专利名称：血管收缩因子及其制备方法和在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明提供一种血管收缩因子及其制备方法和在制药中的应用，属于生物医学领域。
血小板的主要生理功能是参与止血与血栓的形成，并且在动脉粥样硬化、肿瘤转移和炎症反应等过程中起着重要的作用。血小板在这些生理和病理过程中所起的作用与血小板粘附、释放和聚集等活性密切相关。由于上述生理和病理过程中的作用，血小板一直是心血管疾病治疗药物研制，诊断试剂开发的重要靶点(5，6)。
很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼铃蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和泽蛙(Euphlyctis limnocharis)等(7)。这些两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效，已报道药理活性有广谱抗微生物作用、抗肿瘤、局部麻醉、镇痛、免疫调节、心血管系统作用等(7)。另一方面，中药传统的药物成份复杂性和药物炮制方法的局限性，也是造成药源物质成份不能更好发挥作用的重要原因，因而从这些传统药物中寻找特定药理活性的单体化合物是中药现代化的重要内容之一。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药发明的热点(8)。近十几年对几百种两栖类皮肤活性肽和类似物进行了筛选，证明有几十种活性肽有较好的药物开发前景(9)。
我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性蛋白肽类物质的研究还较少。大蹼铃蟾(Bombina maxima)主要分布于我国的云南、四川省，是我国的特色资源动物之一，也是特色的民族民间药物(10)。
发明人将本发明的血管收缩因子轻链的N-端序列经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同和同源系列蛋白。
参考文献1，Banes A et al.，Mechanisms of 5-Hydroxytryptamines2A ReceptorActivation of the Mitogen-Activated Protein Kinase Pathway in VascularSmooth Muscle.J.Pharmacology & Experimental Therapeutics，1999，291，11179-11186.2，Kolch W，Meaningful relationshipsthe regulation of theRas/Raf/MEK/ERK pathway by protein interactions.Biochem.J.，2000，351，289-305.3，陈修，陈维洲，曾贵云，心血管药理学，1998版，北京，人民卫生出版社。4，Katzung BG，Basic and Clinical Pharmacology.6thed，NorwalkAppleton& Lange，1995.5，Gresele P，Agnelli G，Novel approaches to the treatment of thrombosis.Trends Pharmacol.Sci.，2002，23，25-32.6，McCrae KR，Bussel JB，Mannucci PM，Remuzzi G，Cines DB，Plateletsanupdate on diagnosis and management of thrombocytopenic disorders.Hematology(Am Soc Hematol Educ Program)，2001 Jan，282-305.7，江苏新医学院，中药大词典，1997版，上海，上海科学技术出版社。8，Clarke BT，The natural history of amphibian skin secretions，theirnormal functioning and potential medical applications.Biol.Rev.Camb.Philos.Soc.，1997，72，365-379.9，赖仞，赵宇，刘衡，张玉洁，李文辉，张云，两栖类动物皮肤活性物质的利用兼论中国两栖类资源开发的策略。动物学研究，2002，23(1)，65-70。10，叶昌媛，费梁，胡淑琴，中国珍稀及经济两栖动物，1993，成都，四川科学技术出版社。
