专利名称：一种治疗结缔组织疾病的药学组合物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗结缔组织疾病的药学组合物，特别是涉及治疗由于免疫调节失常引发的皮肤、关节及软组织炎症的药学组合物。
背景技术：
结缔组织疾病通常是指一种免疫失常疾病，基因因素对于此种疾病常扮演重要角色，然而其致病原理至今仍未完全明了。结缔组织疾病都具有结缔组织的免疫学或炎症性改变的共有病症。一般常见的病症有关节炎或滑膜炎、胸膜炎、心肌炎、心内膜炎、心包炎、腹膜炎、脉管炎、肌炎、皮肤炎、肾炎、以及结缔组织的变化。结缔组织疾病实质上几乎牵涉所有脏器系统。疾病的进程常常是恶化期与缓解期交互发生。
在结缔组织疾病群中，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)可以说是炎症性关节炎中最常见的一种形式。受影响的关节的主要病理变化包括滑膜增生与血管翳生成、骨与软骨分解、T与B淋巴球的血管内膜下浸润、以及由巨噬细胞与纤维母细胞分泌的前炎症媒介物的生产与诱导。间质性与类纤维母细胞的滑膜细胞会对于四周炎症性细胞激素产生反应性的增生，并且转为类肿瘤性质而造成不可逆的软骨与骨的分解。
Marks PA等人研究显示组蛋白去乙酰基转移酶抑制物不论在活体内与活体外，对于细胞周期休止、细胞分化、或转形细胞的细胞凋零都有很强的诱导作用。组蛋白去乙酰基转移酶抑制物会造成组蛋白去乙酰基转移酶活性的抑制，并导致组蛋白的过乙酰化(Marks PA等人，J.Natl.Cancer Inst.2000；921210-1216；Karmer OH等人，Trends Endocrinol.Metab.2001；12294-300)。结果将向上调节细胞周期抑制物如p21、p27及p16抑制炎症细胞激素如介白素-1、介白素-8、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、及转形生长因子-β(TGF-β)的表现，但向下调节免疫刺激物如介白素-6、介白素-10、及CD154对GAPDH或α-肌动蛋白无作用，这在Lagger G.、Richon，V.M.等人的文章中有报导(Lagger G.，EMBO.J.2002；212672-2681；Richon，V.M.等人，Clin.Cancer Res.2002；8662-667；Richon，V.M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA.2000；9710014-10019；Van Lint，C.等人，Gene Expr.1996，5245-243；Leoni，F.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002；992995-3000；Huang，N.等人，Cytokine，1997；927-36；Mishra等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001；982628-2633；Segain，J.P.等人，Gut，2000；47397-403；Stockhammer，G.等人，J.Neurosurg.2000；83672-681)。
目前已知能够抑制组蛋白去乙酰基转移酶活性的化合物可根据结构差异性分为六类，包括丁酸苯酯所属的短链脂肪酸类(short chainfatty acid class)、低朴第辛(音译depudecin)所属的环氧化合物类(epoxide class)、穿普克辛A(音译trapoxin A)所属、具有一2-胺基-8-酮基-9，10-环氧基-癸酰基团的环四肽类(cyclic tetrapeptide class)、缩酚酸肽(depsipeptide)所属、缺乏一2-胺基-8-酮基-9，10-环氧基-癸酰基团的环四肽类(cyclic tetrapeptide class)、毛斯达丁A或澳杉弗利廷(音译oxamflatin)所属的异羟肟酸类(hydroxamic acid class)、以及苯甲酰胺类(benzamide class)。但是至今仍然没有研发出有效或可治愈此类结缔组织疾病的药物，所以现有药物对于患者治疗效果不佳，而且治疗所需费用高、发病率高、甚至预期寿命变短。因此目前仍然对于预防皮肤、关节或软组织发生分解以及维持其功能的有效药物有迫切的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种治疗结缔组织疾病的药学组合物及其用途。这种药学组合物可显著抑制造成皮肤、关节及软组织发炎的结缔组织疾病的主要症状，预防皮肤溃疡、关节分解、及软组织坏死与水肿的发生，同时也可以阻断滑膜组织增生，维护骨与软骨结构，减少淋巴球浸润，并且抑制前炎症媒介物。
