专利名称：重组t4噬菌体油乳化疫苗的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及鸡传染性囊病病毒基因工程疫苗的制备方法及其在传染性囊病疫苗免疫中的应用。
背景技术：
传染性囊病病毒(IBDV)属于双RNA病毒科(Bimaviridae)禽双RNA病毒属(Avibirnavirus)，它是鸡传染性囊病的病原。目前普遍认为IBDV具有4种成熟蛋白质VP1、VP2、VP3和VP4，分子量分别为90kDa、37-40kDa、32-35kDa和24-30kDa。其中VP2和VP3是主要的结构蛋白，分别占病毒总蛋白的51％和40％。VP2分子量约为40kDa，它含有血清型特异性的能诱导中和抗体的抗原决定簇，是病毒的主要宿主保护性免疫原(Hudson et al，1986)。
自Azad et al(1986)首次在大肠杆菌中表达002-73株的结构蛋白以来，IBDV所有的结构蛋白，包括VP1、VP2、VP3和多聚蛋白前体，以及非结构蛋白VP5，先后在各种表达系统中进行了表达。特别是IBDV主要免疫原VP2，已先后在大肠杆菌、酵母、痘病毒、昆虫杆状病毒表达系统、腺病毒等表达系统中进行了表达。但还没有用噬菌体表达IBDV结构蛋白的报道。
噬菌体表面展示技术(phage display)是1980年代发展起来的一项新的生物技术(Smith，1985)，它能将表达的外源多肽和蛋白质以融合蛋白的形式展示在噬菌体表面，并保持相对独立的空间构象和生物活性。T4噬菌体属于有尾噬菌体中A群A2亚群的典型成员，其基本形态结构是头长径约95nm，横径约为65nm。T4噬菌体衣壳由3种必需衣壳蛋白组成，主要的衣壳蛋白gp23和2个次要衣壳蛋白gp24、gp20。其中分子量为45kDa的gp23在每个病毒颗粒中有960个拷贝，而其余2个次要衣壳蛋白拷贝数较少，gp24有55个拷贝，而gp20只有12个拷贝。此外，在衣壳的外表面包被着2种非必需外壳蛋白分子量为9kDa的SOC和分子量为40kDa的HOC，二者相距7nm，以对称的形式分布于噬菌体二十面体表面。SOC和HOC仅提供噬菌体额外的稳定能力，是在噬菌体衣壳装配完成后才组装到衣壳表面的，它们的缺失不影响T4噬菌体的繁殖和感染。将外源蛋白与T4噬菌体表面的SOC或者HOC蛋白形成融合蛋白，从而可以获得具有外源蛋白的重组T4噬菌体。采用这样的方法，获得了表达爱滋病毒(HIV)gp120 V3肽、脊髓灰质炎病毒VP1(Ren et al，1996)、脑膜炎奈氏菌PorA(Jiang et al，1997)抗原蛋白的重组T4噬菌体。
获得表达传染性囊病病毒结构蛋白VP2的重组T4噬菌体，并以此重组噬菌体为抗原制作传染性囊病疫苗目前未见报导。
发明内容
本发明的目的在于获得表达传染性囊病病毒结构蛋白VP2的重组T4噬菌体，并以此重组噬菌体为抗原制作传染性囊病疫苗，为传染性囊病的防治提供一种新型的疫苗。
本发明提供的重组T4噬菌体是采用基因重组的方法获得的。其构建方法是(1)将传染性囊病病毒vp2基因的cDNA片段插入pR质粒(Renet al，1996)中，构建重组整合质粒pR-VP2，其操作步骤如下用EcoR I在37℃分别消化vp2基因的PCR产物和质粒pR，接着在T4连接酶的作用之下，连接消化的vp2的PCR产物和质粒pR。用连接产物转化大肠杆菌DH5α。经Ampr抗性筛选，获得插入了vp2基因的重组子。然后用1对特异性引物SOC-S(5′-GAATCATATGGCTAGTCTCGCGG-3′)/VP2-A(5′-ATTTGAATTCCTATAGGCCCGAATTAGTCCTT-3′)进行PCR筛选。对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LA培养基中，37℃，200r/m振摇培养16-20h，抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得重组整合质粒pR-VP2。
