具有抗血管生成、抗肿瘤和促凋亡活性的类维生素a衍生物的制作方法

专利名称：具有抗血管生成、抗肿瘤和促凋亡活性的类维生素a衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及类维生素A衍生物，它被赋予抗肿瘤抗血管生成、促凋亡(pro-apoptotic)抗炎活性，具有通式(I) 其中R代表烷基、环烷基、杂环烷基、苯基、取代的苯基、金刚烷基，其中至少一个CH可以取代有C-卤素或C-烷基并且一个CH2可以被O、S、CH-卤素、CH-芳基、CH-杂芳基、CH-芳基烷基、CH-杂芳基烷基、CH-氨基取代；R′代表OR、OCOR、CORIV；R′-D代表O-(CH2)n-O；其中n＝1-3；D代表H、OH、O-烷基、(CH2)n-NH2、(CH2)n-NH-烷基、(CH2)n-OH，其中n＝1-4；R″代表四唑、SO3H、NHSO3H、CHO、COOH、COO-烷基.CONHOH、CONH-芳基、CONH-C6H4OH、CH2OR；PO3H2；CO-(CH2)n-芳基，其中n＝0-4；R代表H、烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、SO3H、α或βD-和L-糖基；RIV代表H、OH、OR；[A]代表[C(RV，RVI)-C(RVII，RVIII)]n、[C(RIX)＝C(RX)]n、[C≡C]n，其中n＝0-3；
RV、RVI、RVII、RVIII代表H、烷基、卤素、OH、OR、NO2、NH2、芳基、-O-、-CH2-、CX2-(其中X是卤素)、-CH(R)-；RIX、RX代表H、OH、卤素、烷基、芳基、CN、NO2、COOR。
维生素A及其生物活性衍生物维生素A醛和维生素A酸，在视觉方面起着重要作用，是生殖系统必需的，在胚胎生长期间起形态发生剂的作用，并以有机体的生长为基础调节大范围的细胞类型的生长和分化[M.Sporn，A.Roberts，D.Goodman，The Retinoids，Raven Press，New York1994]。维生素A酸及其衍生物的生物作用是通过与属于两个家族的核受体相互作用介导的第一个名为RAR(维生素A酸受体)，第二个名为RXR(类维生素AX受体)[P.Chambon，FASEB J.，1996，10，940-54]。每一家族分成3个亚型(α、β、γ)，它们由三个不同的基因编码。
全-反式-维生素A酸(ATRA)与RAR和RXR结合，而9-顺式RA仅与RXR结合。
类维生素A，无论是天然还是合成的维生素A类似物，都对细胞增殖、分化和凋亡产生重大影响这些性能被充分开发用于控制肿瘤和皮肤病学病理情况、以及与变化的血管生成有关的病理情况。
成年人中的血管生成在正常情况下是静止的，但是它代表一种正常功能，例如在伤口愈合，或者在女性生殖周期期间子宫内膜的重建中。
当血管功能降低以及组织灌注不足时，这种血管生成反应受到生理刺激。
更一般地，可以断言，在生理条件下，血管生成构成正反馈以响应不足灌注、或者氧和营养物质的供应降低，例如在动脉闭塞的情况下，在组织物质生长的情形下发生(例如，伴随形成肌肉组织的新血管形成)；以及在与氧和营养物质需求增加有关的工作负荷增加的情况下发生。
在局部缺血的时候，由于动脉部分或完全闭塞，为维持灌注，必需要形成侧支血管。
众所周知，原发肿瘤的生长得到肿瘤组织的良好血管形成的支持。适当供给氧和营养物质促进了肿瘤自身的快速生长。
已证实血管生成的程度在肿瘤的预后方面可以是一个极其负面的因素(van Hinsbergh VW，Collen A，Koolwijk P；Ann.Oncol.，10 Suppl.，460-3，1999；Buolamwini JK；Curr.，Opin.，Chem.，Biol.，3(4)500-9，1999Aug.)。
还了解到，肿瘤细胞生物学方面的基础阶段是获得转移能力。
转移的肿瘤细胞能够丧失与周围结构的粘附性，侵入血管和淋巴管并在它们能够继续复制其自身的远处其它组织定殖。
转移在疾病的临床史上也是一个关键的事情，它是因癌症死亡的主要原因。它与肿瘤位置或相邻区域存在血管组织密切相关并受其促进。
肿瘤细胞穿过周围结构的迁移使这些细胞能够到达肿瘤内血管，无论是预先存在还是由新血管生成而形成，并因此到达血流(Ray JM.，Stetler-Stevenson WG；Eur.Respir.J.，7(11)2062-72，1994；Stetler-Stevenson WG，Liotta LA，Kleiner DE Jr；FASEB J.，7(15)1434-41，1993 Dec.)。
在肿瘤的血管区在淋巴管和血管之间存在交通使赘生细胞能够在这两种血管系统中移动。
最近研究已显示了血管生成和关节炎疾病之间的直接关系(KochAE；Arthritis and Rheumatism 41951-962，1998)。具体地说，已证实关节软骨的新-血管形成在关节翳形成和关节炎进展中起着至关重要的作用。正常的软骨没有血管，而关节炎患者的滑液含有一种由内皮细胞产生的血管生成刺激因子(EASF)。
这种因子的存在与血管形成和软骨降解有关。
其它疾病也与异常的血管生成有关。
已发现在糖尿病性视网膜病[Histol Histopathol 1999 Oct；14(4)1287-94]、牛皮癣[Br.J.Dermatol.1999 Dec；141(6)1054-60]、慢性炎症和动脉粥样硬化[Planta Med.1998 Dec；64(8)686-95]中，受影响的组织的新血管形成是一种促进因子。
因此控制新血管形成是控制和治愈这些疾病的一个基本要素。
已经了解到可用于治疗癌症或具有抗血管生成活性的类维生素A。
一种属于最近一代类维生素A的化合物，CD437(Cancer Research，2002；62(8)，2430-6；Blood，2000；95，2672-82；Leukemia，1999，13，739-49；Cancer Letters，1999，137，217-2)对RARγ具有选择性，在乳房癌、黑素瘤和宫颈癌细胞系中抑制细胞生长并诱导凋亡，这些细胞系包括那些对ATRA耐药的，其作用机理不依赖于受体结合(WO9703682；J.Med.Chem.1995，38，4993-5006)。CD437和其它衍生物如顺式-TTNPB衍生物(即四甲基-四氢-萘基-丙烯基苯甲酸酯)，在开发新的凋亡诱导剂方面起着引导作用。
并列地，一些通过合成获得的类维生素A，诸如TAC-101[Clin.Cancer Res.1999，5，2304-10]或衍生物如RE-80、AM-580或Am-80[Eur.J.Pharmacol.1993，249，113-6]已显示抗血管生成性能。
尽管近年来有所进展，涉及发现用于治疗肿瘤疾病和特征为异常血管生成的疾病的新药的药理学研究仍被许多医药专家认为是最有希望的领域之一。
事实上，迄今为止仍然强烈地意识到需要能够阻断或干扰肿瘤疾病和因异常血管生成引起的疾病的新化合物。如上所述，这些疾病包括肿瘤、肿瘤转移、慢性炎症、关节炎疾病、糖尿病性视网膜病、牛皮癣、慢性炎症和动脉粥样硬化。
现已出人意料地发现，通式(I)的化合物被赋予抗肿瘤、促凋亡和抗血管生成的活性。
本发明的式(I)的化合物在以前从未描述过。
因此通式(I)的化合物是本文所述的本发明的目的。
本文所述的本发明的另一目的是通式(I)的化合物及其在医学领域的用途。
本文所述的本发明的另一目的是通式(I)的化合物及其制备方法。
本文所述的本发明的另一目的是一种含有式(I)化合物作为活性组分以及至少一种药用可接受的赋形剂和/或稀释剂的药物组合物。
本发明的另一目的涉及式(I)的化合物用于制备治疗与变化的血管生成有关的病理情况的药物的用途，其中该病理情况选自关节炎病理情况、肿瘤、转移、糖尿病性视网膜病、牛皮癣、慢性炎症疾病和动脉粥样硬化。
本发明的另一目的涉及式(I)的化合物用于制备治疗肿瘤的药物的用途，其中抗肿瘤活性为细胞毒性性质、和/或凋亡性质、和/或抗血管生成性质；其中肿瘤选自肉瘤、癌、类癌、骨肿瘤、神经内分泌肿瘤、淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、单核细胞白血病、巨核细胞白血病、急性早幼粒细胞白血病或霍奇金病。
本发明的另一目的涉及式(I)的化合物用于制备可用于预防和治疗肿瘤转移的药物的用途。
