竹叶总黄酮作为抗衰老护肤因子在化妆品中的应用的制作方法

专利名称：竹叶总黄酮作为抗衰老护肤因子在化妆品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于日用化妆品领域。本发明涉及一种竹叶总黄酮作为抗衰老护肤因子在化妆品中的应用，目的是为化妆品行业提供一种天然植物来源的抗衰老护肤因子。具体地说是具有抗自由基、抗氧化、抗辐射、抗菌、抑菌和美白、抗皱、祛斑功效的竹叶总黄酮作为抗衰老护肤因子在日用化妆品中的应用。
皮肤是维护人体生命和健康的重要部分，直接与外界接触，是机体的第一道屏障，极易受到环境因素的影响而导致损伤。除了年龄带来的老化因素外，应激反应、污染、阳光和紫外线的照射都是引起皮肤出现皱纹或皱褶的重要原因。
皮肤衰老主要表现在两个方面①皮肤逐渐失去弹性形成皱纹；②皮肤外表逐渐产生黄褐斑、老年斑等各种色斑。根据衰老的自由基理论，在皮肤衰老的过程中，自由基对皮肤的损伤是一个重要因素。体内过量的活性氧自由基与不饱和脂肪酸作用生成丙二醛(MDA)等物质，MDA与细胞膜上的蛋白质等作用生成褐色素，沉淀于皮肤上便成为各种色斑。自由基也能使皮肤内的胶原纤维、弹性纤维交链和变性、变脆、失去弹性，当皮肤内的水分不足时，容易使弹性纤维断裂而形成皱纹。皮肤衰老的深层次原因还包括表皮角质形成细胞的更新代谢减慢，真皮成纤维细胞增殖分裂速度降低。老年人与青年人相比，皮肤表皮变薄，皮肤角质形成细胞和成纤维细胞明显减少，因此促进衰老皮肤细胞的增殖是许多护肤品的追求目标之一。如果化学物既能减少皮肤自由基的生成，提高SOD的活性，又对皮肤细胞具有一定的增殖作用，就可使皮肤组织更新加快，胶原纤维生成增多，保护皮肤的水分，从而有效地减缓皮肤衰老[黄汉生，防老化护肤品，日用化学工业译丛，1994(2)35-38]。
护肤品行业一致认为，卓有成效地护理皮肤必须注意以下两点①应在早年开始使用润湿护肤品；②必须防御皮肤受紫外线的伤害。尽管在减轻皮肤细纹显现的技术方面已取得了一定的进展，但最好的方法仍然是延缓皱纹的出现和尽量减少皱纹的出现。Chanel公司的Mausner认为，社会人口的老龄化和环境的劣化将会导致人们皮肤的老化、并且日趋严重，人们将越来越需要长效、高效的调节性和预防性的护肤品。Elizabeth Arden公司认为，护肤品行业的动向是向Cosmeceuticals(意即功能性营养型化妆品)的方向发展。
人口老龄化的时代特征和化妆品所处的特殊行业背景为具有抗自由基、抗氧化、抗辐射、抗菌、抗炎等生理活性的植物提取物的应用提供了广阔的空间。加之近年来疯牛病所带来的连锁反应，动物源性的护肤因子极易引起人们心理上的恐慌，因此对植物化学素的需求日益增长。国内外已推出的植物性化妆美容品按添加的植物种类分有50多种，具体功效可归纳为防皱、美白、祛斑、止痒、保湿、减肥等方面。这些天然植物的提取物具有副作用小、疗效佳等特点，制成的美容化妆品既保持了化妆品的特色，又具有良好的治疗、保健效果。
黄酮类化合物(Flavonoids，以下简称类黄酮)广泛分布于植物界，到目前为止，已发现了2000多种，多数以苷的形式存在，少数以游离态存在，其生理作用和生物活性是多种多样的。由于其结构的共轭性，对紫外和可见光均显示强吸收，并在可见和紫外区内高度稳定。天然来源的类黄酮还具有抗菌、抗光敏、抗氧化、解毒和增白等作用，能清除皮肤中的自由基，避免自由基对细胞的损伤，促进皮肤的新陈代谢，改善皮肤的弹性，延缓皮肤皱纹的产生，减少色素的沉着，润泽肌肤，达到显著的美白效果[王建国、刘海峰、王建新，防晒剂Parsol1789光分解抑制的研究，香料香精化妆品，2002(1)17-20]。例如，广泛存在于蔬菜与水果中的槲皮素具有抗自由基、抗氧化、抗菌、抗病毒及抗炎、抗过敏的生物活性与药理作用。木犀草素对H.Sui s病毒有很强的抑制作用，浓度在1∶35000时可抑制葡萄球菌和枯草杆菌的生长，对卡他、白色念珠、变形等菌也有抑制作用；有抗炎效能，与磷脂配伍可治疗皮肤炎；在皮肤上的渗透力强，可抑制透明质酸酶活性，与透明质酸同用能延长该物质的生理活性；能抑制和消除皮肤色斑(如老年斑)。指甲油内用少量木犀草素(0.01％)可使指甲釉面层保持光滑。芦丁有抗氧、抗炎、抗口炎病毒作用。芦丁与柠檬烯以50∶1配合对活性氧有良好的抑制作用，能强力吸收紫外线，可用于防晒、增白、护发类化妆品[王建新，天然活性化妆品，中国轻工业出版社，1997214]。在增白型化妆品中加入0.1～0.2％的大豆异黄酮可预防皮肤老化、黑化以及预防褐斑；在发乳中加入2％可吸收紫外线而维持头发光泽。花青素类中的飞燕草素有很强的抗氧与抗炎作用，可抑制头皮或皮肤因皮脂分泌过度引发皮虚而导致的病菌感染，化妆水中用量为1％；从翠菊花中得到的紫菀苷在化妆水中加入可提供较好的稠度和柔滑感，且有祛臭、收敛的功效[汪秋安，天然黄酮类化合物的生理功能及其应用，香料香精化妆品，1999(1)28-33]。类黄酮因其所具有的多种活性及其无毒、无害的安全性而在药品、食品及化妆品中有广泛的应用前景[黄兴余、丁认全，槲皮素及其衍生物在化妆品中的作用及机理，香料香精化妆品，1998(3)17-18]。