(2)用重组整合质粒pR-VP2和缺陷性T4噬菌体T4-Z1(Ren et al，1996)进行同源重组，获得表达VP2蛋白的重组T4噬菌体，其操作步骤如下用整合质粒pR-VP2转化大肠杆菌DH5α，获得的大肠杆菌为E-VP2；在装入500μL SC培养液的器皿中加入1μL氨卞青霉素(Amp)，然后加入10μL E-VP2，在37℃培养至光密度值OD600大约为0.5时，加入50μL T4-Z1，在35℃200r/m振摇培养至有细菌碎片出现，获得的产物为未鉴定的重组T4噬菌体；在1个经过灭菌的器皿中加入培养超过12小时的大肠杆菌DH5α600μL，不加溶菌酶，将在2-10℃储存的SC顶层培养基放在微波炉中溶解，待琼脂温度降到45℃左右的时候取2mL倒入装有大肠杆菌DH5α的器皿中，将混合液混匀，立即倒在平皿上，当琼脂完全冷凝时，在SC顶层培养基上分别点10μL未鉴定的重组T4噬菌体，待吸收完毕后，放在37℃培养16小时以上如果E-VP2中的质粒与T4-Z1发生了重组，成功地将vp2基因转入T4噬菌体中，则在没有加溶菌酶的平皿上可以生长出噬菌斑；再在平皿上铺SC顶层培养基，用灭菌牙签把生长出的噬菌斑在SC顶层培养基上点梅花斑，放在37℃培养12小时以上，生长良好的梅花斑用消毒好的刀片将其剥下，浸泡在磷酸缓冲液中6小时；用特异性引物VP2-S(5′-TGAAGAATTCTATGACGAACCTGCAA-3′)/VP2-A从阳性梅花斑浸泡液中扩增到特异性条带，则说明表达VP2蛋白的重组T4噬菌体已获得。
SC培养液按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone和5gNaCl，加双蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高压灭菌20min后4℃保存。
SC底层培养基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和12g琼脂粉，双蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高压灭菌20min，冷却至50℃，加入灭菌的50mL 1mol/L HCl和10mL 25％柠檬酸钠·2H2O溶液，摇匀后倒平板，4℃保存。
SC顶层培养基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和7g琼脂粉，双蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高压灭菌20min，4℃保存。用时加热溶解，冷却至50℃，加入灭菌的50mL 1mol/L HCl和10mL 25％柠檬酸钠·2H2O溶液，摇匀后备用。
重组T4噬菌体油乳化疫苗的制备方法如下将重组T4噬菌体灭活，其方法是向装有重组T4噬菌体的容器中加入福尔马林，使福尔马林的最终浓度达到0.1％，37℃保温20小时以上。
按以下配方制备油相，每100mL油相组成为4mL司本80，2mL司本85，94mL 10号矿物油，2g硬脂酸铝，15lpf/in2高压灭菌20min，冷却待用；按以下配方制备水相，每100mL水相组成为96mL噬菌体悬液，4mL灭菌过的吐温80，3000r/m搅拌均匀；在组织捣碎机加入200mL油相，一边慢速搅拌，一边缓缓加入100mL水相，待混合均匀之后，10 000r/m快速搅拌2min，获得的白色油乳剂即为重组T4噬菌体油乳化疫苗；重组T4噬菌体油乳化疫苗具有以下特征1.重组T4噬菌体油乳化疫苗是以含有传染性囊病病毒结构蛋白VP2的重组T4噬菌体为抗原制备的，重组T4噬菌体的特征为(1)重组T4噬菌体具有序列表中序列1的核苷酸序列。序列1又称为vp2基因，由1350个碱基对组成，是IBDV主要结构蛋白VP2的编码基因。序列1和T4噬菌体soc基因组成融合基因。该融合基因位于重组T4噬菌体溶菌酶基因(e)和den V基因之间。该序列采用PCR方法可以扩增出特异性条带。
(2)重组T4噬菌体具有序列表中序列2的氨基酸序列。序列2又称为VP2蛋白，是由序列1编码的。其分子量约为40kDa，由450个氨基酸残基组成，它含有血清型特异性的能诱导中和抗体的抗原决定簇，是IBDV的主要宿主保护性免疫原。VP2上的抗原决定簇为构象依赖性的，其诱导的中和抗体能被动地保护宿主免受IBDV的感染。该序列和T4噬菌体SOC蛋白组成融合蛋白，位于重组T4噬菌体头部表面。采用抗SOC或抗VP2的特异性抗体，可以检测到该融合蛋白。
