鳐血管生成抑制因子1功能区变体及其应用的制作方法
【专利摘要】鳐血管生成抑制因子1功能区变体及其应用。本发明公开了一种鳐血管生成抑制因子1功能区蛋白及其变体，及其在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用。使本发明的蛋白变体通过真核表达，能够相对于原始蛋白显著的提高癌细胞的抑制效果。
【专利说明】鳐血管生成抑制因子1功能区变体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体地说，本发明涉及鳐血管生成抑制因子I功能区变体。
【背景技术】
[0002]鳐血管生成抑制因子I功能区以下简称鳐功能区，鳐血管生成抑制因子I是从南海海域一种鳐组织中分离出来的蛋白质(分子量42KD)。研究结果显示:鳐血管生成抑制因子I显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜本身的及人鼻咽癌细胞诱导的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成；无论是腹腔注射还是灌胃都显著抑制裸小鼠Lewis肺癌的生长和转移，减少肿瘤组织微血管密度，下调促血管生成因子VEGF的表达；对裸小鼠黑色素瘤B16细胞的转移也有强抑制作用；下调促转移因子⑶44v6和ErBb2的表达；与5-氟尿嘧啶(5-FU)联合应用时效果更显著。鳐血管生成抑制因子I的作用靶点与美国基因技术研究所开发出的抗癌新药Avastin不同。Avastin是基因工程产品，是VEGF的抗体，其作用靶点是VEGF ;鳐血管生成抑制因子I是天然产物，它不仅作用于VEGF，还作用于bFGF和TOGF。
[0003]在现有技术中，为了提高蛋白的活性，针对蛋白的特异位点进行特异性的突变和取代，从而寻找活性更高的变体是常规的做法。为了进一步提高该蛋白的生物活性， 申请人:通过大量的实验，针对鳐血管生成抑制因子I功能区氨基酸序列中特定的位点进行了点突变，从而获得了比鳐血管生成抑制因子I功能区本身具有更高抑制活性的变体。 [0004]发明详述
[0005]本发明涉及亲本蛋白的分离的变体，其在至少一个对应于SEQ ID NO:1的功能区的位置 9R、17F、42H、57S、62R、71K、80N、89P、100G、101R、129A、134E、151Q、163P、189K 或217R的位置包含修饰。具体而言，本发明的变体具有改善的抑制活性。
[0006]优选地，应用于本发明的方法、呈现改善的抑制活性的蛋白变体为以下任一修饰:9R/G、17F/S、42H/D、57S/L、62R/V、71K/R、80N/W、89P/V、100G/E、101R/C、129A/G、134E/S、151Q/N、163P/K、189K/R 或 217R/T。
[0007]本发明还涉及产生本发明的蛋白变体的方法，包括(a)培养宿主细胞；和(b)回收所述蛋白变体。
[0008]在本发明的产生方法中，使用本领域熟知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，可以通过在合适培养基中和允许表达和/或分离所述多肽的条件下进行的摇瓶培养，和实验室或工业发酵罐中的小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)来培养细胞。使用本领域已知的方法在合适的营养培养基中进行培养，所述营养培养基包含碳源和氮源和无机盐。合适的培养基能够从商业供应商获得或可以根据公开的组成制备(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)。如果多肽分泌到营养培养基中，该多肽能够从所述培养基中直接回收。如果多肽不分泌，其能够从细胞裂解物(lysate)回收。
[0009]所得多肽可以使用本领域已知的方法回收。例如，多肽可以通过常规方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
[0010]本发明的多肽可以通过多种本领域已知的方法纯化，所述方法包括但不限于层析(例如，离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳方法(例如，制备型(preparative)等电聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，Protein Purificat1n, J.-C.Janson 和 Lars Ryden 编，VCH Publishers, New York,1989)。
[0011]本发明的多肽用于制备相应的药物，去用于抑制癌症。