目前已产业化开发的植物黄酮类提取物，如银杏提取物、茶多酚、葡萄籽提取物、松树皮提取物、甘草黄酮、大豆异黄酮、葛根异黄酮等，许多已被应用于化妆品行业。譬如，近30年来，国内外对银杏进行了广泛深入的研究，开发了许多专利性药品、化妆品和保健品[刘燕、陈京华，银杏在防衰老化妆品中的应用研究，日用化学工业，2002，32(4)79-81]。银杏黄酮是强有力的活性氧自由基清除剂，能保护皮肤细胞不受过氧化的影响，从而延长皮肤细胞的寿命，增强其抗衰老的能力；银杏内酯也能加速新陈代谢，改善血液循环，增强细胞活力；此外，银杏提取物还具有广谱杀菌作用，对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和絮状表皮癣菌等常见侵染皮肤的致病菌均有明显的抑制作用，且这种抗菌作用在极低浓度时便可显示。这种高效抗菌的特征，对其作为化妆品功能性原料而言，是极为有利的条件[小除千春等，皮肤外用剂，日本特开平5-70333，1993-03-23]。
在中国，牙膏和洗发水中添加茶提取物已有十几年的历史。现在，日本三井农林公司已推出多种含茶多酚(茶儿茶素类)的产品，用于食品和化妆品[原征彦等，食品工业，1995，38(2)71]。茶中的类黄酮主要是黄烷醇和黄酮醇，其主要功能为抗氧化、抗癌、抗微生物和除臭。儿茶素属于黄烷醇类，占绿茶干重的20～30％，茶中主要的黄酮醇包括槲皮素、四羟基黄酮和杨梅黄酮，约占茶水溶性提取物的2～3％。儿茶素的抗菌和除臭作用延缓了牙齿的腐烂(抗龋)，并改善了口气清新度，因此，可在牙膏、漱口液、口香糖及口气清新剂中添加，也可应用于其他日用品中，如许多洗发水、滋润膏、香水和防晒剂中都含有茶提取物，人们相信它们能对皮肤起镇静作用，并作为抗氧化剂防止皮肤受到自由基的攻击[贾旭东，茶类黄酮类功能及其应用，国外医学卫生学分册，2001，28(6)369-371]。
葛根的主要成分包括异黄酮类、三萜皂甙类和生物碱等，其中最受关注的是葛根素、大豆苷元等异黄酮成分。葛根中的异黄酮类物质能显著抑制酪氨酸酶的催化活性，中断黑素氧化过程，抑制黑素的发生与形成，从而防止黄褐斑、日晒斑等色素沉积。所以葛根被国际化妆品界誉为是又一种源于绿色植物的皮肤脱色组分，并被化妆品科技领先的日本用于祛斑化妆品，日本花王公司已将葛根异黄酮作为活性物质应用于增白霜[唐春红、陈琪，国内外葛营养保健功能的研究与开发现状，中国食品添加剂，2002，(6)56～58]。
从甘草根提制的油溶性萃取物中的甘草类黄酮，对皮肤的痤疮有抑制活性。其水溶性制剂的开发也获得了成功，对痤疮、粉刺的防治作用在人体上都得到了证明对睾丸酮-5a还原酶引起的痤疮和雄性激素引起的痤疮(对抗雄性激素受体)都有阻止作用；对痤疮菌引起的痤疮也有防治作用，对脂肪酶和磷脂肪酶为原因的痤疮也有阻止作用[山本进，化妆品的新原料信息——甘草类黄酮的水溶性制剂，2001，p12-13]。
其他类黄酮如桔皮苷能防止紫外线引起皮肤细胞脂质过氧化而导致的红斑和皮肤癌，这意味着它可作为防晒化妆品的理想原料[欧仕益，桔皮苷的药理作用，中药材，2002，25(7)531-533]。草珊瑚有效成分中含有黄酮苷、香豆素类、有机酸等，江西草珊瑚集团公司已将其提取物试用于洗发水、洗面奶、沐浴露、防晒霜和牙膏等产品中[胡国顺，草珊瑚流浸膏的性能及在化妆品中的应用，日用化学工业，2000(4)61-64]。
我国素有“竹子王国”之称，拥有十分丰富的竹类资源和源远流长的竹文化。境内有竹类40多属400余种，竹林面积约400万ha。据不完全统计，我国有1亿多人口全部或部分从竹林和竹林产品加工中获取生活费用。竹类植物作为森林资源的重要组成部分，不仅有着较高的经济价值，而且具有广泛的生态与社会效益。竹子以其独特的生物学、生态学及多用途等特点，日益受到人们的重视，在中国可持续发展战略中正发挥着越来越重要的作用。
我国在竹子有效成分的研究和开发方面处于国际领先水平。竹叶提取物是张英等于20世纪90年代开发的一种植物类黄酮制剂，其发明专利“一种添加竹叶黄酮提取物的保健啤酒(ZL 98 1 04563.4)”和“从竹叶中提取黄酮类化合物浸膏或粉剂的生产方法(ZL 98 1 04564.2)”分别于2000年和2001年获得国家专利局的授权。大量的研究表明，竹叶黄酮具有优良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒及保护心脑血管、防治老年退行性疾病等生物学功效。并以其丰富的原料来源、明确的功能因子、令人信服的安全性、高效稳定的制剂品质和清新甜香的竹子风味，近年来在功能性食品和医药保健品领域崭露头角[张英，天然功能性添加剂——竹叶提取物，精细与专用化学品，2002，10(7)20～22]。
竹叶提取物的功能因子主要是C-糖苷黄酮，四种主要的竹叶碳苷黄酮分别是荭草苷(Orientin)、异荭草苷(Homoorientin)、牡荆苷(Vitexin)和异牡荆苷(Isovitexin)。碳苷黄酮与氧苷黄酮相比，具有以下几方面的突出优点(1)结构稳定，不易被降解；(2)能深入病灶部位，直接发挥疗效；(3)亲水性增强，有利于食品、药品、化妆品的开发。国际学术界从90年代起开始关注碳苷黄酮，此领域属最新的研究前沿。