(3)本发明提供的重组T4噬菌体还包括具有vp2等同基因的T4噬菌体。vp2等同基因，是与vp2基因的核苷酸序列或氨基酸残基序列相比有一个或若干个核苷酸或氨基酸残基的差别，包括碱基或氨基酸残基的改变、缺失、添加、或插入，或与vp2基因序列中的连续200碱基以上的区段有85％以上的同源性。
2.重组T4噬菌体油乳化疫苗中油相和水相的比例一般为2∶1，但这一比例是可以改变的，其变化幅度在1∶1和3∶1之间。
本发明提供的重组T4噬菌体疫苗具有重要的应用价值。应用之一是用该疫苗免疫鸡，可以获得抗VP2的特异性抗体，并能保护免疫鸡抵抗传染性囊病病毒的攻击。
本发明具有明显的优点和效果。本发明提供的重组T4噬菌体易于纯化，展示在T4噬菌体表面的VP2蛋白具有完整的空间构象。由于SOC位点在T4噬菌体头部表面具有960个拷贝，所以与SOC融合表达的VP2蛋白的拷贝数高。由于VP2蛋白分布于T4噬菌体头部表面，因而T4噬菌体本身充当了VP2蛋白的载体，当本发明提供的重组T4噬菌体作为抗原时，VP2的免疫原性比单独的VP2蛋白强。作为疫苗的抗原、或者作为免疫检测的抗原使用时，和其它的蛋白表达系统表达的VP2蛋白相比，本发明所述的重组T4噬菌体具有明显的优点。
以下结合实施例和附图对本发明提供的表达传染性囊病病毒VP2的重组T4噬菌体的构建、特征分析、重组T4噬菌体油乳化疫苗的制备方法、应用途径作具体说明。
图1为重组整合质粒pR-VP2的构建示意图。pR表示整合质粒，pR-VP2表示插入了vp2基因的重组整合质粒。Ampr表示氨卞青霉素抗性，Kpr表示卡那霉素抗性。e、soc、den V都是T4噬菌体上的基因。EcoRI、BamHI、NdeI、HindIII、PstI、PvuI是质粒上的限制性内切酶位点。
图2为VP2蛋白在重组T4噬菌体SOC位点展示模式图。A为重组整合质粒pR-VP2；B为缺陷型T4噬菌体ФT4-Z1；C、重组后携带有目的基因VP2的重组T4噬菌体ФT4-VP2。
图3为在平板培养基上培养重组T4噬菌体。A为10-6稀释的噬菌体，B为10-7稀释的噬菌体，C为10-8稀释的噬菌体，D为10-10稀释的噬菌体，E为10-11稀释的噬菌体，F为10-12稀释的噬菌体。
图4为重组T4噬菌体的PCR鉴定结果图。泳道1-5是含有IBDV vp2基因的重组噬菌体的PCR产物，泳道M为分子量标记。
图5为野生型T4噬菌体及重组T4噬菌体免疫电镜图谱。A为野生型T4噬菌体。B为与IBD阳性血清反应的野生型T4噬菌体。C为重组T4噬菌体。D为与IBD阳性血清反应的重组T4噬菌体。
具体实施例方式
1、整合质粒pR-VP2的构建采用pR质粒(Ren et al，1996)构建重组整合质粒pR-VP2。用EcoRI在37℃分别消化vp2基因的PCR产物和质粒pR，接着在T4连接酶的作用之下，连接消化的vp2的PCR产物和质粒pR。用连接产物转化大肠杆菌DH5α。转化方法为CaCl2法。经Ampr抗性筛选，获得插入了vp2基因的重组子。然后用1对特异性引物SOC-S/VP2-A进行PCR筛选。对PCR筛选阳性的细菌，挑取单菌落接种于3mL LA培养基中，37℃，200r/m振摇培养16-20小时。采用E.Z.N.A.Plasmid Minipreps Kit抽提质粒，再经限制性内切酶消化和序列测定，获得重组整合质粒pR-VP2。
2、表达VP2蛋白的重组T4噬菌体的获得用重组整合质粒pR-VP2和缺陷性T4噬菌体T4-Z1(Ren et al，1996)进行同源重组，获得表达VP2蛋白的重组T4噬菌体。
先用整合质粒pR-VP2转化大肠杆菌DH5α，获得的大肠杆菌为E-VP2。然后进行以下操作。
在装入500μL SC培养液的试管中加入1μL Amp，然后加入10μLE-VP2，在37℃培养至OD600大约0.5时，加入50μL T4-Z1，继续在35℃200r/m振摇培养至有细菌碎片出现，获得的产物为未鉴定的重组T4噬菌体；在1个经过灭菌的器皿中加入培养超过12小时的大肠杆菌DH5α600μL，不加溶菌酶，将在4℃储存的SC顶层培养基放在微波炉中溶解，待琼脂温度降到45℃左右的时候取2mL倒入装有大肠杆菌DH5α的器皿中，将混合液在旋涡震荡器上混匀，立即倒在平皿上。等到琼脂完全冷凝时，在SC顶层培养基上分别点10μL未鉴定的重组T4噬菌体，待吸收完毕后，放在37℃培养16小时以上，如果E-VP2中的质粒与T4-Z1发生了重组，成功地将vp2基因转入T4噬菌体中，则在不加溶菌酶的平皿上可以生长出噬菌斑；
