专利名称：：间质肺病毒株及其在疫苗制剂中以及用作抗原性序列表达载体的用途和繁殖病毒的方法间质肺病毒林及其在疫苗制剂中以及用作抗原性序列表达载体的用途和繁殖病毒的方法相关申请本发明请求下列美国临时专利申请的优先权2003年4月25日提交的60/465,811;2003年4月30日提交的60/466,776;2003年6月20日提交的60/480,658;2003年8月28日提交的60/498,640;和2004年3月5日提交的60/550,911，它们全文引入本文以供参考。1.介绍本发明涉及一种分离的哺乳动物负链RNA病毒，间质肺病毒(metapneumovirus)(MPV)，该病毒属于副粘病毒科肺病毒亚科。本发明还涉及一种分离的哺乳动物负链RNA病毒及其组分，该病毒从系统发育学上可鉴定为对应或属于间质肺病毒属。本发明涉及哺乳动物间质肺病毒，特别是人间质肺病毒的不同分离林的基因组核脊酸序列。本发明涉及哺乳动物间质肺病毒不同分离林的序列信息在诊断和治疗方法中的应用。本发明涉及编码间质肺病毒基因组或其部分的核苷酸序列，所述间质肺病毒包括哺乳动物和禽类间质肺病毒。本发明还涉及由所述核苷酸序列编码的嵌合或重组病毒。本发明还涉及嵌合和重组的哺乳动物MPV,其中含有一个或多个非天然或异源序列。本发明还涉及疫苗制剂，其中含有哺乳动物或禽类间质肺病毒，包括所述病毒的重组和嵌合形式。本发明的疫苗制剂包括多价疫苗，包括二价和三价疫苗制剂。序列表的副本在本申请中作为表15描述。2.
背景技术：
：一般而言，作为一种破坏力很强的致病因子，副粘病毒每年会导致大量动物及人类的死亡。副粘病毒科是属于单负链病毒(Mononegavirales)(负链单链RNA病毒)目中的一个科，包括副粘病毒和肺病毒两个亚科。后一亚科目前在分类学上分为肺病毒属和间质肺病毒属(Pringle，1999，Arch.Virol.144/2，2065-2070)。人呼吸道合胞病毒(hRSV)，为肺病毒属中的一个种，是世界范围内嬰幼儿下呼吸道感染的最重要的单一致病因子(Domachowske，&Rosenberg,1999，Clin.Microbio.Rev.12(2):298-309)。肺病毒属的其它成员包括牛及绵羊呼吸道合胞病毒以及小鼠肺炎病毒(PVM)。在过去的几十年中，几种哺乳动物疾病，具体是呼吸道疾病(RTI)，具体为人的呼吸道疾病的病原因子，已经鉴定出来(Evans,In:ViralInfectionsofHumans，EpidemiologyandControl.3thedn.(ed.Evans,A.S)22-28(PlenumPublishingCorporation,NewYork,1989))。哺乳动物RTI的常见致病因子是在人(hRSV)及反刍动物如牛或绵羊(bRSV和/或oRSV)中发现的属于肺病毒属的呼吸道合胞病毒。就人RSV而言，根据正反交中和试验差异、免疫学测定中G蛋白的反应性以及G基因的核苷酸序列，分为两个hRSV抗原性亚组。在亚组内，氨基酸序列呈现出94%(A亚组)或98%(B亚组)的同一性，而亚组之间表现出仅53%的氨基酸序列同一性。根据单克隆抗体、RT-PCR试验及RNA酶保护试验，还发现了亚组内的其它变异。两亚组的病毒都在全世界范围内分布，可以发生在单一季节。感染既可以发生于预先-存在免疫性的情况，抗原性变异也不是发生再感染所必需的。参见，例如，Sullender，2000，ClinicalMicrobiologyReviews13(1):1-15;Collins等人FieldsVirology,ed.B.N.Knipe，Howley，P.M.1996，Philadelphia:Lippencott画Raven.1313-1351;Joh謂n等人，1987，(ProcNatlAcadSciUSA，84(16):5625-9;Collins,inTheparamyxoviruses,D.W.Kingsbury,Editor.1991，PlenumPress:NewYork.p.103-153。另一种常见的肺病毒是小鼠肺炎病毒(PVM)，通常仅发现于实验小鼠。但是，哺乳动物中发现的疾病一部分还不能归结于已知病原体。2.1禽类间质肺病毒禽类肺病毒(APV)引发的呼吸道疾病在20世纪70年代后期首次报道于南非(Buys等人，1980，Turkey28:36-46)，给火鸡养殖业造成毁灭性打击。这种火鸡疾病的特征为窦炎和鼻炎，称为火鸡鼻气管炎(TRT)。现已有强有力证据表明APV的欧洲分离林是鸡头肿胀综合征(swollenheadsyndrome)(SHS)的病因(O'Brien,1985，Vet.Rec.117:619-620)。起初，该疾病出现于已感染新城疫病毒(NDV)的产蛋母鸡群，被认为是与新城疫(ND)相关的继发问题，在爆发SHS后的感染鸡群中检测到了抗欧洲APV抗体(Cook等人，1988，AvianPathol.17:403-410)，因而i人为APV为致病因子。禽类肺病毒(APV)又称火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)，是禽类鼻气管炎，一种火鸡上呼吸道感染(Giraud等人，1986，Vet.Res.119:606-607)的致病因子，该病毒是新近命名的间质肺病毒属的唯一成员，迄今为止还未与哺乳动物感染相关，或者更进一步说还未与哺乳动物的疾病有关。APV的血清学亚组可以根据G糖蛋白的核苷酸或氨基酸序列以及使用也识别G糖蛋白的单克隆抗体的中和试验来划分。但是，核苷酸及氨基酸序列中的其它差异也可用于区别APV的血清学亚组。对于亚组A、B和D，亚组内的G蛋白表现出98.5~99.7%的aa序列同一性，而亚组之间仅31.2~38%的aa同一'性。参见，例如，Collins等人，1993，AvianPathology,22:p.469-479;Cook等人，1993，AvianPathology,22:257-273;Bayon-Auboyer等人，JGenVirol,81(Ptll):2723-33;Seal,1998,VirusRes，58(1-2):45-52;Bayon-Auboyer等人，1999，ArchVirol，144(6):91-109;Juhasz，等人，1994，JGenVirol，75(Ptll):2873-80。APV的另一血清型提供于WO00/20600,在此引入作为参考，该文献描述了APV科罗拉多(Colorado)分离林，并用体外血清中和试验将其与已知的APV或TRT林进行了比较。首先，用识别TRT分离林的单特异性多克隆抗血清测试上述科罗拉多分离林。科罗拉多分离株未被抗任一林TRT的单特异性抗血清所中和。但是，其被抗A亚组的一病毒林的超免疫抗血清中和，这种血清中和同源病毒的滴度为1:400，中和科罗拉多分离林的滴度为1:80。使用上述方法，然后用抗TRT的单克隆抗体测定科罗拉多分离林。在每一种情况下，交互中和滴度都<10。另外，还用抗科罗拉多分离株的单特异性抗血清测试两个亚组的TRT分离林。被测的TRT中无一林被抗科罗拉多分离林的抗血清中和。APV科罗拉多分离林不能保护SPF鸡免受TRT病毒的A亚组和B亚組毒林的感染。这些结果表明科罗拉多分离林可能是禽类肺病毒另一血清型的第一个实例(参见，Bayon-Auboyer等人，2000，丄Gen.Vir.81:2723-2733)。禽类肺病毒属于副粘病毒科肺病毒亚科间质肺病毒属(Cavanagh和Barrett,1988，VirusRes.il:241-256;Ling等人，1992，J.Gen.Virol.73:1709-1715;Yu等人，1992，J.Gen.Virol.73:1355-1363)。副粘病毒科分为两个亚科副粘病毒亚科和肺病毒亚科。副粘病毒亚科包括，但不限于副粘病毒属、Rubulavirus和麻渗病毒属。最近，肺病毒亚科根据基因次序和序列同源性分为两个属，即肺病毒属和间质肺病毒属(Naylor等人，1998，J.Gen.Virol"79:1393-1398;Pringle，1998,Arch.Virol.143:1449-1159)。肺病毒属包括但不限于，人呼吸道合胞病毒(hRSV)、牛呼吸道合胞病毒(bRSV)、绵羊呼吸道合胞病毒和小鼠肺病毒。间质肺病毒属包括但不限于，欧洲禽类肺病毒(亚组A和B)，有别于肺病毒属的hRSV种型(Naylor等人，1998,J.Gen.Virol"79:1393-1398;Pringle，1998，Arch.Virol.143:1449-1159)。APV的美国分离林是间质肺病毒属中的第三亚组(亚组C)，因为已经发现它在抗原性和遗传学上不同于欧洲分离林(Seal,1998，VirusRes.58:45-52;Senne等人，1998，In:Proc.47thWPDC，California,pp.67-68)。