专利名称：一种鳗弧菌油乳化二价口服疫苗及其制备的制作方法
技术领域：
本发明涉及鱼用疫苗，具体地说是一种鳗弧菌油乳化二价口服疫苗及其制备。
背景技术：
目前水产养殖中常用的口服疫苗，是使用生物可降解物质(常用聚乙烯醇、 丙烯酸树脂、海藻胶或脂质体)包被一种病源菌株的被膜或全细胞疫苗所制备， 这种疫苗只针对病源菌的一种血清型对养殖动物起到保护作用，免疫保护谱窄， 所使用的生物可降解材料成本高。
发明内容
本发明目的在于为了克服现有技术在口服免疫水产养殖动物中免疫保护谱 窄、材料成本高的缺点，提供一种可针对不同血清型鳗利斯顿氏菌油乳化二价 口服疫苗及其制备。
为实现上述目的，本发明釆用的技术方案如下 鳗利斯顿氏菌01血清型亚型菌株CGMCC No.1870 (M3)形态特征 菌株在2216E培养基24h的菌落呈圆形、半透明，表面光滑、边缘整齐， 直径约1.5mm;在TCBS培养基的菌落呈黄色，直径约3mm;革兰氏染色阴性， 短杆状。可运动。有一根很长的极生单鞭毛和周生菌毛，菌体大小为0.8-1.0 x 1. 5 ~ 1. 7 jnm。
M3菌株氧化酶反应阳性，对弧菌抑制剂0/129(2， 4-二氨基-6, 7-二异丙 基喋啶磷酸盐，150ug/mL)敏感，发酵葡萄糖不产酸，不产色素
鳗利斯顿氏菌01血清型亚型菌株CGMCC No. 1871 (SMP1)形态特征 菌株在2216E培养基24 hr的菌落呈圆形、半透明、表面光滑、边缘整齐。 在TCBS培养基上不生长。革兰氏染色阴性，弯杆状，可运动，有一根很长的极 生单鞭毛。
SMP1菌株氧化酶反应阳性，对弧菌抑制剂0/129 (2, 4-二氨基-6，7-二异 丙基喋啶磷酸盐，150ug/ml)敏感，发酵葡萄糖产酸不产气，不产色素，脲酶 阴性，根据这些特征并结合形态特征，可判定SMP1为弧菌科弧菌属细菌。
生理生化测试的特征参见表l，_
-鉴定项目 SMP1 M3
甲基红 1 ^
v. p + 一
吲哚 - —
0/129敏感性 + +
明胶液化 + +
水解酪素 _ —
Tween 80水解 + +
卵磷脂酶 - +
H2S产生 - —
由阿拉伯糖产酸 + -
由甘糖产酸 + +
由蔗糖产酸 + +
由甘醇产酸 + +
由肌醇产酸 - -
水解淀粉 + +
生长不需加NaCl + 一
7%NaCl中生长 + —
10%NaCl中生长 + _
5'C生长 - _
37'C生长 + _
42'C生长 - —
精氨酸-碱反应 + +
赖氨酸脱羧酶 - -
鸟氨酸脱羧酶 - -
溶血作用 + +
发光 - 一
致病性 + +
+ :阳性，阴性。
疫苗由油相和水相组成，水相中加入利斯顿氏菌属Listonella MacDonellet Collwell的鳗利斯顿氏菌Vibrio anguillar腿01血清型两种亚型菌株保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC No. 1870和CGMCC No. 1871 )的菌悬液。
所述水相为Tween-80，按体积百分比计94%-98%的鳗利斯顿氏菌01血清型 两种亚型菌株的菌悬液和2°/。-6°/。的Tween-80 ;油相为Span-80、硬脂酸铝和 运动黏度7-13的白矿油；油相中各成份为按体积百分比计92%-96%的运动黏 度7-13的白矿油和4%-8%的Span-80和按油相总质量体积比的1. 5%-2. 5%的 硬脂酸铝，其中水相和油相按体积比计为1: 1.5-2,所述两种菌悬液浓度各为 1-6 x 109cells/ml。
疫苗的制备方法
1) 制备乳化疫苗的水相将Tween-80加入到复壮培养培养后并甲醛灭活 的利斯顿氏菌属Listonella MacDonellet Collwell的鳗利斯顿氏菌Vibrio anguilla濯01血清型两种亚型菌株CGMCC No. 1870和CGMCC No. 1871的菌 液中，搅拌混匀，得到乳化疫苗的水相；其中菌悬液占水相体积比的94%-98%, Tween-80占水相体积比的2°/。-6°/。；
