专利名称：用于治疗血管生成依赖性肿瘤的去纤苷酸和/或寡脱氧核糖核苷酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗患肺瘤哺乳动物的方法，所述方法是通过对所述哺乳动物施用有效量的去纤苷酸和/或寡苷酸(oligotide)实现的；具体地，本 发明涉及使用寡苷酸和/或去纤苷酸治疗血管生成依赖性肿瘤。发明背景血管生成是导致从既有的血管系统生成新血管的多步骤过程，并且是 原发性肿瘤生长、入侵和转移发展所必需的(20)。在成人体内，血管生成 往往是受到抑制的，仅仅在生殖、发育和伤口愈合过程中短暂发生。在没 有新血管生成的情况下，肺瘤不能进一步扩大超过临界体积(12)。为促进 此扩大过程，肿瘤必须取得血管生成表型，后者是正(促血管生成 (pro-angiogenic))调节物和负(抗血管生成)调节物之间达到净平衡的结果 (16)。然而，胂瘤在血管构造、分化和功能性血液供应方面高度异质(24)。 这些无血管的血管生成性(avascularpreangiogenic)肿瘤大小的差异部分 地可能是由于肿瘤细胞在不同程度组织缺氧条件下存活的能力不同(18)。某些肿瘤如多发性骨髓瘤、甚至是非实体性白血病和淋巴瘤(8)和(21)、 以及乳腺癌(25)、结肠直肠癌(7)、胃癌(26)、前列腺癌(9)、宫颈癌(19)、肝 细胞癌(23)、还有非小细胞肺癌(13)的血管生成依赖性证据来自这样的观察 结果，即衡量血管生成程度的微血管密度是上述临床病例存活情况的一个 独立预后因素(17)。在最近的临床研究中，同样是在乳腺癌的研究中，逐 渐清楚血管生成相关基因，例如血管内皮细胞生长因子VEGF、 VEGF受 体FLT1以及金属蛋白酶MMP9对临床结果非常重要(6)。定义术语寡苷酸在文中用于指分子量为4000-10000道尔顿的任何寡脱氧 核糖核苷酸。优选是指具有如下分析参数的任何寡脱氧核糖核苷酸 分子量(mw): 4000-10000道尔顿， 增色效应(h):〈10, A+T/C+G: 1.100-1.455， A+G/C+T: 0.800-1.160， 比旋+300國+46.80，优选+30° - +46.20。寡苷酸可以通过从动物和/或植物组织特别是哺乳动物器官中提取生 产，或者可以通过合成生产。当通过提取生产时，优选将按照文献(l)、 (2) 和(3)中描述的方法获得，特此将其并入本文作为参考。已知寡苷酸被赋予 了 一种重要的抗缺血活性。术语去纤苦酸指通过从动物和/或植物組织提取获得的多脱氧核糖核 苷酸，当然也可以通过合成生产；多脱氧核糖核苷酸常用形式是碱金属盐、 通常是钠盐，并且通常分子量是45-50 kDa (CAS注册号83712-60-1)。优 选去纤苷酸以文献(4)和(5)中描述的物理/化学特征存在，特此将其并入本 文作为参考。发明内容我们最近开发了肿瘤血管形成可选路径的模型。我们提出，除了从既 有的血管上芽生内皮细胞之外，携带血液的内皮细胞也可以产生肿瘤血管 系统。这些内皮样细胞(ELC)能够在特定培养条件下自肿瘤相关的树突细 胞转分化而来(ll)。简言之，从来自健康人血液供体的白细胞去除术产物 中淘选出单核细胞，并在粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白介 素4 (IL-4)的存在下培养，以刺激树突细胞(DC)分化。此外，还用由肿瘤 细胞特异性释放的混合物(M-CSF、 IL.6和乳酸，Gottfried等，已投稿)处 理细胞，以促进肺瘤相关的树突细胞(TuDC)长出。这些TuDC-ELC获得了内皮细胞的表型(FactorVIII相关抗原，vWF)，但其丧失了单核细胞标志(CD14)和树突细胞标志(CDla)。重要的是，这些 细胞不表达CD34，也不表达CD133或CD146,这证明它们是真正的转分 化产物，而且没有污染循环的内皮细胞祖先(CD34、 CD133)或者循环的成 熟内皮细胞(CD146)。此外，这些细胞在体外血管生成实验Matrigel 中 能够形成血管样结构。Matrigel 实验是最常见且广泛使用的体外血管生成实验(22)。 Matrigd 为合成的胞外基质蛋白质半固体混合物，其在于模拟生理学存 在于血管内皮细胞壁之下的基质。当在显微镜盖玻片上将所研究的细胞种 植于此基质上时，细胞能够被激活，并在3-7天内形成管状结构，但这仅 在这些细胞具有内皮细胞表型的情况下发生。因此，此Matrigel 实验适 于显示细胞产生肿瘤血管系统的潜能。我们的数据表明，临床及亚临床浓度的寡苷酸和/或去纤苷酸能够抑制 Matrigel 中转分化ELC (TuDC-ELC)的血管形成。在存在或不存在寡苷 酸或去纤苷酸(各10 pg/mL)的情况下，将TuDC-ELC及成熟分化的内皮细 胞[人脐静脉内皮细胞(HUVEC)或微血管内皮细胞(HMEC)作为"稳定"对 照赙育7天。重要的是，单次添加去纤苷酸之后，HUVEC和HMEC的 血管形成潜能不受影响，表明去纤苷酸和/或寡苷酸仅寻靶转分化的内皮细 胞(