日本对竹子有效成分的研发始于20世纪70年代，但大量的工作主要集中在具有日本国资源特色的一类草本型竹子[称竹草(英)Bamboo grass，即Sasaalbomarginta Makino & Shibata等]上，少量涉及刚竹属品种。NishinaAtsuyoshi等1991曾从毛竹的茎皮中检出过抗菌活性成分2，6-甲氧基对苯醌[Jof Agric & Food Chem，1991，39(2)266-269]；1997年申请了专利“含有竹叶提取物的抗菌纸”[JP Patent 9961697]；1998年又申请了“含有VB1和竹提取物的食品抗菌剂”的专利[JP Patent 99269020]。Watanabe Mayumi等1997年申请了“含有竹草提取物的抗菌纸”的专利[JP Patent 98310992]。YamanakaSatoshi等(1998)报道了竹子干馏液的抗菌活性及其应用[Gekkan FudoKemikaru，1998，14(9)57-60]。Nishina Atsuro等1996年申报了“含有竹提取物的抗过敏剂”的专利[JP Patent 97278662]。Kiyooka Takatoshi(1995)申报了“用有机溶剂萃取法从竹皮中制备脱臭剂”的专利[JP Patent 9794290]。Sato T.等1986年报道了一种竹叶提取物溶液用于牙龈的治疗[NipponShishubyo Gakkai Kaishi，1986，28(2)752-757]。尤为值得一提的是，KenjiMatsui等(1990年)申请的日本专利，指出用一种或多种有机溶剂，从斑竹、毛竹、金毛竹等刚竹属的竹子中萃取的有效成分能抑制多种头屑生成菌，防治皮肤老化，并能抑制脂质过氧化和稳定产品[JP Patent 03251518]。但在此专利文献中，原料来源仅仅指竹(bamboo)，并未指竹叶或全竹，而且没有说明有效成分为何种化合物。迄今为止，日本的专利和公开报道的文献并没有明确指出与上述用途相关的竹子有效成分是黄酮类化合物。
张英及其合作者在先前研究的基础上，近来又对竹叶总黄酮与皮肤生理学相关的功能进行了系统研究，主要归纳为以下几个方面。
1竹叶总黄酮的抗氧化、抗衰老作用张英等曾研究了毛金竹[Phyllostachys nigra var.hnonis(Bean)Stepf exRendle]叶提取物抗衰老的生物学功效。结果表明，高剂量组能显著增强小鼠对非特异性刺激的抵抗能力(常压耐缺氧试验，p＜0.01)和抗疲劳能力(游泳试验，p＜0.01)；对正常小鼠的学习能力有一定的促进作用(电迷路法，p＜0.05)；对老年小鼠体内的超氧化物岐化酶(SOD)和谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-px)的活性有显著诱导作用；明显地抑制了老年小鼠血浆过氧化脂质(LPO)的生成、降低了肝脏脂褐素(LF)的含量；通过测定小鼠皮肤和尾腱中羟脯氨酸含量的变化，低剂量时就显示出对胶原蛋白的正效应，表明有抗氧化、抑制脂质过氧化产物、清除脂褐素和保护胶原蛋白的活性[张英、唐莉莉，毛金竹叶提取物抗衰老作用的实验研究，竹子研究汇刊，1997，16(4)62-67]。
2竹叶总黄酮的抗自由基、抗辐射作用2001年，浙江大学生物物理学专业的硕士研究生——徐兵，通过微弱化学发光分析和荧光光度分析等实验手段，比较研究了茶多酚、银杏提取物和竹叶总黄酮三种植物类黄酮清除O2-和OH的活性及其对60Co-r辐照和CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA体系中OH所致DNA损伤的保护作用。
2.1 原材料2.1.1 试样来源茶多酚含量99％，批号991227，浙江大学农业与生物技术学院杨贤强教授提供；银杏提取物总黄酮糖苷含量≥24％，批号20000041，宁波市中药制药厂生产；竹叶总黄酮总黄酮糖苷含量≥24％，批号980625，浙江大学生物系统工程与食品科学学院张英教授提供。用三蒸水将上述试样分别配制成1mg/mL的原液，待用。
2.1.2 药品与试剂小牛胸腺DNA、次黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、鲁米诺、邻菲罗啉(Phen)、荧光探针(EB)均为美国Sigma公司产品；硝酸钾、硫酸铜、配制PBS和CBS的药品和试剂等均为分析纯；酵母多糖悬液从活性干酵母自制；Vc和双氧水溶液现配现用。
2.1.3 仪器RF-5000型荧光分光光度计，日本岛津公司出品；BPCL-II超微弱发光仪，中科院生物物理所制造；60Co-r辐照源由浙江大学核农所辐照中心提供。
2.2 实验方法2.1.1 清除活性氧自由基(O2-和OH)的能力测定分别采用Vc-Cu2+-H2O2-酵母多糖体系产生OH、次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶-鲁米诺体系产生O2-，用适当浓度范围的试样进行抑制，超微弱发光仪测定空白及试验体系的发光值，计算抑制率，并进一步通过线性回归方程计算不同试样对OH和O2-的半抑制浓度(IC50)。