【具体实施方式】
[0012]实施例1
[0013]1.鳐血管生成抑制因子I功能区的获得
[0014]鳐功能区由下列氨基酸残基按下列顺序组成:
[0015]TLDIYKQLRDKETPSGFTLDDVIQTGVDNPGHPF1MTVGCVAGDEESYEVFKALFDPVIQDRHGGYKPTDKHKTDLNHENLKG⑶DLDPNYVLSSRVRTGRSIKG1ALPPHCSRGERRLVEKLCLEGLATLTGEFQGKYYPLTTMSDAEQQQL1DDHFLFDKPVSPLLLASGMARDWPDARG1WHNNDKTFLVWVNEEDHLRV1SMQKGGNMKEVFRRFCVGLKK
[0016]2、鳐血管生成抑制因子I功能区变体的构建
[0017]突变点的引入
[0018](I)、根据相应的突变位点设计相应的诱变引物，采用PCR定点突变法在鳐血管生成抑制因子I功能区所对应的基因上把野生型对应的氨基酸位点进行突变；
[0019](2)、上述PCR产物经胶回收纯化后，用限制性内切酶进行酶切，与经过相同酶切的质粒pmD-18T载体片段连接后，转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞；
[0020](3)、鉴定重组质粒:用酶切、PCR方法对重组质粒进行鉴定，并测序检验，由此得到突变后的核苷酸序列。这些核苷酸序列说对应的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1的基础上，在 9R/G、17F/S、42H/D、57S/L、62R/V、71K/R、80N/W、89P/V、100G/E、101R/C、129A/G、134E/S、151Q/N、163P/K、189K/R 或 217R/T 位置进行了相应的突变。
[0021](4)、pPIC6 α -鳐血管生成抑制因子I功能区变体的表达
[0022]将上述步骤构建获得的鳐血管生成抑制因子I功能区变体基因的两端引入酶切位点，在上游加入信号肽序列，构建得到pPicea -鳐血管生成抑制因子I功能区变体载体，鉴定后，将质粒转染毕赤酵母细胞，并进行真核表达，采用Blasticidin作为筛选标记。诱导其分泌表达目的蛋白，发现甲醇浓度为0.5%、连续诱导4天得到的蛋白表达量较高。经SDS-PAGE电泳分离得到的蛋白条带在Westernblot检测中能与兔抗hCG的抗血清发生反应。实验结果表明我们构建的重组质粒PPIC6 α -鳐血管生成抑制因子I功能区变体在巴斯德毕赤酵母中平均的表达量为表达量约为140mg/L。
[0023]3、鳐血管生成抑制因子I功能区变体抑制肿瘤的生长和转移
[0024]BALB/c裸鼠随机分为对照组、阳性(环磷酰胺)对照组和实验组，每组8只，雌雄各半。每鼠背部皮下接种0.2ml Lewis肺癌细胞悬液(4X 106细胞)Lewis肺癌细胞。肿瘤接种后第7天，实验组腹腔注射不同剂量鳐功能区溶液，每天I次，共14次；对照组腹腔注射等量溶剂；阳性对照组腹腔注射环磷酰胺，每周I次，共2次。第21天牺牲小鼠，剥离肿瘤称重(用10%中性福尔马林固定用于免疫组化实验)，解剖、观察并记录肝转移节结数。
按下式计算肿瘤生长抑制率和肿瘤转移抑制率:
[0025]
【权利要求】
1.一种鳐血管生成抑制因子I功能区蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
2.—种鳐血管生成抑制因子I功能区蛋白变体，其特征在于:其在至少一个对应于SEQID NO:I 的成熟多肽的位置 9R、17F、42H、57S、62R、71K、80N、89P、100G、101R、129A、134E、151Q、163P、189K 或 217R 进行取代。
3.—种鳐血管生成抑制因子I功能区蛋白变体，其特征在于，在SEQ ID NO:1所示的氨基酸的基础上，分别在 9R/G、17F/S、42H/D、57S/L、62R/V、71K/R、80N/W、89P/V、100G/E、101R/C、129A/G、134E/S、151Q/N、163P/K、189K/R 或 217R/T 进行相应的取代。
4.如权利要求3所述的蛋白变体在制备抑制肿瘤药物中的用途。
5.一种 抗肿瘤药物制剂，它含有权利要求3所述的蛋白质以及药学上合适的载体。
【文档编号】A61P35/00GK104031136SQ201410249736
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2014年6月6日 优先权日:2014年6月6日
【发明者】张垒, 张勇 申请人:杭州普英生物科技有限公司