2) 制备乳化疫苗的油相按体积百分比计取92%-96%的运动黏度7-13的 白矿油、4%-8%的Span-80和按总油相质量体积比1. 5%-2. 5%的硬脂酸铝，将
其混合，加热使硬脂酸铝溶化，即得到乳化疫苗的油相；
3)制备乳化疫苗l倍体积的水相缓慢加入到1.5-2倍体积油相中，以1000 一1500 rpm的转速进行磁力搅拌10-20分钟，即得到油包水性乳化二价疫苗。 所述两种菌株复壮培养至浓度各为大于109cellS/ml。 本发明所具有优点如下
1. 本发明釆用鳗利斯顿氏菌Ol血清型两种亚型菌株制备的油乳化二价口服 疫苗可以拓宽疫苗保护谱、增加疫苗的免疫协同作用，诱导水产养殖动物肠道 的非特异性和特异性免疫应答，并提供保护效应。
2. 制备本发明的油乳化二价口服疫苗，所使用的材料成本低。
图1为本发明鳗利斯顿氏菌M3菌株的形态图。 图2为本发明鳗利斯顿氏菌SMP1菌株的形态图。 图3为使用本发明疫苗免疫后大菱鲆后肠溶菌酶活力变化情况图。 图4为使用本发明疫苗免疫后大菱鲆后肠抗蛋白酶活力变化情况图。 图5为使用本发明疫苗免疫后大菱鲆后肠抗鳗利斯顿氏菌M3抗体效价变化 情况图。
图6为使用本发明疫苗免疫后大菱鲆后肠抗鳗利斯顿氏菌SMP1抗体效价变 化情况图。
图7为使用本发明疫苗免疫大菱鲆后鳗利斯顿氏菌M3感染大菱鲆死亡情况图。
图8为使用本发明疫苗免疫大菱鲆后鳗利斯顿氏菌SMP1感染大菱鲆死亡情 况图。
图9为使用本发明疫苗免疫大菱鲆后在大菱鲆后肠切片上检测到的抗体图。 图10为使用未乳化疫苗免疫大菱鲆后在大菱鲆后肠切片上检测的抗体图。 图11为不使用本发明疫苗的大菱鲆后肠组织切片图。
利斯顿氏菌属Listonella MacDonellet Collwell的鳗利斯顿氏菌Vibrio anguillarum 01血清型亚型菌株M3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心No. 1870。
利斯顿氏菌属Listonella MacDonellet Collwell的鳗利斯顿氏菌Vibrio anguillarum 01血清型亚型菌株SMP1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心No. 1871。
下面根据
和实施例对本发明作进一步说明。 实施例1
利斯顿氏菌属Listonella MacDonellet Collwell的鳗利斯顿氏菌Vibr io anguillamm 01血清型亚型菌株M3保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心No. 1870。
利斯顿氏菌属Listonella MacDonellet Collwell的鳗利斯顿氏菌Vibr io anguillarum 01血清型亚型菌株SMP1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会
普通微生物中心No. 1871。
菌株M3形态特征
菌株在2216E培养基24h的菌落呈圆形、半透明，表面光滑、边缘整齐， 直径约1.5mm;在TCBS培养基的菌落呈黄色，直径约3mm;革兰氏染色阴性， 短杆状。可运动。有一根很长的极生单鞭毛和周生菌毛，菌体大小为0.8-1.0 x 1, 5 ~ 1. 7 (见图1 )。
菌株M3反应阳性，对弧菌抑制剂0/129(2, 4-二氨基-6, 7-二异丙基喋啶 磷酸盐，150ug/mL)敏感，发酵葡萄糖不产酸，不产色素
菌株SMP1形态特征
菌株在2216E培养基24 hr的菌落呈圆形、半透明、表面光滑、边缘整齐。 在TCBS培养基上不生长。革兰氏染色阴性，弯杆状，可运动，有一根很长的极 生单鞭毛(见图2)。
菌株SMP1氧化酶反应阳性，对弧菌抑制剂0/129 (2, 4-二氨基-6，7-二异 丙基喋啶磷酸盐，150 ug/ml)敏感，发酵葡萄糖产酸不产气，不产色素，脲酶 阴性，根据这些特征并结合形态特征，可判定菌株SMP1为弧菌科弧菌属细菌。
