整合蛋白拮抗剂/抑制剂”或“整合蛋白受体拮抗剂/抑制剂”指的是天然的或者合成的分子，它阻断并抑制整合蛋白受体。有时，此术语包括针对所述整合蛋白受体的配体(例如对于αvβ3玻连蛋白，纤维蛋白，纤维蛋白原，冯·维勒布兰德因子，血小板反应蛋白，层粘连蛋白；对于αvβ5玻连蛋白；对于αvβ1纤连蛋白和玻连蛋白；对于αvβ6纤连蛋白)的拮抗剂。本发明优选针对整合蛋白受体的拮抗剂。整合蛋白(受体)拮抗剂可以是天然的或合成的肽，非肽，肽模拟物(pepetidomimetica)，免疫球蛋白例如抗体或抗体的功能性片段，或免疫缀合物(融合蛋白)。
本发明优选的整合蛋白抑制剂为针对αv整合蛋白受体(例如，αvβ3，αvβ5，αvβ6和亚类)的抑制剂。优选的整合蛋白抑制剂为αv拮抗剂，尤其是αvβ3拮抗剂。本发明优选的αv拮抗剂是RGD肽，肽模拟物(非肽)拮抗剂和抗整合蛋白受体抗体如阻断αv受体的抗体。
典型的非免疫学的αvβ3拮抗剂在US 5,753,230和US 5,766,591中有教导。优选的拮抗剂为含RGD的线性和环型肽。环肽通常更稳定且在血清中的半衰期更长。然而，本发明最优选的整合蛋白拮抗剂是环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)(EMD 121974，Cilengitide，Merck KgaA，德国；EP 0770622)，它可有效地阻断整合蛋白受体αvβ3、αvβ1、αvβ6、αvβ8、αllbβ3。
科技文献和专利文献中均描述过αvβ3/αvβ5/αvβ6整合蛋白受体的适宜肽类拮抗剂及肽模拟(非肽)拮抗剂。例如，可参见Hoekstra和Poulter，1998，Curr.Med.Chem.5，195；WO 95/32710；WO 95/37655；WO97/01540；WO 97/37655；WO 97/45137；WO 97/41844；WO 98/08840；WO98/18460；WO 98/18461；WO 98/25892；WO 98/31359；WO 98/30542；WO99/15506；WO 99/15507；WO 99/31061；WO 00/06169；EP 0853 084；EP0854 140；EP 0854 145；US 5,780,426；和US 6,048,861。公开了也适用于本发明的苯并氮杂唑及相关的苯并二氮杂唑和苯并环庚烯αvβ3整合蛋白受体拮抗剂的专利包括WO 96/00574，WO 96/00730，WO 96/06087，WO 96/26190，WO 97/24119，WO 97/24122，WO 97/24124，WO98/15278，WO 99/05107，WO 99/06049，WO 99/15170，WO 99/15178，WO 97/34865，WO 97/01540，WO 98/30542，WO 99/11626和WO99/15508。在WO 98/08840；WO 99/30709；WO 99/30713；WO 99/31099；WO 00/09503；US 5,919,792；US 5,925,655；US 5,981,546；和US 6,017,926中描述了具有主链构象环约束特征的其他整合蛋白受体拮抗剂。在US 6,048,861和WO 00/72801中公开了一系列的壬酸衍生物，它们是有效的αvβ3整合蛋白受体拮抗剂。WO 00/38665中公开了其他化学小分子整合蛋白拮抗剂(多数为玻连蛋白拮抗剂)。其它αvβ3受体拮抗剂已被证实可有效地抑制血管生成。例如，合成的受体拮抗剂如(S)-10，11-二氢-3-[3-(吡啶-2-基氨基)-1-丙氧基]-5H-二苯并[a，d]环庚烯-10-乙酸(命名为SB-265123)已经在很多哺乳动物模型系统中实验过。(Keenan等，1998，Bioorg.Med.Chem.Lett.8(22)，3171；Ward等，1999，DrugMetab.Dispos.27(11)，1232)。适用作拮抗剂的整合蛋白拮抗剂的甄选实验在如Smith等，1990，J.Biol.Chem.265，12267中以及参考专利文献中有描述。
抗整合蛋白受体的抗体也广为人知。可对适宜的抗整合蛋白(如αvβ3，αvβ5，αvβ6)的单克隆抗体进行修饰，使它包括自身的抗原结合片段(包括F(ab)2，Fab和工程化的Fv或单链抗体)。针对整合蛋白受体αvβ3的一个合适的且优选使用的单克隆抗体被定为LM609(Brooks等，1994，Cell 79，1157；ATCC HB 9537)。在WO 97/45447中公开了一个强特异性抗αvβ5抗体-P1 F6，它也优选用于本发明。另一合适的αvβ6选择性抗体是选择性针对整合蛋白受体的αv链的MAb 14D9.F8(WO 99/37683，DSMACC2331，Merck KGaA，德国)以及MAb 17.E6(EP 0719859，DSMACC2160，Merck KGaA)。另一个适宜的抗整合蛋白抗体为上市的Vitraxin。
“生血管生长因子或生长因子受体”是能够通过自身的激活促进血管生长和发育的因子或受体。典型地，血管内皮生长因子(VEGF)及其受体属于此类。
此处的术语“抗体”或“免疫球蛋白”有最广义的含义，特别包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、由至少2个完整抗体构成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)以及抗体片段，只要它们显示有所需的生物学活性即可。此术语一般包括由2个或多个具有不同结合特异性的抗体或抗体片段连接在一起构成的杂合抗体。
根据抗体恒定区的氨基酸序列，完整的抗体可被划分成不同的“抗体(免疫球蛋白)类型”。完整抗体有5个主要类型IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中有些可以被进一步划分成“亚类”(同种型)，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。相应于不同抗体类型的重链恒定区分别称为α，δ，ε，γ和μ。本发明优选的抗体主要类型是IgG，更具体的说是IgG1和IgG2。
抗体常常是分子量约150,000的糖蛋白，由2条同样的轻(L)链和2条同样的重(H)链组成。每条轻链都通过一个共价二硫键和重链相连，而在不同免疫球蛋白同种型的重链中二硫键数目不同。每条重链和轻链还有规则间隔的链内二硫键。每条重链都在一端有一个可变区(VH)并随后有多个恒定区。每条轻链都在一个末端上有一个可变区(VL)，在另一末端上有一个恒定区。轻链的恒定区和重链的第一个恒定区并列，轻链的可变区和重链的可变区并列。据信特定氨基酸残基构成轻链和重链可变区之间的介面。可将脊椎动物物种的抗体“轻链”划分成2个明确不同的类型，称为卡帕(κ)和拉姆达(λ)，这取决于它们恒定区的氨基酸序列。
本处所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均质的抗体群中获得的抗体，即，除了可能的天然发生的微量突变以外，抗体群内的每一株抗体都是相同的。单克隆抗体具有高度的特异性，它针对单一的抗原位点。而且，和多克隆抗体制品不同，多克隆抗体含有针对不同决定簇(表位)的不同抗体，而每个单克隆抗体都仅针对抗原上的一个决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体的优越之处还在于可以合成无其他抗体污染的单克隆抗体。单克隆抗体的制备方法包括Kohler和Milstein(1975，Nature 256，495)和＂单克隆抗体技术，啮齿类和人类杂交瘤的制备和表征＂(1985，Burdon等，Eds，Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology，Volume 13，Elsevier Science Publishers，Amsterdam)中描述的杂交瘤法，或者可以用广为人知的重组DNA方法进行制备(实例可参见US 4,816,567)。也可用比如Clackson等，Nature，352624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.，22258，1-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库中分离单克隆抗体。
术语“嵌合抗体”是指这样的抗体，其重链和/或轻链的一部分和来自特定物种的抗体或属于特定抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，然而链的其余部分则与来自另一物种的抗体或属于另一抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，该术语还指此种抗体的片段，只要其具有所需的生物学活性即可(例如US 4,816,567；Morrison等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，816851-6855(1984))。生产嵌合型和人源化抗体的方法是本领域技术人员所熟知的。例如，制备嵌合抗体的方法包括Boss(Celltech)和Cabilly(Genentech)(US 4,816,397；US 4,816,567)的专利中描述的方法。