图1A)。然而，当反复添加去纤苷酸时，其也能够阻断完全分化的成熟 内皮细胞的血管生成(见下文)。借助于NIH免费赠送的软件(Image J， http:〃rsb.info.nih.gov/ij/)，我们 能够对这些效应进行量化，评估了血管的总长以及照片的面积，然后以总 长/面积[象素力得出微血管密度(MVD)。 DF显著(p-0.02， T检验)下调 TuDC誦ELC的MVD (图1B)。为了用可选的血管生成实验支持这些数据，当每日施用DF时，大鼠 动脉内皮细胞在MatrigelTM中的芽生几乎被100。/。阻止(图2)，表明DF不 仅作用于转分化的内皮细胞，而且还作用于完全分化的成熟内皮细胞。动脉环实验是用来研究大血管内皮细胞的。但肿瘤血管系统通常由微 血管内皮细胞构成。因此，我们以孩bfc管内皮细胞经9-ll天的培养后通过真皮成纤维细胞层进行血管化为基础，进行了第三种体外血管生成实验。这些血管样结构随后能够通过CD31和vWF染色进行观察。如图3(A和B)所示，DF每日施用，能够卓越地阻断人微血管内皮细 胞的血管生成。有趣的是，10ng/mL左右的浓度似乎最为有效。单次施用 DF不能够显著阻断血管生成。总而言之，我们的数据强有力地表明，去纤苷酸和/或寡苷酸能够阻断 如下细胞的血管生成肿瘤相关的转分化内皮细胞以及从早已存在的血管 细胞产生的那些细胞。寡苷酸和去纤苷酸是否也在体内抑制血管生成，还正在进行研究。我 们目前进行了背皮肤小室实验(dorsal skin chamber assay) (14),以研究去 纤苷酸在高度血管化的人胃癌小鼠模型(异种移植系统)中的效应。第一手 数据清楚表明DF处理肿瘤的微血管密度(MVD)低于对照肿瘤的微血管密 度。这组实验将会得到及时再现。DF能够阻断血管生成的作用机制尚有待阐明，但Western印迹分析 的初步证据表明DF对活化的p70S6激酶(p-p7086)(—种丝裂原活化蛋白 激酶)具有下调效应。有关p70S6激酶影响的其他证据获自另一血管形成实验，即在存在或 不存在p70S6激酶抑制剂DRB的情况下孵育HMEC。我们还有接受了同种异体干细胞移植(SCT)患者的第 一手临床数据 在一群去纤苷酸治疗的17名患者中，已经观察到血清VEGF水平的鲜明 下降，这也表明去纤苷酸可能通过撤除芽生肿瘤内皮细胞的生长因子而起 作用。去纤苷酸和寡苷酸为治疗血管生成依赖性肿瘤的强有力候选物，并且 可以单独使用，或者与其他抗血管生成剂如雷帕霉素联合使用(14)。有趣 的是，雷帕霉素具有促血栓形成活性的负面副作用(15)，而通过同时施用 抗血栓形成的纤溶性去纤苷酸能够减弱此副作用。参考文献1. US56461272. US56462683. US60461724. US49855525. US52236096. 't Veer，L.J.等(2002) Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature, 415， 530-536.7. Abdalla，S.A.等(1999) Prognostic relevance of microvessel density in colorectal tumours. Oncol.Rep.， 6, 839-842.8. Andersen，N.F.等 (2005) Syndecan-1 and angiogenic cytokines in multiple myeloma: correlation with bone marrow angiogenesis and survival. Br.J.Haematol.， 128， 210-217.9. Bostwick,D.G. & Iczkowski，K.A. (1998) Microvessel density in prostate cancer: prognostic and therapeutic utility. Semin.Urol.Oncol.， 16， 118-123.10. Eissner，G.等 (2002) Fludarabine induces apoptosis， activation, and allogenidty in human endothelial and epithelial cells: protective effect of defibrotide. Blood, 100， 334-340.11. Fernandez，P.B.等 (2001) Dendritic cells derived from peripheral monocytes express endothelial markers and in the presence of angiogenic growth factors differentiate into endothelial-like cells. Eur丄Cell Biol" 80, 99-110.12. Folkman，J.等 (1971) Isolation of a tumor factor responsible for angiogenesis. J.Exp.Med.， 133, 275-288.13. Fontanini，G.等(1995) Microvessel count predicts metastatic disease and survival in non-small cell lung cancer. J.Pathol" 177, 57-63.14. Guba，M.等(2002) Rapamycin inhibits primary and metastatic tumor growth by antiangiogenesis: involvement of vascular endothelial growth factor. Nat.Med.， 8， 128-135.15. Guba，M.