在灭菌的平皿上铺SC顶层培养基，然后用灭菌牙签把生长出的噬菌斑在SC顶层培养基上点梅花斑，放在37℃培养12小时以上，生长良好的梅花斑用消毒好的刀片将其剥下，浸泡在磷酸缓冲液中6小时；采用PCR筛选T4噬菌体转化子。检测vp2基因的PCR反应体系组成如下每25μL反应体系中含2.5μL 10×PCR缓冲液，2μL dNTPs，0.3μL Taq酶，0.5μL VP2-S(5′-TGAAGAATTCTATGACGAACCTGCAA-3′)，0.5μL VP2-A，1μL梅花斑浸泡液和18.2μL双蒸水。将反应混合物混匀、离心后，在PCR仪上进行温度循环。温度循环程序如下首先94℃3min；然后94℃40sec、51℃40sec、72℃90sec，共循环30次；最后72℃10min。采用1％琼脂糖凝胶(含0.5μg/mL溴化乙啶)电泳对PCR反应产物进行检测。如果观察到特异性条带，则说明已获得了表达VP2蛋白的重组T4噬菌体。
SC培养液按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone和5gNaCl，加双蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高压灭菌20min后4℃保存。
SC底层培养基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和12g琼脂粉，双蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高压灭菌20min，冷却至50℃，加入灭菌的50mL 1mol/L HCl和10mL 25％柠檬酸钠·2H2O溶液，摇匀后铺平板，4℃保存。
SC顶层培养基按下列方法配制每1000mL中含有10g Tryptone，5g NaCl和7g琼脂粉，双蒸水定容至1000mL，15lpf/in2高压灭菌20min，4℃保存。用时加热溶解，冷却至50℃，加入灭菌的50mL 1mol/L HCl和10mL 25％柠檬酸钠.2H2O溶液，摇匀后备用。
3、重组T4噬菌体的免疫电镜观察分别取野生型T4噬菌体、重组T4噬菌体和1/3体积IBD阳性血清混合，37℃放置1小时后，直接涂片。同时用不加阳性血清的上述噬菌体作对照。磷钨酸负染，JEM-1010型透射电镜观察。比较与IBD抗血清反应前后的噬菌体形态，发现野生型T4噬菌体的形态不受IBD阳性血清的影响；而重组T4噬菌体的形态受IBD阳性血清影响明显。未与IBD阳性血清反应的重组T4噬菌体的形态与野生型T4噬菌体形态相同，头部为白色；而与抗血清作用之后的重组T4噬菌体头部变黑。
4、重组T4噬菌体的ELISA检测将重组T4噬菌体用包被缓冲液进行系列稀释，然后在96孔聚乙烯酶标板上每孔加入稀释的噬菌体200μL，4℃放置12小时以上。弃去溶液，用PBS缓冲液洗3次。接着每孔加入封闭液100μL，37℃保温1小时。弃去溶液后，用清洗缓冲液洗3次。接着每孔加入100μL 1000倍稀释的IBD特异性血清，37℃保温1h。弃去血清后，用清洗缓冲液洗3次。然后每孔加入100μL 1∶2500稀释的HRP标记的兔抗鸡IgG，37℃保温1h。弃去溶液后，用清洗缓冲液洗3次。再加入100μL反应底物，25℃保温20min后，加入2％硫酸作为反应终止液。最后用Emax酶标仪于630nm波长读数。结果表明，重组T4噬菌体与IBDV阳性血清呈特异性反应，当重组T4噬菌体1∶10000以内稀释时，S/N均超过2.0。
反应底物的配制方法5gTMB溶于5mL无水乙醇，取4mL加0.2mol/LpH6.0的醋酸钠溶液16mL，用时加等体积的0.03％的H2O2，现配现用。
5、重组T4噬菌体油乳化疫苗的制备重组T4噬菌体油乳化疫苗的制备方法如下将重组T4噬菌体灭活，其方法是向装有重组T4噬菌体的容器中加入福尔马林，使福尔马林的最终浓度达到0.1％，37℃保温20小时以上；按以下配方制备油相，每100mL油相组成为4mL司本80，2mL司本85，94mL 10号矿物油，2g硬脂酸铝。15lpf/in2高压灭菌20min，冷却待用。再按以下配方制备水相。每100mL水相组成为96mL噬菌体悬液，4mL灭菌过的吐温80。3 000r/m搅拌均匀。在组织捣碎机加入200mL油相，一边慢速搅拌，一边缓缓加入100mL水相。待混合均匀之后，10 000r/m快速搅拌2min。获得的白色油乳剂即为重组T4噬菌体油乳化疫苗。将制备好的重组T4噬菌体油乳化疫苗置于4℃保存。