“人源化抗体”是非人(如啮齿类)嵌合抗体形式的抗体，其含有最低量的源于非人免疫球蛋白的序列。就大部分而言，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区(CDR)的残基被替换成非人物种(如小鼠，大鼠，兔或非人灵长类)(供体抗体)的具有所需的特异性、亲和性和作用的高变区残基。有时，人免疫球蛋白构架区(FR)残基被对应的非人残基替换。而且，人源化抗体还可以含有受体抗体和供体抗体上均没有的残基。这些修饰可以进一步限定抗体的性能。通常，人源化抗体含有至少一个，一般两个可变区的基本上全部内容，其中所有或基本上所有的高变环都对应于非人免疫球蛋白的相应部分，而所有或基本上所有的FR都是人免疫球蛋白序列中的FR。人源化抗体也可任选地含有至少一部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，特别是人免疫球蛋白的恒定区。人源化抗体的制备方法描述在例如Winter，US 5,225,539和Boss，Celltech，US 4,816,397中。
术语“可变”或“FR”指的是如下事实，即抗体与抗体之间在可变区的某些部分具有十分不同的序列，这些部分用于各特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，此可变性并不均匀分布在抗体的整个可变区。它集中在轻链和重链可变区的三个称为高变区的区段中。可变区的较高保守部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区每一个都包含四个FR(FR1-FR4)，它们主要采用β-片层构型，由三个高变区连接，而高变区形成环与β-片层连接且有时形成β-片层结构的一部分。每条链的高变区通过FR紧密邻近，并与另一条链的高度可变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))。虽然恒定区没有直接参与抗体和抗原的结合，但是显示出多种效应子功能，如参与抗体的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
此处所用的术语“高变区”或“CDR”指负责与抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区一般包含“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，轻链可变区的24-34位(L1)，50-56位(L2)和89-97位(L3)残基，重链可变区的31-35位(H1)，50-65位(H2)和95-102位(H3)残基)；和/或“高变环”的氨基酸残基(例如，轻链可变区的26-32位(L1)，50-52位(L2)和91-96位(L3)残基，重链可变区的26-32位(H1)，53-55位(H2)和96-101位(H3)残基；Chothia和Lesk J.Mol.Biol.196901-917(1987))。
“构架区”或“FR”残基是指除本处定义的高变区残基以外的那些可变区残基。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选包含抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab′，F(ab′)2，Fv和Fc片段，diabodies，线性抗体，单链抗体分子；及由抗体片段构成的多特异性抗体。“完整抗体”是指包含结合抗原的可变区以及轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH1，CH2和CH3)的抗体。完整抗体优选具有一个或多个效应子功能。
木瓜蛋白酶消化抗体产生2个相同抗原结合片段(称之为＂Fab＂片段，每个片段含有一个抗原结合位点和一个CL区和一个CH1区)以及一个残余的＂Fc＂片段(其名称反映了其易于结晶的能力)。
抗体＂Fc＂区一般含有CH2，CH3和IgG1或IgG2抗体主要类型的铰链区。铰链区是具有约15个氨基酸残基的基团，它把CH1区和CH2-CH3区结合起来。
胃蛋白酶处理产生一个＂F(ab′)2＂片段，它有2个抗原结合位点且仍有交联抗原的能力。＂Fv＂是最小的抗体片段，它含有一个完整的抗原识别和抗原结合位点。此区域由一个重链可变区和一个轻链可变区通过牢固的非共价连接形成的二聚体组成。在此构型中每个可变区的3个高变区(CDR)相互作用在VH-VL二聚体表面上确定出一个抗原结合位点。总的说来，6个高变区赋予了抗体的抗原结合特异性。但是，甚至仅一个可变区(或仅含有3个抗原特异性高变区的一半Fv)也有识别并结合抗原的能力，虽然它比完整的结合位点的亲合力低。Fab片段还包括轻链的恒定区和重链的第一恒定区(CH1)。＂Fab片段和Fab片段的不同之处在于在重链CH1区的羧基端多了几个残基，包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。F(ab′)2抗体片段最初以Fab′片段对形式产生，这两个Fab′片段之间有半胱氨酸铰链。抗体片段的其它化学偶联也是已知的(参见如Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，1996；.US 4,342,566)。
“单链Fv＂或＂scFv＂抗体片段包含抗体的VH和VL区，其中，这些结构域存在于一条多肽链上。Fv多肽优选在VH和VL结构域之间还含有多肽接头，它可使scFv形成抗原结合所需的结构。单链FV抗体也可从例如Plückthun(The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，Vol.113，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，pp.269-315(1994))，WO 93/16185；US 5,571,894；US 5,587,458；Huston等(1988，Proc.Natl.Acad.Sci.85，5879)或Skerra和Plueckthun(1988，Science 240，1038)获知。
术语“diabodies”是指有两个抗原结合位点的小抗体片断，此片断包含一个重链可变区(VH)，它与轻链可变区(VL)连接在同一多肽链(VH-VL)上。通过利用不能使位于同一链上的这两个域配对的小接头，使一条链上的这些结构域被迫与另一条链的互补域配对从而产生两个抗原结合位点。例如在EP 404,097；WO 93/11161中对diabodies有更充分的描述。
“双特异性抗体”是一个双价的抗体(或其有免疫治疗活性的片段)，其有2个不同特异性的抗原结合位点。例如第一个抗原结合位点可针对血管生成受体(例如整合蛋白或VEGF受体)，而第二个抗原结合位点可针对ErbB受体(例如EGFR或Her2)。双特异性抗体能用化学方法(实例参见Kranz等(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78，5807)或＂polydoma＂技术(参见US 4,474,893)或重组DNA技术制备，所有这些技术均为本身已知的技术。其他方法在WO 91/00360，WO 92/05793和WO 96/04305中有描述。双特异性抗体还能用单链抗体来制备(实例参见Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85，5879；Skerra和Plueckthun(1988)Science 240，1038)。这些是以单条多肽链形式产生的抗体可变区类似物。为了构成双特异性结合剂，单链抗体可以通过本领域内技术人员熟知的化学方法或遗传工程方法偶联在一起。本发明的双特异性抗体也可以用亮氨酸拉链序列来制备。此序列可来自于转录因子Fos和Jun的亮氨酸拉链区(Landschulz等，1988，Science 240，1759；综述见，Maniatis和Abel，1989，Nature 341，24)。亮氨酸拉链是约20-40个残基长的特殊氨基酸序列，典型地每7个残基就有一个亮氨酸。此拉链序列形成两亲性α螺旋，亮氨酸残基在疏水侧面上排成一线以便形成二聚体。相应于Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链的肽优选形成异二聚体(O′Shea等，1989，Science 245，646)。含有拉链的双特异性抗体及其制备方法在WO 92/10209和WO 93/11162中有公开。本发明的双特异性抗体可以是针对VEGF受体和αvβ3受体的抗体，其中这两个受体是在上面论及单特异性抗体时讨论过的受体。