如上所述，原发肿瘤的生长受到肿瘤组织的良好血管形成促进，并且新血管生成的程度可能是赘生物预后方面的高度负面因子。事实上，在肿瘤部位充足供应氧和营养物质促进肿瘤本身快速生长。
众所周知，可以为医师利用来治疗肿瘤的抗肿瘤药仍然不能阻止许多患者死于这些疾病。还公知大多数肿瘤患者不用单一抗癌药物治疗，而是用几种抗癌药物的组合治疗。需要联合施用抗癌药源于以下事实通过在不同代谢水平起作用，在某些情况下它们有利于肿瘤完全缓解，而在其它情况下它们延长了患者的寿命和/或改善了所治疗患者的生活质量。
迄今仍然强烈意识到需要新的化合物与已知抗肿瘤化合物联合使用。
本文所述的本发明的化合物可以与一种或多种抗肿瘤药联合使用。
本文所述的本发明的另一目的是一种或多种式(I)的化合物与一种或多种已知的抗癌药的组合，其中抗癌药选自烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、抗微管蛋白药、嵌入化合物、抗代谢物、天然产物诸如长春花属生物碱、表鬼臼毒素、抗生素、酶、taxans、细胞分化化合物、磷酸酪氨酸激酶抑制剂诸如Iressa或Glivec、TRAIL(与肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体)、DR4或DR5受体的激动剂(TRAIL的位点)、免疫学抗肿瘤治疗用的化合物、抗肿瘤疫苗、或干扰素α、β、γ。
本文所述的本发明的另一目的是一种药物组合物，包括一种或多种式(I)的化合物与一种或多种已知的抗癌药的组合，和一种或多种药用可接受的赋形剂或载体。
本文所述的本发明的另一目的是一种或多种式(I)的化合物与一种或多种已知的抗癌药用于制备治疗肿瘤的药物的用途。
本文所述的本发明的另一目的是一种或多种式(I)的化合物与一种或多种已知的抗癌药用于制备治疗肿瘤的药物的用途，特征在于式(I)的化合物作为抗癌药的辅助物存在。
下面的实施例描述本发明。
一般合成步骤式(I)的化合物是通过以下反应制得将式(II)的化合物 其中R、R′和D具有式(I)中所述的含义，X代表卤素；与4-甲酰基硼酸在Miyaura-Suzuki反应中反应(Chem.Rev.1995，95，2457-83)，得到式(III)的醛。

使式(III)的化合物(其中R、R′和D具有前面所述的含义)按照文献[例如Wittig(Org.Reactions，Vol.14)、Wadsworth-Horner-Emmons(Org.Reactions，Vol.25)、Knoevenagel(Org.Reactiohs，Vol.15)、Henry(Houben-Weyl，Methoden der organischen Chemie，Vol.10/1，p.250)、Darzens(Org.Reactions，Vol.5)等的反应]所述的熟知步骤反应，得到通式(I)的化合物，其中[A]代表C(RV，RVI)＝C(RVII，RVIII)并且RV、RVI、RVII、RVIII代表H、烷基、卤素、OH、OR、NO2、NH2、芳基、-O-，或者其中[A]代表C≡C。
或者，通式(I)的化合物可以由通式(II)的化合物通过根据Miyaura-Suzuki(Chem.Rev.1995.95，2457-83)与通式(IV)的硼酸的反应制得 其中A和R″具有前面所述的含义。
或者，通式(I)的化合物，其中[A]代表C(RV，RVI)＝C(RVII，RVIII)或C≡C，可以如下制得从通式(V)的化合物开始 其中R、R′和D具有前面所述的含义，X代表卤素；通过已知方法，例如通过Heck(Org.Reactions，Vol.27)所述的在有金属或有机金属催化剂存在的情况下与取代的烯或炔反应。
或者，通式(I)的化合物，其中[A]代表C(RV，RVI)＝C(RVII，RVIII)或C≡C可以从通式(I)的化合物开始，其中R和D是H并且R′具有前面所述的含义，通过与醇，例如金刚烷-1-醇、1-甲基-1-环己醇、叔丁醇等，在有硫酸或其它酸作为催化剂存在的情况下的烷基化反应制得，例如Charpentier等人(J.Med.Chem.1995，38，4993-5006)所述。用类似反应和合适醇可以从通式(I)的化合物(其中D是H而R，R′具有前面所述的含义)开始制备通式(I)的化合物。
通式(I)的化合物，其中[A]代表C(RV，H)-C(H，RVIII)并且RV、RVIII代表-CH2-，可以由通式(I)的化合物(其中[A]代表C(RV，RVI)＝C(RVII，RVIII))通过文献中已知的环丙烷化反应制得，例如Simmons-Smith所述的反应和类似反应，例如J.Am.Chem.Soc.1959，81，4256或J.Am.Chem.Soc.1981，103，5813中所述，或者由通式(I)的化合物(其中A是CH＝CH2，并且R″是H)通过与重氮基乙酸乙酯的反应制得。通式(I)的化合物，其中[A]代表C(RV，H)-C(H，RVIII)并且RV、RVIII代表-O，可以由通式(I)的化合物(其中[A]代表C(RV，RVI)＝C(RVII，RVIII))通过文献中已知的环氧化反应，例如与二氧杂环丙烷或类似物反应制得，如Yang和同事在J.Org.Chem.，1995，60，3887-9中所述。
通式(I)的化合物，其中[A]代表C-C，可以由通式(I)的化合物(其中[A]代表C(RV，RVI)＝C(RVII，RVIII)或C≡C)通过已知的对双键或三键的还原反应例如催化氢化反应制得。
通式(I)的化合物，其中R″代表CONHOH，可以从通式(I)的化合物(其中R″代表COOH)开始，通过用于合成异羟肟酸的文献中已知的步骤制得，例如通过与O-苄基羟基胺和缩合剂反应[De Luca等人J.Org.Chem.，2001，66，2534]，接着催化氢化，或者与O-三甲基甲硅烷基羟基胺反应，接着去甲硅烷基。
通式(I)的化合物，其中R″代表CONH芳基，可以由通式(I)的化合物(其中R″代表COOH)通过用于合成酰胺类的文献中已知的步骤制得，例如Sangmam等人(Synth.Commun.，1998，28，2945-58)用于维生素A酸酰胺所述。
通式(I)的化合物，其中R″代表CH2OH，可以从通式(I)的化合物(其中R″代表COOH)或者由其酯或衍生物通过用于合成醇的文献中已知的步骤例如用LiAlH4还原制得。
实施例14-(3-(1-金刚烷基)-4-叔丁基二甲基-甲硅烷氧基苯基)苯甲醛的制备按照如下报道的合成

图1制备标题化合物。
合成图1 将1.56g(3.70mmol)4-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-3-(1-金刚烷基)-溴苯[Charpentier等人J.Med.Chem.，1995，38，4993-5006]溶解在7.5ml甲苯中。加入3.7ml的2M Na2CO3水溶液、0.128g(0.11mmol)四-三苯膦-钯，并加入610mg(4.07mmol)4-甲酰基苯硼酸的1.73ml乙醇溶液。在氮气流下将由此获得的溶液回流2小时。然后将溶液冷却，用乙酸乙酯吸收，并用NaCl饱和溶液洗涤。
将各相分离，将有机相过滤，在Na2SO4上干燥，再次过滤，将溶剂蒸发，并将残余物在硅胶(Merck)上使用己烷∶乙酸乙酯3∶1作为洗脱剂进行闪蒸色谱。
获得1.09g标题化合物。
熔点158℃。
1HNMR(CDCl3)δ0.37(6H，s，-Si(CH3)2)；1.05(9H，s，-t-Bu)；1.78(6H，s，6Ad.)；2.09(3H，s，3Ad.)；2.15(6H，s，6Ad.)；6.88(1H，d，1Ar，J＝8.54Hz)；7.35(1H，dd，1Ar，J＝2.24Hz，J＝8.54Hz)；7.51(1H，d，1Ar，J＝2.24Hz)；7.70(2H，d，2Ar，J＝8.14Hz)；7.90(2H，d，2Ar，J＝8.14Hz)；10.01(1H，s，-CHO)。
实施例2
E-4(3-(1-金刚烷基)-4-叔丁基二甲基-甲硅烷氧基苯基)肉桂酸甲酯的制备按照下面的合成图2制备标题化合物。
合成图2 将386mg(0.864mmol)4-(1-叔丁基二甲基甲硅烷氧基-2-(1-金刚烷基)苯基))-苯甲醛溶解在4.5ml氯仿中，加入298mg(0.864mmol)三苯基亚正膦基乙酸甲酯(methyl triphenylphosphoranylidenacetate)，并将由此获得的溶液回流3小时。将溶液冷却，蒸发掉溶剂，然后在硅胶(Merck)上，使用己烷∶CH2Cl21∶1作洗脱剂经受闪蒸色谱。获得350mg标题化合物。