将鳗利斯顿氏菌01血清型两种亚型菌株M3和SMP1进行复壮将M3与SMP1 分别接液体试管，28'C摇床过夜，用pH7. 4的PBS离心洗涤菌液，至菌体浓度 为108CellS/ml,分别腹腔注射大菱鲆，取注射后死亡的大菱鲆解剖，内脏划平 板取样，得到复壮的两株细菌；挑取复壮后两种亚型菌株M3和SMP1单菌落分 别接种至含1.5。/。NaCl的胰大豆蛋白胨肉汤培养基中，28°C 200转/分钟摇床培 养24-48小时后，加入终浓度为0. 3%甲醛室温灭活48小时，而后5000转/分钟 离心10分钟，用pH7.4的缓冲溶液PBS洗涤，共进行3次洗涤使悬菌体中两菌 株浓度分别为109cells/ml。胰大豆蛋白栋肉汤培养基成分18g TSB， 9g NaCl， 600ml蒸馏水，调pH至7. 4， 117°C高压灭菌35分钟。
1) 制备乳化疫苗的水相将Tween-80加入到复壮培养培养后的浓度分别 为109CellS/ml甲醛灭活的鳗利斯顿氏菌01血清型两种亚型菌株菌液中，撹拌 混匀，得到乳化疫苗的水相；其中菌悬液按体积百分比96%取19. 2ml， Tween-80 按体积百分比4%取0. 8 ml。
2) 制备乳化疫苗的油相按体积百分比94y。取28.2ml IO号白油，按体积 百分比6%取1. 8 ml Span-80，按油相总质量体积比2%取0. 6 g硬脂酸铝，将其
混合，加热使硬脂酸铝完全溶化，urc高压灭菌25分钟，制备成乳化疫苗的油相。
3) 制备乳化疫苗按体积百分比1: 1. 5计取20 ml水相缓慢加入到30 ml 油相中，以1000 rpm的转速进行磁力搅拌10分钟，即得到形成乳白色油包水 性乳化二价疫苗。
实施例2
与实施例l不同之处在于
l)制备乳化疫苗的水相将复壮培养培养后甲醛灭活的浓度分别为4x 10"cells/ml的鳗利斯顿氏菌01血清型两种亚型菌株菌液加入到Tween-80中，搅拌混匀，得到乳化疫苗的水相；其中菌悬液按体积百分比94%取18.8ml， Tween-80按体积百分比6%取1. 2 ml。
2)制备乳化疫苗的油相制备乳化疫苗的油相按体积百分比92%取27. 6ml 10号白油，按体积百分比8%取2.4 ml Span-80，按油相总质量体积比1. 5%取 0.45 g硬脂酸铝，将其混合，加热使硬脂酸铝完全溶化，灭菌制备成乳化疫苗 的油相； 1
3 )制备乳化疫苗按体积百分比1: 2计取20 ml水相缓慢加入到40 ml油 相中，以1000 rpm的转速进行磁力搅拌10分钟，即得到形成乳白色油包水性 乳化二价疫苗。
实施例3
与实施例1不同之处在于
1) 制备乳化疫苗的水相将复壮培养培养后甲醛灭活的浓度分别为6x 109cells/ml的鳗利斯顿氏菌01血清型两种亚型菌株菌液加入到Tween-80中， 搅拌混匀，得到乳化疫苗的水相；其中菌悬液按体积百分比98%取19. 6ml， Tween-80按体积百分比2°/。取0. 4 ml。
2) 制备乳化疫苗的油相按体积百分比92%取28.8ml IO号白油，按体积 百分比4%取1. 2 ml Span-80,按油相总质量体积比2. 5%取0. 75 g硬脂酸铝， 将其混合，加热使硬脂酸铝完全溶化，灭菌制备成乳化疫苗的油相；
3) 制备乳化疫苗按体积百分比1: 1. 8计取20 ml水相缓慢加入到36 ml 油相中，以1000 rpm的转速进行磁力搅拌10分钟，即得到形成乳白色油包水 性乳化二价疫苗。
应用例1
将50 ml实施例1制备的乳化疫苗加入到300 g鱼粉中，使用搅拌机充分 搅拌混匀，制备分别包埋有乳化疫苗和未乳化疫苗的饵料。饵料置于5(TC烘箱 中，烘烤6-10个小时至干燥，得到鱼饵料。鱼饵料中细菌细胞含量为10'cells/g 僻料。将暂养大菱鲆随机分为两组，分别投喂含乳化疫苗、未乳化疫苗和未加 疫苗的饵料。每天按0.75g/尾分上下午投喂2遍，投喂2天即为免疫一次，每 隔两周免疫一次，共免疫3次。免疫后检测大菱鲆后肠非特异性与针对两种抗 原的特异性免疫应答反应。参见图3、图4、图5、图6。
应用例2