术语“免疫缀合物”指和非免疫学效应分子通过共价键融合在一起的抗体或免疫球蛋白或其有免疫学活性的片段。此融合伙伴(partner)优选为可以糖基化的肽或蛋白质。所述的非抗体分子能连接到抗体重链恒定区的C末端或连接到轻链和/或重链可变区的N末端。此融合伙伴可以通过接头分子连接，一般这种接头分子是含3-15个氨基酸残基的肽。本发明的免疫缀合物优选包含由针对血管生成受体(优选整合蛋白或VEGF受体)的免疫球蛋白或其有免疫治疗效果的片段和TNFα组成的融合蛋白或基本由TNFα和IFNγ或其他适合的细胞因子通过N末端和所述的免疫球蛋白(优选Fc部分)的C末端相连组成的融合蛋白。
术语“融合蛋白”指的是由一个或多个非免疫治疗活性(非抗体)蛋白或肽组成的天然或合成分子，其中这些蛋白或肽具有不同的特异性并任选地通过接头分子融合在一起。例如，本发明的融合蛋白可以是由环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMe-Val)和TNFα和/或IFNγ融合组成的分子。
“杂合抗体”是连接在一起的两个或多个抗体或抗体结合片段，它们中每个都有一个不同的结合特异性。杂合抗体可以通过两个或多个抗体或抗体片段的缀合而制备。优选的杂合抗体由交联的Fab/Fab′片段组成。很多偶联或交联试剂可用于抗体的缀合。比如蛋白A，碳二亚胺，N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯(SATA)和N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基联硫基)丙酸酯(SPDP)(实例参见Karpovsky等(1984)J.EXP.Med.160，1686；Liu等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，8648)。其他的方法还有Paulus，Behring Inst.Mitt.，No.78，118(1985)；Brennan等(1985)Science30m81或Glennie等(1987)J.Immunol.139，2367描述的方法。另一个方法使用邻苯二马来酰亚胺(oPDM)将三个Fab′片段偶联在一起(WO91/03493)。本发明中多特异性抗体也是适用的，并可按照如WO 94/13804和WO 98/50431的教导进行制备。
抗体“效应子功能”是指抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)引起的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括补体依赖的细胞毒性，Fc受体结合，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)，吞噬作用；细胞表面受体(如B细胞受体)的下调等。
术语“ADCC”(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用)指的是这样一个细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(如天然杀伤(NK)细胞，嗜中性粒细胞，和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并随后引起靶细胞的裂解。介导ADCC的重要细胞-NK细胞只表达FcγR III，而单核细胞可表达FcγR I，FcγR II和FcγR III。为估计目的分子的ADCC活性，可利用例如现有技术(US 5,500,362；US 5,821,337)中描述的体外ADCC实验来进行。此实验中有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。
“人效应细胞”是能表达一个或多个FcR并执行效应子功能的白细胞。此细胞优选表达至少FcγR III并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)，天然杀伤(NK)细胞，单核细胞，细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。
术语“Fc受体”或“FcR”用于描述与抗体Fc区结合的受体。优选的FcR是天然序列的人FcR。而且，优选的FcR是结合IgG抗体的受体(γ受体)并包括FcγR I，FcγR II和FcγR III亚类的受体-包括这些受体的等位基因变体和可变剪接形式。例如，对FcR的综述可参见Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9457-92(1991)。
术语“细胞因子”是对由一个细胞群释放的作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。这类细胞因子的实例有淋巴因子、单核因子以及传统的多肽激素。细胞因子包括生长激素如人生长激素，N-甲硫氨酰基人生长激素以及牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如促卵泡激素(FSH)，促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；整合蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGFβ；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGFα和TGFβ；红细胞生成素(EPO)；干扰素如IFNα，IFNβ和IFNγ；集落刺激因子如M-CSF，GM-CSF和G-CSF；白细胞介素如IL-1，IL-1a，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12；和TNFα或TNFβ。本发明优选的细胞因子为干扰素和TNFα。
本处使用的术语“细胞毒性剂”指的是可以抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。此术语旨在包括放射性同位素，化疗剂，毒素如细菌，真菌，植物或动物来源的酶活性毒素，或它们的片段。此术语还可以包括细胞因子家族的成员，优选IFNγ。
术语“化疗剂”或“抗肿瘤剂”包括具有抗肿瘤效果的化学药剂，即直接地(作用在肿瘤细胞上，比如通过抑制细胞生长或细胞毒性作用)和间接地(通过如修饰生物学反应等机制)防止肿瘤细胞的发育，成熟或扩散的化学药剂。本发明适宜的化疗剂优选为天然的或合成的化学化合物，但是生物分子如蛋白质，多肽等并不被明确地排除在外。大量的现有处于商业使用、临床评价和临床前研发阶段的抗肿瘤剂都可包括在本发明内，用于通过和TNFα及上面提到的抗血管生成剂及任选地其它药剂比如EGF受体拮抗剂相联合来治疗肿瘤/赘生物。应当指出化疗剂可以任选地与上述药剂联合一起施用。
化疗剂的实例包括烷化剂，如氮芥，吖丙啶化合物，烷基磺酸酯以及其他有烷基化作用的化合物如亚硝基脲，顺氯氨铂和达卡巴嗪；抗代谢物如叶酸、嘌呤或嘧啶拮抗剂；有丝分裂抑制剂如长春花生物碱和鬼臼毒素衍生物；细胞毒性抗生素和喜树碱衍生物。优选的化疗剂或化疗法包括氨磷汀(ethyol)，顺氯氨铂，达卡巴嗪(DTIC)，放线菌素D，氮芥，链脲霉素，环磷酰胺，carrnustine(BCNU)，环己亚硝脲(CCNU)，阿霉素(adriamycin)，阿霉素微脂体(doxil)，吉西他滨(gemzar)，柔红霉素，柔红霉素微脂体(daunoxome)，甲基苄肼，丝裂霉素，阿糖胞苷，足叶乙甙，氨甲蝶呤，5-氟尿嘧啶(5-FU)，长春花碱，长春新碱，博来霉素，紫杉醇(taxol)，泰索帝(多烯紫杉醇，docetaxel)，阿地白介素(aldesleukin)，天冬酰胺酶，白消安，卡铂，克拉立平，喜树碱，CPT-11，10-羟基-7-乙基-喜树碱(SN38)，达卡巴嗪，氟尿苷，氟达拉滨，羟基脲，异环磷酰胺，伊达比星，巯乙磺酸钠，干扰素α，干扰素β，伊立替康(irinotecan)，米托蒽醌，托泊替堪，亮丙瑞林，甲地孕酮，抗瘤氨酸，巯嘌呤，普卡霉素(plicamycin)，氯苯二氯乙烷，天冬酰胺酶(pegaspargase)，喷司他丁(pentostatin)，哌酰溴烷，普卡霉素，链脲霉素，他莫西芬，替尼泊甙，睾内酯，硫鸟嘌呤，塞替派，尿嘧啶氮芥，维诺利宾，苯丁酸氮芥及其组合。本发明最优选的化疗剂是顺氯氨铂，吉西他滨，阿霉素，紫杉醇和博来霉素。