熔点148℃。
1HNMR(CDCl3)δ0.36(6H，s，-Si(CH3)2)；1.05(9H，s，-t-Bu)；1.77(6H，s，6Ad.)；2.08(3H，s，3Ad.)；2.15(6H，s，6Ad.)；3.80(3H，s，-OCH3)；6.44(1H，d，-CH＝，J＝16.07Hz)；6.86(1H，d，1Ar，J＝8.54Hz)；7.30(1H，dd，1Ar，J＝2.24Hz，J＝8.54Hz)；7.47(1H，d，1Ar，J＝2.24Hz)；7.50-7.70(4H，m，4Ar)；7.71(1H，d，CH＝，J＝16.07Hz)。
实施例3E-4-(3-(1-金刚烷基)-4-羟基苯基)肉桂酸甲酯的制备按照下面的合成图3制备标题化合物。
合成图3 将1g(2.6mmol)2-(1-金刚烷基)-4-(4-溴苯基)苯酚、358mg(4.16mmol)丙烯酸甲酯、5.8mg(0.02mmol)乙酸钯和30mg(0.1mmol)三-(邻甲苯基)-膦在1.2ml三乙胺中的混合物回流4小时。将三乙胺蒸发，用2N HCl和乙酸乙酯吸收，分离有机相，用水洗涤，在Na2SO4上干燥并将溶剂蒸发。得到640mg产物。
熔点＞240℃。
1HNMR(DMSO-d6)δ1.75(6H)，2.1(9H)，3.72(s，3H，OCH3)，6.63(d，1H，J＝16Hz)，6.85(dd，1H，J＝8.8，1.8Hz)，7.3-7.4(2H arom.)，7.55-7.85(5H)，9.55(s，1H，OH)。
实施例4E-4-(3-(1-金刚烷基)-4-羟基苯基)肉桂酸的制备(ST 1926)按照下面的合成图4制备标题化合物。
合成图4 将42mg(1mmol)LiOH.H2O溶解在8.2 ml THF(四氢呋喃)∶H2O 1∶1中，加入100mg(0.2mmol)E-4(3-(1-金刚烷基)-4-叔丁基二甲基甲硅烷氧基苯基)肉桂酸甲酯，并将由此获得的溶液在室温下搅拌3小时。将THF蒸发，用2N HCl酸化，用乙酸乙酯萃取并在Na2SO4上干燥。
过滤并蒸发，然后在硅胶(Merck)上用己烷∶乙酸乙酯2∶3，接着1∶1作洗脱剂经受闪蒸色谱。获得55mg产物。
熔点＞240℃。Rf＝0.50(Merck硅胶60F254，EtOAc)1HNMR(DMSO-d6)δ1.74(6H，s，6Ad.)；2.04(3H，s，3Ad.)；2.12(6H，s，6Ad.)；6.51(1H，d，-CH＝，J＝16.18Hz)；6.85(1H，d，1Ar，J＝8.82Hz)；7.30-7.40(2H，m，2Ar)；7.55-7.63(3H，m，2Ar+CH＝)；7.70(2H，d，2Ar，J＝8.09Hz)；9.54(1H，s，-OH)；12.34(1H，brs，-COOH)。
MS(m/z)374(M+，100)。
实施例54-(3-(1-金刚烷基)-4-甲氧基苯基)丙炔酸甲酯的制备按照下面的合成图5制备标题化合物。
合成图5 将301mg(1.26mmol)4-溴苯基丙炔酸甲酯溶解在2.5ml甲苯中，加入1.34ml 2M Na2CO3的水溶液，然后加入43.7mg Pd-四三苯膦，最后加入398mg(1.39mmol)3-(l-金刚烷基)-4-甲氧基苯基硼酸，将该混合物回流3小时。粗产物在乙醚中吸收，有机相用饱和NaCl溶液洗涤，在Na2SO4上干燥，蒸发至干，得到570mg粗产物。在硅胶(Merck)上用己烷∶乙酸乙酯2∶1作洗脱剂经过闪蒸色谱，得到15mg纯产物。
熔点175℃。
1H-NMR(CDCl3)δ3.86(s，3H，OCH3)，3.90(s，3H，OCH3)，6.96(d，1H，J＝8.5)，7.43(dd，1H，J＝2.2，8.5)，7.47(d，1H，J＝2.2)，7.55.7.70(4Harom.)。
实施例64-(3-(1-金刚烷基)-4-甲氧基苯基)丙炔酸的制备(ST 1879)按照下面的合成图6制备标题化合物。
合成图6 将15mg(0.0374mmol)E-4-(3-(l-金刚烷基)-4-甲氧基苯基)丙炔酸甲酯溶解在2.14ml 0.7N NaOH的甲醇溶液中，并将该混合物回流1小时。蒸发掉甲醇，在水中吸收，并用6N HCl酸化，用乙醚萃取。在Na2SO4上干燥并蒸发掉溶剂之后，残余物用己烷洗涤，过滤之后获得10mg产物。
熔点156℃。Rf＝0.41(Merck硅胶60F254，EtOAc/MeOH 2/1)1H-NMR(DMSO-d6)δ1.70(s，6H)，2.10(s，9H)，3.85(s，3H，OCH3)，7.05(d，1H，J＝8.4，H-6′)，7.40(d，1H，J＝2，H-2′)，7.45-7.60(3H arom.)，7.65(2H arom.)实施例7E-4-(3-(l-金刚烷基)-4-甲氧基苯基)肉桂醇的制备按照下面的合成图7制备标题化合物。
合成图7 将375μl的1M LiAlH4的四氢呋喃溶液(0.365mmol)加入到5ml无水四氢呋喃中，在冰浴中冷却，加入151mg(0.375mmol)E-4-(3-(1-金刚烷基)-4-甲氧基苯基)肉桂酸甲酯(参见实施例19)，冷却下搅拌1小时，然后在室温下搅拌过夜。在冰浴中冷却之后，加入5ml 10％NH4Cl的水溶液，将四氢呋喃蒸发，然后用乙酸乙酯吸收。分离有机相并在Na2SO4上干燥。蒸发掉溶剂，获得126mg粗产物，在硅胶(Merck)上用二氯甲烷∶己烷3∶1，然后再用己烷∶乙酸乙酯28∶72作洗脱剂色谱，得到11mg产物。
熔点148℃。
1H-NMR(CDCl3)δ1.75(s，6H)，2.15(9H)，3.90，s，3H，OCH3)，4.38(dd，2H，J＝6，1.6)，6.41(dt，1H，J＝6，16，＝CHCH2OH)，6.67(dd，1H，J＝1.6，16，芳基CH＝)，6.96(d，1H，J＝8.3，H-6′)，7.42(dd，1H，J＝2.2，8.3，H-5′)，7.45(m，2H，H-2 e H-6)，7.48(d，1H，J＝2.2，H-3′)，7.55(m，2H，H-3e H-5)MS m/z 374(M+)。
实施例8E-4-(4-羟基苯基)肉桂酸甲酯的制备按照下面的合成图8制备标题化合物。
合成图8 将2g(8.03mmol)4-(4-溴苯基)苯酚、1.1g(12.8mmol)丙烯酸甲酯、18mg(0.08mmol)乙酸钯和94mg(0.31mmol)三-(邻甲苯基)膦在3.7ml三乙胺中的混合物回流6小时。加入另外6mg乙酸钯和30mg三-(邻甲苯基)膦并加热1小时，然后加入另外30mg乙酸钯和94mg二三-(邻甲苯基)膦并加热3.5小时。然后将反应物用6M HCl酸化，加入乙酸乙酯，并搅拌一段时间以溶解沉淀物，将各相分离，有机相在Na2SO4上干燥并将溶剂蒸发。粗产物(934mg)通过在己烷/乙醚中吸收纯化并过滤出得到1.7g标题产物。
熔点233-235℃1HNMR(CDCl3)δ3.70(s，3H，OCH3)，6.13(d，1H，CH＝，J＝16)，6.82(d，2H，H-3′e H-5′)，7.48，d，2H，H-2′e H-6′)，7.6-7.75(5H)。
实施例9E-4-(3-(1-甲基环己基)-4-羟基苯基)肉桂酸甲酯的制备按照下面的合成图9制备标题化合物。
合成图9
将150mg(0.6mmol)E-4-(4-羟基苯基)肉桂酸甲酯和68.5mg 1-甲基-l-环己醇溶解在1.2ml CH2C12中，用0.032ml浓H2SO4处理并将该混合物回流1天。加入水并用饱和碳酸氢钠溶液将混合物中和。水相用乙酸乙酯萃取几次，在Na2SO4上干燥，过滤并蒸发。所得粗产物在硅胶(Merck)上用己烷∶乙酸乙酯9∶1作洗脱剂闪蒸色谱。获得20mg产物。
1HNMR(丙酮-d6)δ1.43(3H，s，-CH3)；1.4-1.9(8H，m，cyclohex.)；2.3-2.45(2H，m，cyclohex.)；3.80(3H，s，-OCH3)；6.60(1H，d，CH＝，J＝16.18Hz)；7.0(1H，d，1Ar，J＝8.2Hz)；7.44(1H，dd，1Ar，J＝8.2Hz，2.2Hz)；7.65(1H，d，1Ar，J＝2.2Hz)；7.7-7.85(5H，m，4Ar+CH＝)；8.65(1H，s，-OH)。