负链APV电镜检测显示为多形的(pleomorphic),有时呈球形的病毒颗粒，直径为80-200nm，带有长为1000~2000的长丝(CollinsandGough，1988，J.Gen.Virol.69:909-916)。包膜是一层布满着长度为13-15nm纤突的膜。核壳为螺旋形，直径14nm，螺距7nm。核壳的直径小于副粘病毒属及麻渗病毒属，副粘病毒属及麻渗病毒属核壳的直径通常约为18nm。尽管禽类肺病毒感染在世界其它地方的禽类中已经存在多年，但是对于美国来说其是一种突发性疾病。在1996年5月，一种高度传染性的火鸡呼吸道疾病出现于科罗拉多，随后在美国衣阿华州埃姆斯市国立兽医服务实验室(NVSL)中分离出了APV(Senne等人，1997，Proc.134thAim.Mtg.，AVMA，pp.190)。此前，美国和加拿大被i人为没有禽类肺病毒(Pearson等人，1993，In:NewlyEmergingandRe-emergingAvianDiseases:AppliedResearchandPracticalApplicationsforDiagnosisandControl,pp.78-83;HeckerandMyers,1993，Vet.Rec.132:172)。1997年初，在明尼苏达用血清学方法从火鸡中检测到了APV。在第一例确诊时，APV感染已经扩散到了许多农场。与该疾病相关的上呼吸道临床症状有眼睛水泡肿，鼻腔有分泌物以及眶下窦肿胀。二次感染会使症状加剧。感染禽类的发病率可高达100%。死亡率为1~90%，且6-12周龄的幼禽死亡率最高。禽类肺病毒通过接触传播。鼻腔分泌物、感染禽类的流动、污染的水、污染的设备；受到污染的饲料运输车辆以及运栽行为都能造成病毒的传播。康复后的火鸡被认为是携带者。由于证明该病毒感染产蛋火鸡输卵管的上皮细胞，而且APV已经在幼禽中检测到，所以卵传播也是可能的传播途径。2.2PIV感染副流感病毒感染能导致婴幼儿严重的呼吸道感染(Tao等人，1999,Vaccine17:1100-08)。传染性副流感病毒感染占世界范围内全部呼吸道感染儿科患者住院病例约20%。出处同上。PIV是副粘病毒科呼吸道病毒属(PIV1，PIV3)或rubulavirus(PIV2，PIV4)的成员。PIV由两个结构部分组成(l)位于内部的核糖核蛋白芯或核壳，内含病毒基因组，以及(2)外部大致为球形的脂蛋白包膜。它的基因组是单链负链RNA，长约15,456个核苷酸，编码至少8个多肽。这些蛋白包括但不限于核壳结构蛋白(根据属的不同为NP，NC，或N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合糖蛋白(F)、血凝素神经氨酸酶糖蛋白(HN)、大聚合酶蛋白(L)、和功能未知的蛋白C和蛋白D。副流感病毒核壳蛋白(NP、NC或N)由每一蛋白单元中的两个结构域组成，其中一个为氨基末端结构域，该结构域占该分子约2/3，与RNA直接作用，另一为羧基末端结构域，该结构域位于装配好的核壳的表面。据信铰链部分位于这两个结构域的连接部从而赋予该蛋白一些柔性(参见，Fields等人(ed.)，1991，FundamentalVirology,SecondEdition,RavenPress,NewYork,在此全文引入作为参考)。基质蛋白(M)显然参与了病毒的装配，并且与病毒膜和核壳蛋白都相互作用。磷蛋白(P)经过了磷酸化，据信发挥调节转录的作用，并且有可能参与曱基化、磷酸化和聚腺苷酸化。融合糖蛋白(F)与病毒膜相互作用，首先生成为无活性的前体，然后翻译后切割生成为两个二硫键连接的多肽。活性F蛋白还参与了副流感病毒颗粒穿透进入宿主细胞过程，通过促进病毒包膜与宿主细胞质膜的融合来起该作用，出处同上。糖蛋白血凝素神经氨酸酶(HN)从包膜中伸出从而使病毒同时具有了血凝素和神经氨酸酶活性。HN的氨基末端高度疏水，它的作用是将HN蛋白锚定入脂质双层，出处同上。最后，大聚合酶蛋白(L)在转录和复制中发挥重要作用，出处同上。2.3RSV感染呼吸道合胞病毒(RSV)是嬰幼儿严重下呼吸道疾病的主要致病因子(Feigen等人，eds.，1987，In:TextbookofPediatricInfectiousDiseases,WBSaunders,Philadelphia,p.1653-1675;NewVaccineDevelopment,EstablishingPriorities,Vol.1，1985，NationalAcademyPress,WashingtonDC，p.397-409;和Ruuska廳等人，1993，Curr.Probl.Pediatr.23:50-79)。RSV感染的每年流行特点都明显为全球性，但是RSV在特定季节中的发生及强度因地区而变化(Hall，1993，Contemp.Pediatr.10:92-110)。在北半球的温带地区，它通常开始于深秋结束于晚春。原发性RSV感染最多见于6周至两岁的儿童，不常见出生后前4周的嬰儿医院感染(Hall等人，1979，NewEngl.丄Med.300:393-396)。RSV感染的高发儿童包括但不限于，早产嬰儿(Hall等人，1979，NewEngl.J.Med.300:393-396)和患有下列病症的儿童支气管肺发育异常(Groothuis等人，1988，Pediatrics82:199-203)、先天性心脏病(MacDonald等人，NewEngl.J.Med.307:397-400)、先天性或获得性免疫缺陷(Ogra等人，1988，Pediatr.Infect.Dis.J.7:246-249;和Pohl等人，1992，J.Infect.Dis.165:166-169)、和嚢性纤维化(Abman等人，1988，J.Pediatr.113:826-830)。患有心和肺病以RSV感染就诊嬰儿的死亡率为3%-4%(Navas等人，1992，J.Pediatr.121:348-354)。RSV感染成人以及嬰儿和儿童。在健康成人中，RSV可导致占主导地位的上呼吸道疾病。近来，已经发现一些症状性RSV感染的成人，特别是老年人，出现RSV感染症状的几率比先前的报道更高(Evans,A.S.，eds"1989，ViralInfectionsofHumans.EpidemiologyandControl,3rded.，PlenumMedicalBook,NewYork,p.525-544)。另外还报道了发生于家庭护理患者及专门机构护理的年轻患者中的几个流行病例(Falsey，A.R.，1991，Infect.ControlHosp.Epidemiol.12:602-608;和Garvie等人，1980，Br.Med.J.281:1253-1254)。最后，RSV可引发免疫抑制人群，特别是骨髓移植患者的严重疾病(Hertz等人，1989，Medicine68:269-281)。已有RSV疾病的治疗措施还很有限。下呼吸道严重RSV疾病通常需要相当的支持性护理，包括施用湿化氧气和呼吸辅助(Fields等人,eds,1990，FieldsVirology,2nded.,Vol.l，RavenPress,NewYork,P.1045-1072)。尽管疫苗能防止RSV感染和/或RSV-相关疾病，但是现在还没有一种疫苗获得许可。发展疫苗最大的障碍是安全性。一种福尔马林灭活疫苗尽管具有免疫原性，但是被免疫婴儿中的RSV出人意料的引发了比用类似方法制备的三价副流感疫苗免疫嬰儿更高发且更严重的下呼吸道疾病(Kim等人，1969，Am.J.Epidemiol.89:422-434;andKapikian等人，1969，Am.J.Epidemiol.89:405-421)。几种候选RSV疫苗已经被放弃，其它的则还在开发中(Murphy等人，1994，VirusRes.32:13-36)，但是即使安全性问题得到解决，疫苗的效杲还必须提高。大量问题有待解决。新生儿期就需要马上免疫，因为下呼吸道感染的高峰发生于2-5月龄。预计新生儿免疫应答的不完备和高滴度母源获得RSV抗体一起可以降低新生儿期疫苗的免疫原性(Murphy等人，1988，J.Virol.62:3907-3910;andMurphy等人，1991，Vaccine9:185-189)。最后，原发性RSV感染及疾病不能很好地保护继发性RSV疾病(Henderson等人，1979，NewEngl.J.Med.300:530-534)。目前，预防RSV疾病的最有效方法是被动免疫。起初的证据表明IgG的保护作用来自雪貂(ferret)(Prince,G.A"Ph.D.diss"UniversityofCalifornia,LosAngeles,1975)和人(Lambrechtetal，1976，J.Infect.Dis.134:211-217;和Glezen等人，1981，J.Pediatr.98:708-715)母源抗体试验结果。Hemming等人(Morell等人，eds.