术语“癌”和“肿瘤”指的是或描述的是典型特征为无调控细胞生长的哺乳动物生理疾病。通过施用本发明的药物组合物，可对肿瘤进行治疗，如乳腺，心脏，肺，小肠，结肠，脾，肾，膀胱，头部和颈，卵巢，前列腺，脑，胰腺，皮肤，骨，骨髓，血液，胸腺，子宫，睾丸，子宫颈和肝的肿瘤。更具体地，肿瘤选自腺瘤，血管肉瘤(angio-sarcoma)，星形细胞瘤，上皮癌，生殖细胞瘤，成胶质细胞瘤，神经胶质瘤，错构瘤，血管内皮瘤，血管肉瘤(hemangio sarcoma)，血肿，肝胚细胞瘤，白血病，淋巴瘤，成神经管细胞瘤，黑素瘤，成神经细胞瘤，骨肉瘤，成视网膜细胞瘤，横纹肌肉瘤，肉瘤和畸胎瘤。
详细地说，肿瘤选自肢端色斑样黑素瘤，光化性角化病，腺癌，囊腺癌，腺瘤，腺肉瘤，腺鳞癌，星形细胞瘤，前庭大腺癌，基底细胞癌，支气管腺癌，毛细血管瘤、癌、癌肉瘤，海绵状胆管癌，软骨肉瘤，脉络丝乳头状瘤/癌，透明细胞癌，囊腺瘤，内胚窦瘤，子宫内膜增生，子宫内膜间质肉瘤，子宫内膜腺癌，室管膜肉瘤，上皮样肉瘤，尤因肉瘤，纤维板层样癌，局灶性结节性增生，胃泌素瘤，生殖细胞瘤，成神经胶质细胞瘤，胰升糖素瘤，成血管细胞瘤，血管内皮瘤，血管瘤，肝腺瘤，肝腺瘤病，肝细胞癌，胰岛素瘤，上皮内瘤形成，上皮间鳞状细胞癌，侵袭性鳞状细胞癌，大细胞癌，平滑肌肉瘤，恶性着色斑型黑素瘤，恶性黑素瘤，恶性间皮瘤，成神经管细胞瘤，髓上皮瘤，黑素瘤，脑膜肿瘤，间皮肿瘤，转移性肿瘤，粘液上皮癌，成神经细胞瘤，神经上皮腺癌，结节性黑色素瘤，燕麦细胞癌，少突神经胶质瘤，骨肉瘤，胰腺多肽，乳头状浆液性腺癌，松果体细胞瘤，垂体瘤，浆细胞瘤，假肉瘤，肺母细胞瘤，肾细胞瘤，成视网膜细胞癌，横纹肌肉瘤，肉瘤，浆液性癌，小细胞肺癌，软组织癌，抑生长素分泌细胞肿瘤，鳞癌，鳞状细胞癌，间皮下，表浅蔓延型黑素瘤，未分化的癌，眼色素层黑色素瘤，疣状癌，血管活性肠多肽瘤，完全分化的癌，和肾母细胞瘤。
“ErbB受体”是指属于ErbB受体家族的受体蛋白酪氨酸激酶，包括EGFR(ErbB1)，ErbB2，ErbB3和ErbB4受体以及此家族中有待于在将来进行鉴别的其他成员。ErbB受体一般含有一个可与ErbB配体结合的细胞外结构域；一个亲脂性的跨膜结构域；一个保守的细胞内酪氨酸激酶结构域；以及一个含有若干可被磷酸化的酪氨酸残基的羧基端信号结构域。ErbB受体可以是“天然序列的”ErbB受体，或它的“氨基酸序列变异体”。优选的ErbB受体是天然序列的人ErbB受体。ErbB1指的是编码EGFR蛋白产物的基因。最优选的是EGF受体(Her1)。“ErbB1”和“HER1”在本处可互换使用且均指人HER1蛋白。“ErbB2”和“HER2”在本处可互换使用且均指人HER2蛋白。本发明优选ErbB1受体(EGFR)。
“ErbB配体”是结合并且/或者激活ErbB受体的多肽。与EGFR结合的ErbB配体包括有EGF，TGF-a，双调蛋白，β-细胞调节素(betacellulin)，HB-EGF和表皮调节素(epiregulin)。
术语“ErbB受体拮抗剂/抑制剂”指的是天然或合成的能结合并阻断或抑制ErbB受体的分子。因此通过阻断受体，拮抗剂阻止了ErbB配体(激动剂)的结合以及激动剂/配体受体复合物的活化。ErbB拮抗剂可能针对HER1(EGFR)或HER2。本发明优选的拮抗剂针对EGF受体(EGFR，Her1)。ErbB受体拮抗剂可以是抗体或抗体的免疫治疗活性片段或非免疫生物学分子—如肽、多肽蛋白。化学分子也包括在内，但是本发明优选的拮抗剂为抗EGFR抗体和抗HER2抗体。
本发明优选的抗体为抗Her1和抗Her2抗体，更优选抗Her1抗体。优选的抗Her1抗体为MAb 425，优选人源化的MAb 425(hMAb 425，US5,558,864；EP 0531472)和嵌合MAb 225(cMAb 225，US 4,943,533和EP0359 282)。最优选的是单克隆抗体h425，在单药物治疗中它已显示出高疗效和降低的负反应和副作用。最优选的抗Her2抗体是Genentech/Roche上市的HERCEPTIN。本发明的有效EGF受体拮抗剂还可以是天然的或合成的化学化合物。此类优选分子的一些实例包括有机化合物、有机金属化合物、有机化合物和有机金属化合物的盐。
HER2受体拮抗剂的实例有苯乙烯基取代的杂芳基化合物(US5,656,655)；双单环和/或双环芳基、杂芳基、碳环和杂碳环化合物(US5,646,153)；三环的嘧啶化合物(US 5,679,683)；有受体酪氨酸激酶抑制活性的喹唑啉衍生物(US 5,616,582)；杂芳基乙烯基或杂芳基乙烯基芳基化合物(US 5,196,446)；可以抑制EGFR、PDGFR和FGFR受体家族的名称为6-(2，6-二氯代苯基)-2-(4-(2-二乙基-氨基乙氧基)苯基氨基)-8-甲基-8H-吡啶并(2，3)-5-嘧啶-7-酮的化合物(Panek，等，1997，J.Pharmacol.Exp.Therap.283，1433)。
“放射性疗法”可以利用本发明的药物组合物进行治疗的肿瘤还可以利用放射线或放射药物进行治疗。放射源既可以给患者外用也可以给患者内用。如果给患者外用放射源，该治疗方法称作体外照射放疗(EBRT)。如果给患者内用放射源，此治疗称为近距放射疗法(BT)。已经使用的一些典型的放射活性原子包括镭，铯-137，和铱-192，镅-241和金-198，钴-57；铜-67；锝-99；碘-123；碘-131；以及铟-111。也可以用放射活性同位素标记本发明药剂。当前放射性疗法是控制不能切除的和不宜手术的肿瘤和/或肿瘤转移的标准治疗方法。已经看到放射性疗法和化疗组合可提高疗效。放射性疗法依据的原理是投射到靶区的高剂量辐射将导致肿瘤和正常组织中的增殖细胞的死亡。辐射剂量方案一般根据辐射吸收剂量(rad)，时间和分段进行确定，并且必须由肿瘤专家进行仔细确定。患者接受的辐射量将取决于各种因素，但两个最重要的因素是肿瘤相对身体其它重要结构或器官的位置，以及肿瘤扩散的程度。对患者实施放射性疗法的一个优选治疗方案是疗程持续5-6个星期，将50-60Gy总剂量按照每星期5天每天1次1.8-2.0Gy的剂量给患者分段施用。Gy是戈瑞的缩写，指100 rad剂量。在优选的实施方案中，血管生成拮抗剂和TNFα/IFNγ以及放射物对人类患者肿瘤的治疗具有协同作用。换句话说，所述化合物如果与放射物和/或化疗剂组合，则对肿瘤生长的抑制作用将增强。本发明可任选地使用放射性疗法。在不能给患者施用足量的本发明药剂的情况下建议和优选使用放射性疗法。
“药物治疗”就步骤而言，本发明的方法包括多种实施形式。比如，本发明的药剂可以同时地，相继地或独立地使用。另外，药剂可分开施用且两次施用间隔在约3周以内，即第二种药剂在第一种活性剂施用后基本上立即开始施用到第一种药剂施用后不超过约3周的时间开始施用。本方法可在手术之后进行。或者，手术可在施用第一种活性药剂和施用第二种活性药剂之间的间隔期内进行。此方法的实例是将本发明方法和外科肿瘤摘除手术联合应用。根据本发明方法的治疗典型地包括在一个或多个施用周期内施用本治疗组合物。例如，当进行同时施用的时侯，含有2种药剂的治疗组合物在一个周期内持继施用大约2天到约3周。此后，治疗周期可根据执业医生的判断按需要进行重复。类似地，如果进行相继施用，则每种治疗剂施用的时间可调整到典型地覆盖同样的时间。两周期之间的间隔可从约0到2个月不等。
本发明的药剂可通过注射或随时间逐渐输注经肠胃外施用。体内待治疗的组织用全身给药的方法一般就可进行治疗，因此最经常使用的方法是静脉内给予治疗组合物，但是当目标组织可能含有靶分子的时候，其他组织和给药方法也是可考虑的。因此，本发明的药剂可眼内，静脉内，腹膜内，肌内，皮下，腔内，经皮，通过常位注射和输注给药，而且还可以通过蠕动方式给药。例如，包括本发明的整合蛋白拮抗剂的治疗组合物通常通过静脉方式，比如以单位剂量注射给药。本发明的治疗组合物包含生理学可耐受的载体和溶解或分散于其中作为活性成分的本处描述的相关药剂。
如在本处使用的那样，术语“药学上可接受的”指这样的组合物，载体，稀释剂和试剂，这些物质可用在哺乳动物身上而不会产生不想要的生理效应如恶心，眩晕，反胃等。其中溶解或分散有活性成分的药物组合物的制备是本领域技术人员所熟知的，不必在制剂的基础上进行限定。典型地，这种组合物可制成注射剂如液体溶液或悬液，但是，也可制成适于在使用前在液体中形成溶液或混悬液的固体形式。制剂也可进行乳化。可将活性成分和其量适于本处描述的治疗方法的药学上可接受的并与活性成分兼容的赋形剂混合。适当的赋形剂是，例如，水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等以及这些的组合。另外，如果需要的话，组合物还可以包括小量可增加活性成分效用的辅助物质如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂等。本发明治疗组合物可在其中包括这些成分在药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括酸加成盐(和多肽的游离氨基基团成盐)，所述酸是无机酸，例如，盐酸或磷酸，或像乙酸，酒石酸，苦杏仁酸等有机酸。也可从无机碱，例如，钠，钾，铵，钙或铁的氢氧化物，以及有机碱如异丙胺，三甲基胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等，得到与游离羧基基团形成的盐。在环肽αv拮抗剂制剂中特别优选使用HCl盐。生理学上可耐受的载体是本领域的技术人员所熟知的。液相载体的例子为无菌水溶液，它可以仅含有活性组分和水或可以还含有缓冲剂例如在生理pH值的磷酸钠，生理盐水或两者，如磷酸缓冲盐水。再者，含水载体可以含有一种以上的缓冲盐以及诸如氯化钠和氯化钾等盐，葡萄糖，聚乙二醇和其他溶质。液体组合物也可含有有水或无水的液相。这类其他液相的例子有甘油，植物油如棉籽油和水油乳液。