上述发明目的通过下述技术方案得以实现。
本发明的治疗结缔组织疾病的药学组合物，包括组蛋白去乙酰基转移酶抑制物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
组蛋白去乙酰基转移酶抑制物或其药学上可接受的盐的有效剂量占该药学组合物总重量的0.1％～50％。
组蛋白去乙酰基转移酶抑制物包括丙戊酸(valproic acid)、毛斯达丁A(trichostatin A)、丁酸苯酯(phenyl butyrate)、低朴第辛(depudecin)、穿普克辛A(trapoxin A)、缩酚酸肽(depsipeptide)、澳杉弗利廷(oxamflatin)、或苯甲酰胺类(benzamide)。
在本发明的实例中，组蛋白去乙酰基转移酶抑制物优选丁酸苯酯和毛斯达丁A。丁酸苯酯抑制组蛋白去乙酰基转移酶的机制是属于毫摩尔浓度下的非竞争性机制；而毛斯达丁A则是组蛋白去乙酰基转移酶的专一性抑制物，即使在次微摩尔(sub-mM)范围下也具有抑制效果。
组蛋白去乙酰基转移酶抑制物药学上可接受的盐包括碱金属盐如钠盐或钾盐、碱土金属盐如钙盐或镁盐、或含有机碱的盐如铵盐、三乙基胺盐或乙醇胺盐。
本发明的药学组合物中药学上可接受的载体依服用方式的不同而采用不同的载体。在口服的情形下，可以软胶囊或硬胶囊、锭剂、颗粒、粉末、溶液、悬浮液等方式使用。在非口服的情形下，可以乳膏、油剂、凝胶、乳液、贴片、栓剂、脂肪体剂型、注射液、点滴注入剂型等使用，而维持持续性膜吸收是以固体、黏液、或悬浮液形式使用。本领域技术人员可选择适合各种载体、磨碎处理或悬浮剂的使用方式与使用剂型或配方。
本发明的药学组合物可以口服或非口服方式使用。
本发明的有效剂量，本领域技术人员可根据使用途径以及同时可能施行的治疗方法如其它抗炎症或抗肿瘤药剂的使用等而有所不同。对于任何特定个体(如人类、狗、或猫)有效剂量与治疗方法也根据种种其它因素而异，其它因素包括所使用特定化合物的活性、个体年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、使用时间、代谢速率、疾病严重程度与病程、以及病患对疾病的反应等；然而，一般而言，不论何种使用方式，有效剂量通常为0.1％(重量)到50％(重量)。
本发明的治疗结缔组织疾病的药学组合物的制备方法为将组蛋白去乙酰基转移酶抑制物或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体按常规方法混合即可。
本发明的药学组合物可在制备治疗结缔组织疾病包括类风湿性关节炎、系统性红斑性狼疮、进行性系统性硬化症、修格连式干燥症、皮肌炎和混合性结缔组织病等疾病的药物中应用。
本发明的组蛋白去乙酰基转移酶抑制剂可以在毛斯达丁A与丁酸苯酯、或其药学上可接受载体或盐类的外，更包括一成分，其具有抗炎症或抗肿瘤活性。
本发明的优点和效果本发明的组蛋白去乙酰基转移酶抑制物可以用药学上可接受的盐的形式使用，如此而来，本发明的化合物可以长期使用却又不会有影响药物作用的副作用。
本发明的丁酸苯酯与毛斯达丁A的试验结果发现，这类组蛋白去乙酰基转移酶抑制物对于由于自身免疫调节失常而在结缔组织发生的结缔组织疾病如滑膜增生，血管翳形成，骨与软骨分解，皮肤炎症、溃疡或纤维化，淋巴球浸润，以及前炎症媒介物的产生等具有抑制作用。
由于结缔组织疾病的特征为细胞周期失调，以及前炎症细胞激素异常反应。由实施例12与13的结果显示，丁酸苯酯与毛斯达丁A对于结缔组织疾病可以同时使细胞周期抑制物p16向上调节，也向下调节前炎症媒介物TNF-α。由此结果更可推知组蛋白去乙酰基转移酶抑制物对于治疗结缔组织疾病很有效。
下面结合具体实施方式
进一步说明本发明的效果。
图1是实施例10中以丁酸苯酯(2mM)处理在不同时间点的西方墨点法结果照片。
图2是实施例10中以毛斯达丁A(200nM)处理在不同时间点的西方墨点法结果照片。