，1986，ClinicalUseofIntravenousImmunoglobulins,AcademicPress,London,P.285-294)发现在疑似患有新生儿脓毒血症新生儿体内静脉内免疫球蛋白UVIG)药动学研究中，RSV抗体可用来治疗或防止RSV感染。在该试验中，值得注意的是一个呼吸道分泌物含RSV的嬰儿在IVIG输注后迅速康复。IVIG曲线的后续分析发现异常高滴度的RSV中和抗体。同一组研究者然后测定了富含RSV中和抗体的超免疫血清或免疫球蛋白保护棉鼠和灵长类免受RSV感染(Prince等人，1985，VirusRes.3:193-206;Prince等人，1990，J.Virol.64:3091-3092;Hemming等人，1985，J.Infect.Dis.152:1083-1087;Prince等人，1983，Infect.Immun.42:81-87;andPrince等人，1985，J.Virol.55:517-520)。这些试验的结果表明IVIG除了能治疗或防止RSV相关病症，还可用于防止RSV感染。最近临床试验表明这种被动施用RSV超免疫球蛋白(RSVIVIG)能够保护易感儿童免受RSV引发的严重下呼吸道感染(Groothius等人，1993，NewEngl.J.Med.329:1524-1530;和ThePREVENTStudyGroup,1997，Pediatrics99:93-99)。尽管这是防止RSV感染的一大进步，但是这种治疗方法在广泛使用上存在某些局限。首先，RSVIVIG必须在几小时内静脉内输注达到有效剂量，其次，超免疫球蛋白中活性物质的浓度不足以治疗易感成人或大部分心肺病易感儿童。第三，静脉内输注需要再RSV季节住院数月。最后，选择足够提供者制备RSV高免球蛋白满足该产品的需要也是一大难题。目前，只有约8%正常提供者的RSV中和抗体滴度足够高能够定量超免疫球蛋白的产量。提高免疫球蛋白特异性活性的一种方法是制备一种或多种高效RSV中和单克隆抗体(MAbs)。这类MAbs应该是人的或人源化的从而保留有利的药动学并且避免人抗鼠抗体应答，由于重复剂量需要贯穿RSV季节。现已证实RSV表面的两种糖蛋白F和G是中和抗体的耙标(Fields等人，1990，同上；和Murphy等人，l994，同上)。针对RSVF蛋白的A抗原位点中的表位的人源化抗体SYNAGIS,要求在整个RSV季节(北半球从11月至4月)按推荐的每月15mg/kg体重的剂量，肌肉内施用给儿童患者防止RSV引发的严重下呼吸道感染。SYNAGIS是人抗体(95%)与鼠(5%)抗体序列的结合体。参见，Johnson等人，1997，J.Infect.Diseases176:1215-1224和美国专利No.5，824，307，文献全文在此引入作为参考。人重链序列源自人IgGl恒定区以及Cor(Press等人，1970,Biochem.J.117:641-660)和Cess(Takashi等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:194-198)的VH基因的可变框架区域。人轻链序列源自CK的恒定区和VL基因K104Jk-4的可变框架区域(Bentley等人，1980，Nature288:5194-5198)。鼠序列源自鼠单克隆抗体Mab1129(Beeler等人，1989，J.Virology63:2941-2950)，该方法是将鼠互补决定区移植入人抗体框架。人呼吸道疾病中的一大部分是由副粘病毒亚科和肺病毒亚科的成员引发的。本申请中首次描述了感染人的另一种哺乳动物肺病毒hMPV的鉴定。仍然需要有效疫苗提供针对导致呼吸道感染的多种病毒的保护作用。2.4病毒进入宿主细胞不断有人表明，某些有包膜病毒例如逆转录病毒、正粘病毒、线状病毒和副粘病毒可能使用融合机制来进入宿主细胞(Eckert等人，2001，Amm.Rev.Biochem.70:777-810;Weissenhorn等人，1999，Mol.Membr.Biol.16:3-9;Lamb等人，1999,Mol.Membr.Biol.16:11-19;Skehel等人，2000，Annu.Rev.Biochem.69:531-569;Bentz，J.，2000，BiophysJ.78:886-900;Peisajovich等人，2002，TrendsBiochem.Sci.27:183-190)。在该模型下，融合蛋白发生构象改变，例如，位于副粘病毒的F蛋白的N-末端的融合肽被暴露以插入到细胞膜内(Wang等人，2003，Biochem.Biophys.Res.Comm.302:469-475)。已有人表明高度保守的七氨基酸重复肽(heptadrepeat)(HR)区促进该融合过程(Wang等人，2003，Biochem.Biophys.Res.Comm.302:469-475)。因此，七氨基酸重复肽是通过抑制与宿主细胞融合来预防病毒感染和/或繁殖的有吸引力的靶目标。本申请中引述和讨论的文献不应被理解为是对本发明现有技术的承认。3.发明概述本发明涉及一种分离的哺乳动物负链RNA病毒，间质肺病毒(MPV)，该病毒属于副粘病毒科肺病毒亚科。本发明还涉及在系统发育学上可鉴定为对应或属于间质肺病毒属的分离的哺乳动物负链RNA病毒及其组分。具体而言，本发明涉及一种哺乳动物MPV，该病毒在系统发育学上与巴黎CNCM中保藏号为1-2614的病毒分离林的相关程度比其与C型APV的相关程度更密切。在更具体的实施方案中，所述哺乳动物MPV可以是哺乳动物MPV的Al、A2、Bl或B2变种。但是，本发明的哺乳动物MPV包括待鉴定的其它变种，而不仅限于A1、A2、B1或B2变种。本发明涉及哺乳动物间质肺病毒，特别是人间质肺病毒的不同分离林的基因组核苷酸序列。本发明涉及哺乳动物间质肺病毒的不同分离林的序列信息在诊断和治疗方法中的用途。本发明涉及哺乳动物间质肺病毒不同分离抹的基因组核苷酸序列之间的差异，及其在本发明诊断和治疗方法中的用途。在特定实施方案中，编码N、M、F、L、P、M2-l、M2-2、SH或GORF的哺乳动物MPV的核苷酸序列可以用于鉴定本发明的病毒。在其它特定实施方案中，编码N、M、F、L、P、M2-l、M2-2、SH或GORF的哺乳动物MPV的核苷酸序列被用于将哺乳动物MPV划分为Al、A2、Bl或B2变种。在一特定实施方案中，本发明涉及将不同间质肺病毒分离林中的单核苷酸多态性(SNP)用于诊断目的。本发明涉及源自哺乳动物MPV或禽类肺病毒(APV)的重组及嵌合病毒。依据本发明，重组病毒是一种源自哺乳动物MPV或APV的由内源或天然基因组序列或非天然基因组序列编码的病毒。依据本发明，非天然序列是指由于一处或多处突变而有别于天然或内源基因组序列的序列，所述突变包括但不限于基因组序列中能或不会导致表型改变的点突变、重排、插入、缺失等。依据本发明，本发明的嵌合病毒是一种重组的MPV或APV，其中还含有异源核苷酸序列。依据本发明，嵌合病毒可由具有下述特性的核苷酸序列编码基因组中添加了异源核苷酸序列或者基因组中的内源或天然核苷酸序列被异源核苷酸序列所替换。在某些实施方案中，本发明的嵌合病毒源自MPV或APV，其中的一个或多个ORF或其部分被来自另一林间质肺病毒的同源ORF或其部分所替换。在一个范例实施方案中，哺乳动物MPVF基因的ORF被APVF基因的ORF所替换。在一些其它实施方案中，本发明的嵌合病毒源自APV，其中一个或多个ORF被哺乳动物MPV的同源ORF所替换。本发明涉及编码间质肺病毒(包括哺乳动物和禽类毒林)基因组或其部分的核苷酸序列。本发明涉及编码间质肺病毒基因产物的核苷酸序列。具体而言，本发明涉及但不限于编码MPV的F蛋白、G蛋白、M蛋白、SH蛋白、N蛋白、P蛋白、M2蛋白或L蛋白的核苷酸序列。具体而言，本发明涉及编码哺乳动物MPV变种的F蛋白、G蛋白、M蛋白、SH蛋白、N蛋白、P蛋白、M2蛋白或L蛋白的核苷酸序列，所述变种是例如但不限于MPV的Al、A2、Bl或B2变种。除了相对于病毒基因组为异源或非天然的核苷酸序列之外，本发明还涉及编码间质肺病毒，包括哺乳动物和禽类间质肺病毒的基因组或其部分的cDNA或RNA。本发明还涉及所述cDNA或RNA编码的嵌合或重组病毒。本发明进一步还涉及哺乳动物MPV以及哺乳动物MPV不同变种的F蛋白、G蛋白、M蛋白、SH蛋白、N蛋白、P蛋白、M2蛋白或L蛋白的多肽及氨基酸序列。本发明进一步还涉及抗哺乳动物MPV以及哺乳动物MPV不同变种的F蛋白、G蛋白、M蛋白、SH蛋白、N蛋白、P蛋白、M2蛋白或L蛋白的抗体。该抗体可用于诊断和治疗方法。在一些更具体的实施方案中，所述抗体特异性针对哺乳动物MPV。在一些实施方案中，所述抗体特异性针对哺乳动物MPV的变种。本发明进一步还涉及含有下列一种或多种蛋白的疫苗制剂及免疫原性组合物哺乳动物MPV的F蛋白、G蛋白、M蛋白、SH蛋白、N蛋白、P蛋白、M2蛋白和/或L蛋白。本发明进一步还涉及包含哺乳动物或禽类间质肺病毒的疫苗制剂及免疫原性组合物，所述病毒包括所述病毒的重组及嵌合形式。具体而言，本发明涉及含有MPV和/或APV的重组或嵌合形式的疫苗制剂。