典型地，对于形式为例如，整合蛋白受体阻断抗体或抗体片段或抗体缀合物或者抗VEGF受体阻断抗体、片断或缀合物的免疫治疗剂，治疗有效量是在生理可耐受的组合物中给药时，足以使血浆浓度达到约0.01微克(μg)每毫升(ml)至约100μg/ml，优选约1μg/ml至5μg/ml，通常约5μg/ml的量。换言之，剂量可从约0.1mg/kg变化到约300mg/kg，优选约0.2mg/kg至约200mg/kg，最优选约0.5mg/kg至约20mg/kg，一日或多日持继进行一日一次或一日多次给药。当免疫治疗剂是单克隆抗体的片段或缀合物的时侯，其用量可很容易地根据片段/缀合物的质量相对于整个抗体的质量的比例进行调整。以摩尔浓度表示，优选的血浆浓度为约2微摩尔(μM)至约5毫摩尔(mM)，优选约100μM到1mM抗体拮抗剂。
对于属于非免疫治疗性肽或蛋白质多肽(例如TNFα、IFNγ)或其他类似大小的生物分子的本发明药剂，其治疗有效的量典型地为这样的多肽量，即在生理可耐受的组合物中给药时足以使血浆浓度达到约0.1微克(μg)每毫升(ml)至约200μg/ml，优选约1μg/ml至约150μg/ml的量。根据每摩尔有约500克质量的多肽来计算，优选的血浆摩尔浓度为约2微摩尔(μM)到约5毫摩尔(mM)，优选约100μM至1mM多肽拮抗剂。
对于本发明中优选为化学拮抗剂或(化学)化疗剂(既不是免疫治疗剂，也不是非免疫治疗性肽/蛋白)的活性药剂，其典型剂量为每公斤体重每天10mg至1000mg，优选约20至200mg，更优选的是50至100mg。
本发明的“药物组合物”可以包含能降低或避免伴随本发明联合疗法出现的副作用的药剂(“辅助疗法”)，这包括但不限于，如降低抗癌药物毒性作用的药剂，例如骨重吸收抑制剂，心脏保护药物。所述的辅助药剂可以防止或降低化疗，放射治疗或手术带来的恶心和呕吐的发生率，或降低施用骨髓抑制性抗癌药物带来的感染机率。辅助药剂是本领域内的技术人员所熟知的。此外，本发明的免疫治疗剂还可以和佐剂如BCG和免疫系统刺激剂一起使用。而且，组合物可包括含有具细胞毒性作用的放射性标记同位素或其他细胞毒性剂如细胞毒性肽(例如细胞因子)或细胞毒性药物等的免疫治疗剂或化疗剂。
术语用于治疗肿瘤或肿瘤转移的“药物试剂盒”指的是一种包装以及通常地药剂在肿瘤和肿瘤转移治疗方法中的使用说明书。本发明试剂盒中的药剂一般被配制成本处所描述的治疗组合物，因此可以采用任何适于试剂盒内放置的形式。这些形式可以包括液体，粉末，片剂，混悬液等以便提供本发明的拮抗剂和/或融合蛋白。这些药剂可以在适合于根据本发明方法单独给药的各单独容器中提供，或可以在此包装中的单一容器内结合在组合物中提供。包装中可含有足以按照此处描述的治疗方法施用一次或多次的药剂量。本发明试剂盒还包括包装中所含材料的“使用说明”。
图1HUVEC球的形成和存活不需要整合蛋白连接。(a)阻断性抗VE-钙粘着蛋白(75)mAb或Ca2+-耗竭(EDTA，EDTA/Ca2+)抑制HUVEC球的形成，而阻断性抗整合蛋白α1(Lia1/2)，α5(SAM-1)，αVβ3(LM609)和PECAM-1(10D9)的mAb和RGD肽均不抑制HUVEC球的形成。(b)生存力。从球体(○)和纤连蛋白(●)培养物回收的HUVEC具有相似的生存曲线。
图2整合蛋白依赖性粘着保护HUVEC抵抗TNF诱导的细胞凋亡。(a)YoPro-1摄取暴露于TNF(T)和TNF/IFNγ(TI)没有引起纤连蛋白粘着HUVEC中的YoPro-1着色，而引起了HUVEC球体中的YoPro-1强着色，这种着色受到caspase抑制剂—BOC和ZVAD的抑制。TNF±IFNγ(TI)。C，未处理的培养物。(b)利用蛋白质印迹法证明caspase-3激活和PARP断裂(箭头)存在于TNF/IFNγ-处理(TI)的球体HUVEC中而不存在于纤连蛋白粘着HUVEC中。C，未处理的培养物。(c，d)HUVEC的生存力曲线，此HUVEC暴露于TNF(■)，TNF/IFNγ(▲)或对照培养基(○)。(e)在抗α1(△/▲)，αVβ3(□/■)和α4(○/●)整合蛋白的固定化抗体(imAb)上在TNF/IFNγ存在(实心符号)或不存在(空心符号)时进行培养的HUVEC的生存力。
图3TNF诱导的NF-κB激活不需要整合蛋白连接。(a)蛋白质印迹法和(b)电泳迁移率变动分析(EMSA)证实了在暴露于TNF/IFNγ的纤连蛋白-粘着HUVEC和球体中的1-κB磷酸化(Pi-κB)、1-κB降解(I-κB)和NF-κB核转位(EMSA)的平行动力学。(c)流式细胞计分析显示在暴露于TNF(----)或TNF/IFNγ(-)的纤连蛋白和球体HUVEC培养物上具有相同的ICAM-1的细胞表面表达诱导。(……)未处理细胞。PECAM-1表达作为对照。
图4Akt的活化是HUVEC存活所必需的并且Akt的活化需要整合蛋白连接。(a)检测经指定时间的TNF/IFNγ刺激后纤连蛋白粘着HUVEC和球体HUVEC培养物中的磷酸化Akt(Pi-Akt)和总Akt(Akt)。(b)左图PI-3激酶抑制剂——渥曼青霉素(W)和LY294002(LY)使纤连蛋白粘着HUVEC对TNF(T)和TNF/IFNγ(TI)诱导的细胞凋亡敏感。死细胞以YoPro-1染色显示。右图暴露于LY294002(●)，TNF/IFNγ(△)或LY294002/TNF/IFNγ(▲)的纤连蛋白粘着HUVEC的存活曲线。(○)未处理的培养物。(c)组成活性的PI-3激酶(p110*)和Akt(Aktmp)，但不是野生型Akt(Aktwt)或对照质粒(pBS)，促进暴露于TNF(●)或TNF/IFNγ(▲)的球体细胞存活。(○)未处理的培养物。插入表示的是流式细胞计分析的转染细胞的EGFP荧光(％阳性细胞)。(d)在没有(C)或有TNF(T)或TNF/IFNγ(TI)存在下以纤连蛋白粘着的单层形式或球体形式培养经对照质粒(pBS)或组成活性Akt(Akt*)电穿孔及Ad△NI-κB或AdLacZ感染的HUVEC。凋亡细胞通过YoPro-1染色检测。活的纤连蛋白粘着细胞用结晶紫染色。(e)在有梯度浓度TNF的存在下，在纤连蛋白上培养经对照质粒(空心符号)或pAktmp(实心符号)电穿孔及AdΔNI-κB(○/●)或AdLacZ(△/▲)感染的HUVEC，活的粘着细胞通过测定结晶紫染色的孔的OD值进行确定。(f)流式细胞计数分析未处理的HUVEC(……)、或经TNF(----)和TNF/LY294002(-)处理的HUVEC(左图)以及经Ad△NI-κB(中图)或AdLacZ感染并暴露于TNF(----)和TNF/IFNγ(-)的HUVEC中的ICAM-1表达。
图5(a-c)利用蛋白质印迹法分析暴露于TNF/IFNγ所示时间的纤连蛋白和球体HUVEC培养物中的Pi-Akt，MDM2，p53，Pi-FKHR/FRKHL1(a)，及Pi-MEK，Pi-p38和Pi-JNK和Pi-ERK。研究证明，就总的Akt，FKHR，MEK，p38，ERK和JNK蛋白而言，总蛋白量表现出相等。响应TNF/IFNγ，细胞球体培养物同纤连蛋白粘着细胞相比，它缺少Akt和FKHR/FKRL1的磷酸化但p53水平增加且MEK，p38、ERK和JNK的磷酸化增强。
附图6在体外降低的整合蛋白连接增强TNF的细胞毒性。(a)将HUVEC在不存在(C)或存在TNF(T)或TNF/IFNγ(TI)的条件下在纤连蛋白或PLL上培养16小时。凋亡的和活的粘着细胞分别用YoPro-1和结晶紫染色显示。(b)EMD121974破坏αVβ3介导的HUVEC在明胶上的粘附(■)但是不破坏α5β1/αVβ3的α5β1组分介导的对纤连蛋白的粘附(●)。对照肽EMD135981无此作用(空心符号)。(c)如图所示在没有(C)或存在TNF/IFNγ(TI)、EMD121974和EMD135981时，HUVEC在纤连蛋白上进行培养。凋亡细胞和粘着细胞分别用YoPro-1染色和相差显微镜显示。(d)c部分所示实验中的HUVEC的生存力曲线，无肽(○/●)；EMD121974(△/▲)；EMD135981(□/■)。未处理的培养物，空心符号。TNF/IFNγ处理的培养物，实心符号。(e)HUVEC生存力曲线，此HUVEC细胞用Aktmp(空心符号)或pBS(实心符号)电穿孔并在纤连蛋白上进行培养并暴露于单独的TNF/IFNγ(○/●)或还暴露于EMD121974(△/▲)或EMD135981(□/■)肽。Aktmp阻止由EMD121974和TNF/IFNγ联合处理诱导的细胞死亡。