2.1.2 对DNA损伤的保护作用测定2.1.2.1 EB-DNA体系荧光强度检测法在1mL荧光杯中，加入25μg NDA和2μg EB，再加入一定浓度的试样溶液，不足部分用10mmol/L的硝酸钾溶液补足，静置10min后进行荧光强度的测定。测试条件为狭缝Ex＝5nm，Em＝5nm，激发波长520nm，中等扫描速度，扫描范围为550～720nm，测定不同条件下最大发射的荧光强度(在580.8nm附近)，并计算试样对荧光强度的抑制率I。
2.1.2.2 超微弱发光检测法用0.1mol/L CBS(pH＝10.5)配制CuSO4-Phen-DNA溶液10mL(加入10-2mol/L的邻菲罗啉490μl、10-2mol/L的CuSO470μl、4×10-4g/mL的DNA 35μl)，取上述溶液858μl，加10-2mol/L Vc溶液42μl，得到体积为900μl的混合液。在混合液中加入不同浓度的试样后，用CBS补足使总体积为1000μl，置入发光仪测量室中。最后以200μl3％的H2O2启动反应，记录化学发光的动力学曲线。
2.1.3 抗DNA的辐照损伤实验在5mL指形塑料离心管中加入0.4mL的DNA溶液(含DNA100μg)，加入0、20、40、80、160μg/mL的不同试样，以双蒸水补齐至2mL。每一试样的不同浓度均设三个平行样，对上述系列指管进行γ-射线照射。60CO的源强度约为144000Ci(2001年4月12日)。实验共设五个剂量，分别为0、0.8、2、8、20Gy，但所有的处理均采用相同的剂量率，为0.5Gy/min。辐照完成后2.5h内迅速按2.1.1中的方法测定。
2.3 结果2.3.1 清除O2-和OH能力的比较表1 三种植物黄酮类提取物试样清除活性氧自由基的性能比较

比较三种试样清除O2-和OH的能力，竹叶总黄酮与银杏提取物非常接近，茶多酚略强于它们，推测与其高纯度有关(表1)。
2.3.2 对EB-DNA系统荧光特性的影响三种植物黄酮类提取物对EB-DNA系统荧光强度的抑制呈显著的浓度依赖关系，从IC50值比较，竹叶总黄酮与银杏提取物十分接近，均强于茶多酚(表2)。表2三种天然植物黄酮类提取物试样对EB-DNA系统荧光强度的抑制率

黄酮类化合物可能与EB竞争在DNA分子上的结合位点，将嵌入在DNA碱基对上的EB分子拉下来，这样，试样的浓度越高，结合DNA上的EB分子就越少，EB-DNA的荧光强度就越低。
2.3.3 对DNA辐射损伤的保护作用表3 不同剂量的γ-辐照对EB-DNA荧光特性的影响

表3显示，辐照对DNA溶液可产生直接效应和间接效应。直接效应能引起DNA分子氢键破坏、双螺旋解开、碱基脱落、单双链断裂等；间接效应主要是由于辐照时所产生的自由基，尤其是OH，攻击DNA链，导致DNA分子的损伤。结果造成EB与DNA结合位点减少，荧光强度值也就降低。
表4、表5和表6分别显示了不同种类、不同浓度试样在不同剂量下对EB-DNA荧光强度的影响。类黄酮能有效清除自由基，因此对辐照引起的DNA分子的自由基损伤有显著的保护作用。茶多酚、银杏提取物、竹叶总黄酮在20～160μg/mL的浓度范围内，在不同的剂量下，均能使EB-DNA的荧光强度保持在较高的水平，说明它们具有防护DNA辐照损伤作用，并显示浓度依赖关系。从三种提取物的保护作用大小看，茶多酚略强于银杏提取物和竹叶总黄酮，后二者相接近。
表4不同浓度的茶多酚对不同剂量辐照时EB-DNA荧光强度的影响

表5不同浓度的银杏提取物对不同剂量辐照时EB-DNA荧光强度的影响

表6不同浓度的竹叶总黄酮对不同剂量辐照时EB-DNA荧光强度的影响

2.3.4 对CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA化学发光动力学的影响CuSO4-Phen-Vc-H2O2-DNA的化学发光体系在碱性介质中，邻菲罗啉(Phen)在金属离子的催化下，能与H2O2作用产生化学发光，其最大发射波长在445～450nm范围内。据相关文献报道，O2是引起Phen生成化学发光物的主要因素，在发光动力学曲线上处于前峰位置。同时，体系中产生的OH引起DNA损伤断裂，产生一延迟于Phen本身发光的慢的化学发光，最大发射波长在380～420nm之间，此发光是游离鸟嘌呤的特征反应，在发光动力学曲线上处于后峰位置。
本发光体系在茶多酚、银杏提取物、竹叶总黄酮三种试样存在的情况下，前峰、后峰峰值下降相当明显，其半抑制浓度约在0.2μg/mL。造成发光峰值的下降是由于抗氧化剂清除了启动链式反应的OH等，减少了.OH等造成的DNA损伤，认为类黄酮起到了预防型抗氧化剂的作用。同时也看出，前峰峰值的出现时间几乎没有变化，而后峰峰值滞后，且随抗氧化剂浓度的增加，峰值后移时间延长。认为造成后峰发光峰值延时是由于试样清除了自由基链式反应的中间态自由基，使链式反应中断，起到防护DNA自由基损伤的作用，说明类黄酮是起断链作用的抗氧化剂。证明了茶多酚、银杏提取物、竹叶总黄酮等类黄酮化合物同时作为一级抗氧化剂和二级抗氧化剂而起作用[徐兵，几种天然抗氧化剂对DNA的保护作用及其分子放射生物学机制的研究，浙江大学硕士学位论文，2001]。