本发明进一步还涉及含有嵌合MPV的疫苗，其中所述嵌合MPV编码一种或多种APV蛋白，并且其中所述嵌合MPV任选地还表达一种或多种异源或非天然序列。本发明还涉及含有嵌合APV的疫苗，其中所述嵌合APV编码一种或多种hMPV蛋白，并且其中所述嵌合APV任选还表达一种或多种异源或非天然序列。本发明还涉及多价疫苗，包括二价和三价疫苗。具体而言，本发明的多价疫苗包括由同一或不同肺病毒载体表达的两种或多种抗原性多肽。多价疫苗中的抗原性多肽包括但不限于MPV、APV、PIV、RSV、流感病毒或其它负链RNA病毒或其它病毒如麻渗病毒的抗原性多肽。本发明进一步还涉及治疗个体呼吸道感染的方法。在一些实施方案中，本发明涉及通过向个体施用含有哺乳动物MPV的疫苗制剂来治疗呼吸道感染的方法。在特定实施方案中，治疗个体呼吸道感染的方法包括向个体施用含有重组或嵌合哺乳动物MPV或APV的疫苗制剂或免疫原性组合物。在更具体的实施方案中，所述重组或嵌合哺乳动物MPV是减毒的。在特定实施方案中，本发明涉及治疗人类患者呼吸道感染的方法，其中包括向人类患者施用包含重组或嵌合APV，或者编码APV的F蛋白、G蛋白、M蛋白、SH蛋白、N蛋白、P蛋白、M2蛋白或L蛋白的核苷酸序列的疫苗制剂。本发明提供了一种分离的负链单链RNA病毒MPV，该病毒属于副粘病毒科肺病毒亚科，在系统发育学上可鉴定为属于间质肺病毒属，其中所述病毒在系统发育学上与含有SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示核苷酸序列的病毒分离林间的相关程度比其与禽类鼻气管炎致病因子火鸡鼻气管炎病毒间的相关程度更密切。在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的负链单链RNA间质肺病毒，其中所述病毒的基因组包含SEQIDNO:18所示核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的负链单链RNA间质肺病毒，其中该病毒的基因组包含SEQIDNO:19所示核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的负链单链RNA间质肺病毒，其中该病毒的基因组包含SEQIDNO:20所示核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的负链单链RNA间质肺病毒，其中该病毒的基因组包含SEQIDNO:21所示核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸，其中所述核酸的核苷酸序列与SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21具有至少70Y。的序列同一性，其中所述序列同一性是在SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21的全长范围内测定的。在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸，其中所述核酸编码一种蛋白，该蛋白包含(i)与哺乳动物MPV变种B1的G蛋白(SEQIDNO:324)具有至少66%序列同一性的氨基酸序列；(ii)与哺乳动物MPV变种Bl的N蛋白(SEQIDNO:368)具有至少98.5%序列同一性的氨基酸序列；(iii)与哺乳动物MPV变种Bl的P蛋白(SEQIDNO:376)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(iv)与哺乳动物MPV变种B1的M蛋白(SEQIDNO:360)相同的氨基酸序列；(v)与哺乳动物MPV变种Bl的F蛋白(SEQIDNO:316)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(vi)与哺乳动物MPV变种Bl的M2-l蛋白(SEQIDNO:340)具有至少98%序列同一性的氨基酸序列；(vii)与哺乳动物MPV变种Bl的M2-2蛋白(SEQIDNO:348)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(viii)与哺乳动物MPV变种Bl的SH蛋白(SEQIDNO:384)具有至少83%序列同一性的氨基酸序列；或(ix)与哺乳动物MPV变种B1的L蛋白(SEQIDNO:332)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸，其中所述核酸编码一种蛋白质，该蛋白包含(i)与哺乳动物MPV变种Al的G蛋白(SEQIDNO:322)具有至少66%序列同一性的氨基酸序列；(ii)与哺乳动物MPV变种Al的N蛋白(SEQIDNO:366)具有至少99.5%序列同一性的氨基酸序列；(iii)与哺乳动物MPV变种Al的P蛋白(SEQIDNO:374)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(iv)与哺乳动物MPV变种A1的M蛋白(SEQIDNO:358)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(v)与哺乳动物MPV变种Al的F蛋白(SEQIDNO:314)具有至少98%序列同一性的氨基酸序列；(vi)与哺乳动物MPV变种Al的M2-l蛋白(SEQIDNO:338)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(vii)与哺乳动物MPV变种Al的M2-2蛋白(SEQIDNO:346)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(viii)与哺乳动物MPV变种Al的SH蛋白(SEQIDNO:382)具有至少84%序列同一性的氨基酸序列；或(ix)与哺乳动物MPV变种Al的L蛋白(SEQIDNO:330)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸，其中所述核酸编码一种蛋白质，该蛋白包含(i)与哺乳动物MPV变种A2的G蛋白(SEQIDNO:332)具有至少66%序列同一性的氨基酸序列；(ii)与哺乳动物MPV变种A2的N蛋白(SEQIDNO:367)具有至少99.5%序列同一性的氨基酸序列；(iii)与哺乳动物MPV变种A2的P蛋白(SEQIDNO:375)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(iv)与哺乳动物MPV变种A2的M蛋白(SEQIDNO:359)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(v)与哺乳动物MPV变种A2的F蛋白(SEQIDNO:315)具有至少98%序列同一性的氨基酸序列；(Vi)与哺乳动物MPV变种A2的M2-l蛋白(SEQIDNO:339)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(vii)与哺乳动物MPV变种A2的M2-2蛋白(SEQIDNO:347)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(viii)与哺乳动物MPV变种A2的SH蛋白(SEQIDNO:383)具有至少84%序列同一性的氨基酸序列；或(ix)与哺乳动物MPV变种A2的L蛋白(SEQIDNO:331)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸，其中所述核酸编码一种蛋白质，该蛋白包含(i)与哺乳动物MPV变种B2的G蛋白(SEQIDNO:325)具有至少66%序列同一性的氨基酸序列；(ii)与哺乳动物MPV变种B2的N蛋白(SEQIDNO:369)具有至少97%序列同一性的氨基酸序列；(iii)与哺乳动物MPV变种B2的P蛋白(SEQIDNO:377)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(iv)与哺乳动物MPV变种B2的M蛋白(SEQIDNO:361)相同的氨基酸序列；(v)与哺乳动物MPV变种B2的F蛋白(SEQIDNO:317)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(vi)与哺乳动物MPV变种B2的M2-l蛋白(SEQIDNO:341)具有至少98%序列同一性的氨基酸序列；(vii)与哺乳动物MPV变种B2的M2-2蛋白(SEQIDNO:349)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(viii)与哺乳动物MPV变种B2的SH蛋白(SEQIDNO:385)具有至少84%序列同一性的氨基酸序列；或(ix)与哺乳动物MPV变种B2的L蛋白(SEQIDNO:333)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸，其中该核酸能够与哺乳动物MPV的核酸在高度严格、中度严格或低度严格条件下特异性地杂交。