实施例102-(l-金刚烷基)-4-溴-6-N-邻苯二甲酰亚氨基甲基)苯酚的制备按照下面的合成图10制备标题化合物。
合成图10 向500mg(1.63mmol)2-金刚烷基-4-溴苯酚的7ml二氯甲烷溶液中加入289mg(1.63mmol)N-羟基甲基邻苯二甲酰亚胺和2滴浓H2SO4。将该混合物回流3小时，用水稀释，并用二氯甲烷萃取。将溶剂蒸发并在硅胶上用己烷∶乙酸乙酯80∶20作洗脱剂色谱，得到348mg(46％)产物。
熔点253℃。
1HNMR(CDCl3)δ1.78(6H，s，6Ad.)；2.09(3H，s，3Ad.9；2.12(6H，s，6Ad.)；4.76(2H，s，-CH2-)；7.28(1H，d，1Ar，J＝2.94Hz)，7.45(1H，d，1Ar，J＝2.94Hz)；7.76(2H，dd，2Ar，J＝2.94Hz，J＝5.52Hz)；7.88(2h，dd，2Ar，J＝2.94Hz，J＝5.52Hz)；8.13(1H，s，-OH)。
实施例11E-4-(3-(1-金刚烷基)-5-(N-邻苯二甲酰亚氨基甲基)-4-羟基苯基)肉桂酸甲酯的制备按照下面的合成图11制备标题化合物。
合成图11 将100mg 2-(l-金刚烷基)-4-溴-6-N-邻苯二甲酰亚氨基甲基)苯酚悬浮于1.6ml二噁烷中并在氮气流下；加入59.7mg(双频哪酸)硼(boro(bispinacolate))、63mg无水乙酸钾、5mg二氯(二苯膦二茂铁)钯和103mg 4-溴肉桂酸甲酯。将其回流2小时，重悬于乙酸乙酯中，用1ml的2M HCl酸化，有机相用饱和NaCl溶液洗涤，在Na2SO4上干燥，蒸发掉溶剂并在硅胶上用己烷∶乙酸乙酯65∶35色谱。得到32mg(27％)产物。
熔点216℃。
1HNMR(CDCl3)δ1.78(6H，s，6Ad.)；2.09(3H，s，3Ad.)；2.12(6H，s，6Ad.)；3.83(3H，s，-OCH3)；4.90(2H，s，-CH2-)；6.44(1H，d，CH＝，J＝16.18 Hz)；7.45-7.90(11H，m，10 Ar+CH＝)；8.22(1H，s，OH)。
MS(m/z)547(M+，100)；400(30)；160(30)。
实施例12E-4-(3-(1-金刚烷基)-5-(N-邻苯二甲酰亚氨基甲基)-4-羟基苯基)肉桂酸的制备按照下面的合成图12制备标题化合物。
合成图12 将30mg E-4-(3-(l-金刚烷基)-5-(N-邻苯二甲酰亚氨基甲基)-4-羟基苯基)肉桂酸甲酯加入到1ml的乙酸和37％盐酸的3∶1混合物中，将该混合物回流30小时。将乙酸蒸发，然后用水吸收，将固体残余物过滤，并用水洗涤。得到24mg产物。
熔点216℃。
1HNMR(DMSO-d6)δ1.73(6H，s，6Ad.)；2.04(3H，s，3Ad.)；2.12(6H，s，6Ad.)；4.81(2H，s，-CH2-)；6.45(1H，d，-CH＝，J＝16.18 Hz)；7.07(1H，d，1Ar，J＝1.84Hz)；7.30(1H，d，1Ar，J＝1.84Hz)；7.46(2H，dd，2Ar，J＝8.82Hz，J＝1.84Hz)；7.53(1H，d，-CH＝，J＝16.18Hz)；7.64(2H，dd，2Ar，J＝8.82Hz，J＝1.84Hz)；7.78-7.94(4H，m，4Ar)；8.60(1H，s，-OH)；12.5(1H，brs，COOH)。
MS(m/z)533(M+，100)；386(40)；160(60)130(50)。
实施例13E-4-(3-(1-金刚烷基)-5-(氨基甲基)-4-羟基苯基)肉桂酸的制备按照下面的合成图13制备标题化合物。
合成图13
将20mg E-4-(3-(1-金刚烷基)-5-(N-邻苯二甲酰亚氨基甲基)-4-羟基苯基)肉桂酸悬浮于0.15ml甲醇中，加入0.013ml水合肼，在50℃下将该混合物加热5小时。将溶剂蒸发，重悬于水中，用2M HCl酸化并在真空下将沉淀物过滤。将粗产物干燥，用四氢呋喃处理以溶解邻苯二甲酰肼，并过滤。
熔点195℃1HNMR(DMSO-d6)δ1.73(6H，s，6Ad.)；2.04(3H，s，3Ad.)；2.12(6H，s，6Ad.)；4.00(2H，s，-CH2-)；6.45(1H，d，-CH＝，J＝16.18Hz)；7.07-8.00(5H，m，5Ar)。
实施例144-(7-金刚烷-1-基-苯并(1，3)二氧戊环-5-基)-苯甲醛的制备按照下面的合成图14制备标题化合物。
合成图14 将0.875g(2.61mmol)4-金刚烷-1-基-6-溴-苯并(1，3)二氧戊环溶解在5.2ml甲苯中，并加入2.6ml 2M Na2CO3水溶液、0.090g(0.08mmol)四-三苯膦-钯、和0.430g(2.87mmol)4-甲酰基苯硼酸的1.2ml乙醇溶液。在氮气流下将其回流7小时。将其冷却，在乙酸乙酯中吸收，并用饱和NaCl溶液洗涤。有机相在Na2SO4上干燥，过滤并将溶剂蒸发。在硅胶(Merck)上用己烷∶乙酸乙酯9∶1作洗脱剂闪蒸色谱之后，得到0.66g产物(70％)。
1HNMR(CDCl3)δ1.80(6H，s，6Ad.)；2.09(3H，s，3Ad.)；2.12(6H，s，6Ad.)；6.02(2H，s，-CH2-)；7.01(1H，d，1Ar，J＝1.86Hz)；7.04(1H，d，1Ar，J＝1.86Hz)；7.68(2H，d，2Ar，J＝8.19Hz，)；7.92(2H，d，2Ar，J＝8.19Hz，)；10.02(1H，s，-CHO)。
实施例15E-4-(7-金刚烷-1-基-苯并(1，3)二氧戊环-5-基)-肉桂酸甲酯的制备按照下面的合成图15制备标题化合物。
合成图15 在氮气下将300mg的4-(7-金刚烷-1-基-苯并(1，3)二氧戊环-5-基)苯甲醛的4.5ml CHCl3溶液用278mg三苯基亚正膦基乙酸甲酯处理并回流5小时，3小时之后再加入叶立德(20％)。在该段时间结束时将溶剂蒸发，并且残余物在硅胶上用己烷∶二氯甲烷45∶55作洗脱剂色谱。得到298mg产物。
熔点205℃。
1HNMR(CDCl3)δ1.72(6H，s，6Ad.)；2.06(3H，s，3Ad.)；2.12(6H，s，6Ad.)；3.80(3H，s，-OCH3)；5.97(2H，s，-CH2-)；6.44(1H，d，-CH＝，J＝16Hz)；6.95(1H，d，1Ar，J＝1.86Hz)；6.98(1H，d，1Ar，J＝1.86Hz)；7.52-7.58(4H，m，4Ar)；7.71(1H，d，-CH＝，J＝16Hz，)。
实施例16E-4-(7-金刚烷-1-基-苯并(1，3)二氧戊环-5-基)-肉桂酸的制备按照下面的合成图16制备标题化合物。
合成图16 将200mg(0.48)E-4-(7-金刚烷-1-基-苯并(1，3)二氧戊环-5-基)-肉桂酸甲酯悬浮于LIOH.H2O的25ml THF/H2O 3∶2溶液中并在室温下搅拌过夜。将THF蒸发，羧酸酯悬液用己烷洗涤，然后用2N HCl酸化，并在冰浴中冷却。过滤之后得到150mg(78％)产物。
熔点＞300℃。Rf＝0.59(Merck硅胶60F254，EtOAc/己烷9/1)1HNMR(DMSO-d6)δ1.72(6H，s，6Ad.)；2.01(3H，s，3Ad.)；2.12(6H，s，6Ad.)；6.01(2H，s，-CH2-)；6.52(1H，d，-CH＝，J＝16.18Hz)；6.99(1H，d，1Ar，J＝1.84Hz)；7.14(1H，d，1Ar，J＝1.84Hz)；7.60(1H，d，-CH＝，J＝16.18Hz)；7.62(2H，dd，2Ar，J＝8.46Hz，1.84Hz)；7.68(2H，dd，2Ar，J＝8.46Hz，1.84Hz)。
实施例172-[4-(3-(1-金刚烷基)-4-羟基苯基)]环丙烷甲酸甲酯的制备按照下面的合成图17制备标题化合物。
合成图17
将0.5mg四乙酸铑二水合物和36μl重氮基乙酸乙酯加入到150mg(3-金刚烷-1-基-4′-乙烯基联苯基-4-氧基)叔丁基二甲基甲硅烷(由相应的醛通过Wittig反应制得)的2ml二氯甲烷溶液中。室温下将反应物静置5天，加入总共5mg催化剂和10μl重氮基乙酸乙酯。经硅藻土将催化剂过滤，在硫酸钠上干燥，蒸发，在硅胶上用65∶35己烷∶乙酸乙酯的混合物色谱。
获得43mg两种非对映异构体顺式和反式的混合物。