将鳗利斯顿氏菌油乳化二价口服疫苗与含等量细菌抗原的未乳化疫苗分别 与自制饵料混匀、成型、干躁，制成乳化和未乳化的鳗利斯顿氏菌二价口服疫 苗，细菌细胞含量为1(Tcells/g饵料。将暂养大菱鲆随机分为三组，分别投喂 含乳化疫苗、未乳化疫苗和未加疫苗的饵料。每天按0.75g/尾分上下午投喂2 次，连续投喂7天。并在免疫后30天取免疫组和对照组大菱鲆各20尾，分别 以菌株M3和SMP1进行浸泡攻毒感染实验，各组死亡情况如图7和图8，取后肠 组织制作组织切片，通过原位杂交检测抗体。参见图9、图IO、图ll。
乳化疫苗组对菌株M3和SMP1感染的免疫保护力分别为100%和50%，未乳化 免疫组对菌株M3和SMP1感染的免疫保护力分别为57. 9%和0%。
权利要求
1.一种鳗弧菌油乳化二价口服疫苗，其特征在于疫苗由油相和水相组成，水相中加入利斯顿氏菌属Listonella MacDonellet Collwell的鳗利斯顿氏菌Vibrio anguillarum O1血清型两种亚型菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC No.1870和CGMCC No.1871)的菌悬液。
2. 根据权利要求l所述的鳗弧菌油乳化二价口服疫苗，其特征在于所述 水相为Tween-80，按体积百分比计94%-98°/。的鳗利斯顿氏菌01血清型两种亚型 菌株的菌悬液和2°/。-6°/。的Tween-80 ;油相为Span-80、硬脂酸铝和运动黏度 7-13的白矿油；油相中各成份为按体积百分比计92%-96%的运动黏度7-13 的白矿油和4%-8%的Span-80和按油相总质量体积比的1. 5%-2. 5%的硬脂酸 铝，其中水相和油相按体积比计为1: 1.5-2，所述两种菌悬液浓度各为 l-6109cells/ml。
3. —种根据权利要求l所述的鳗弧菌油乳化二价口服疫苗的制备方法，其 特征在于1) 制备乳化疫苗的水相将Tween-80加入到复壮培养培养后并甲醛灭活 的利斯顿氏菌属Listonella MacDonellet Collwell的鳗利斯顿氏菌Vibrio anguillarum 01血清型两种亚型菌株CGMCC No. 1870和CGMCC No. 1871的菌 液中，搅拌混匀，得到乳化疫苗的水相；其中菌悬液占水相体积比的94%-98%， Tween-80占水相体积比的2°/。-6°/。；2) 制备乳化疫苗的油相按体积百分比计取92 /。-96%的运动黏度7-13的 白矿油、4%-8%的Span-80和按总油相质量体积比1. 5°/。-2. 5%的硬脂酸钼，将 其混合，加热使硬脂酸铝溶化，即得到乳化疫苗的油相；3) 制备乳化疫苗l倍体积的水相缓慢加入到1.5-2倍体积油相中，以1000 一1500 rpm的转速进行磁力搅拌10-20分钟，即得到油包水性乳化二价疫苗。
4. 根据权利要求3所述的鳗弧菌油乳化二价口服疫苗的制备方法，其特征 在于所述两种菌株复壮培养至浓度各为大于1(Tcells/ml。
全文摘要
本发明涉及鱼用疫苗，具体地说是一种鳗弧菌油乳化二价口服疫苗及其制备。具体为疫苗由油相和水相组成，水相为Tween-80，其加入甲醛灭活的利斯顿氏菌属Listonella MacDonellet Collwell的鳗利斯顿氏菌Vibrioanguillarum O1血清型两种亚型菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC No.1870和CGMCC No.1871)的菌悬液；油相为Span-80、硬脂酸铝和运动黏度7-13的白矿油；其中水相和油相按体积比计为1∶1.5-2；水相中的菌悬液按体积百分比计94％-98％。本发明采用鳗弧菌O1血清型两种亚型菌株制备的油乳化二价口服疫苗可以拓宽疫苗保护谱、增加疫苗的免疫协同作用，诱导水产养殖动物肠道的非特异性和特异性免疫应答，并提供保护效应。制备本发明的油乳化二价口服疫苗，所使用的材料成本低。
文档编号A61K39/116GK101190332SQ20061013444
公开日2008年6月4日 申请日期2006年12月1日 优先权日2006年12月1日
发明者张培军, 徐永立, 波 王, 鹏 肖, 莫照兰, 邹玉霞 申请人:中国科学院海洋研究所