在一些实施方案中，本发明提供了一种病毒，该病毒含有SEQIDNO:18-21所示核苷酸序列或其片段。在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的蛋白，该蛋白含有(i)与哺乳动物MPV变种B1的G蛋白(SEQIDNO:324)具有至少66%序列同一性的氨基酸序列；(ii)与哺乳动物MPV变种Bl的N蛋白(SEQIDNO:368)具有至少98.5%序列同一性的氨基酸序列；(iii)与哺乳动物MPV变种Bl的P蛋白(SEQIDNO:376)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(iv)与哺乳动物MPV变种Bl的M蛋白(SEQIDNO:360)相同的氨基酸序列；(v)与哺乳动物MPV变种Bl的F蛋白(SEQIDNO:316)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(vi)与哺乳动物MPV变种Bl的M2-l蛋白(SEQIDNO:340)具有至少98%序列同一性的氨基酸序列；(vii)与哺乳动物MPV变种Bl的M2-2蛋白(SEQIDNO:348)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(viii)与哺乳动物MPV变种Bl的SH蛋白(SEQIDNO:384)具有至少83%序列同一性的氨基酸序列；或(ix)与哺乳动物MPV变种Bl的L蛋白(SEQIDNO:332)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的蛋白，该蛋白含有(i)与哺乳动物MPV变种Al的G蛋白(SEQIDNO:322)具有至少66%序列同一性的氨基酸序列；(ii)与哺乳动物MPV变种Al的N蛋白(SEQIDNO:366)具有至少99.5%序列同一性的氨基酸序列；(iii)与哺乳动物MPV变种Al的P蛋白(SEQIDNO:374)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(iv)与哺乳动物MPV变种Al的M蛋白(SEQIDNO:358)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(v)与哺乳动物MPV变种Al的F蛋白(SEQIDNO:314)具有至少98%序列同一性的氨基酸序列；(vi)与哺乳动物MPV变种Al的M2-l蛋白(SEQIDNO:338)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(vH)与哺乳动物MPV变种A1的M2-2蛋白(SEQIDNO:346)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(viii)与哺乳动物MPV变种Al的SH蛋白(SEQIDNO:382)具有至少84%序列同一性的氨基酸序列；或(ix)与哺乳动物MPV变种Al的L蛋白(SEQIDNO:330)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的蛋白，该蛋白含有(i)与哺乳动物MPV变种A2的G蛋白(SEQIDNO:323)具有至少66%序列同一性的氨基酸序列；(ii)与哺乳动物MPV变种A2的N蛋白(SEQIDNO:367)具有至少99.5%序列同一性的氨基酸序列；(iii)与哺乳动物MPV变种A2的P蛋白(SEQIDNO:375)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(iv)与哺乳动物MPV变种A2的M蛋白(SEQIDNO:359)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(v)与哺乳动物MPV变种A2的F蛋白(SEQIDNO:315)具有至少98%序列同一性的氨基酸序列；(vi)与哺乳动物MPV变种A2的M2-l蛋白(SEQIDNO:339)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(vii)与哺乳动物MPV变种A2的M2-2蛋白(SEQIDNO:347)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(viii)与哺乳动物MPV变种A2的SH蛋白(SEQIDNO:383)具有至少84%序列同一性的氨基酸序列；或(ix)与哺乳动物MPV变种A2的L蛋白(SEQIDNO:331)具有至少"％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的蛋白，该蛋白含有-.(i)与哺乳动物MPV变种B2的G蛋白(SEQIDNO:325)具有至少66%序列同一性的氨基酸序列；(ii)与哺乳动物MPV变种B2的N蛋白(SEQIDNO:369)具有至少97%序列同一性的氨基酸序列；(iii)与哺乳动物MPV变种B2的P蛋白(SEQIDNO:377)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(iv)与哺乳动物MPV变种B2的M蛋白(SEQIDNO:361)相同的氨基酸序列；(v)与哺乳动物MPV变种B2的F蛋白(SEQIDNO:317)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(vi)与哺乳动物MPV变种B2的M2-l蛋白(SEQIDNO:341)具有至少98%序列同一性的氨基酸序列；(vii)与哺乳动物MPV变种B2的M2-2蛋白(SEQIDNO:349)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(viii)与哺乳动物MPV变种B2的SH蛋白(SEQIDNO:385)具有至少84%序列同一性的氨基酸序列；或(ix)与哺乳动物MPV变种B2的L蛋白(SEQIDNO:333)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体，其中所述抗体能与由下列氨基酸序列组成的蛋白特异性地杂交(i)与哺乳动物MPV变种B1的G蛋白(SEQIDNO:324)具有至少66%序列同一性的氨基酸序列；(ii)与哺乳动物MPV变种Bl的N蛋白(SEQIDNO:368)具有至少98.5%序列同一性的氨基酸序列；(iii)与哺乳动物MPV变种Bl的P蛋白(SEQIDNO:376)具有至少％%序列同一性的氨基酸序列；(iv)与哺乳动物MPV变种Bl的M蛋白(SEQIDNO:360)相同的氨基酸序列；(v)与哺乳动物MPV变种Bl的F蛋白(SEQIDNO:316)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(vi)与哺乳动物MPV变种Bl的M2-l蛋白(SEQIDNO:340)具有至少98%序列同一性的氨基酸序列；(vii)与哺乳动物MPV变种Bl的M2-2蛋白(SEQIDNO:348)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(viii)与哺乳动物MPV变种B1的SH蛋白(SEQIDNO:384)具有至少83%序列同一性的氨基酸序列；或(ix)与哺乳动物MPV变种Bl的L蛋白(SEQIDNO:332)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体，其中所述抗体能与由下列氨基酸序列组成的蛋白特异性地杂交(i)与哺乳动物MPV变种Al的G蛋白(SEQIDNO:322)具有至少66%序列同一性的氨基酸序列；(ii)与哺乳动物MPV变种Al的N蛋白(SEQIDNO:366)具有至少99.5%序列同一性的氨基酸序列；(iii)与哺乳动物MPV变种Al的P蛋白(SEQIDNO:374)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(iv)与哺乳动物MPV变种Al的M蛋白(SEQIDNO:358)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(v)与哺乳动物MPV变种Al的F蛋白(SEQIDNO:314)具有至少98%序列同一性的氨基酸序列；(vi)与哺乳动物MPV变种Al的M2