1HNMR(CDCl3)δ0.45(6H，s，-Si(CH3)；0.95(3H，t，-CH3，J＝7Hz)；1.1(9H，s，tBu)；1.25(3H，t，-CH3，J＝7Hz)；1.35-1.55(1H，m，1-CH2)；1.55-1.74(1H，m，1-CH2)；1.79(6H，s，6Ad.)；1.95(1H，m，-CH-COOEt)2.07(3H，s，3Ad.)；2.12(6H，s，6Ad.)；2.48-2.65(1H，m，-CH-Ar)；3.85(2H，q，-OCH2，J＝7Hz)；4.18(2H，q，-OCH2，J＝7 Hz)；6.82(1H，dd，1Ar，J＝1.84Hz，8.46Hz)；7.15(1H，d，1Ar，J＝8.46Hz)；7.25(2H，dd，2Ar，J＝8.0Hz，1.84Hz)；7.45-7.50(3H，m，3Ar)。
实施例18顺式和反式2-(4-(3-(1-金刚烷基)-4-羟基苯基)]环丙烷甲酸的制备按照下面的合成图18制备标题化合物。
合成图18
将113mg担载在细碎Al2O3上的KF(40％)加入到2-[4-(3-(1-金刚烷基)-4-羟基苯基)]环丙烷甲酸甲酯(110mg)的4.4ml二甲氧基乙烷溶液中，并在室温下搅拌2天。过滤之后，将溶剂蒸发，将该粗产物加入到63mgLiOH.H2O在12.4ml 50％四氢呋喃水溶液中的溶液中。室温下将其搅拌3天，蒸发掉溶剂，用乙醚萃取，用2M 0-HCl酸化，并用乙酸乙酯萃取。蒸发之后，产物(58mg)在硅胶上用己烷∶乙酸乙酯40∶60进行色谱。获得6mg反式-2-4-(3-(1-金刚烷基)-4-羟基苯基)]环丙烷甲酸(熔点190℃)、10mg非对映异构体的混合物和20mg顺式-2-[4-(3-(l-金刚烷基)4-羟基苯基)]环丙烷甲酸。
熔点204℃Rf＝0.23顺式；0.44反式(Merck硅胶60F254，EtOAc/己烷6/4)1H NMR(MeOD)δ反式1.45-1.50(1H，m，1-CH2)；1.60-1.65(1H，m，1-CH2)；1.95-2.0(7H，m，-CH-COOEt+6Ad)2.2(3H，s，3Ad.)；2.35(6H，s，6Ad.)；2.50-2.58(1H，m，-CH-Ar)；6.84(1H，d，1Ar，J＝8.46Hz)；7.24(2H，dd，2Ar，J＝7.35Hz，J＝1.84Hz)；7.31(1H，dd，1Ar，J＝8.46Hz，2.57Hz)；7.42(1H，d，1Ar，J＝2.57Hz)；7.52(2H，dd，2Ar，J＝7.35Hz，J＝1.84Hz)。
1H NMR(MeOD)δ顺式1.40-1.50(1H，m，1-CH2)；1.70-1.75(1H，m，1-CH2)；1.95-2.0(6H，s，6Ad)；2.10-2.15(4H，m，3Ad+-CH-COOH)；2.30(6H，s，6Ad.)；2.70-2.78(1H，m，-CH-Ar)；6.83(1H，d，1Ar，J＝8.46Hz)；7.30(1H，dd，1Ar，J＝8.46Hz，2.57Hz)；7.38(2H，dd，2Ar，J＝7.30Hz，J＝1.84Hz)；7.42(1H，d，1Ar，J＝2.57Hz)；7.49(2H，dd，2Ar，J＝7.30Hz，J＝1.84Hz)。
MS(m/z)388(M+，100)；135(50)。
实施例19E-4-(3-(1-金刚烷基)-4-甲氧基苯基)肉桂酸甲酯的制备按照下面的合成图19制备标题化合物。
合成图19
向NaH(60％在矿物油中，66mg，2.74mmol)的3.3mL DMF悬浮液中，于N2下加入969mg(2.49mmol)E-4(3-(l-金刚烷基)-4-羟基肉桂酸甲酯。室温下将该混合物搅拌1小时，然后滴186μL(2.99mmol)CH3I。
室温下将反应静置过夜；在加入80ml冷水之后，水相用CH2Cl2(4x60ml)萃取。有机层用水洗涤，在Na2SO4上干燥并将溶剂蒸发。获得972mg产物(97％)。
1H-NMR(CDCl3)δ1.75(6H)，2.1(9H)，3.75(s，3H，OCH3)，3.80(s，3H，-COOCH3)；6.40(d，1H，CH＝，J＝16Hz)，6.90(d，1H，1Ar，J＝8.8Hz)，7.35(dd，1H，1Ar，J＝8.8，1.8Hz)；7.42(d，1H，1Ar，J＝1.8Hz)；7-48-7.53(m，4H，4Ar)；7.65(d，1H，CH＝，J＝16Hz)。
实施例20E-4-(3-(1-金刚烷基)-4-甲氧基苯基)肉桂酸的制备(ST 1898)按照下面的合成图20制备标题化合物。
合成图20 将455mg(10.8mmol)LiOH.H2O溶解在90ml THF∶H2O 1∶1中；加入873mg(2.17mmol)E-4(3-(1-金刚烷基)-4-甲氧基苯基)内桂酸甲酯，并在室温下将由此获得的溶液搅拌2天。将THF蒸发，用2N HCl酸化并将白色沉淀过滤出来。固体用AcOEt和Et2O洗涤，获得792mg(94％)标题化合物。
Rf＝0.28(Merck硅胶60F254，EtOAc/己烷9/1)1HNMR(DMSO-d6)δ1.74(6H，s，6Ad.)；2.04(3H，s，3Ad.)；2.12(6H，s，6Ad.)；3.75(3H，s，-OCH3)；6.50(1H，d，-CH＝，J＝16Hz)；6.98(1H，d，1Ar，J＝8.8Hz)；7.40-7.70(7H，m，6Ar+CH＝)；12.3(1H，brs，-COOH)。
ST1926对肿瘤细胞系的细胞毒性为了进行细胞毒性试验，使用两种急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞系。
1.细胞系NB4，带有染色体易位t(15；17)，它产生融合蛋白PML/RARα。该细胞系对药用剂量的ATRA(10-7-10-6M)的分化作用极其敏感；2.细胞系HL60，相对于细胞系NB4，其响应ATRA的敏感性较差。该细胞系不携带上述的染色体易位。
将这些细胞系保持在含有10％胎牛血清(FCS)和1％谷氨酰胺的RPMI 1640中。
还使用源自实体肿瘤的不同细胞系。
1.人前列腺癌PC3和DU145。将这些细胞系保持在含有10％FCS、1％丙酮酸钠和1％谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中；2.人结肠腺癌LoVo。将该细胞系保持在含有10％FCS和1％谷氨酰胺的HAM′s F-12培养基中。
3.人卵巢癌，诸如A2780和A2780/Dx，分别对药物(阿霉素、紫杉醇、依托泊苷、长春新碱)敏感和耐药；IGROV-1和IGROV-1/Pt，分别对基于铂的化学疗法敏感和耐药，将它们保持在含有10％FCS、1％丙酮酸钠和1％谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中；4.人黑素瘤MeWo和MeS 2.21，成胶质细胞瘤GBM，非小细胞肺癌A431，NCI-H460，骨肉瘤SAOS和U20S，将它们保持在含有10％FCS、1％丙酮酸钠和1％谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中。
该细胞毒性试验是使用NB4或HL-60细胞悬液(10000/孔)进行的。将这些细胞以250μl的体积接种在96孔板中并在37℃下培养24小时。次日以增加的浓度加入测试化合物ST 1926[(2E)-3-[3′-(l-金刚烷基)-4′-羟基[l，1′-联苯基]-4-基]-2-丙烯酸酯/丙烯酸]，并在37℃下在含有5％CO2的潮湿环境中将这些细胞再培养24小时。在第3天，将平板在1600×g下离心10分钟除去培养基并倾析掉上清液。加入250μl PBS；然后再在1600xg下将平板离心10分钟并将上清液倾析掉。加入200μl/孔的含10％FCS的RPMI 1640培养基，并在37℃下将这些平板再培养48小时。在第5天，再在1600×g下将这些平板离心10分钟，并将这些平板翻转除去培养基，加入200μl PBS和50μl冷的80％TCA。然后将这些平板在冰上静置培养至少1小时。翻转除去TCA；将这些平板在蒸馏水中浸泡洗涤3次并首先在纸上干燥，然后通过喷射热空气干燥。向所有孔中加入200μl在1％乙酸中的0.4％sulphorodamine B。在室温下将这些平板再培养30分钟。