3竹叶总黄酮的抑菌、抗炎作用3.1 实验原材料3.1.1 菌株来源粪肠球菌(E.faecalis)、化脓性链球菌(S.pyogenes)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、普通变形杆菌(P.vulgaris)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)来自浙江省人民医院临床泌尿生殖道标本中，实验前3个月内分离所得。标准菌种金黄色葡萄球菌S.aureus(ATCC25923)、大肠埃希菌E.coli(ATCC25922)由浙江省临床检验中心提供。
3.1.2 实验动物ICR小鼠(清洁级)、体重18～21g、雄性，由浙江省实验动物中心提供。
3.1.3 试样竹叶总黄酮总黄酮糖苷含量≥50％，为冷冻干燥的棕褐色结晶样粉末，置干燥器内储存，临用时以蒸馏水配制，超声波助溶。
3.1.4 药品及试剂2％巴豆油临用时以2％巴豆油、20％无水乙醇、5％蒸馏水和73％乙醚配制而成；消炎痛原料药，由宁波制药厂惠赠，临用时以1％CMC-Na混悬配制而成；二甲苯杭州化学试剂厂；M-H肉汤、M-H琼脂购自浙江省军区后勤检验所工厂；0.22μm的细菌滤膜为美国Milipore公司产品；新生小牛血清超级无支原体，购自杭州四季青生物工程材料研究所。
3.1.5 仪器设备Shell/JB 3200型CO2培养相，美国Sheldon公司产品；DG-3022A型酶联免疫检测仪，华东电子管厂出品；COIC型生物倒置显微镜，重庆光学仪器厂制造；SC-1型水平层流净化工作台，苏州洁净技术研究所制造；CQ250超声波清洗器，中船总公司七院七二六所超声仪器厂出品。
3.2 方法与结果
3.2.1 抑菌作用参照《中华人民共和国卫生部医政司全国临床检验操作规程》第二版有关内容进行。
化脓性链球菌按药物液体稀释法进行在灭菌M-H肉汤中加入10％量灭活的小牛血清，再加入试样制成25mg/mL浓度后，经灭菌大注射器装细菌滤膜除菌过滤处理。其无菌滤液按2倍递次以灭菌M-H血清培养基液稀释，每管1mL。各管加入经4～6小时培养的幼龄化脓链球菌液0.05mL(总含菌量为104c.f.u)置35℃恒温箱培养20～24h后，以其不出现细菌生长之最低药物含量管作为其MIC值。
其他细菌以药物对倍稀释法进行将各小瓶分装之M-H琼脂、高压灭菌溶化后，冷却至55℃左右，加入不同量的试样，使之分别成为25.0、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78和0.39mg/mL浓度，设一不加药的M-H琼脂作为加菌后阳性生长对照皿。然后在各皿中滴加6种(见3.1.1菌株来源)经比浊定菌浓度之菌液0.05mL(总含菌量为104c.f.u)，用接种环涂成小园斑(均为4～6h幼龄菌)，干后覆皿，置35℃恒温培养16～20h后，以其不出现细菌生长之最低试样浓度管作为其MIC值。
表7 竹叶总黄酮的抑菌作用

结果表明竹叶总黄酮对上述7种细菌均有不同程度的抑制作用(表7)。
3.2.2 抗炎作用3.2.2.1 对小鼠巴豆油致耳廓肿胀的影响小鼠按体重随机分成5组，每组12只，设置如下①对照组等体积生理盐水，0.8mL/20g；②消炎痛组消炎痛10mg/kg；③高剂量组10mg/mL的BLTF-01，剂量为400mg/kg；④中剂量组5mg/mL的BLTF-01，剂量200mg/kg；⑤低剂量组2.5mg/mL的BLTF-01，剂量100mg/kg。动物每天p.o.给药1次，连续7d(消炎痛仅给药1次)，末次给药后1h，小鼠右耳涂2％巴豆油0.02mL/只、致炎，4h后处死，沿耳廓剪下左右耳，以9mm环钻冲下左右耳片，称重，以左右耳片重量之差值记作肿胀率。
实验结果表明，小鼠灌胃给予200mg/kg和400mg/kg剂量的竹叶总黄酮连续7天后，对巴豆油所致耳廓肿胀具有显著(*p＜0.05)和极显著(p＜0.01)的抑制作用，并呈明显的剂量依赖关系(表8)。表8 竹叶总黄酮对小鼠巴豆油所致耳廓肿胀的影响

注与对照组相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
3.2.2.2 对小鼠二甲苯致耳廓肿胀的影响小鼠按体重随机分成5组，每组10只，设置同3.2.2.1。动物每天p.o.给药1次，连续7d(消炎痛仅给药1次)，末次给药后30min，小鼠右耳涂二甲苯0.05mL/只、致炎，15min后处死，沿耳廓剪下左右耳，以9mm环钻冲下左右耳片，称重，以左右耳片重量之差值记作肿胀率。并与对照组比较，判断疗效。
表9 竹叶总黄酮对小鼠二甲苯所致耳廓肿胀的影响

注与对照组相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