-l蛋白(SEQIDNO:338)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(vii)与哺乳动物MPV变种Al的M2-2蛋白(SEQIDNO:346)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(viii)与哺乳动物MPV变种Al的SH蛋白(SEQIDNO:382)具有至少84%序列同一性的氨基酸序列；或(ix)与哺乳动物MPV变种Al的L蛋白(SEQIDNO:330)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体，其中所述抗体能与由下列氨基酸序列组成的蛋白特异性地杂交(i)与哺乳动物MPV变种A2的G蛋白(SEQIDNO:323)具有至少66%序列同一性的氨基酸序列；(H)与哺乳动物MPV变种A2的N蛋白(SEQIDNO:367)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(iii)与哺乳动物MPV变种A2的P蛋白(SEQIDNO:375)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(iv)与哺乳动物MPV变种A2的M蛋白(SEQIDNO:359)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(v)与哺乳动物MPV变种A2的F蛋白(SEQIDNO:315)具有至少98%序列同一性的氨基酸序列；(vi)与哺乳动物MPV变种A2的M2-l蛋白(SEQIDNO:339)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(vii)与哺乳动物MPV变种A2的M2-2蛋白(SEQIDNO:347)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(viii)与哺乳动物MPV变种A2的SH蛋白(SEQIDNO:383)具有至少84%序列同一性的氨基酸序列；或(ix)与哺乳动物MPV变种A2的L蛋白(SEQIDNO:331)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种抗体，其中所述抗体能与由下列氨基酸序列组成的蛋白特异性地杂交(i)与哺乳动物MPV变种B2的G蛋白(SEQIDNO:325)具有至少66%序列同一性的氨基酸序列；(ii)与哺乳动物MPV变种B2的N蛋白(SEQIDNO:369)具有至少97%序列同一性的氨基酸序列；(iii)与哺乳动物MPV变种B2的P蛋白(SEQIDNO:377)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(iv)与哺乳动物MPV变种B2的M蛋白(SEQIDNO:361)相同的氨基酸序列；(v)与哺乳动物MPV变种B2的F蛋白(SEQIDNO:317)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(vi)与哺乳动物MPV变种B2的M2-l蛋白(SEQIDNO:341)具有至少98%序列同一性的氨基酸序列；(vii)与哺乳动物MPV变种B2的M2-2蛋白(SEQIDNO:349)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(viii)与哺乳动物MPV变种B2的SH蛋白(SEQIDNO:385)具有至少84%序列同一性的氨基酸序列；或(ix)与哺乳动物MPV变种B2的L蛋白(SEQIDNO:333)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种检测样本中哺乳动物MPV变种Bl的方法，该方法包括将样本与变种Bl的特异性抗体接触。在一些实施方案中，本发明提供了一种检测样本中哺乳动物MPV变种Al的方法，该方法包括将样本与变种Al的特异性抗体接触。在一些实施方案中，本发明提供了一种检测样本中哺乳动物MPV变种A2的方法，该方法包括将样本与变种A2的特异性抗体接触。在一些实施方案中，本发明提供了一种检测样本中哺乳动物MPV变种B2的方法，该方法包括将样本与变种B2的特异性抗体接触。在一些实施方案中，本发明提供了一种鉴定病毒分离林为哺乳动物MPV的方法，该方法包括将所述分离株或其组分与哺乳动物MPV的特异性抗体接触。在一些实施方案中，本发明提供了一种病毒学诊断哺乳动物MPV感染的方法，该方法包括通过将样本与MPV的特异性抗体接触从而测定所述哺乳动物样本中病毒分离林或其组分的存在。在一些实施方案中，本发明提供了一种病毒学诊断个体哺乳动物MPV感染的方法，该方法包括从个体获取样本，然后将样本与MPV特异性抗体接触，其中如果抗体与样本结合则表明个体感染了哺乳动物MPV。在一些实施方案中，本发明提供了感染性重组病毒，其中所述重组病毒包含哺乳动物MPV基因组，并且另外还包含非天然的MPV序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种重组核酸，其中所述重组核酸包含(i)编码MPV变种Al的G多肽的核酸；以及(ii)编码非天然MPV多肽的核酸。在一些实施方案中，本发明提供了一种重组核酸，其中所述重组核酸包含(i)编码MPV变种A2的G多肽的核酸；以及(ii)编码非天然MPV多肽的核酸。在一些实施方案中，本发明提供了一种重组核酸，其中所述重组核酸包含(i)编码MPV变种Bl的G多肽的核酸；以及(ii)编码非天然MPV多肽的核酸。在一些实施方案中，本发明提供了一种重组核酸，其中所述重组核酸包含(i)编码MPV变种B2的G多肽的核酸；以及(ii)编码非天然MPV多肽的核酸。在一些实施方案中，本发明提供了一种感染性嵌合病毒，其中所述嵌合病毒含有哺乳动物MPV第一变种的基因组，其中哺乳动物MPV第一变种基因组中一个或多个开放阅读框已被源自哺乳动物MPV第二变种的类似开放阅读框所替换。在一些实施方案中，本发明提供了一种感染性嵌合病毒，其中所述嵌合病毒含有哺乳动物MPV第一变种的基因组，其中哺乳动物MPV第二变种的一个或多个开放阅读框被插入哺乳动物MPV第一变种的基因组内。在一些实施方案中，本发明提供了一种感染性嵌合病毒，其中所述嵌合病毒含有哺乳动物MPV的基因组，其中哺乳动物MPV基因组中一个或多个开放阅读才匡已被编码一种或多种下列蛋白质的ORF所替换(i)禽类MPVF蛋白；(ii)禽类MPVG蛋白；(iii)禽类MPVSH蛋白；(iv)禽类MPVN蛋白；(v)禽类MPVP蛋白；(vi)禽类MPVM2蛋白；(vii)禽类MPVM2-l蛋白；(viii)禽类MPVM2-2蛋白；或(ix)禽类MPVL蛋白。在一些实施方案中，本发明提供了一种感染性嵌合病毒，其中所述嵌合病毒含有禽类MPV的基因组，其中禽类MPV基因组中一个或多个开放阅读框已被编码下列一种或多种下列蛋白的开放阅读框所替换(i)哺乳动物MPVF蛋白；(ii)哺乳动物MPVG蛋白；(iii)哺乳动物MPVSH蛋白；(iv)哺乳动物MPVN蛋白；(v)哺乳动物MPVP蛋白；(vi)哺乳动物MPVM2蛋白；(vii)哺乳动物MPVM2-1蛋白；(viii)哺乳动物MPVM2-2蛋白；或(ix)哺乳动物MPVL蛋白。在一些实施方案中，本发明提供了感染性嵌合或重组病毒，其中所述嵌合或重组病毒是使用种间或种内聚合酶拯救的。在一个实施方案中，本发明提供了嵌合或重组病毒，其中所述嵌合或重组病毒是使用MPV聚合酶拯救的。在一个实施方案中，本发明使用源自病毒的聚合酶，所述聚合酶与欲拯救的病毒的聚合酶不同，即聚合酶源自不同变种、亚型或其它物种。在另一个实施方案中，本发明提供了感染性嵌合或重组病毒，其中所述嵌合或重组病毒是使用源自另一病毒的聚合酶拯救的，所述聚合酶包括但不限于PIV、APV或RSV的聚合酶。例如但不限于可能的组合，RSV聚合酶可用于拯救MPV;MPV聚合酶可用于拯救RSV;或者PIV聚合酶可用于拯救MPV。在本发明的另一个实施方案中，用于拯救重组病毒的聚合酶复合物是由源自不同病毒的聚合酶蛋白编码的。例如但不限于可能的组合，在一个实施方案中，聚合酶复合蛋白是由以下基因编码的MPV的N基因、PIV的L基因、RSV的P基因以及MPV的M2-l基因。在其它实施方案中，M2-l基因不是聚合酶复合物的组分。在本发明的另一个实施方案中，例如，聚合酶复合蛋白是由以下基因编码的RSV的N基因、RSV的L基因、APV的P基因和RSV的M2-l基因。在本发明的另一个实施方案中，拯救本发明的重组病毒不需要M2-l基因。本领域技术人员应当熟悉可用来编码聚合酶复合蛋白，从而拯救本发明重组嵌合病毒的组合类型。在一些实施方案中，本发明提供了一种免疫原性组合物，其中所述免疫原性组合物含有本发明所述的感染性重组病毒。