翻转除去sulphorodamine B，通过在1％乙酸中浸泡3次清洗这些平板，然后首先用吸水纸干燥，然后喷射热空气干燥。将200μl的10mM Tris碱加入到所有孔中并将这些平板搅拌至少20分钟。使用Multiskan分光光度计于540nm下测定光密度。
就粘附的细胞而言，采用的步骤相同，只是在第3天的平板洗涤是通过翻转然后加入PBS3次进行的，而不在1600×g下离心。同样在第5天，通过翻转平板将上清液除去。
通过与ST1926培养24小时，在除去化合物之后48小时来测定细胞存活率。与产品培养24小时能够以浓度依赖性方式抑制细胞增殖。表1显示了对研究的每一肿瘤细胞系计算得到的IC50值(抑制细胞存活率50％的产品浓度)。证实ST1926表现出对人早幼粒细胞白血病肿瘤细胞系NB4(IC50＝0.022μM)的细胞毒性比对其它肿瘤系计算的大10倍左右。
表1ST1926的细胞毒性
实施例9评价ST1926对肿瘤细胞周期的影响为了评价本发明的化合物对细胞周期的不同阶段的影响，进行细胞荧光测定细胞周期分析。
将HL60或NB4以150000个细胞/ml含10％FCS的RPMI 1640培养基的密度接种到平板上，加入以0.01-0.1μM的浓度溶解在0.1％DMSO中的测试化合物(ST 1926)，在有或者没有亚适剂量的ATRA(5-10nM(对NB4)和0.5μM(对HL60))的情况下在暗处并在恒温箱中放置3天，不更换培养基。
在处理的第3天，抽取500000个细胞，在180×g下离心5分钟，在没有钙和镁的PBS中洗涤2次。在由保持在-20℃下的丙酮/甲醇1∶4v/v和50％无钙和镁的PBS组成的固定混合物中将这些细胞(1×106/ml固定剂)固定至少1小时；然后将这些细胞离心，在无钙和镁的PBS中洗涤，再次离心和洗涤。在暗处于室温下将该细胞沉淀物与200μl碘化丙锭(100μg/ml)和200μl RNAse(150KU/mg)培养30分钟。
样品通过尼龙过滤器(60-80μm直径)过滤并经细胞荧光计FACScan(Becton Dickinson)分析，获取20000事件/样品，在488nm的激发波长和620nm的发射波长下。使用专用软件包Modfit v.2.0(BectonDickinson)进行细胞周期阶段的百分比的分析。
就前列腺癌细胞PC3的细胞周期分析而言，将这些细胞以500000个细胞/ml接种到平板的RPMI培养基中。用化合物ST1926处理24小时之后，如上所述分析细胞。
实施例9/1评价ST1926对人早幼粒细胞白血病NB4细胞的细胞周期的影响对用ST1926处理(3天)对NB4的细胞周期的影响的分析显示，本发明的化合物在0.08和0.1μM的浓度诱导生长停滞在周期的复制S阶段和凋亡。所得结果报道于表2。
表2.
ST1926对NB4的细胞周期的影响
实施例9/2评价ST1926对人早幼粒细胞白血病HL-60细胞的细胞周期的影响对用ST1926处理3天对HL-60细胞的细胞周期的影响的分析显示，在0.5和1μM的浓度下，细胞周期不可测定，但是，该化合物已显示强的促凋亡效果。
所得结果报道于表3。
表3.
ST1926对人早幼粒细胞白血病HL-60细胞的细胞周期的影响
实施例9/3
ST1926对前列腺癌PC3细胞的细胞周期的影响对用ST1926处理24小时对PC3细胞周期的影响的分析显示，在处理结束时即刻，测试的化合物在测定的最高浓度(0.4μM)下诱导凋亡；在细胞恢复24小时之后，这些细胞在S阶段积聚，而在0.4μM的浓度下，诱导细胞凋亡。
所得结果报道于表4。
表4ST1926对人前列腺癌PC3细胞的细胞周期的影响
ST1926与TRAIL(与肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体)联合的体外细胞毒性活性淋巴细胞以及自然杀伤细胞负责TRAIL产生(与肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体)，它是TNF细胞因子家族(肿瘤坏死因子)的成员。该膜蛋白诱导多种转化细胞凋亡，并且与该家族的其它成员不同，它在体外对正常细胞似乎没有细胞毒性。TRAIL通过与两个含有死亡域的死亡受体DR4和DR5相互作用诱导凋亡。因此，认为TRAIL是一种肿瘤选择性、凋亡诱导性细胞因子和一种预防和治疗癌症的有希望的新候选物(Neoplasia，6535-546，2001)。
对两种不同肿瘤细胞系如M109鼠肺癌和A2780/Dx多重耐药的人卵巢癌进行ST1926与TRAIL组合的细胞毒性的研究。将细胞保持在含有10％FCS、1％丙酮酸钠和1％谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中。
将这些细胞以250μl的体积接种在96孔平板中并在37℃下培养24小时。次日，以递增的浓度加入测定化合物ST 1926[(2E)-3-[3′-(1-金刚烷基)-4′-羟基[1，1′-联苯基]-4-基]-2-丙烯酸酯/丙烯酸]或TRAIL，并在37℃、含有5％CO2的潮湿环境下将这些细胞再培养72小时。在第5天，将这些平板翻转除去上清液。加入200μl PBS和50μl冷的80％TCA。然后将这些平板在冰上静置培养至少1小时。翻转除去TCA；将这些平板在蒸馏水中浸泡洗涤3次并首先在纸上干燥，然后通过喷射热空气干燥。向所有孔中加入200μl在1％乙酸中的0.4％sulphorodamine B。在室温下将这些平板再培养30分钟。翻转除去sulphorodamine B，通过在1％乙酸中浸泡3次洗涤这些平板，然后首先用吸水纸干燥，然后喷射热空气干燥。将200μl的10mM Tris碱加入到所有孔中并将这些平板搅拌至少20分钟。使用Multiskan分光光度计于540nm下测定光密度。
使用Drewinko等人的分析(Cancer Biochem.Biophys.1187-195，1976)测定ST1926和TRAIL之间的相互作用。
如下进行分析(SFaxSFb/Sfa+SFb)/100，其中SFa是ST1926的存活分数，SFb是TRAIL的存活分数。
数值说明以下效果值＞1协同作用，＜1拮抗作用，＝1没有影响。
在两种细胞系中，ST1926显示出与TRAIL的协同活性(图1和2)。
ST1926在鼠肺癌模型M109和3LL中的抗肿瘤活性通过s.c.传代肿瘤片段保持鼠肺腺癌Madison 109细胞(M 109)。接种之日，将细胞悬液以3×105个细胞/小鼠的密度肌内注射到20g雌性BALB/c小鼠的左后肢中。通过将1×105个细胞/小鼠在C57BL/6J小鼠内i.m.传代(每10-14天)常规保持3LL鼠Lewis肺癌。为了测定抗肿瘤活性，从供体小鼠切除肿瘤并在机械分离和酶消化之后通过台盼蓝染料排除试验评价肿瘤细胞活力。然后，将1×105细胞/100μl/小鼠肌内注射到C57BL/6J小鼠的右后腿肌肉内。
从肿块能够测定之日起使用数字测径器(Vernier Caliper)每周两次测定肿瘤维度。从两个主要维度(长和宽)的大小(以mm计)，采用公式(长×宽2)/2，即肿瘤体积mm3，评价肿瘤块。就每一试验组而言，相对于对照即(100-(T/C％)计算肿瘤体积抑制的百分比(TVI％)。在最后给予ST1926之后两天评价TVI。
还测定平均存活时间(MST)，平均寿命的增加以ILS％(寿命增加)表示，以(MSTT/MSTc)×100-100计算。
用对非成对数据的非参数Mann Whitney检验，使用得自GraphPadinc的Instat软件，进行每一组获得的TVI和存活时间值之间的比较。
在使用之前即刻制备ST1926溶液，将其溶解在cremophor∶乙醇1∶1中，接着以1∶4稀释到缓冲盐水溶液中。以10ml/kg的体积处理动物。在不同剂量下的ST1926的处理方案为连续5天(qdx5)，在接种肿瘤细胞后1天开始并重复3个循环。
首先，在每次处理之前将小鼠(每个组8只)称重，以便以在整个给药期间观察到的重量的可能变化为基础，能够给予正确量的物质，并且还能够登记整个处理期间的最大失重(BWL％Max)。
将结果报道于下表5。ST1926证实，在患鼠肺肿瘤M109的动物中，以10mg/kg口服和15mg/kg腹膜内的剂量，按照处理方案qdx5x3w，存活率增加，并且抑制了肿瘤质量。
而且，ST1926以10mg/kg口服的剂量延长了携带3LL-肿瘤的小鼠的寿命，并且使肿瘤体积减少65％。
表5.