实验结果表明，小鼠灌胃给予400mg/kg剂量的竹叶总黄酮连续7天后，对二甲苯所致耳廓肿胀具有显著(*p＜0.05)的抑制作用(表9)。
4 竹叶总黄酮的皮肤生理活性4.1 实验材料与方法4.1.1 试样竹叶总黄酮棕黄色粉末，总黄酮含量为28.7％。试样用DMSO溶解，经0.22μm滤膜抽滤除菌，以无血清DMEM稀释为受试浓度，终浓度为0.5％、0.05％和0.005％，-4℃保存。以无血清DMEM作为对照。
4.1.2试剂、器皿、仪器DMEM培养基、角质形成细胞(K-SFM)培养基(Gibco BRL公司)，胰岛素(美国Sigma公司)、胰蛋白酶(美国Difco公司)小牛血清(NBS，杭州四季青公司)，四甲基偶氮唑(MTT，美国Fluka公司)，二甲亚砜(DMSO，上海生物化学研究所)；化可的松、青霉素、链霉素、Ficoll、96孔板及24孔板、及35mm培养皿和25cm2培养瓶(美国Corning公司)。酶标仪(BIO-TEK公司)、pH计、超净台、培养箱、722分光光度计。
4.1.3 细胞培养4.1.3.1 皮肤角质形成细胞的原代培养在无菌条件下剥离SD大鼠(3日龄)背部皮肤，将皮片置于4℃冰箱中30～60min贴壁，垂直缓慢地加入0.25％胰酶，于4℃冰箱过夜(10～11h)，然后用PBS漂洗，并用含10％NBS的DMEM培养液中和胰酶。分离表皮与真皮，刷取表皮基地层角质形成细胞，离心去除成纤维细胞。用K-SFM培养基将细胞密度调整至1×106/mL，接种于96孔板及24孔板，24h后换第一次液，以后每隔1d换液。待细胞生长至亚融合状态，饥饿处理24h后加入各浓度试样。
4.1.3.2 皮肤成纤维细胞的原代培养将分离的真皮继续消化90min，以含10％NBS的DMEM中和胰酶，于DMEM中剪碎并吹打，100目滤网过滤，洗细胞2次，用含10％NBS的DMEM培养液调整细胞密度至2×106/mL，接种于96孔板。24h后换第一次液，以后每2～3d换液。当细胞生长至80％融合时，饥饿处理24h后加入各浓度受试物。
4.1.3.3 B-16黑素瘤细胞培养用含15％NBS的DMEM培养基调整细胞数目至1×104个/ml，接种于培养瓶及35mm培养皿。
4.1.4 细胞增殖活力测定
96孔板每孔接种2×105个细胞，当培养达亚融合状态后换液并加入各浓度受试物，每一浓度为4个样本。加药后24h各孔加10μl MTT，继续培养4h，弃上清，加100μl溶解液后，在酶标仪上于570mm、630nm处检测。
4.1.5 脂质过氧化产物(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)测定MDA测定采用TBA比色法，SOD测定采用亚硝酸盐还原法，试剂盒由南京建成生物公司提供。
4.1.6 黑素细胞酪氨酸酶活性及合成黑素测定4.1.6.1 酪氨酸酶活性测定将B16细胞密度调成1.0×104个细胞，每个35mm培养皿接种1.0mL细胞悬液，培养24h.。细胞处倍增期时加入各浓度受试物，24h时收获细胞，用PBS冲洗两遍，加入2.0Ml PBS(内含0.1％Triton-X)，37℃、30min后，取出细胞碎片液0.1mL，进行蛋白质测定。在剩余液中加入含有0.1％L-DOPA的PBS 2.0mL，37℃孵育1h，400nm处比色测定。
4.1.6.2 黑素合成测定将细胞密度调称1.0×104个细胞，接种于培养瓶中培养24h，加入受试物，48h换L液，受试液作用72h收获细胞。将细胞用PBS冲洗，用胰蛋白酶消化。搜集细胞溶解在2mL PBS中，取出0.2mL测定蛋白质含量。在剩余0.9mL细胞液中，加入1.8mL、4mol/L的NaOH，100℃下加热20min，于400nm处比色测定。
4.1.7安全性评价测试根据1999年国家卫生部颁布的《化妆品卫生规范》中的安全性评价程序和方法进行。受试物浓度为10％。皮肤刺激试验取受试物0.2ml涂于皮肤上。每天一次，每次1h，连续14天；眼刺激试验将受试物0.1ml滴入结膜囊中，于染毒后1、24、48、72h以及第4天、第7天对动物眼睛进行检查。
4.2 结果4.2.1 对皮肤细胞的增殖作用表10显示竹叶总黄酮在0.005％～0.05％剂量范围内具有促进皮肤细胞增殖的作用，其中对皮肤角质形成细胞的增殖作用在0.005％浓度时显著(p＜0.05)、在0.05％浓度时极显著(p＜0.01)；对皮肤成纤维细胞的增殖能力与对照组相比也有显著性差异(0.005％时，p＜0.05)。
表10 竹叶总黄酮对两种皮肤细胞增殖能力的影响

注*p＜0.05，**p＜0.01，与对照相比。
4.2.2 对皮肤细胞MDA生成量与SOD活性的影响表11可见，竹叶总黄酮在0.0005％～0.005％剂量范围内具有减低脂质过氧化产物MDA生成、提高抗氧化酶SOD活性的作用，其中0.005％剂量组与对照相比具有显著性(p＜0.05)。
4.2.3 皮肤美白功效B16黑素肿瘤细胞酪氨酸酶抑制试验结果表明，竹叶总黄酮对该酶活性无明显影响；而由黑素合成试验结果得知，0.005％～0.05％浓度时对黑素合成具有显著的抑制作用(见表12)。
表11竹叶总黄酮对皮肤角质形成细胞MDA生成与SOD活性的影响