为实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案血管收缩因子，是我们从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤中分离得到的65KDa血管收缩因子，由3条肽链组成的蛋白质，包括2条相同的轻链和1条重链，轻链在聚丙烯酰胺凝胶电泳上的表观分子量还原条件下和质谱测定都为16KDa，重链在聚丙烯酰胺凝胶电泳上的表观分子量还原条件下和质谱测定都为33KDa，等电点6.2，糖含量17-19％。血管收缩因子轻链的N-端20个氨基酸残基序列是苯丙氨酸—丝氨酸—天冬氨酸—亮氨酸—谷胺酰胺—异亮氨酸—甘氨酸—丝氨酸—亮氨酸—赖氨酸—半胱氨酸—丙氨酸—缬氨酸—丙氨酸—丙氨酸—酪氨酸—天冬氨酸—谷胺酰胺—甘氨酸—丙氨酸(Phe Ser Asp Leu GlnIle Gly Ser Leu Lys Cys Ala Val Ala Ala Tyr Asp Gln Gly Ala NON TER)，重链的N-端封闭。
血管收缩因子的制备方法。大蹼铃蟾，采自云南省山区，采用如下方法之一收集原材料粗品方法1，活体用水清洗干净，处死、剥皮，皮肤被剪成小片，浸于生理盐水，匀浆、离心(10000rpm，20分钟)、冷冻干燥、低温保存；或者是方法2，将活体大蹼铃蟾用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心去除沉淀(10000rpm，20分钟)，收集上清液冷冻干燥。上述任一方法所获原材料粗品采用DEAE Sephadex A-50离子交换，Sephadex G-75凝胶过滤，取第二步柱层析分离出的峰II即可。然后用高效液相色谱(HPLC)，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)方法鉴定其纯度，分子量测定采用MALDI-TOF质谱和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定N-端氨基酸序列结构。
血管收缩因子作为制备心血管疾病治疗药物和诊断试剂的应用。
本发明的有益效果在于该血管收缩因子同时具有收缩血管，诱导血小板聚集的活性，与其他血管收缩因子相比较，具有结构特殊，生物活性强且多样化的特点。
图2为本发明血管收缩因子的Sephadex G-75凝胶过滤层析图。
图3为本发明血管收缩因子导致动脉血管收缩及量效关系图。
图4为本发明血管收缩因子诱导血小板聚集及量效关系图。
第一步，DEAE Sephadex A-50离子交换按照上述方法获得原材料大蹼铃蟾皮肤匀浆液(或者皮肤分泌物)冻干粉，溶解于0.05M Tris-HCl，含10mMEDTA，pH7.3的缓冲液，装于10KDa透析袋，于同样缓冲液透析12小时；DEAESephadex A-50(Pharmacia产品)阴离子交换柱(500mm长，26mm直径)经0.05MTris-HCl，含10mM EDTA，pH7.3缓冲液平衡，已透析好的样品上柱，经两个柱体积同样缓冲液冲洗至穿透峰被完全洗脱，再用含NaCl的缓冲液进行梯度洗脱，收集相应活性成分峰III(
图1)。
第二步，Sephadex G-75凝胶过滤第一步得到的活性成分峰III冻干，溶解于pH7.8，0.05M Tris-HCl，0.1M NaCl，含10mM EDTA缓冲液，上样于SephadexG-75(Pharmacia产品)凝胶过滤柱(1000mm长，26mm直径)，用同样缓冲液洗脱，收集相应活性成分峰II即得到纯化的血管收缩因子(图2)。
然后用高效液相色谱HPLC，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法鉴定其纯度，分子量测定采用MALDI-TOF和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定N-端氨基酸序列结构。
从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤中分离得到的65KDa血管收缩因子，是由3条肽链组成的蛋白质，包括2条相同的轻链和1条重链，轻链在聚丙烯酰胺凝胶电泳上的表观分子量还原条件下和质谱测定都为16KDa，重链在聚丙烯酰胺凝胶电泳上的表观分子量还原条件下和质谱测定都为33KDa，等电点6.2，糖含量17-19％。血管收缩因子轻链的N-端20个氨基酸残基序列是苯丙氨酸—丝氨酸—天冬氨酸—亮氨酸—谷胺酰胺—异亮氨酸—甘氨酸—丝氨酸—亮氨酸—赖氨酸—半胱氨酸—丙氨酸—缬氨酸—丙氨酸—丙氨酸—酪氨酸—天冬氨酸—谷胺酰胺—甘氨酸—丙氨酸，(Phe Ser Asp Leu Gln Ile Gly Ser Leu LysCys Ala Val Ala Ala Tyr Asp Gln Gly Ala NON_TER)。血管收缩因子重链的N—端封闭。