图3～图5是实施例10以抗乙酰化的组蛋白H3的抗体进行萤光染色照片；其中图3为阴性对照照片；图4为以丁酸苯酯处理后的萤光染色照片；图5为以毛斯达丁A处理后的萤光染色照片。
图6是实施例10丁酸苯酯对于由辅佐性关节炎来源的滑膜纤维母细胞会表现出剂量与时间依存性的生长抑制曲线图； 代表丁酸苯酯的浓度为1mM时的曲线；
代表丁酸苯酯的浓度为2mM时的曲线； 代表丁酸苯酯的浓度为5mM时的曲线。
图7是实施例10毛斯达丁A对于由辅佐性关节炎来源的滑膜纤维母细胞会表现出剂量与时间依存性的生长抑制曲线图； 代表毛斯达丁A的浓度为100nM时的曲线； 代表毛斯达丁A的浓度为200nM时的曲线； 代表毛斯达丁A的浓度为300nM时的曲线。
图8.1和～图8.2是实施例10西方墨点法结果照片；其中第1列为对照组(无处理组)，第2列为丁酸苯酯(2mM)处理组，第3列为毛斯达丁A(200nM)处理组。
图9.1～图9.6是实施例11以抗乙酰化的组蛋白H3的抗体进行的免疫萤光染色照片；其中图9.1为第1天的对照组图；图9.2为第15天的对照组图；图9.3为丁酸苯酯处理组第1天的照片；图9.4为丁酸苯酯处理组第15天的照片；图9.5为毛斯达丁A处理组第1天的照片；图9.6为毛斯达丁A处理组第15天的照片。
图10.1～10.16是实施例11中的一系列照片；其中图10.1是踝与跖关节的侧视图(载体组)；图10.2是踝与跖关节的侧视图(药剂处理组)；图10.3是脚掌后视图(载体组)；图10.4是脚掌后视图(药剂处理组)；图10.5是矢状切面图(载体组)；图10.6是矢状切面图(药剂处理组)；图10.7是脚掌关节的显微切片照片(载体组)；图10.8是脚掌关节的显微切片照片(药剂处理组)；图10.9和图10.13是40倍视野下组织化学染色照片(载体组)；1-骨；2-血管翳；3-关节腔；4-滑膜；图10.10和图10.14是40倍视野下组织化学染色照片(药剂处理)；
5-滑膜；6-关节腔；7-骨；图10.11和图10.15是100倍视野下组织化学染色照片(载体组)；图10.12和图10.16是100倍视野下组织化学染色照片(药剂处理组)。
图11.1、图11.3和图11.5是实施例11中10％(重量)丁酸苯酯处理组的组织化学染色照片；其中1-滑膜。
图11.2、图11.4和图11.6是实施例11中1％(重量)毛斯达丁A处理组的组织化学染色照片；其中2-滑膜。
图12.1～图12.12是实施例12的组织化学染色照片；其中图12.1～图12.6为丁酸苯酯处理组；图12.7～图12.12为载体组；图12.1、图12.3、图12.5、图12.7、图12.9和图12.11为H&E染色照片；图12.2、图12.4、图12.6、图12.8、图12.10和图12.12为p16免疫组织化学染色照片；图12.1、图12.2、图12.7和图12.8为40倍视野下染色照片；图12.3、图12.4、图12.9和图12.10为100倍视野下染色照片；图12.5、图12.6、图12.11和图12.12为200倍视野下染色照片；其中1、2、3、4、5-滑膜；6、8、10、12、14、16-血管翳；7、9、11、13、15、17-软骨。
图13.1～13.10是实施例13中免疫组织化学染色照片；其中图13.1、图13.3、图13.5、图13.7和图13.9为载体组；图13.2、图13.4、图13.6、图13.8和图13.10为丁酸苯酯处理组；图13.1和图13.2为关节在40倍视野下免疫组织化学染色照片；
其中1-血管翳；2、3-滑膜；图13.3和图13.4为关节在100倍视野下免疫组织化学染色照片；其中4-血管翳；5、6-滑膜；图13.5和图13.6为皮下组织在100倍视野下免疫组织化学染色照片；图13.7和图13.8为皮下组织在200倍视野下免疫组织化学染色照片；图13.9为真皮在100倍视野下免疫组织化学染色照片；图13.10为表皮在100倍视野下免疫组织化学染色照片。
图14.1是实施例13中毛斯达丁A对于发生结缔组织疾病的结缔组织中p16在200倍视野下的免疫组织化学染色照片。
图14.2是实施例13中毛斯达丁A对于发生结缔组织疾病的结缔组织中TNF-α在200倍视野下的免疫组织化学染色照片。
具体实施例方式
下面结合一些实施例来进一步说明本发明，但这些实施例并非用以限定本发明的保护范围。
首先介绍本发明实施例所采用的化合物。