图7减少的整合蛋白连接增强TNF在体内的细胞毒性。带有BN-175同基因软组织肉瘤的BN大鼠通过ILP技术以EMD121974(□)，TNF(△)或EMD1 21974/TNF(■)进行处理。(○)假处理的大鼠。ILP处理之后连续六天测量肿瘤生长。结果表示为平均肿瘤体积±s.e.m.(n＝6)。将此同基因软组织肉瘤BN-175的小块植入雄性BN大鼠的右后肢，肉瘤直径达到12-14mm时开始处理(Manusama等，Oncol.Rep.6，173-177.(1999))。股动脉和静脉插上硅橡胶套管并用止血带封闭侧支循环(collaterals)。用5ml Heamacce灌注30分钟(2.4ml/min)，Heamacce中添加大丸剂形式(boluse)的药物(EMD121974，500μg，在灌注液中终浓度是170μM；TNF，50μg)。灌注液经氧化处理，腿部用温暖褥垫保温38-39℃。用EMD12194灌注的大鼠在ILP处理前2小时和处理后3小时还全身施用该肽(100mk/kg，腹膜内)。用卡尺测量肿瘤的二维直径并计算肿瘤体积(V)(V＝0.4×A2×B，其中B指的是最大直径，A是垂直于B的直径)。每组处理6只大鼠。按照(Manusama等，Oncol.Rep.6，173-177.(1999))所述方法评估局部和全身的副作用。
图8在体外减少整合蛋白连接增强了TNF-，TRAIL-和FasL诱导的细胞毒性。按照所示在没有(对照)或有EMD121974(300μM)，TNF(200ng/ml)，FasL(200ng/ml)，TRAIL(200ng/ml)，LIGHT(200ng/ml)和IFNγ(330ng/ml)存在下，将HUVEC在纤连蛋白包被的微量滴定平板上过夜培养。通过MST实验测定生存力。
本发明可通过下列实施例更详细说明。
实施例1整合蛋白依赖的粘着内皮细胞抗TNFα诱导的细胞凋亡。
HUVEC球的形成和存活不需要整合蛋白为检验整合蛋白连接对TNF诱导的细胞凋亡的作用，我们鉴定了无整合蛋白依赖性粘着时培养内皮细胞的条件。内皮细胞的单细胞悬浮液由于失巢凋亡(anoikis)很快死亡(Meredith等，Mol.Biol Cell.4，953-961(1993))因此无法进一步分析。但是将高密度(1.0×106个细胞/ml)的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)接种在BSA包被的孔中，在2-4小时内形成了多细胞球，并且能够存活24小时以上，这依赖于VE-钙粘着蛋白而整合蛋白没有任何可检测到的贡献。通过阻断性单克隆抗体(mAb)或以EDTA耗竭Ca2+-Mg2+来抑制VE-钙粘着蛋白活性可阻断细胞球形成，而对于抗α2，α3，α5，α6，β1，αVβ3或aVβ5整合蛋白的抑制性mAbs、基于RGD的封闭性肽和封闭性抗PECAM-1mAb，这些组分的单独或组合存在都不影响HUVEC球体(图1a，未显示数据)。
为确定球体培养对细胞生存力的影响，将球体和纤连蛋白-粘着的HUVEC在铺平板后的6-72小时之间进行回收，之后系列稀释并再继续培养48小时，测定相对细胞数。稀释曲线的向左移动或变平表明细胞生存力降低。在铺平板后6，12，16和24小时，从球体培养物回收的HUVEC的生存力与来自纤连蛋白粘着培养物的HUVEC的生存力相当，但是从36小时开始来自球体培养物的HUVEC的生存力进行性降低(图1b在16小时，未显示数据)。
综合这些结果证明在没有整合蛋白依赖性粘着存在时，HUVEC能够形成球体并存活24小时以上。
实施例2粘附于纤连蛋白可保护HUVEC抵抗TNF诱导的细胞凋亡。
为检验整合蛋白是否能够调节TNF诱导的细胞凋亡，我们在纤连蛋白(整合蛋白依赖的粘着)上或以球体(整合蛋白不依赖的粘着)形式培养HUVEC，其中在培养物中加入或不加入TNF(200ng/ml)及IFNγ(330ng/ml)-TNF细胞毒性的增强剂(Dealtry等，Eur.J.Immunol.17，689-693(1987))。将纤连蛋白上的单层HUVEC暴露于TNF±IFNγ，细胞没有出现YoPro-1摄取(Idziorek等，J.Immunol.Methods185，249-258(1995))、膜联蛋白V的细胞表面结合、caspase-3的激活和caspase-3底物PARP的切割(图2a，2b，未显示数据)，这些现象证实此暴露未增加细胞凋亡。相反，以TNF±IFNγ处理的HUVEC球体中增加了YoPro-1的摄取(此增加可以被caspase抑制剂BOC，Z-VAD，IETD和DVED抑制)、DNA片段化、caspase-3的激活和PARP的切割(图2a，2b，未显示数据)。为检测TNF±IFNγ对细胞存活的影响，我们测定了未处理的培养物和处理的培养物的生存力。将纤连蛋白粘着的HUVEC暴露于TNF±IFNγ不影响细胞的生存力(图2c)。细胞球体以TNF处理，结果80％以上细胞死亡，而以TNF/IFNγ联合处理，细胞全部死亡(图2d)。单独以IFNγ处理没有细胞毒性(未显示数据)。HUVEC通过αVβ3和α5β1整合蛋白粘附于固定化的纤连蛋白上(Ruegg等，Nature Med.4，408-414(1998))。为检测这些整合蛋白每个对纤连蛋白上的细胞的生存的贡献，我们在塑料-固定化的抗αVβ3、α1、α5和α4整合蛋白mAb(imAb)上培养HUVEC。固定化的抗αVβ3、抗α5和抗α1 mAb能够保护HUVEC抵抗TNF诱导的死亡而抗α4 mAb则不能(图2e，未显示数据)。
从这些结果我们可以推断αVβ3和αVβ1整合蛋白介导的粘着可以抑制TNF诱导的细胞凋亡，而缺少αVβ1和αVβ3整合蛋白-介导的粘着则使HUVEC对TNF和caspase介导的细胞凋亡敏感。
实施例3整合蛋白依赖性信号保护内皮细胞抵抗TNFα诱导的细胞凋亡。
TNF诱导的NF-κB激活不需要整合蛋白连接核因子-κB(NF-κB)的激活促进暴露于TNF的细胞的生存(Beg& Baltimore，Science 274，782-784；Van Antwerp等，Science 274，787-789(1996))。因为通过整合蛋白的细胞粘着能够激活NF-κB(Scatena等，J.Cell Biol.141，1083-1093(1998))，所以我们研究了细胞球体对TNF诱导的细胞凋亡的敏感性是否是由于缺少NF-κB激活而致。通过测定1-κB的磷酸化和降解、NF-κB的核转位及ICAM-1(NF-κB诱导的基因)的细胞表面表达来检测暴露于TNF±IFNγ的球体HUVEC和纤连蛋白粘着HUVEC培养物中的NF-κB激活。我们未观察到在1-κB磷酸化和降解、NF--κB核转位和ICAM-1表达上有显著差异(图3a-c)，表明TNF诱导的培养于球体中的HUVEC的细胞凋亡不是由于削弱的NF-κB激活所致。
实施例4活化作用依赖于整合蛋白连接并是细胞存活所必需的下面，分析Akt/PKB的激活，Akt/PKB是一个TNF激活的蛋白激酶，它促进内皮细胞的存活(Madge & Pober，J.Biol.Chem.275，15458-15465.(2000))。与组成性的和TNF-诱导的Akt激活一样，纤连蛋白粘着HUVEC中的基础Akt磷酸化因暴露于TNF/IFNγ而增加。相反，在未处理的球体中没有观测到Akt磷酸化，而暴露于TNF/IFNγ只引起弱磷酸化(图4a)。为了分析Akt激活和HUVEC存活的相关性，我们用渥曼青霉素和LY294002—两种磷酸肌醇-3(PI-3)激酶(Akt的上游激活剂)的药理学抑制剂(Kandel，& Hay，Exp.Cell Res.253，210-229.(1999))—处理纤连蛋白粘着细胞，还在球体中表达了Akt(Aktmp)和PI-3激酶催化亚基(p110*)的组成型活性形式。渥曼青霉素和LY294002的处理使暴露于TNF±IFNγ的纤连蛋白粘着细胞的细胞凋亡增加而存活降低(图4b)，而Aktmp和p110*而非野生型的Akt(Aktwt)或对照质粒(pBS)可以保护球体抵抗TNF±IFNγ诱导的细胞凋亡(图4c)。
从这些结果我们推断Akt的激活是暴露于TNF±IFNγ中的HUVEC的存活所必需的，并且Akt的基础和TNF诱导的激活都依赖整合蛋白的连接。