ST1926(qdx5x3w)对鼠肺M 109肿瘤的抗肿瘤活性
*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001相对于对照(Mann-Whitney)。
ST1926在人卵巢癌模型A2780和A2780/Dx以及人非小细胞肺癌NCI-H460中的抗肿瘤活性在37℃、含有5％CO2的潮湿环境中，将人卵巢癌细胞A2780、A2780/Dx和NCI-H460保持在含有10％FCS、2mM谷氨酰胺、50μg/ml庆大霉素的RPMI-1640中。将细胞用胰蛋白酶消化，收集在完全培养基中，并在约1100rpm下离心10分钟，将沉淀物重悬在Hank′s 199培养基中；将该操作进行2次。细胞以20×106/ml的密度重悬在Hank′s 199培养基中并将0.1ml(相当于2×106个细胞/小鼠)s.c.注射到CD1 nu/nu 6周龄的雌性小鼠的右胁腹内。
在使用之前即刻制备ST1926溶液，溶解在cremophor乙醇1∶1中，接着以1∶4稀释到缓冲盐水溶液中。动物处理以10ml/kg的体积给药。不同剂量的ST1926的处理方案持续5天(qdx5)，在肿瘤细胞接种后1天开始并重复3个循环。
从肿块能够测定之日起使用数字测径器(Yernier Caliper)每周两次测定肿瘤维度。从两个主要维度(长和宽)的大小(以mm计)，采用公式(长×宽2)/2，即肿瘤体积mm3，评价肿瘤块。就每一试验组而言，相对于对照(即(100-(T/C％))计算肿瘤体积抑制的百分比(TVI％)。在最后给予ST1926之后两天评价TVI。
对小鼠进行测定，直到对照组肿瘤重量达到2g，然后通过颈脱位将小鼠处死。
用对非成对数据的非参数Mann Whitney检验，使用得自GraphPadinc的Instat软件，在每一组获得的TVI值之间进行比较。
首先，在每次处理之前将小鼠称重，以便以在整个给药期间观察到的重量的可能变化为基础，能够给予正确量的物质，并且还能够记录整个处理期间的最大失重(BWL％max)。
将结果报道于表6。同样，在这种情况下ST1926以15-5mg/kg口服的剂量，按照处理方案qdx5x3w，抑制了患人卵巢腺癌A2780、多重耐药的A2780/Dx和人非小细胞肺癌NCI-H460的小鼠的肿瘤质量。
表6.
ST1926(qdx5x3w)对人卵巢癌A2780、A2780/Dx和非小细胞肺癌NCI-H460的抗肿瘤活性
*P＜0.05相对于对照。
ST1926显示出以15mg/kg口服的剂量按照方案qdx4x3w在有和没有紫杉醇(15mg/kg，腹膜内，按照方案q7dx3)的情况下在NCI-H460非小细胞肺癌内有效(表7)。
表7.
ST1926(qdx4x3w)对非小细胞肺癌NCI-H460在有和没有紫杉醇(q7dx3)的情况下的抗肿瘤活性
**P＜0.01相对于对照；°P＜0.05相对于ST1926(Mann-Whitney)。
ST 1926当以15mg/kg口服剂量按照方案qdx3x3w给药时显示显著的抗肿瘤活性(表8)。
表8.
ST1926(qdx3x3w)对非小细胞肺癌NCI-H460的抗肿瘤活性
*P＜0.05相对于对照(Mann-Whitney)。
ST1879对牛肾上腺微循环(microcircle)内皮(BMEC)细胞系的细胞毒性使用内皮细胞系BMEC，预先以如下方式从新鲜牛肾上腺制备。在处死之后即刻从动物取下腺并贮藏在冰中直到到达实验室。在无菌条件(Bio-Hazard层流通风橱)下，将这些腺在Betadine溶液中洗涤5分钟，接着用2升无菌PBS洗涤。然后用无菌一次性解剖刀将这些腺切成小段，约2mm，并转移到含有PBS(30ml/腺)的聚苯乙烯Falcon管中。在冷却离心机中在4℃下以600rpm离心之后，倾析上清液。将沉淀重悬在等体积(相对沉淀物的体积)的0.12％的胶原酶A(Boehringer Mannheim)中并在振荡下于37℃下培养2小时。通过过滤器(Sigma)(首先200目，然后100目)连续过滤之后，将上清液加入到15％DMEM FBS溶液中以抑制胶原酶A的作用。将该溶液在1000rpm、室温下离心，将沉淀物重悬在含有20％FBS、50μg/ml牛脑提取物(BBE)、50μg/ml肝素(Sigma)、0.5％v/v庆大霉素(Sigma)、1％ v/v L-谷氨酰胺的DMEM培养基中并接种到用1％明胶(猪明胶Sigma)凝胶化的培养皿上。在达到融合时，将这些细胞用内皮标记物，例如因子VIII表征。
使用BMEC细胞进行细胞毒性测定。将这些细胞以200μl的体积接种到96孔平板中并在37℃下培养24小时。次日，以从200μM到1.56μM减少的浓度加入测定化合物ST1879，并在37℃下在含有5％CO2的潮湿环境中将这些细胞再培养24小时。在第3天，将该平板翻转除去培养基并在第3天通过翻转和加入300μl PBS 4次洗涤该平板。洗涤之后，加入200μl/孔的前面所述的用于平板接种在明胶上的培养基。在第5天，通过翻转平板除去培养基，并将这些细胞用冷15％TCA的溶液处理1小时。用水浸泡平板并通过翻转除去将这些孔洗涤3次。向每一孔中加入200μl在1％乙酸中的0.4％sulphorodamine B。在室温下将这些平板再培养30分钟。翻转除去sulphorodamine B，通过在1％乙酸中浸泡3洗涤这些平板，然后首先用吸水纸干燥，然后喷射热空气干燥。向每一孔中加入200μl的10mM Tris碱并将这些平板振荡至少20分钟。使用Multiskan分光光度计于540nm下测定光密度。
通过与ST1879培养24小时在除去化合物之后48小时来测定细胞存活率。与产品培养24小时能够以浓度依赖性方式抑制细胞增殖。表5显示了计算的IC50值(抑制50％细胞存活率的产品浓度)，ST1879已证实等于105μM的差的细胞毒性和等于25μM的非毒性浓度，随后将其用于研究ST1879对内皮细胞迁移的影响(参见表9)。
表9ST1879对内皮细胞的细胞毒性
内皮BMEC细胞趋化性为了评价ST1879对内皮细胞趋化性的影响，使用Boyden室，它由带2个孔的室组成，1个在下面，另一个在上面，它们通过8μm的确定孔径的聚碳酸酯过滤器分开。在下面孔中加入化学引诱因子1％FBS在DMEM中，在上面孔中加入牛肾下微循环内皮细胞(BMEC)(悬浮在含有1％无脂肪酸的猪血清白蛋白的DMEM中)。ST1879抑制细胞向化学引诱因子方向穿过聚碳酸酯过滤器迁移的能力，是通过计数过滤器下侧存在的细胞数来定量评价的。表8中报道的移动百分比是按照公式(处理-对照/对照)×100计算的。ST1926在等于50和25μM的浓度下显示抑制BMEC细胞向化学引诱剂刺激物FCS的趋化性(表10)。
表10.
ST1879诱导的对BMEC细胞的迁移的抑制
ST1879对HUVEC细胞在matrigel上分化的影响内皮细胞在matrigel上的分化试验，是一种常用于评价产品抗血管生成活性的试验。Matrigel是一种得自肿瘤的重组基底膜提取物，主要由层粘连蛋白和胶原IV组成，在其上内皮细胞以类似毛细血管的三维结构组织起来。通过显微镜计数″结″可以测定其网络密度，该″结″定义为两个以上的管状结构离开的交叉点，或者可以通过计算机化成象系统(能够计算毛细血管结构所占面积的百分比)测定。
将4℃下的Matrigel(Becton-Dickinson)接种到24孔平板中并使其在37℃下的恒温箱中胶凝30分钟。在有或者没有25μM无毒浓度的ST1879情况下将人脐带内皮细胞HUVEC(Clonetics)重悬在500μl培养基中，并接种在该matrigel上。培养5小时之后，用4％低聚甲醛的PBS溶液固定这些细胞。通过显微镜计数3个独立视野的结的数目/视野将结果定量化，并以相对于阳性对照的百分比计。
ST1879以25μM的浓度显示61％抑制这些内皮细胞在matrigel上的分化(表11)。
表11.