丁酸苯酯(phenylbutyrate，分子量164.21)为一天然、无毒、无色、无味的芳香族脂肪酸，纯化自哺乳动物尿液与血清中，已经被美国食品药物管理局(FDA)认可，可用于与天生尿素合成失败相关的高氮血症孩童，并且已经用于继发于高剂量化疗的高氮血症成年人。该药物会在肝脏与肾脏中代谢成为乙酸苯酯，继而与谷胺酸酰胺结合而形成苯乙酰谷氨酰胺(phenylacetylglutamine)，该化合物将作为尿中排泄废弃氮的载体。丁酸苯酯也曾经被评估用于镰状细胞性贫血、β-地中海贫血、囊肿纤维化、肾上腺脑白质障碍(adrenalleukodystrophy)、以及血液性与非血液性恶性肿瘤等疾病的临床试验。
毛斯达丁A(分子量164.21)为一氢氧氨酸，分离自吸水链霉菌(Streptomyces hydroscopicus)，是用作为抗霉菌剂、抗肿瘤剂、以及抗原虫剂。
实施例1丁酸苯酯(phenylbutyrate)油质软膏的制备将470克白色矿脂(white petrolatum)(供货商Riedel-deHaen)、25克石蜡50/52(市售)、以及5克丁酸苯酯(供货商Merck)置于一烧杯中混合并加热至70℃形成一糊状物。将该糊状物于400rpm搅拌1小时，并冷却至室温。
实施例2丁酸苯酯油质软膏的制备将65克白色矿脂(white petrolatum)(供货商Riedel-de Haen)、15克十八烷醇(Riedel-de Haen)、260克软石蜡(Merck)、155克液态石蜡(Merck)、以及5克丁酸苯酯(Merck)置于一烧杯中混合并加热至70℃形成一糊状物。将该糊状物于400rpm搅拌1小时，并冷却至室温。
实施例3丁酸苯酯乳剂的制备第一成分70克Tefose 63(市售)、20克Superpolystate(市售)、10克Coster 5000(市售)、15克Myriyol 318(市售)、以及15克GMS SE(市售)于一烧杯中混合并加热至70℃。
第二成份5.739克丁酸苯酯化钠(供货商Triple Crown America，Inc.)、0.125克甲基戊酮(methylparaben)(Merck)、0.075克丙基戊酮(propylparaben)(Merck)、以及149.061克去离子水于一烧杯中混合并加热至70℃。
将第二成份缓慢地加入第一成分中并继续以400rpm搅拌5分钟直到形成一混合物。将2％Stabileze QM(将2克Stabileze QM(Merck)溶于98克去离子水，并于70℃加热搅拌形成一糊状物，并冷却至室温而制备得)加入该混合物并搅拌5分钟。以0.85％(重量)磷酸(Merck)调整混合物的pH值到5.34，并以600rpm搅拌20分钟。混合物冷却至室温。
实施例4丁酸苯酯凝胶的制备第一成分10克Stabileze QM(Merck)、232.035克去离子水于一烧杯中混合并加热至70℃。
第二成份5.739克丁酸苯酯化钠(供货商Triple Crown America，Inc.)、0.125克甲基戊酮(methylparaben)(Merck)、0.075克丙基戊酮(propylparaben)(Merck)、232.035克去离子水、以及20克10％NaOH于一烧杯中混合并加热至70℃。
将第二成份缓慢地加入第一成分中并继续以400rpm搅拌20分钟直到形成一混合物。将混合物冷却至室温。
实施例5丁酸苯酯凝胶的制备第一成分10克Stabileze QM(Merck)、380.561克去离子水于一烧杯中混合并加热至70℃。
第二成份5.739克丁酸苯酯化钠(Triple Crown America，Inc.)、0.125克甲基戊酮(methylparaben)(Merck)、0.075克丙基戊酮(propylparaben)(Merck)、83.5克1，2-丙二醇、以及20克10％NaOH于一烧杯中混合并加热至70℃。
将第二成份缓慢地加入第一成份中并继续以400rpm搅拌20分钟直到形成一混合物。将混合物冷却至室温。
实施例6丁酸丙酯缓释配方的制备两种配方是如下表1的组合物。
表1两种缓释配方的组合物(单位克)
*PF-127是组合物的基质，而羧甲基纤维素钠是增厚剂。
制备方法为将表1中的成分混合。