实施例4TNF处理的HUVEC的存活需要Akt和NF-κB的激活在活性NF-κB存在下，Aktmp抑制TNF-诱导的细胞球体的细胞凋亡。我们还检测了NF-κB活化和活性Akt信号是否均为细胞存活所需要的，还是只有活性Akt就可以。我们利用能够表达非降解I-κB的腺病毒(Ad△NI-κB—可防止IκB-NFκB解离(Brown等，Science267，1485-1488.(1995))感染HUVEC，阻断表达组成型活性Akt(Aktmp)的细胞中NF-B的激活。Ad△NI-κB使纤连蛋白粘着HUVEC对TNF±IFNγ诱导的细胞凋亡敏感，而且此作用不受Aktmp影响。对照电穿孔(pBS)和腺病毒感染(AdLacZ)没有作用。Ad△NI-κB还使过表达Aktmp的细胞球体对TNF±IFNγ诱导的细胞凋亡敏感(图4d)。为检测Akt是否能使缺少NF-κB激活的HUVEC免受低剂量TNF的影响，将表达wt和Aktmp的HUVEC的贴壁单层细胞以Ad△NI-κB感染并暴露于TNF(0.33-100ng/ml)。Ad△NI-κB使HUVEC对细胞凋亡敏感(TNF＞0.1ng/ml)，但是Aktmp甚至在这些低剂量TNF下也不能保护HUVEC(图4e)。而且，LY294002和渥曼青霉素不能抑制TNF诱导的ICAM-1表达，这表明HUVEC中的NF-κB激活不需要Akt信号(图4f，未显示数据)，这与球体中ICAM-1的诱导相一致(参见图3c)。相反，以Ad△NI-κB感染的HUVEC抑制响应TNF±IFNγ的ICAM-1表达(图4f)。
综上所述这些结果证明暴露于TNF±IFNγ中的HUVEC的存活需要同时激活Akt和NF-κB两者。
实施例5整合蛋白连接促进FKHR和MDM2的激活并且抑制MEK、p38和JNK的磷酸化Akt的抗细胞凋亡活性最初被归因于它磷酸化和抑制caspase-9和Bad的作用(Datta等，Genes Dev.13，2905-2927.(1999))。然而现在，研究表明Akt依赖性存活涉及Forkhead转录因子(FKHR/FKHRL1)的磷酸化和抑制(Datta等，Genes Dev.13，2905-2927.(1999)；Brunet等，Cell 96，857-868，(1999))和MDM2的磷酸化和抑制、p53的降解(Mayo & Donner，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，11598-11603.(2001))以及对蛋白激酶ERK、p38和JNK的活化的抑制(Rommel等，Science 286，1738-1741.(1999)；Gratton等，J.Biol.Chem.276，30359-30365.(2001)；Park等，J.Biol.Chem.277，2573-2578.(2002)；Madge & Pober，J.Biol.Chem.275，15458-15465.(2000))。我们研究了缺乏整合蛋白连接和Akt信号是否伴随有这些信号途径的变化。我们测定了在暴露于TNF/IFNγ的粘着HUVEC和细胞球中MDM2、p53和磷酸化的FKHR/FRKHL1、MEK、p38和-JNK的水平。细胞球同纤连蛋白粘着细胞相比缺少FKHR/FKRL1的磷酸化且MDM2的水平和p53的累积减少(图5a)。此外，细胞球中基础的和TNF/IFNγ-诱导的MEK、p38和JNK的磷酸化增加(图5b)。这些结果与Akt通过抑制FKHR/FKHR1、减少p53水平以及抑制MEK、p38和JNK的磷酸化从而促进存活的作用一致。
实施例6利用小分子化合物抑制整合蛋白依赖的粘着可以在体内和体外使内皮细胞对TNFα诱导的细胞凋亡敏感。
减少整合蛋白连接使粘着HUVEC对TNFα诱导的细胞凋亡敏感在减少整合蛋白连接的条件下针对TNF的敏感性出现增加并非是细胞球体所特有的对于在聚-L-赖氨酸(PLL)上培养和存活的HUVEC，其中PLL是一种促进不依赖整合蛋白的粘着的底物(Bershadsky等，Curr.Biol.6，1279-1289.(1996))，TNF±IFNγ的加入引起细胞大量死亡(图6a)，这种死亡可通过表达Aktmp来防止(未显示)。此外，我们利用EMD121974((环(Arg-Gly-Asp-D-Phe-[N-Me]-Val)，αVβ3/αVβ5拮抗环肽)(Dechantsreiter等，J.Med.Chem.42，3033-3040.(1999))选择性抑制纤连蛋白上的HUVEC中的整合蛋白αVβ3，而不影响纤连蛋白上依赖于α5β1/αVβ3的α5β1组分的粘着(图6b)。虽然TNF/IFNγ和EMD121974两者单独都不影响细胞存活，但是细胞同时暴露于TNF/IFNγ和EMD121974(而不是非抑制性对照肽EMD135981)却增加了细胞凋亡和细胞的脱附(图6c)并降低了存活(图6d)。而Aktmp的表达保护纤连蛋白粘着HUVEC抵抗由TNF、IFNγ和EMD121974诱导的细胞凋亡(图6e)。
实施例7整合蛋白连接的减少使粘着HUVEC对TNF配体家族的不同死亡配体所诱导的细胞凋亡敏感对于死亡受体信号的促细胞凋亡效应，整合蛋白连接减少会引起细胞对此效应的敏感性增加，这种敏感性增加并不限于TNF，当在纤连蛋白上培养的HUVEC在EMD121974存在下暴露于TRAIL和FasL时也观察到这种增加。LIGHT，一种能与没有死亡结构域的受体结合的配体，显示与αVβ3阻断没有协同作用(图7)。
实施例8EMD121974增加移植肿瘤(established tumor)对TNF的抗肿瘤活性的敏感性生血管内皮细胞表达αVβ3整合蛋白并且αVβ3连接促进内皮细胞存活(Brooks等，Cell79，1157-1164(1994)；Brooks等，Science 264，569-571(1994))。据观察EMD121974在体外可以使内皮细胞对TNF诱导的细胞凋亡敏感，这说明这种化合物能够增强TNF的抗肿瘤活性。为验证这个假说，我们处理带有同基因BN175软组织肉瘤的大鼠，同基因BN175软组织肉瘤是一种在体外和体内抗TNF细胞毒性的高度进攻性和血管化的肿瘤(Manusama等，Oncol.Rep.6，173-177.(1999))。我们利用分离肢体灌注(ILP)技术给带肿瘤的肢体施用TNF、EMD121974或TNF和EMD121974的组合。单独以TNF或肽处理对肿瘤生长没有影响。相反，联合施用TNF和EMD121974使50％动物中的肿瘤受到完全抑制，并导致肿瘤生长的整体显著降低(图8)。在EMD121974/TNF处理的动物中没有观测到局部的和全身的毒性，这一现象说明EMD121974选择性地增加肿瘤对TNF的细胞毒性的敏感性。BN175肿瘤细胞对TNF不敏感，并且不表达活性αVβ3整合蛋白(这可以通过该细胞甚至在高浓度Mn2+存在时仍缺少与纤维蛋白原的粘着和它们对αVβ3选择性抑制剂如EMD121974的低敏感性(未发表的观测结果)推断)，由此我们推断此有效的协同抗肿瘤作用最有可能涉及到肿瘤脉管系统的破坏。
综合我们研究所得的体外数据，强有力的说明在此系统中对于调控内皮细胞的存活，整合蛋白αVβ3要比αVβ1重要。
实施例9HUVEC培养和电穿孔HUVEC按照以前(Ruegg等，Nature Med 4，408-414(1998))所述方法进行制备和培养并在第3-7代间使用。完全培养基是M199(LifeTechnologies，瑞士巴塞尔)、10％FCS(Seromed，德国柏林)、12μg/ml的牛脑提取物(Clonetics-Bio Whittaker，Walkersville，MD，USA)、10ng/ml人重组EGF(Peprotech，英国伦敦)、25U/ml肝素、1μg/ml氢化可的松(Sigma Chemie)、2 mM L-谷氨酰胺、100μg/ml链霉素和100U/ml青霉素(Life Technologies)。对于电穿孔，将HUVEC重悬浮于完全培养基中，然后和DNA(20μg特定质粒和5μg pEGFP-C1)一起在冰上孵育5分钟后，利用Gene Pulser(Biorad，Glattbrugg，瑞士)进行电穿孔。经电穿孔的HUVEC培养48小时之后使用。在电穿孔后40小时，约80％的细胞表达了EGFP。
实施例10球体形成HUVEC经胰蛋白酶消化收集，以1.0×106细胞/ml的浓度重新悬浮于完全培养基中，并以1ml/孔接种到提前包被有1％BAS的12孔非组织培养板(Evergreen Scientific，Los Angeles，CA，USA)中。对于聚集作用研究，将200μl细胞悬浮液单独或在有mAb(10μg/ml)、EDTA(5mM)或Ca2+/EDTA(10/5mM)存在下接种到包被有1％BAS的ELISA板孔(Maxisorp II，NUNC，Roskilde，Denmark)中。在6小时和16小时评价球体的形成。利用Televal 31显微镜(Carl Zeiss AG，Zurich，瑞士)显微成像。