ST1879诱导的对HUVEC细胞分化的抑制
ST1879和ST1898对人肿瘤细胞系的细胞毒性使用人急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4进行该细胞毒性测定，将它们保持在含有10％胎牛血清(FCS)和1％谷氨酰胺的RPMI 1640中。
还使用另外两种实体肿瘤细胞系1.人前列腺癌PC3。将该细胞系保持在含有10％FCS、1％丙酮酸钠和1％谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中。
2.人结肠腺癌LoVo。将该细胞系保持在含有10％FCS和1％谷氨酰胺的HAM′s F-12培养基中。
使用10000个NB4细胞/孔进行细胞毒性测定。将这些细胞以250μl的体积接种到96孔平板中并在37℃下培养24小时。次日，以增加的浓度加入测定化合物ST1879，并在37℃下在含有5％CO2的潮湿环境中将这些细胞再培养24小时。在第3天，将该平板在1600×g下离心10分钟除去培养基并倾析掉上清液。加入250μl PBS；然后再在1600xg下将平板离心10分钟并将上清液倾析掉。加入200μl/孔的含10％FCS的RPMI 1640培养基，并在37℃下将这些平板再培养48小时。在第5天，再在1600×g下将这些平板离心10分钟，并将这些平板翻转除去培养基，加入200μl PBS和50μl的80％冷TCA。然后将这些平板在冰上静置培养至少1小时。翻转除去TCA；将这些平板在蒸馏水中浸泡洗涤3次并首先在纸上干燥，然后通过喷射热空气干燥。向每个孔中加入200μl在1％乙酸中的0.4％sulphorodamine B。在室温下将这些平板再培养30分钟。翻转除去sulphorodamine B，通过在1％乙酸中浸泡3次洗涤这些平板，然后首先用吸水纸干燥，然后喷射热空气干燥。将200μl的10mM Tris碱加入到每一孔中并将这些平板搅拌至少20分钟。使用Multiskan分光光度计于540nm下测定光密度。
就粘附的细胞系PC3和LoVo而言，采用的步骤相同，只是在第3天的平板洗涤，是通过翻转，然后加入PBS 3次进行的，而不在1600xg下离心。同样在第5天，通过翻转平板将上清液除去。
通过与ST1879或ST1898培养24小时，在除去化合物后48小时来测定细胞存活率。与产品培养48小时足以以浓度依赖性方式抑制细胞增殖。表10显示了对研究的每一肿瘤细胞系计算的IC50值(抑制50％细胞存活率的产品浓度)。ST1879已证实对LoVo细胞的细胞毒性(IC50＝5.2μM)比对前列腺癌细胞系PC3(IC50＝13.6μM)和对人早幼粒细胞NB4细胞系(58.5μM)计算的要大。ST1898也已显示对结肠癌LoVo更具活性(参见表12)。
表12.
ST1879和ST1898的细胞毒性
ST1879和ST1898对NB4细胞的促分化效应将NB4细胞以150000个细胞/ml的密度接种在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中。然后将这些细胞用ST 1879或ST 1898以从0.4μM开始到0.01μM的递减的浓度处理并在恒温箱中放置3天，不更换培养基。为了测定该分化影响，从每一样品中收集500000个细胞，离心并重悬在1ml含有10％血清、1mg/ml氮蓝四唑(NBT)和100ng PMA(乙酸肉豆蔻佛波醇)的RPMI 1640培养基中。将这些如上所述重悬的细胞在37℃下培养60分钟。在培养结束时将这些细胞离心并将沉淀物重悬在1ml含有10％Triton×100的PBS中。将这些样品进行超声处理直到溶解，然后在540nm的波长下通过分光光度计读数。含有分化细胞的样品变成略带紫色，而对照样品和/或未分化细胞的这些样品保持白色或者着色浅得多。根据如下报道的AC50(对50％细胞分化的活化浓度)评价ST1879或ST1898的促分化作用。ST1898证实具有良好的促分化能力，可通过AC50值等于19nM来衡量(见表13)。
表13.
ST1879和ST1898对NB4细胞的促分化作用
ST1879、ST1926和ST1898在鸡尿囊绒膜(CAM)模型中的抑血管(angiostatic)活性鸡尿囊绒膜是非常血管化的薄膜，其中血管在发育的第4天出现，到发育的第8天发展出动静脉系统，并且积极增殖直到第11天。
本研究的目的是在基本条件下和在有血管增殖的诱导剂bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的情况下追踪CAM中的血管发育。本研究使用在其发育的最初阶段的鸡胚胎蛋。在发育的第3天，打开壳使CAM的血管可以看见。在发育的第9天通过连续3天施加约1mm3片段的无菌明胶(GELFOAM Pharmacia-Upjohn)到CAM表面，在其上给予bFGF(50ng/胚胎)或讨论的产品来进行处理。
通过将0处理时的血管与后面时间(第12天)的血管比较而获得该分子对血管增殖的影响的评价。
如下将结果报道于表14。3个产品证实在鸡尿囊绒膜模型中以0.25-0.5μg/胚胎的浓度具有抑血管活性(表14)。
表14.
ST1879、ST1926、ST1898的抑血管活性
结果是每个海绵中的血管数的平均值±SE。
权利要求
1.式(I)的化合物 其中R代表烷基、环烷基、杂环烷基、苯基、取代的苯基、金刚烷基，其中至少一个CH可以取代有C-卤素或C-烷基并且一个CH2可以被O、S、CH-卤素、CH-芳基、CH-杂芳基、CH-芳基烷基、CH-杂芳基烷基、CH-氨基取代；R′代表OR、OCOR、CORIV；R′-D代表O-(CH2)n-O；其中n＝1-3；D代表H、OH、O-烷基、(CH2)n-NH2、(CH2)n-NH-烷基、(CH2)n-OH，其中n＝1-4；R″代表四唑、SO3H、NHSO3H、CHO、COOH、COO-烷基.CONHOH、CONH-芳基、CONH-C6H4OH、CH2OR；PO3H2；CO-(CH2)n-芳基，其中n＝0-4；R代表H、烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基、杂芳基烷基、SO3H、α或βD-和L-糖基；RIV代表H、OH、OR；[A]代表[C(RV，RVI)-C(RVII，RVIII)]n、[C(RIX)＝C(RX)]n、[C≡C]n，其中n＝0-3；RV、RVI、RVH、RVIII代表H、烷基、卤素、OH、OR、NO2、NH2、芳基、-O-、-CH2-、CX2-(其中X是卤素)、-CH(R)-；RIX、RX代表H、OH、卤素、烷基、芳基、CN、NO2、COOR。
2.权利要求1的式(I)的化合物及其在医学领域的用途。
3.一种药物组合物，包含式(I)化合物作为活性组分以及至少一种药用可接受的赋形剂和/或稀释剂。
4.式(I)的化合物用于制备治疗与变化的血管生成有关的病理情况的药物的用途。
5.如权利要求4的用途，其中该病理情况选自关节炎病理情况、肿瘤、转移、糖尿病性视网膜病、牛皮癣、慢性炎症和动脉粥样硬化。
6.如权利要求4或5的用途，其中该病理情况是糖尿病性视网膜病。
7.如权利要求4或5的用途，其中该病理情况是牛皮癣。
8.如权利要求4或5的用途，其中该病理情况是慢性炎症疾病。
9.如权利要求4或5的用途，其中该病理情况是动脉粥样硬化。
10.如权利要求4或5的用途，用于治疗关节炎病理情况。
11.式(I)的化合物用于制备具有抗肿瘤活性的药物的用途。
12.如权利要求11的用途，其中抗肿瘤活性为细胞毒性性质。
13.如权利要求11的用途，其中抗肿瘤活性为凋亡性质。
14.如权利要求11的用途，其中抗肿瘤活性为抗血管生成性质。
15.式(I)的化合物用于制备可用于预防和治疗肿瘤转移的药物的用途。
16.如权利要求11-15的用途，其中肿瘤选自肉瘤、癌、类癌、骨肿瘤、神经内分泌肿瘤、淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、单核细胞白血病、巨核细胞白血病或霍奇金病。
17.如权利要求16的用途，其中肿瘤是急性早幼粒细胞白血病。
18.由一种或多种式(I)的化合物与一种或多种已知的抗癌药组成的组合。
19.权利要求18的组合，其中抗癌药选自烷化剂、拓扑异构酶抑制剂、抗微管蛋白药、嵌入化合物、抗代谢物、天然产物诸如长春花属生物碱、表鬼臼毒素、抗生素、酶、taxans、细胞分化化合物、磷酸酪氨酸激酶抑制剂诸如Iressa或Glivec、TRAIL(与肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体)、DR4或DR5受体的激动剂(TRAIL的位点)、免疫学抗肿瘤治疗用的化合物、抗肿瘤疫苗、或干扰素α、β、γ。
20.一种药物组合物，包括权利要求18的组合和一种或多种药用可接受的赋形剂或载体。
21.一种或多种式(I)的化合物与一种或多种已知的抗癌药用于制备治疗肿瘤的药物的用途。
22.一种或多种式(I)的化合物与一种或多种已知的抗癌药用于制备治疗肿瘤的药物的用途，特征在于式(I)的化合物作为抗癌药的辅助物存在。
全文摘要
式(I)的化合物，其中R、R′、R″、A和D具有本文中所述的含义，可用作治疗以血管生成改变为特征的病理情况的药物和抗肿瘤药。
文档编号C07C229/34GK1537094SQ02815008
公开日2004年10月13日 申请日期2002年7月18日 优先权日2001年7月31日
发明者L·默里尼, S·达尔拉维勒, S·潘科, G·吉安尼尼, C·皮萨诺, L·维斯丝, L 默里尼, 材崮, 顾 申请人:希格马托制药工业公司