实施例7丁酸苯酯脂肪体配方的制备于此种脂肪体配方，蛋黄卵磷脂(egg phosphatidylcholine，EPC)及胆固醇是作为等同-或不同-摩尔浓度的主要脂质成分。以不同脂肪丁酸苯酯比例可获得多种含有丁酸苯酯的脂肪体。脂肪体是经由薄膜水合作用制备、并以膜挤压成形、且实际评估的。
实施例8毛斯达丁A软膏的制备将472.5克白色矿脂(Riedel-de Haen)、27克石蜡50/52(市售)、以及0.5克毛斯达丁A(Sigma)置于一烧杯中混合并加热至70℃形成一糊状物。将该糊状物于400rpm搅拌1小时，并冷却至室温。
实施例9毛斯达丁A软膏的制备将67.5克白色矿脂(Riedel-de Haen)、16克十八烷醇(Riedel-deHaen)、260.5克软石蜡(Merck)、155.5克液态石蜡(Merck)、以及0.5克毛斯达丁A(Sigma)置于一烧杯中混合并加热至70℃形成一糊状物。将该糊状物于400rpm搅拌1小时，并冷却至室温。
实施例10组蛋白去乙酰基转移酶抑制物对辅佐性关节炎的滑膜纤维母细胞的生长影响本发明的揭示主要是针对毛斯达丁A与丁酸苯酯对于一种结缔组织疾病模式，即辅佐性关节炎(adjuvant arthritics)的治疗，但上述化合物的治疗仅是用于说明与验证本发明。
辅佐性关节炎是一种结缔组织疾病的动物模式，且已经建立并具有特定特征(Winter CA等人，Arthritis Rheum.1966，9394-404)。实验所采用体重约150±20克的Long Evans大鼠与体重约22±2克的源自ICR的雄性小鼠是由台湾美商泛球药理研究所(MDS Pharma Service-Taiwan Ltd.)动物育种中心取得。每5只小鼠所配置的空间为约45×23×15cm3大小。在对动物进行实验前，是将动物饲养于美商泛球药理研究所的实验室内，置于APEC(Allentown Gaging，Allentown，NJ，USA)笼子中，并处于卫生环境下，控制温度(22-24℃)与湿度(60-80％)，且于12小时光/暗周期至少一周。给予动物自由摄取小鼠的标准实验室饲料(LabDiet 5001，USA)与自来水。诸如饲养、实验进行中、以及处理实验结束后丢弃的动物等所有相关工作都是依照动物相关生物医学研究的国际指导原则(the International Guiding Principles for BiomedicalResearch Involving Animals，CIOMS Publication No.ISBN 9290360194，1985)进行。
将充分磨碎的死菌结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)悬浮液(DIFCO，USA；0.3mg于0.1ml淡矿物油；完全弗氏佐剂CFA)施打至右后脚掌的跖下部位，此日定为第1天。后脚掌的体积的测量是于第0天(CFA处理前)、CFA处理后第1、5、10与15天以Plethsmometer(Cat.No.7150，UGO BASILE，Italy)与Watercell(25mm diameter，Cat.No.7157，UGO BASILE，Italy)测量右脚掌(以CFA处理)，并于第0、14、与18天测量左脚掌(未以CFA处理)；大鼠于第一次施打前与施打后一小时测量体重。在CFA处理后4小时(视为第1天)以及的后第5、10与15天测量右后脚掌体积(急性期)；并且在第14与18天测量对侧左脚掌体积(延迟期)。本模式的炎症活性是以计算急性期与延迟期的数值而定。
在第10天由建立辅佐性关节炎的大鼠取得滑膜样品。收集的滑膜组织以5mg/ml胶原蛋白(Sigma)与DNase(Sigma)消化，并通过一金属丝网以制备分离的细胞。将细胞(0.5×106)分装至含有10ml RPMI 1640培养液(Gibco)、并添加10％胎牛血清、2mM左旋谷胺酸酰胺、50U/ml盘尼西林以及50mg/ml链霉素的10公分培养盘中培养。当细胞生长至90％满时，以胰蛋白-EDTA溶液将细胞由培养盘移除以进行继代培养。用于试验的细胞是继代第5代的细胞。