在一些实施方案中，本发明提供了一种检测样本中哺乳动物MPV的方法，该方法包括将样本与本发明的核酸序列接触。在一些实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其中所述药物组合物含有本发明的感染性重组病毒。在一些实施方案中，本发明提供了检测样本中哺乳动物MPV的方法，其中所述方法包括扩增或探测MPV相关核酸、加工的产物或其衍生物。在更具体的实施方案中，本发明提供了基于检测样本中MPV的方法的聚合酶链反应。在另一个实施方案中，本发明提供了可用于特异性地检测MPV相关核酸、加工的产物或其衍生物的寡核苷酸探针。在另一个实施方案中，本发明提供了用于检测被病毒感染的宿主中MPV抗体的诊断方法。在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗或预防哺乳动物呼吸道感染的方法，该方法包括施用含有哺乳动物间质肺病毒的疫苗。在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗或防止哺乳动物呼吸道感染的方法，该方法包括施用含有本发明重组哺乳动物间质肺病毒的疫苗。在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗或预防哺乳动物呼吸道感染的方法，该方法包括施用含有禽类间质肺病毒的疫苗。在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗或预防人呼吸道感染的方法，该方法包括施用含有禽类间质肺病毒的疫苗。在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗或预防个体呼吸道感染的方法，该方法包括向个体施用本发明组合物。在一些实施方案中，本发明提供了一种鉴定可用于治疗哺乳动物MPV感染的化合物的方法，其中该方法包括(a)用哺乳动物MPV感染动物；(b)向动物施用测试化合物；以及(c)测定测试化合物对动物感染的效果，其中能减轻感染程度或改善感染相关症状的化合物被鉴定为可用于治疗哺乳动物MPV感染的化合物。在一些实施方案中，本发明提供了一种鉴定可用于治疗哺乳动物MPV感染的化合物的方法，其中该方法包括(a)用哺乳动物MPV感染细胞培养物；(b)用测试化合物孵育细胞培养物；以及(c)测定测试化合物对细胞培养物感染的效果，其中能减轻感染程度的化合物被鉴定为可用于治疗哺乳动物MPV感染的化合物。在一些实施方案中，本发明提供了一种诊断动物的哺乳动物MPV感染的方法，其中该方法包括通过将所述样本与能和禽类肺病毒组分反应的核酸或抗体反应从而测定所述动物样本中病毒分离林或其组分的存在，所述核酸或抗体可以与MPV组分交叉反应。在一些实施方案中，本发明提供了一种血清学诊断动物感染哺乳动物MPV的方法，该方法包括将取自动物的样本与本发明的蛋白接触。在一些实施方案中，本发明提供了一种血清学诊断动物感染哺乳动物MPV的方法，该方法包括将取自动物的样本与APV的蛋白接触。在一些实施方案中，本发明提供了一种血清学诊断禽类APV感染的方法，该方法包括将取自动物的样本与本发明的蛋白接触。在一些实施方案中，本发明提供了一种分离的负链单链RNA病毒MPV，该病毒属于副粘病毒科肺病毒亚科，在系统发育学上可鉴定为对应间质肺病毒属，该病毒在系统发育学上与巴黎CNCM中保藏号为I-2614的病毒分离林的相关程度比其与禽类鼻气管炎致病因子火鸡鼻气管炎病毒间的相关程度更密切。3.1习惯命名及缩写cDNA互补DNAL大蛋白M基质蛋白(排列于包膜内)F融合糖蛋白HN血凝素-神经氨酸酶糖蛋白N，NP或NC核蛋白(与RNA结合具有聚合酶活性)P磷蛋白MOI感染复数NA神经氨酸酶(包膜糖蛋白)PIV副流感病毒hPIV人副流感病毒hPIV33型人副流感病毒APV/hMPV具有hMPV序列的重组APVhMPV/APV具有APV序列的重组hMPV哺乳动物MPV哺乳动物间质肺病毒nt核香酸RNP核糖核酸蛋白rRNP重组RNPvRNA基因纟且病毒RNAcRNA反基因组病毒RNAhMPV人间质肺病毒APV禽类肺病毒MVA修饰后的痘苗病毒安卡拉林(Ankara)FACS荧光激活细胞分选仪CPE细胞病变效应位置l被转录的病毒基因组笫一基因的位置位置2天然病毒基因组第一和第二开放阅读框之间的位置，或者可替换地为，被转录的病毒基因组第二基因的位置位置3天然病毒基因组第二和第三开放阅读框之间的位置，或者可替换地为，被转录的病毒基因组第三基因的位置位置4天然病毒基因组第三和第四开放阅读框之间的位置，或者可替换地为，被转录的病毒基因组第四基因的位置位置5天然病毒基因组第四和第五开放阅读框之间的位置，或者可替换地为，被转录的病毒基因组第五基因的位置位置6天然病毒基因组第五和第六开放阅读框之间的位置，或者可替换地为，被转录的病毒基因组第六基因的位置dpi(感染后天数)F(融合)HAI(血凝抑制)HN(血凝素神经氨酸酶糖蛋白)hpi(感染后小时数)MOI(感染复数)POI(感染位置)bPIV-3(3型牛副流感病毒)hPIV-3(3型人副流感病毒)RSV(人呼吸道合胞病毒)SEM(不含血清的培养基)TCID5(50%组织培养感染剂量)4.附图描述图1:发现的分离林00-l与肺病毒亚科其它成员的氨基酸序列的同源百分比。百分比(x100)是关于N、P、M、F和L中的两个RAP-PCR片段(8和9/10)的氨基酸序列。图2:使用免疫荧光和病毒中和分析得到的、按年龄组别分类的人的MPV血清阳性率。图3:用RAP-PCR和RT-PCR在病毒分离林00-1(Al)获得的片段位置和大小所图示表示的APV的基因组。用RAP-PCR获得片段1到10。用RAP-PCR片段1和2中的引物和基于APV和RSV(Randhawa等人，1997，J.Virol.71:9849-9854)的前导和尾随序列设计的引物获得了片段A。用RAP-PCR片段1和2以及RAP-PCR片段3中设计的引物获得了片段B。用RAP-PCR片段3以及RAP-PCR片段4、5、6和7中设计的引物获得了片段C。图4:肺病毒亚科的成员与病毒分离抹00-1(Al)的N、P、M和FORF的比较。比对显示病毒分离林00-l(Al)完整的N、F、M和P蛋白以及部分L蛋白的氨基酸序列。分离林00-1(Al)和其它病毒不同的氨基酸被标出，一致的氨基酸用句点表示。缺位用破折号表示。数字与蛋白质中的氨基酸位置相对应。缩写如下所示APV-A、B或C:禽类肺病毒A、B或C型；hRSV:牛或人呼吸道合胞病毒；PVM:小鼠的肺炎病毒。L8:用RAP-PCR获得的位于L中的片段8，L9/10:用RAP-PCR获得的位于L中的片段9和10的共有部分。对于L蛋白的比对，仅有bRSV，hRSV和APV-A的序列可以利用。图5:MPV核蛋白的预测的氨基酸序列和其它肺炎病毒的序列的比对。保守区域用框和标签A、B以及C表示。肺病毒中的保守区域用灰影表示。缺位用破折号表示，句点表示与MPV—致的氨基酸残基的位置。图6:MPV的磷蛋白与其它肺病毒的氨基酸序列的比较。高度相似的区域被框住，并且富含谷氨酸的区域在灰影中。缺位用破折号表示。句点表示与MPV—致的氨基酸残基的位置。图7:MPV基质蛋白与其它肺病毒的推导出的氨基酸序列的比较。保守的六肽序列在灰影中。缺位用破折号表示。句点表示与MPV一致的氨基酸残基的位置。图8:MPV分离林00-1(Al)的基因组图谱。每个ORF都标出起始和终止密码子的核苷酸位置。穿过LORF的双线表示L基因的截短形式。图谱下的3个阅读框表示原始的GORF(nt6262-6972)和重叠的潜在第二ORF。图9:MPV融合蛋白与其它肺病毒的预测的氨基酸序列的比对。保守的半胱氨酸残基被框住。N-相连的糖基化位点加了下划线。F0的断裂位点加了双下划线；融合肽、信号肽和膜锚定结构域用灰影表示。缺位用破折号表示，句点表示与MPV—致的氨基酸残基的位置。图10:MPVM2ORF与其它肺病毒的氨基酸序列的比较。M2-lORF的比对显示于条格A中，其保守的氨基末端用灰影表示。三个保守的半胱氨酸残基用印刷粗体字并用#号表示。M2-2ORF的比对显示于条格B中。缺位用破折号表示，并且句点表示与MPV—致的氨基酸残基的位置。图11:MPV的SHORF的氨基酸序列分析。(A)MPV的SHORF的氨基酸序列，其丝氨酸和苏氨酸残基位于灰影中，半胱氨酸残基用粗体字，并且疏水区域加双下划线。潜在的N-相连的糖基化位点加单下划线。箭号表示在疏水结构域側面的碱性氨基酸位置。(B)MPV，APV-A和hRSV-B的SH蛋白的疏水结构的比对。使用了17个氨基酸的窗。箭号表示强疏水结构域。ORF里的位置在X轴上给出。图12:MPVG蛋白ORF的氨基酸序列分析。(A)MPV的GORF的氨基酸序列，其丝氨酸、苏氨酸和脯氨酸残基位于灰影中。半胱氨酸残基用粗体字，并且疏水区域加双下划线。潜在的N-相连的糖基化位点加单下划线。(B)MPV、APV-A和hRSV-B的G蛋白的疏水结构的比对。使用了17个氨基酸的窗。