通过上述方法得到的血管收缩因子作为制备心血管疾病治疗药物和诊断试剂的应用。
实施例二1，血管收缩因子收缩动脉血管的作用兔棒击处死后立即取出胸主动脉，剪成2毫米宽的动脉环，动脉环于37℃克氏液保温，同时充入95％的O2和5％的CO2。动脉环加载1克的张力，于克氏液中平衡至收缩力处于稳定状态时，加入不同量溶解于生理盐水的大蹼铃蟾血管收缩因子用离体器官测定仪检测其收缩信号和收缩能力，此试验重复六次，取平均值。结果表明，该血管收缩因子具有显著的引起兔胸主动脉收缩的效应，而且呈现良好的量效关系。在10纳摩尔浓度时，该血管收缩因子可以导致动脉环4.5克的收缩(图3)。
2，血管收缩因子诱导血小板聚集的作用人新鲜富血小板血浆与不同浓度的溶解于生理盐水的血管收缩因子37℃搅拌保温，以血小板积聚仪监测血小板聚集反应。结果表明，该血管收缩因子具有显著的诱导血小板聚集的活性。在10纳摩尔浓度时，该血管收缩因子可以诱导80％的血小板聚集(图4)。
上述实验结果表明该血管收缩因子具有显著的引起兔胸主动脉收缩的效应，而且呈现良好的量效关系。在10纳摩尔浓度时，该血管收缩因子可以导致动脉环4.5克的收缩。另一方面，血小板诱导聚集实验表明，该血管收缩因子具有显著的诱导血小板聚集的活性。在10纳摩尔浓度时，该血管收缩因子可以诱导80％的血小板聚集。
<110>中国科学院昆明动物研究所<120>血管收缩因子及其制备方法和在制药中的应用<160>1<210>1<211>20<212>PRT<213>大蹼铃蟾(Bombina maxima)<220><221>NON TER<222>(20)<400>1Phe Ser Asp Leu Gln Ile Gly Ser Leu Lys Cys Ala Val Ala Ala1 5 10 15Tyr Asp Gln Gly Ala20
权利要求
1，血管收缩因子，其特征是从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤中分离得到的65KDa血管收缩因子，是由3条肽链组成的蛋白质，包括2条相同的轻链和1条重链，轻链在聚丙烯酰胺凝胶电泳上的表观分子量还原条件下和质谱测定都为16KDa，重链在聚丙烯酰胺凝胶电泳上的表观分子量还原条件下和质谱测定都为33KDa，等电点6.2，糖含量17-19％；血管收缩因子轻链的N-端20个氨基酸残基序列是苯丙氨酸—丝氨酸—天冬氨酸—亮氨酸—谷胺酰胺—异亮氨酸—甘氨酸—丝氨酸—亮氨酸—赖氨酸—半胱氨酸—丙氨酸—缬氨酸—丙氨酸—丙氨酸—酪氨酸—天冬氨酸—谷胺酰胺—甘氨酸—丙氨酸；重链的N-端封闭。
2，血管收缩因子的制备方法，其特征是采用如下方法之一收集原材料粗品方法1，取大蹼铃蟾皮肤，在生理盐水中匀浆后，离心去除沉淀，收集上清液冷冻干燥；或者是方法2，将活体大蹼铃蟾用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，滴加无水乙醚，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心去除沉淀、收集上清液冷冻干燥；上述任一方法所获原材料粗品经离子交换，凝胶过滤纯化，即可得到。
3，血管收缩因子作为制备心血管疾病治疗药物和诊断试剂的应用。
全文摘要
本发明涉及一种血管收缩因子及其制备方法和在制药中的应用，属于生物医学领域。该血管收缩因子是从中国两栖类动物大蹼铃蟾皮肤中分离得到的分子量为65KDa由3条肽链组成的蛋白质，包括2条相同的轻链和1条重链，轻链的分子量为16KDa，重链的分子量为33KDa，等电点6.2，糖含量17－19％。血管收缩因子轻链的N－端20个氨基酸序列结构是Phe Ser Asp Leu Gln Ile Gly Ser Leu Lys Cys Ala Val Ala Ala Tyr Asp Gln Gly Ala；重链的N－端封闭。其制备方法是收集大蹼铃蟾皮肤匀浆液或者皮肤分泌物，离心去除沉淀、收集上清液冷冻干燥，经离子交换，凝胶过滤纯化即可得到。该血管收缩因子具有强烈收缩血管，诱导血小板聚集的活性，可作为制备心血管疾病治疗药物和诊断试剂的应用。
文档编号C07K14/435GK1446824SQ0211351
公开日2003年10月8日 申请日期2002年3月25日 优先权日2002年3月25日
发明者张云, 赖仞 申请人:中国科学院昆明动物研究所