由辅佐性关节炎来源、增殖的滑膜纤维母细胞以丁酸苯酯或毛斯达丁A处理，再以最后24小时培养时加入的3H-胸腺嘧啶核进行增殖的确认。所采用的药剂是将丁酸苯酯(Merck)溶解于灭菌水，并以NaOH调整pH至7.2，或者将丁酸苯酯钠(Triple Crown，U.S.A)溶解于灭菌水，或是毛斯达丁A(Sigma)溶解于乙醇。以含有10mMTris-HCl(pH6.5)、50mM亚硫酸钠、1％Triton X-100、10mM MgCl2、以及8.6％蔗糖的缓冲液、并采用一均质器，将细胞溶解以分离出滑膜纤维母细胞的细胞核。再以酸萃取法分离出组蛋白。接着，将分离的组蛋白(5μg)以15％聚丙烯酰胺-0.1％硫酸十二酯钠小型凝胶电泳分离，并转染至硝基纤维素滤膜。采用专一性辨认组蛋白H3的过乙酰化型的抗体(upstate biotechnology)侦测过乙酰化的组蛋白。
结果如图1～图7所示，图1与图2是西方墨点法结果照片，显示丁酸苯酯与毛斯达丁A会诱发乙酰化组蛋白H3的累积；在未加入药剂前，乙酰化组蛋白H3无法被侦测出来，加入丁酸苯酯或毛斯达丁A的后4小时，会发现乙酰化组蛋白H3明显增加，到12小时时达到最大量，以后就会消退。此外，丁酸苯酯与毛斯达丁A亦会诱发乙酰化组蛋白H4的累积(数据未显示)。图3～图5为以抗乙酰化的组蛋白H3的抗体进行免疫萤光染色的照片。免疫萤光染色是先将滑膜纤维母细胞以丁酸苯酯(2mM)或毛斯达丁A(200nM)处理或不处理6小时，接着以FITC结合的抗乙酰化H3抗体染色。结果显示丁酸苯酯与毛斯达丁A皆会诱发乙酰化组蛋白的累积。另外，图6与图7显示丁酸苯酯与毛斯达丁A对于由辅佐性关节炎来源的滑膜纤维母细胞会表现出剂量与时间依存性的生长抑制。其结果是以相对于对照培养(无药物添加)组的DNA合成百分比值表示。并且每个数值是由两次实验取得三份样品的平均值±SE。另进行停药试验发现，组蛋白去乙酰基转移酶抑制物对于发生辅佐性关节炎的滑膜纤维母细胞的生长抑制较其对于正常滑膜纤维母细胞的生长抑制为强(数据未显示)，但组蛋白去乙酰基转移酶抑制物对于发生辅佐性关节炎的滑膜纤维母细胞的生长抑制是不可逆性的，而其对于正常滑膜纤维母细胞的生长抑制为可逆的(数据未显示)。此外，图8.1与图8.2为西方墨点法结果，显示丁酸苯酯(2mM)与毛斯达丁A(200nM)处理12小时后会在由辅佐性关节炎来源的滑膜纤维母细胞诱发p16与p21这两种细胞周期抑制物的向上调节。第1列为对照组(无处理组)样品、第2列为丁酸苯酯处理组样品、以及第3列为毛斯达丁A处理组样品。当药物停用时，在两种来源的纤维母细胞p21马上就向下调节，但在发生辅佐性关节炎的滑膜纤维母细胞p16却仍维持高量(数据未显示)。此结果显示p16的诱导在发生辅佐性关节炎的滑膜纤维母细胞是特征性的。
实施例11局部使用丁酸苯酯与毛斯达丁A对于发生结缔组织疾病的皮肤、关节与软组织炎症的抑制效果如实施例10所述的方法建立结缔组织疾病的动物模式。每组采用5只Long Evans大鼠，且每只体重约为150±20克。接着，将10％丁酸苯酯乳剂与1％毛斯达丁A软膏分别以每只脚掌200mg与10mg的剂量、每天两次局部施与大鼠，并持续18天。在第一次施与前述药剂后，将充分磨碎的死菌结核杆菌(Mycobaeterium tuberculosis)悬浮液(DIFCO，USA；0.3mg于0.1ml淡矿物油；完全弗氏佐剂CFA)施打至右后脚掌的跖下部位，此日定为第1天。后脚掌的体积的测量是于第0天(CFA处理前)、CFA处理后第1、5、10与15天以Plethsmometer(Cat.No.7150，UGO BASILE，Italy)与Water cell(25mm diameter，Cat.No.7157，UGO BASILE，Italy)测量右脚掌(以CFA处理)，并于第0、14、与18天测量左脚掌(未以CFA处理)；大鼠于第一次处理前与最后一次处理后一小时测量体重。本模式的炎症活性是以计算急性期(右后脚掌体积)与延迟期(对侧左后脚掌体积)的数值而定。以CFA注射载体对照大鼠也是在第0与18天测量体重，CFA注射载体对照大鼠通常在这段实验期间会增重约20至10克。判断显著差异是以相对于载体处理对照组有30％或以上脚掌体积减少为准。
表2的结果显示，10％(重量)丁酸苯酯乳剂与1％(重量)毛斯达丁A软膏对于发生结缔组织疾病的皮肤、关节、与软组织皆具有局部抗炎症效果，可以防止或减缓关节分解、皮肤溃疡、软组织水肿、纤维化与坏死，并维持肢体功能。
表2抗炎症活性(A)急性期(单侧踝关节)
(B)延迟期(对侧踝关节)
*CMC为0.5％羧基甲基纤维素(carboxymethylcellulose)，与氢化可的松(hydrocortisone)可由Sigma(USA)购得。