6、重组T4噬菌体油乳化疫苗免疫鸡的实验效果40只1天龄SPF白来航鸡随机分成2组，每组20只，饲养在隔离器中，饮水和饲料均经过灭菌消毒处理。饲养至28天时，进行皮下接种。第1组为空白对照组，不免疫；第2组为重组T4噬菌体免疫组，每只鸡的免疫剂量为2×109个噬菌体。42天龄时进行第2次免疫，分组处理及免疫剂量与28天龄时相同，免疫途径为肌肉注射。
分别在第2次免疫后15天(57天龄)、30天(72天龄)采血，按常规方法分离血清，保存在-20℃，每组每次抽10只鸡采血。采用IDEXX公司的IBD ELISA试剂盒测定血清中IBD抗体，用S/P表示抗体水平。57天龄时对照组和实验组S/P分别为0.18和0.53；72天龄时对照组和实验组S/P分别为0.23和0.90。
7、用重组T4噬菌体作为抗原检测鸡血清中IBD抗体以重组T4噬菌体为包被抗原，建立检测IBD抗体的ELISA方法。将重组噬菌体稀释为1×108/ml，每孔加入100μL稀释稀T4噬菌体，4℃放置12小时以上。用清洗缓冲液(PBS，pH7.2，含0.05％吐温20)洗3次后，每孔加入100μL5％的脱脂奶粉/PBS，37℃放置2h。用清洗缓冲液洗3次后，每孔加入100μL 1∶100稀释的IBD阳性血清，37℃反应1h。再用清洗缓冲液洗3次后，每孔加入100μL适当稀释的辣根过氧化酶标记的鼠抗鸡IgG抗体，37℃反应1h。每孔加入反应底物100μL，室温观察颜色变化。在10-30min时达到显色高峰。每孔加入100μL终止液(1mol/L H2SO4)，终止显色反应，在酶标仪上读取OD450值。该方法具有良好的特异性。用该方法检测鸡新城疫(ND)特异性血清、鸡脑脊髓炎(AE)特异性血清、鸡传染性支气管炎(IB)特异性血清、鸡传染性喉气管炎(ILT)特异性血清、禽流感(AI)特异性血清，无交叉反应性。对采自现场的92份IBD阳性血清的检测结果与IDEXX公司的IBD ELISA试剂盒检测结果的相关性为97.8％。
序列表序列数2序列1(1)类型DNA(2)长度1350碱基对(3)序列atgacgaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg60ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctag agaagcacac tctcaggtca 120gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180cctggtttcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcaa tgggaactac 240aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagctacaa ctactgcagg 300ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcacta 360aatggcacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaacgaca aaatcgggaa cgtcctagta 480ggggaagggg taaccgtcct cagcttaccc acatcatatg atcttgggta tgtgagactc 540ggtgacccca ttcccgctat agggctcgac ccaaaaatgg tagcaacatg tgacagcagt 600gacaggccca gagtctacac cataactgca gccgatgatt accaattctc atcacagtac 660caagcaggtg gggtaacaat cacactgttc tcagctaata tcgatgccat cacaagcctc 720agcatcgggg