注*p＜0.05，与对照相比。表12 竹叶总黄酮对B16黑素肿瘤细胞酪氨酸酶活性和黑素合成的影响

注*p＜0.05，**p＜0.01，与对照相比。
4.2.4 皮肤安全性评价测试竹叶总黄酮的皮肤刺激试验及眼刺激试验结果均为阴性，显示无皮肤及眼刺激性。
4.3 结论皮肤刺激试验与眼刺激试验是了解外来物在与皮肤或粘膜接触的情况下，是否对皮肤产生刺激损害作用或导致粘膜发生炎性病变，是化妆品及其生产原料安全性评价的必检项目。测试结果显示，竹叶总黄酮的皮肤和眼结膜刺激反应均为阴性，表明在皮肤外用条件下，对人体皮肤及粘膜不会产生刺激作用。试验表明，竹叶总黄酮对皮肤细胞具有良好的生物学作用，能够促进皮肤角质形成细胞及成纤维细胞的增殖能力，同时提高SOD活性，降低氧化损伤，提示竹叶总黄酮可作为延缓皮肤衰老的活性物质应用到化妆品中。皮肤美白功效测试发现，竹叶总黄酮能够降低黑色素细胞合成黑素的含量，提示可能具有对皮肤的美白功效。
竹叶总黄酮作为抗衰老护肤因子应用在化妆品中。
本发明的优点是提供了一种来源广阔、安全高效、经济适用的抗衰老护肤因子——竹叶总黄酮，对其与皮肤生理功能相关的特性进行了系统研究，表明其具有抗自由基、抗氧化、抗辐射，抗菌、抑菌，促进皮肤细胞增殖，防止皮肤的氧化损伤，减少黑素合成，延缓皮肤衰老等美容功效，并能赋予产品以竹子特有的清香，在诸如营养滋润剂、防晒护肤剂、抗皱美白剂、洁面乳、洗发水、沐浴露等日用化妆品领域有着广阔的应用前景。


图1是竹叶总黄酮的红外谱图(经溴化钾压片)；图2是竹叶总黄酮的紫外谱图(溶于光谱纯的甲醇)。
具体实施方法本发明所指的竹叶总黄酮是从禾本科(Graminae)、竹亚科(Bambusoideae)、刚竹属(Phyllostachys Sieb.et Zucc)品种的叶子中得到的不同精度的黄酮制剂，其生产工艺在张英以前的二项发明专利(专利号分别为ZL 98 1 04564.2和ZL 98 1 04563.4)中已有涉及。需要指出的是，本专利所指的竹叶总黄酮既可以是采用上述专利工艺得到的产品，也可以是在此基础上进一步运用吸附～解吸、膜分离、超临界流体萃取等高新技术及其组合方法精制得到的竹叶黄酮制品。
竹叶总黄酮的外观为黄色或棕黄色粉末(也可以浸膏形式存在)，总黄酮糖苷含量(以干基计)可以变化在10～90％之间，其中荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷四种主要碳苷黄酮的含量占总黄酮糖苷含量的50％以上。经溴化钾压片后的红外光谱图显示，竹叶总黄酮在3400、2925、1610、1118、1077cm-1等附近有特征性吸收(见附图I)；将其溶于光谱纯甲醇后，在200～600nm的波长范围内进行扫描，谱图显示在240～280nm之间有一强吸收峰，在340～380nm之间有一次强吸收峰，符合黄酮类化合物的典型特征(见附图II)。
竹叶总黄酮的化学试剂鉴别取试样0.5g溶于100mL95％的乙醇中，①取上述溶液1 mL，加1％FeCl3-乙醇溶液2～3滴，应显深蓝色或兰紫色。②取上述溶液1mL，加1％AlCl3-乙醇溶液2～3滴，应呈鲜黄色。③取BLTF0.5g，加入10mL乙醚，超声波辅助萃取30s，过滤。取滤液1mL，置70～90℃的水浴中挥干乙醚后，依次加入2％的间二硝基苯溶液(用95％乙醇配制)和2.5mol/L的KOH水溶液各1mL，应立即出现微红色，放入上述热水浴中，迅速变成深紫红色。
本发明所涉的最新研究表明，竹叶总黄酮对皮肤和粘膜无刺激、过敏性反应；具有可与茶多酚和银杏提取物相媲美的抗自由基、抗氧化和抗辐射活性；在0.005％～0.05％的剂量范围内即能显著地促进皮肤细胞的增殖，并能显著地抑制黑素的合成；在0.0005％～0.005％剂量范围内即能显著减低MDA生成，并提高SOD的活性，具备了作为一种安全、高效、经济的植物化学素用作抗衰老护肤因子的充分和必要的条件。
鉴于竹叶总黄酮所具有的抗自由基、抗氧化、抗衰老、抗辐射、抗菌、抑菌、消炎、美白、抗皱等多重生物学等功效，同时符合作为化妆品添加剂的安全性要求，可作为抗衰老护肤化妆品的功能性因子，应用在诸如营养滋润剂、防晒护肤剂、抗皱美白剂、洁面乳、洗发水、沐浴露等多种日用化妆品中。
除了竹叶总黄酮中的功效成分外，本发明的护肤因子可以与通常用于化妆品中的组分适当地配合、制成各种不同用途的产品。这些其他的组分可以包括各种维生素及其衍生物、透明质酸、表面活性剂、润湿剂、螯合剂、pH调节剂、赋形剂、其他紫外线吸收剂、防腐剂、染料、香料等。
本发明的化妆品可以制成各种形式，如油质化妆品、乳剂化妆品、水质化妆品。
本发明化妆品具有美白、抗皱、防晒、消炎、祛斑和祛豆等美容护肤效果。
本发明将通过下列非限制性实施例进行举例说明。以下配方实例中的单位均为重量百分比(w/％)。
实施例1营养美容露(霜)蜂蜡 13～17精制地蜡 13～17凡士林15～20羊毛脂 3～7橄榄油 8～12聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯 2～6香料 0.1～1竹叶总黄酮0.005～0.05水加至100。