注表2中数字加括号代表有显著差异。
参考表2可了解，采用系统性、即口服使用氢化可的松进行临床治疗结缔组织疾病急性期。在第1天，氢化可的松有显着地抑制效果，然而在第10天后的效果减低。0.5％羧基甲基纤维素是氢化可的松的赋形剂，在此用作为对照组。相反地，10％丁酸苯酯乳剂与1％毛斯达丁A软膏开始时的效果并不显着，但是在第10天开始会分别有40％与50％的抑制效果，到了第15天还分别维持有31％与41％的抑制效果。而由于1％丁酸苯酯不如10％丁酸苯酯有效果，也显示出丁酸苯酯的作用是具有剂量反应性的关系。
在表2中，氢化可的松的系统性抑制效果有部分显示于延迟期(即左脚掌)，然而丁酸苯酯与毛斯达丁A并不显着。结果显示本发明的局部配方的确具有局部而非系统性效果，因此对于局部施用于体表区域很有用。
图9.1～图9.6为萤光染色照片，显示以10％丁酸苯酯乳剂或1％毛斯达丁A软膏可于活体内诱发乙酰化组蛋白。由萤光染色(SantaCruz)结果显示，在第1与15天，对于发生结缔组织疾病的软组织施用丁酸苯酯或毛斯达丁A显示具有增加乙酰化组蛋白H3的作用。
图10.1～图10.16为一系列照片，显示丁酸苯酯或毛斯达丁A在抑制结缔组织疾病上具有相似的效果。左侧图(图10.1、图10.3、图10.5、图10.7、图10.9、图10.11、图10.13与图10.15)为载体组；右侧图(图10.2、图10.4、图10.6、图10.8、图10.10、图10.12、图10.14与图10.16)为药剂处理组。图10.1与图10.2为踝与跖关节的侧视图，比较后发现治疗组的踝关节与跖关节水肿情形有受抑制的现象。图10.3与图10.4为脚掌后视图，在治疗组的跖部皮肤伤口复原较为改善，上述皮肤伤口是由于注射死菌结核杆菌至跖下部位以诱发结缔组织疾病而产生的。图10.5与图10.6为矢状切面图，显示在载体组的脚掌关节结构有水肿与受破坏的情形，而治疗组维持完整。图10.7与图10.8为显微切片照片，确认在治疗组中血管翳形成受到抑制、软组织水肿也减轻、且关节也维持完整。图10.9与图10.10为组织化学照片(放大倍数为40倍)，显示载体组发生严重滑膜增生、血管翳形成与关节分解，而在治疗组仅有中度滑膜增生且无血管翳形成现象。图10.11与图10.12为高倍放大照片(放大倍数为100倍)，显示发生结缔组织疾病的软骨与骨受到破坏，但以组蛋白去乙酰基转移酶治疗后维持完整。图10.13与图10.14为组织化学照片(放大倍数为40倍)，显示载体组有严重真皮水肿、皮下厚纤维化与微脓肿生成、以及分散性淋巴浸润，但是治疗组显示正常真皮结构、且只有小的局限性淋巴聚集，没有水肿现象。图10.15与图10.16为高倍放大照片(放大倍数为100倍)，显示载体组在皮下组织有分散性淋巴浸润与纤维化，而治疗组只有局限性淋巴聚集，且肌肉束与结缔组织仍可分辨。
如表2与图11.1～图11.6所示，1％毛斯达丁A软膏比10％丁酸苯酯乳剂的效力更强。对于淋巴球浸润、软组织水肿以及滑膜增生的抑制，在1％毛斯达丁A软膏处理组的效果都比在10％丁酸苯酯乳剂处理组更佳。
实施例12丁酸苯酯抑制物在发生结缔组织疾病的炎症侵入性滑膜对于细胞周期调节物的效用由于滑膜增生与血管翳生成可被1％毛斯达丁A软膏与10％丁酸苯酯乳剂抑制，因此萃取滑膜组织中蛋白质，研究p16与p21是否会被诱导表现。结果发现在没有药剂处理的正常与辅佐性关节炎，不论是p16或p21都没有表现。然而，在药剂处理组的辅佐性关节炎的滑膜组织，从第1天开始，p16就有持续诱发表现的现象，而p16与p21在有药剂处理的正常滑膜组织细胞仍没有被诱导，可见对于活体内的正常组织生长，1％毛斯达丁A软膏或10％丁酸苯酯乳剂都没有作用。
图12.1～图12.12为低倍至高倍的H&E染色以及免疫组织化学染色照片，其中图12.1～图12.6为丁酸苯酯处理组；显示细胞周期调节物p16在发生结缔组织疾病的滑膜有向上调节的现象，且在丁酸苯酯治疗后，血管翳生成有受到抑制，只是滑膜处仍有少数淋巴球浸润。
图12.7～图12.12为载体组图；显示在结缔组织疾病中严重滑膜增生与血管翳生成会破坏关节的软骨与骨。相反地，比起治疗组的滑膜，在载体组侵入性滑膜并没有染出细胞周期调节物p16。
由上述可知，丁酸苯酯在发生结缔组织疾病的滑膜母细胞会诱发细胞周期休止，而预防血管翳生成与关节分解。