实施例11球体形态分析为进行形态学评定，将球体包埋在Epon(Fluka Chemie)中并且所得厚切片以1％Metylene/Azur蓝染色。为进行免疫染色，冰冻球体切片在4％甲醛(Fluka Chemis，Buchs，Switzerland)中固定。切片用1％BSA封闭后，接着与一级mAb(20μg/ml)和Cyan3-标记的GaM抗血清(West Grove，PA，USA)一起孵育1小时。就TUNEL反应而言，冰冻球体切片在4％多聚甲醛中固定并按照(Ruegg等，上述引文)所述进行处理。球体经碘化丙锭复染以测定总DNA含量。切片在配有CCD摄像机(Photonic Science，Milham，UK)的落射荧光显微镜(Axioskop，Carl Zeiss AG)上或者通过激光共聚焦显微镜(LSM 410，Carl Zeiss AG)进行观察。细胞凋亡指数通过计算绿色(TUNEL染色的片断化的DNA)和红色(碘化丙锭染色的总DNA)象素之间的比率来确定。每一条件下分析的球体的数目是C，31；T，21；TI，12。为检测培养物中的凋亡细胞，将DNA染料YoPro-1(250nM)添加到总培养物或收集的漂浮细胞中(Delhase，M.，Li，N.& Karin，M.炎症应答中激酶的调节作用.Nature 406，367-368.2000))。培养物通过倒置荧光显微镜(Leica DM IRB，Heerbrugg，Switzerland)进行观察。就电子显微术而言，球体用100mM二甲胂酸缓冲液中的2.5％戊二醛进行固定并在1％OsO4中进行后固定处理。细胞在乙醇中脱水并包埋在Epon中。利用PhilipsCM10透射电镜检测超薄切片。
实施例12细胞存活和增殖就细胞存活而言，以TNFα(200ng/ml＝104U/ml)±IFNγ(330ng/ml＝104U/ml)刺激HUVEC球体(以1×106个细胞/ml铺于1％BSA-包被的24mm非组织培养平板(Evergreen Scientific)孔中)或贴壁细胞(以4×105个细胞/ml铺于3μg/ml纤连蛋白-包被的35mm非组织培养平板(Evergreen Scientific)孔中)。在进行刺激前1或4小时，分别按照下列浓度加入激酶抑制剂或EMD肽渥曼青霉素，100nM；LY294002，20μM；EMD肽，300μM。培养16小时后，细胞以5mM EDTA或1x胰蛋白酶(用于贴壁培养)进行解离(对于球体，20℃进行5分钟)并收获，洗涤后以4×105细胞/ml重悬浮于完全培养基中，以100μl/孔等分到微量组织培养平板(Falcon，Becton Dickinson)的孔中并以1∶2阶(step)一式三份进行滴定。48小时后相对细胞数通过测量在培养的最后4个小时期间的MTT转化来估计。结果以540nm下的O.D.值(Packard Spectra Count，Meriden，CT，USA)给出，表示为三个重复孔的平均值±s.d。
实施例13细胞脱附实验Maxisorp II ELISA板用1μg/孔的纤连蛋白或0.5％明胶在PBS中4℃下包被过夜。洗涤包被的孔并用1％BSA在37℃处理2小时进行封闭，之后在使用之前再进行洗涤。以2×104细胞/孔加入不含FCS的基础培养基中并通过离心(40xg)短暂沉淀。细胞在37℃保持2小时进行贴壁，然后加入梯度浓度的肽。2小时后，用温热的PBS洗涤板孔，贴壁细胞在2％多聚甲醛中固定，用0.5％结晶紫(Sigma Chemie)染色并通过620nm下的O.D.读数进行定量(Packard Spectra Count)。结果以O.D.值给出，表示为特异性粘附(＝在ECM蛋白上的粘附减去在BSA上的粘附)的一式两份重复孔的平均值±s.d.。
实施例14流式细胞计HUVEC和EGFP表达的间接免疫染色按照如下所述的标准步骤(Ruegg等，上述引文)进行。死细胞通过碘化丙锭染色排除。所有样品都用FACScan II和Cell Quest软件(Becton Dickinson，Mountain ViewCA，USA)进行分析。
实施例15电泳迁移率变动分析(EMSA)
按照(Cai等，J Biol Chem 272，96-101.(1997))所述方法制备HUVEV(每种条件各1×106个细胞)的核提取物并与合成的末端利用T4激酶以[γ-32 P]ATP标记的、含有人HIV长末端重复的κB序列的双链31聚体寡核苷酸一起孵育。NF-1κB与32P-标记的寡核苷酸的结合通过PAGE和放射自显影进行测定。
实施例16蛋白质印迹法50μl细胞裂解物上清液(1×106，于250μl的2×Laemmli缓冲液中)用7.5％-12.5％SDS-PAGE解析并利用湿法转印(Bio Rad)转移到Immobilon-P膜(Millipore，Volketswil，Switzerland)上。接着将膜在5％奶粉中孵育1小时，在4℃下与一级抗体一起孵育过夜，然后与HRP-标记的GaM(Dako，Zug，Switzerland)一起孵育1小时。利用ECL系统(Amersham-Pharmacia Biotech)进行检测。为进行再次探测，膜在50℃下在2％SDS，50mM Tris和100mM BME中处理30分钟进行探针剥离。
权利要求
1.药物组合物，其包含治疗有效量的至少(i)一种抗血管生成剂和(ii)肿瘤坏死因子α(TNFα)或具有TNFα生物活性的分子，及任选地药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗血管生成剂是整合蛋白(受体)抑制剂/拮抗剂或VEGF(受体)抑制剂/拮抗剂。
3.如权利要求2所述的药物组合物，其中所述抗血管生成剂是整合蛋白受体抑制剂/拮抗剂。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其中所述整合蛋白受体抑制剂/拮抗剂是含RGD的线性或环状肽。
5.如权利要求4所述的药物组合物，其中所述含RGD的肽是环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)。
6.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述抗血管生成剂是与整合蛋白受体或VEGF受体结合的抗体或抗体的免疫治疗活性片段。
7.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗血管生成剂和TNFα连接在一起形成一个融合分子。
8.如权利要求1-8任一项所述的药物组合物，其还包含至少一种细胞毒性剂和/或化疗剂。
9.如权利要求8所述的药物组合物，其中所述细胞毒性剂是干扰素γ(IFNγ)。
10.如权利要求9所述的药物组合物，其中所述化疗剂选自顺氯氨铂、阿霉素、吉西他滨、多烯紫杉醇、紫杉醇、博来霉素。
11.如权利要求1-8任一项所述的药物组合物，其还包含ErbB受体酪氨酸激酶家族的抑制剂。
12.如权利要求11所述的药物组合物，其中所述的抑制剂是抗EGFR抗体、抗HER2抗体或抗体的免疫治疗活性片断。
13.药物试剂盒，其包含这样的包装，该包装含有(i)至少一种抗血管生成剂、(ii)TNFα或具有TNFα生物活性的分子以及任选地(iii)别的细胞毒性剂和/或化疗剂。
14.如权利要求13所述的药物试剂盒，其包含(i)整合蛋白受体抑制剂/拮抗剂，(ii)TNFα，(iii)IFNγ。
15.如权利要求14所述的药物试剂盒，其包含(i)环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)，(ii)TNFα，(iii)IFNγ。
16.如权利要求13-15任一项所述的药物试剂盒，其中所述药物活性剂在所述包装中各于分开的容器内提供。
17.权利要求1-12任一项所述的药物组合物或权利要求13-16任一项所述的药物试剂盒在制备用于治疗肿瘤和肿瘤转移的药物或药物组合物中的用途。
18.治疗个体的肿瘤或肿瘤转移的方法，其包括同时或相继地给所述个体施用治疗有效量的(i)抗血管生成剂和(ii)TNFα。
19.如权利要求18所述的方法，其包括还给所述个体施用治疗有效量的细胞毒性剂和/或化疗剂。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述细胞毒性剂是IFNγ。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述化疗剂选自顺氯氨铂、阿霉素、吉西他滨、多烯紫杉醇、紫杉醇、博来霉素。
22.如权利要求18-21任一项所述的方法，其包括同时或相继地给所述个体施用治疗有效量的(i)环(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal)、(ii)TNFα和(iii)IFNγ。
23.如权利要求18所述的方法，其包括还给所述个体施用治疗有效量的ErbB受体酪氨酸激酶家族的抑制剂。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述抑制剂是抗EGFR抗体、抗HER2抗体或抗体的免疫治疗活性片断。
全文摘要
本发明涉及用于肿瘤转移治疗的联合疗法，包括施用抗血管生成剂和肿瘤坏死因子α(TNFα)及任选地其它细胞毒性剂如干扰素γ(IFNγ)或化疗剂如抗EGFR抗体。本方法和含有所述药剂的药物组合物可协同地加强各单个治疗剂对肿瘤细胞增殖的抑制效果，得到比单组份单独使用时更有效的治疗效果。
文档编号A61K45/06GK1505527SQ02808876
公开日2004年6月16日 申请日期2002年4月18日 优先权日2001年4月24日
发明者M·格雷尔, S·戈德曼, C·鲁格, M 格雷尔, 侣 申请人:默克专利有限公司