本产品对皮肤有抗菌、美容、改善血液循环、促进新陈代谢、增强皮肤活力、润湿表皮、抑制异状皮脂分泌，以及活化细胞、抗组织毒等作用。
实施例2抗皱增白蜜L-抗坏血酸及其衍生物 1～3橄榄油 10～20肉豆蔻酸异丙酯3～7壬基酚聚氧乙烯醚 0.1～1甘油 3～7透明质酸 1～3竹叶总黄酮 0.005～0.05乙醇 5～10水 加100。
本品具有抗皱、美白、保湿、祛斑等作用。
实施例3防晒霜十六～十八醇 6～10白油26#3～6棕榈酸异丙酯 3～6二甲基硅油 1～2单甘酯 2～3
羊毛酯 0.1～1聚乙二醇-6000 0.1～1甘油 2～6竹叶总黄酮 0.005～0.05SPP-200(磷酯季胺化物阳离子乳化剂) 2～3香精、防腐剂 0.1～1水 加至100。本品具有防晒、抗衰老及护肤功效。
本品具有抑制皮肤表面的有害菌，活化皮肤细胞，调理皮肤及预防皮肤癌的作用，并使浴后的身体长时间带有一种怡人的清香。实施例6洗发香波十二烷基硫酸钠 40～60羟丙基纤维素0.5～1.5油基二乙醇酰胺 3～7阳离子型动物蛋白3～7
聚乙二醇羊毛酯 1～3尼泊金甲酯 0.1～0.3季胺化合物-15 0.05～0.15聚氨基丙基双胍氯代二甲苯酚0.05～0.15大豆磷脂0.1～1竹叶总黄酮 0.01～0.5水 加至100。
本品除可使头发发亮、柔软、易梳外，还可防止洗发过程中角蛋白的流失，防止头发的枯黄分叉，防治头皮瘙痒，从而起到保护头发的功效，并使洗后的头发长时间带有一种淡雅的香味。
显然，根据上述的实例，本发明可以有许多的改良和变更。因此，应当明白，在所附权力要求的范围内，除这里描述的外，本发明也可以用其他方法实施。
权利要求
1.一种竹叶总黄酮作为抗衰老护肤因子在化妆品中的应用，其特征在于竹叶总黄酮作为抗衰老护肤因子应用在化妆品中。
2.根据权利要求1所述的竹叶总黄酮作为抗衰老护肤因子在化妆品中的应用，其特征在于所说的化妆品为营养美容露(霜)、抗皱增白蜜、防晒霜、洗面奶、沐浴露、洗发香波。
3.根据权利要求2所述的竹叶总黄酮作为抗衰老护肤因子在化妆品中的应用，其特征在于所说的营养美容露(霜)的重量百分组成为蜂蜡 13～17精制地蜡 13～17凡士林15～20羊毛脂 3～7橄榄油 8～12聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯 2～6香料 0.1～1竹叶总黄酮 0.005～0.05水 加至100。
4.根据权利要求2所述的竹叶总黄酮作为抗衰老护肤因子在化妆品中的应用，其特征在于所说的抗皱增白蜜的重量百分组成为L-抗坏血酸及其衍生物 1～3橄榄油 10～20肉豆蔻酸异丙酯3～7壬基酚聚氧乙烯醚0.1～1甘油 3～7透明质酸 1～3竹叶总黄酮0.005～0.05乙醇 5～10水加100。
5.根据权利要求2所述的竹叶总黄酮作为抗衰老护肤因子在化妆品中的应用，其特征在于所说的防晒霜的重量百分组成为十六～十八醇 6～10白油26#3～6棕榈酸异丙酯 3～6二甲基硅油 1～2单甘酯 2～3羊毛酯 0.1～1聚乙二醇-6000 0.1～1甘油 2～6竹叶总黄酮0.005～0.05SPP-200(磷酯季胺化物阳离子乳化剂) 2～3香精 防腐剂 0.1～1水 加至100。
6.根据权利要求2所述的竹叶总黄酮作为抗衰老护肤因子在化妆品中的应用，其特征在于所说的洗面奶的重量百分组成为维生素E及其衍生物 0.05～0.5三硬脂酸甘油酯 6～10鲸蜡醇 1～3液体石蜡 8～16竹叶总黄酮0.01～0.05三乙醇胺 1～3丙二醇 4～8水 加至100。
7.根据权利要求2所述的竹叶总黄酮作为抗衰老护肤因子在化妆品中的应用，其特征在于所说的沐浴露的重量百分组成为两性月桂酸基羟丙基磺酸盐 20～30椰子油酸酰胺丙基羟丙基磺化甜菜碱7～13月桂基醚硫酸盐(30％) 8～12月桂酰胺基二乙醇胺0.5～1.5竹叶总黄酮 0.01～0.5水 加至100。
8.根据权利要求2所述的竹叶总黄酮作为抗衰老护肤因子在化妆品中的应用，其特征在于所说的洗发香波的重量百分组成为十二烷基硫酸钠 40～60羟丙基纤维素 0.5～1.5油基二乙醇酰胺3～7阳离子型动物蛋白 3～7聚乙二醇羊毛酯1～3尼泊金甲酯0.1～0.3季胺化合物-15 0.05～0.15聚氨基丙基双胍氯代二甲苯酚 0.05～0.15大豆磷脂 0.1～1竹叶总黄酮0.01～0.5水加至100。
全文摘要
本发明公开了一种竹叶总黄酮作为抗衰老护肤因子在化妆品中的应用，目的是为化妆品行业提供一种天然植物来源的抗衰老护肤因子。竹叶总黄酮具有抗自由基、抗氧化、抗辐射、抗菌、抑菌、促进皮肤细胞增殖、防止皮肤的氧化损伤、减少黑素合成、延缓皮肤衰老等美容功效，且对皮肤和粘膜无刺激、过敏性反应，并能赋予产品以竹子特有的清香，可应用在诸如营养滋润剂、防晒护肤剂、抗皱美白剂、洁面乳、洗发水、沐浴露等多种日用化妆品中。
文档编号A61K8/49GK1436524SQ0311565
公开日2003年8月20日 申请日期2003年3月3日 优先权日2003年3月3日
发明者张英, 吴晓琴, 陆柏益 申请人:杭州浙大力夫生物科技有限公司