gagaactcgt gtttcaaaca agcgtccaag gccttatact gggtgctacc 780atctacctta taggctttga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtggc cgcagacaat 840gggctaacgg ccggcactga caaccttatg ccattcaaca ttgtgattcc aaccagcgag 900ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtga cctccaaaag tggtggtcag 960gcgggggatc agatgtcatg gtcagcaagt gggagcctag cagtgacgat ccacggaggc 1020aactacccag gggccctccg tcccgtcaca ctagtagcct acgaaagagt ggcaacaggg 1080tctgtcgtta cggtcgccgg ggtgagcaac ttcgagctga tcccaaatcc tgaactagca 1140aagaacctgg tcacagaata cggccgattt gacccagggg ccatgaacta cacaaaattg 1200atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtat ggccaacaag ggagtacact 1260gactttcgcg agtacttcat ggaggtggca gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320gcatttggct tcaaggacat aattcgggca 1350
序列2(1)类型蛋白质(2)长度450氨基酸残基(3)序列MTNLQDQTQQ IVPFIRSLLM PTTGPASIPD DTLEKHTLRS ETSTYNLTVG DTGSGLIVFF 60PGFPGSIVGA HYTLQSNGNY KFDQMLLTAQ NLPASYNYCR LVSRSLTVRS STLPGGVYAL 120NGTINAVTFQ GSLSELTDVS YNGLMSATAN INDKIGNVLV GEGVTVLSLP TSYDLGYVRL 180GDPIPAIGLD PKMVATCDSS DRPRVYTITA ADDYQFSSQY QAGGVTITLF SANIDAITSL 240SIGGELVFQT SVQGLILGAT IYLIGFDGTA VITRAVAADN GLTAGTDNLM PFNIVIPTSE 300ITQPITSIKL EIVTSKSGGQ AGDQMSWSAS GSLAVTIHGG NYPGALRPVT LVAYERVATG 360SVVTVAGVSN FELIPNPELA KNLVTEYGRF DPGAMNYTKL ILSERDRLGI KTVWPTREYT 420DFREYFMEVA DLNSPLKIAG AFGFKDIIRA 450
权利要求
1.重组T4噬菌体油乳化疫苗的制备方法，其特征在于先将已制备的油相放于组织捣拌机内，一边捣拌，一边缓缓和加入水相，待混合均匀后，10000r/m快速搅拌2min，获得白色重组T4噬菌体油乳化疫苗，油相与水相比例为1-3∶1；油相的制备每100ml油相组成为4mL司本80，2mL司本85，94mL10号矿物油，2g硬脂酸铝，15lpf/in2高压灭菌20min，冷却即成；水相的制备每100mL水相组成为96mL噬菌体悬液，4mL灭菌过吐温，3000r/m搅拌均匀，即成。
全文摘要
本发明涉及鸡传染性囊病病毒基因工程疫苗的制备，尤其是重组T4噬菌体油乳化疫苗的制备。本发明提供了一个用含有鸡传染性囊病病毒结构蛋白VP2的重组T4噬菌体为抗原制备油乳化疫苗的方法，该疫苗含有传染性囊病病毒结构蛋白VP2。本发明还涉及重组T4噬菌体在传染性囊病疫苗免疫中的应用。
文档编号A61P31/14GK1554445SQ20031011751
公开日2004年12月15日 申请日期2003年12月25日 优先权日2003年12月25日
发明者曹永长, 毕英佐, 马静云 申请人:华南农业大学