实施例13丁酸苯酯对于发生结缔组织疾病的结缔组织的前炎症媒介物的作用如图13.1～图13.10所示，在载体组中，肿瘤坏死因子α(TNF-α)在发生结缔组织疾病的皮肤、皮下组织以及关节的炎症区域广泛分布，但是在丁酸苯酯治疗组的皮肤只有染出少量TNF-α。此结果显示丁酸苯酯可以在发生结缔组织疾病的结缔组织(包括关节边缘的滑膜、皮下组织、真皮、以及表皮)抑制前炎症媒介物TNF-α。
此外，毛斯达丁A也有与丁酸苯酯相同的效果，可以对p16向上调节，并对TNF-α向下调节。如图14.1所示，毛斯达丁A在关节腔内衬的薄滑膜可以向上调节p16的表现，但是，在发生结缔组织疾病的软组织并没有染出TNF-α(如图14.2)。
由实施例12与13的结果显示，丁酸苯酯与毛斯达丁A对于结缔组织疾病可以同时使细胞周期抑制物p16向上调节，也向下调节前炎症媒介物TNF-α。由此结果更可推知组蛋白去乙酰基转移酶抑制物对于治疗结缔组织疾病很有效，因该病的特征为细胞周期失调，以及前炎症细胞激素异常反应。
而由本发明以上所述的实施例可了解，由组蛋白去乙酰基转移酶抑制物制备的药可用来治疗包括类风湿性关节炎、系统性红斑性狼疮、进行性系统性硬化症、修格连式干燥症、皮肌炎以及混合性结缔组织病，所以本发明的药物组合物在制备治疗以上由于改变免疫调控的自体免疫失常而造成皮肤、关节、及软组织炎症的结缔组织疾病是一新颖、且有治疗潜力的药物。
权利要求
1.一种治疗结缔组织疾病的药学组合物，其特征在于包括组蛋白去乙酰基转移酶抑制物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
2.权利要求1的药学组合物，其特征在于所述的组蛋白去乙酰基转移酶抑制物包括丙戊酸、毛斯达丁A、丁酸苯酯、低朴第辛、穿普克辛A、缩酚酸肽、澳杉弗利廷、或苯甲酰胺类。
3.权利要求1的药学组合物，其特征在于所述的其药学上可接受的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、或含有机碱的盐。
4.权利要求3的药学组合物，其特征在于所述的碱金属盐为钠盐或钾盐；所述的碱土金属盐为钙盐或镁盐；所述的含有机碱的盐为铵盐、三乙基胺盐或乙醇胺盐。
5.权利要求1的药学组合物，其特征在于所述的药学上可接受的载体为乳剂、凝胶、乳液、贴片、栓剂、粉末、脂肪体剂型、注射液、或点滴注入剂型。
6.权利要求2的药学组合物，其特征在于所述的组蛋白去乙酰基转移酶抑制物为丁酸苯酯。
7.权利要求2的药学组合物，其特征在于所述的组蛋白去乙酰基转移酶抑制物为毛斯达丁A。
8.权利要求1～7的任一药学组合物，其特征在于组蛋白去乙酰基转移酶抑制物或其药学上可接受的盐的有效剂量占该药学组合物总重量的0.1％～50％。
9.权利要求1的药学组合物的用途，其特征在于在制备治疗类风湿性关节炎药物中的应用。
10.权利要求1的药学组合物的用途，其特征在于在制备治疗系统性红斑性狼疮药物中的应用。
11.权利要求1的药学组合物的用途，其特征在于在制备治疗进行性系统性硬化症药物中的应用。
12.权利要求1的药学组合物的用途，其特征在于在制备治疗修格连式干燥症药物中的应用。
13.权利要求1的药学组合物的用途，其特征在于在制备治疗皮肌炎药物中的应用。
14.权利要求1的药学组合物的用途，其特征在于在制备治疗混合性结缔组织病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及治疗结缔组织疾病的药学组合物及其用途，特别是涉及治疗由于免疫调节失常引发的疾病的药学组合物。该药学组合物包括组蛋白去乙酰基转移酶抑制物或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。抑制物或其盐的有效剂量占该药学组合物总重量的0.1％～50％。该组合物可显著抑制造成皮肤、关节及软组织发炎的结缔组织疾病的主要症状，预防皮肤溃疡、关节分解及软组织坏死与水肿的发生，同时也可阻断滑膜组织增生，维护骨与软骨结构，减少淋巴球浸润，抑制前炎症媒介物。本发明的药学组合物可在制备治疗结缔组织疾病包括治疗类风湿性关节炎、系统性红斑性狼疮、进行性系统性硬化症、修格连式干燥症、皮肌炎和混合性结缔组织病药物中应用。
文档编号A61K31/21GK1589905SQ0315626
公开日2005年3月9日 申请日期2003年9月2日 优先权日2003年9月2日
发明者钟邑林 申请人:钟邑林