等(2005) Rapamycin induces tumor-specific thrombosis via tissue factor in the presence of VEGF. Blood.16. Hanahan，D. & Folkman，J. (1996) Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell, 86， 353-364.17. Hasan，J.等(2002) Intra-tumoural microvessel density in human solid tumours. Br.J.Cancer， 86， 1566-1577.18. Helmlinger，G.等(1997) Interstitial pH and p02 gradients in solid tumors in vivo: high-resolution measurements reveal a lack of correlation* Nat.Med.， 3， 177-182.19. Kainz，C.等(1995) Prognostic value of tumour microvessel density in cancer of the uterine cervix stage IB to IIB. Anticancer Res" 15， 1549-1551.20. Morabito，A.等 (2004) Antiangiogenic strategies, compounds, and early clinical results in breast cancer. Crit Rev.Oncol.Hematol" 49， 91-107.21. Podar，K. & Anderson，K.C. (2005) The pathophysiologic role of VEGF in hematologic malignancies: therapeutic implications. Blood, 105， 1383-1395.22. Staton，C.A.等(2004) Current methods for assaying angiogenesis in vitro and in vivo. Int丄Exp.Pathol" 85,233-248.23. Sun，H.C.等(1999) Microvessel density of hepatocellular carcinoma: its relationship with prognosis. J.Cancer Res.Clin.Oncol" 125， 419-426.24. Verheul,H.M. 等 (2004) Are tumours angiogenesis-dependent J.Pathol" 202， 5-13.25. Weidner，N.等 (1992) Tumor angiogenesis: a new significant andindependent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma. J.Natl.Cancer Inst" 84,1875-1887. 26. Xiangming，C.等(1998) Angiogenesis as an unfavorable factor related to lymph node metastasis in early gastric cancer. Ann.Surg.Oncol" 5， 585-589.
权利要求
1.去纤苷酸和/或分子量4000-10000道尔顿的寡脱氧核糖核苷酸在制备治疗血管生成依赖性肿瘤的药物中的用途。
2. 根据权利要求l的用途，其特征在于所述寡脱氧核糖核苷酸具有如 下分析^lt: h <10, A+T/C+G: 1.100-1.455， A+G/C+T: 0.800-1.160，比 旋+30°- +46.80。
3. 根据权利要求2的用途，其特征在于比旋为+30°至+46.2°。
4. 根据权利要求1的用途，其特征在于所述寡脱氧核糖核苷酸和/或 去纤苷酸通过从动物和/或植物组织优选哺乳动物器官中提取获得。
5. -限据权利要求1的用途，其特征在于所述寡脱氧核糖核苷酸和/或 去纤苷酸通过合成获得。
6. 根据权利要求l的用途，其特征在于所述血管生成依赖性肿瘤为多 发性骨髓瘤。
7. 根据权利要求l的用途，其特征在于所述血管生成依赖性肺瘤为乳 腺癌。
8. 根据权利要求l的用途，其特征在于所述药物施用于哺乳动物。
9. 根据权利要求l的用途，其特征在于所述哺乳动物为人。
10. 根据权利要求1的用途，其特征在于所迷药物静脉内施用。
11. 根据权利要求l的用途，其特征在于所述药物为水性溶液。
12. 根据权利要求1的用途，其特征在于所述药物含有至少一种其他 具有抗肿瘤作用的活性成分。
13. 根据权利要求12的用途，其特征在于其它具有抗肿瘤作用的活性 成分选自雷帕霉素、紫杉醇、野百合碱、BCNU和/或环磷酰胺。
14. 根据权利要求l的用途，其特征在于所述药物含有常规赋形剂和/ 或佐剂。
全文摘要
(本发明)描述了去纤苷酸和/或分子量4000-10000道尔顿的寡脱氧核糖核苷酸单独或与其他具抗肿瘤作用活性成分联合作为抗肿瘤剂的用途。所述寡苷酸可以通过从动物和/或植物组织特别是哺乳动物器官中提取生产，或者可以通过合成生产。能治疗的肿瘤优选血管生成依赖性肿瘤，如多发性骨髓瘤或乳腺癌。
文档编号A61P35/00GK101232892SQ200680006573
公开日2008年7月30日 申请日期2006年2月27日 优先权日2005年3月3日
发明者G·艾森纳, L·I·费罗, M·亚科贝利 申请人:真蒂奥姆有限公司