箭号表示疏水结构域，并且ORF里的位置在X轴上给出。图13:MPV和其它副粘病毒的聚合酶基因的保守结构域氨基酸序列的比较。结构域III用四个框住的结构域III中的保守聚合酶模体(A、B、C、D)表示(Poch等人，1989EMBOJ8:3867-74;Poch等人，1990，J.Gen.Virol71:1153-62)。缺位用破折号表示，并且句点表示与MPV—致的氨基酸残基的位置。缩写如下所示hPIV-3:3型人副流感病毒；SV:仙台病毒；hPIV-2:2型人副流感病毒；NDV:新城病毒；MV:麻渗病毒；nipah:Nipah病毒。图14:肺病毒属的成员与病毒分离林OO-l(Al)的N、F、M和FORF的系统发育分析。系统发育分析基于病毒的如下基因序列来进行F(条格A)，N(条格B)，M(条格C)和P(条格D)。系统发育树基于采用100次bootstrap和3次jiimble的最大可能性分析法。代表核苷酸变化的数值范围以每个树表示。图15:MPV和选定的副粘病毒的M2-l和LORF的系统发育分析。如图13图例所述，M2-1ORF用与肺病毒属的其它成员(A)的M2-lORF进行比对，而LORF用与肺病毒属和选定的其它副粘病毒的其它成员的LORF进行比对。系统发育树由采用100次bootstrap和3次jumble的最大可能性分析法生成。代表核苷酸变化的数值范围以每个树表示。树中的数字表示基于共有树的bootstrap值。图16:九个原始MPV分离株和APV-C及其遗传近亲的F(条格A),N(条格B),M(条格C)20和L(条格D)ORF的部分的系统发育关系。系统发育树基于最大可能性分析法。代表核苷酸变化的数值范围以每个树表示。APV-C的登记号条格A:D00850;条格B:U39295;条格C:X58639;以及条格D:U65312。图17:hMPV的所有四个变种，即变种Al、A2、Bl或B2的不同分离林的F基因的比对。图18:hMPV的所有四个变种，即变种Al、A2、Bl或B2的不同分离林的F蛋白的比对。图19:hMPV的所有四个变种，即变种Al、A2、Bl或B2的不同分离林的G基因的比对。图20:hMPV的所有四个变种，即变种A1、A2、Bl或B2的不同分离林的G蛋白的比对。图21:基于F基因序列的系统发育树，其显示hMPV各自变种的不同分离林的系统发育关系。图22:基于G基因序列的系统发育树，其显示图13所示的hMPV各自变种的不同分离林的系统发育关系。图23:MPV分离林00-1(Al)在Vero细胞中的生长曲线。Vero细胞以0.1的MOI感染。图24:CAT-hMPV微复制子构建体的序列。序列片段编码的功能显示于序列的下方。图25:来自CAT-hMPV微复制子的CAT的表达。用于转染的不同构建体显示于x-轴上；CAT表达量显示于y-轴上。该图显示转染后24小时的CAT的表达和转染后48小时的CAT的表达情况。标准品用CAT蛋白的稀释液。图26:前导和尾随序列比较显示了不同病毒前导和尾随序列的比对。图27:hMPV基因组分析显示了与hMPV基因组构成相关的hMPV基因组序列的PCR片段。突变位点显示于显示了PCR片段的竖条下面。图28:hMPV分离林00-1(Al)和hMPV分离林99-1(Bl)的限制性酶谱。各自分离林中的限制性位点显示于显示了hMPV基因组构成的图表下方。图表上方的范围以kb显示了hMPV基因组的位置。图29A和29B:hMPVcDNA装配。上方的图表显示hMPV的基因组构成，下方的橫条显示装配成编码病毒的全长cDNA的PCR片段(见图27)。表示PCR片段的橫条上方的数字以械基对显示了病毒基因组的位置。图30:来自MPV分离林00-1(Al)基因组3'末端的核苷酸和氨基酸序列信息。给出ORF。N:核蛋白的ORF;P:磷蛋白的ORF;M:基质蛋白的ORF;F:融合蛋白的ORF;GE:基因末端；GS:基因起始。图31A和B:来自MPV分离林00-1(Al)聚合酶基因(L)所得片段的核苷酸和氨基酸序列信息。L中片段的定位是基于APV-A(登记号U65312)的蛋白质同源性的。翻译片段8(图31A)定位于氨基酸数8至243,片段9和10的一致部分(图31B)定位于APV-ALORF的氨基酸数1358至1464。图32:用ned/00/Ol(Al)和/或ned/99/Ol(Bl)接种的12个豚鼠15的喉鼻擦拭物RT-PCR分析结果。图33A:感染ned/00/Ol(Al)和重复感染ned層Ol(Al)(GP4、5和6)或ned/99/Ol(Bl)(GP1和3)的豚鼠的抗ned/00/Ol(Al)和ned/99/Ol(Bl)的IgG应答。图33B:感染ned/99/Ol和重复感染ned/00/Ol(Al)(GP8和9)或ned/99/01(Bl)(GP10、11、12)的豚鼠的抗ned/00/Ol(Al)和ned/99/Ol(Bl)的IgG应答。图34:感染ned/00/Ol(Al)或ned/99/Ol(Bl)的豚鼠血清之ned/00/Ol(Al)和ned/99/Ol(Bl)的ELISA特异性。图35:3个同源的(00-1/00-1)、2个同源的(99-1/99-1)，2个异源的(99-1/00-1)和2个异源的(00-1/99-1)感染的豚鼠的抗ned/00/Ol(Al)和ned/99/01(Bl)的平均IgG应答的ELISA。图36:hMPV感染的豚鼠的APV抑制平均百分比。图37:ned/00/01(Al)和ned/99/01(Bl)感染的豚鼠的抗ned/00/Ol(Al)、ned/99/Ol(Bl)和APV-C的病毒中和滴度。图38:(两次)接种ned/00/Ol(Al)的恒河猴的喉擦拭物的RT-PCR分析结果。图39A(上两条格)(重复)感染ned/00/01(Al)的恒河猴的抗ned/00/01(Al)的IgA，IgM和IgG应答。图39B(底条格)感染ned/00/01(Al)的恒河猴的抗APV的IgG应答。图40:人血清中IgG抗体检测用hMPVELISA和APV抑制ELISA的使用比较。图41:两个原型hMPV分离林与APV-A和APV-C的比较；用于编码各种病毒蛋白的核酸DNA相似性矩阵。图42:两个原型hMPV分离林与APV-A和APV-C的比较；用于各种病毒蛋白的蛋白相似性矩阵。图42b:哺乳动物个原型MPV的编码序列的比较。左栏显示核酸序列比较，右栏显示氨基酸序列比较。NL/1/00是变种A1(SEQIDNO:19)的原型。NL/17/00是变种A2(SEQIDNO:20)的原型。NL/l/99是变种Bl(SEQIDNO:18)的原型。NL/1/94是变种B2(SEQIDNO:21)的原型。图43:两个原型hMPV分离林的核蛋白的氨基酸比对。图44:两个原型hMPV分离林的磷蛋白的氨基酸比对图45:两个原型hMPV分离林的基质蛋白的氨基酸比对。图46:两个原型hMPV分离林的融合蛋白的氨基酸比对。图47:两个原型hMPV分离林的M2-l蛋白的氨基酸比对。图48:两个原型hMPV分离林的M2-2蛋白的氨基酸比对。图49:两个原型hMPV分离林的短疏水蛋白的氨基酸比对。图50:两个原型hMPV分离林的附着糖蛋白的氨基酸比对。图51:两个原型hMPV分离林的聚合酶蛋白N-末端的氨基酸比对。图52:hMPV分离林00-1(Al)的非编码序列。(A)正义链中位于ORF和基因组末端之间的非编码序列。从左到右，首先列出的是标示ORF的终止密码子，随后为非编码序列，标示的下一个ORF的基因起始信号及起始密码子。数字显示的是hMPV起始及终止密码子的第一个位置。用下划线标出的是与已公开基因终止信号表现出相似性的序列，用上划线标出的是与DAAAAAU/A/C表现出相似性的序列。(B)hMPV基因组末端的核苷酸序列。hMPV基因组末端相互间比对以及与APV基因组末端的比对。下划线区域标出的是RT-PCR试验所用引物序列，这些引物序列是根据APV和RSV3'和5'末端序列设计而成的。粗斜体核苷酸是N基因起始信号的部分。Le:前导序列，Tr:尾随序列。图53:hMPV分离林00-1(Al)与hMPV分离林99-1(Bl)之间基因组序列的序列比较。图54:通过聚腺苷酸化与3，RACE方法结合测定得到的人间质肺病毒(hMPV)NL/1/00(Al)基因组RNA的前导序列。图55:用PCR产物直接和用PCR克隆测序分析都表明hMPV的前导区是由前导序列中最靠近3'端的20个核苷酸5'ACGCGAAAAAAACGCGTATA(按正义cDNA方向表示)组成的。下划线标出的是两个新近鉴定的核苷酸。图56:由感染病毒的成功拯救而导致的噬斑形成，所述感染病毒得自具有APV前导和尾随序列的重组hMPV克隆#2。图57:拯救的重组hMPV的免疫染色。对于免疫染色，使用豚鼠多克隆抗体，然后使用抗豚鼠HRP和DAKOAEC底物。对于得自不同变种，即A1、A2、Bl和B2的hMPV，正免疫染色是明显的，这表明在所有亚组中都实现了成功拯救。(pl=感染后)图58:用于检测样本中hMPV存在的RT-PCR和DNA印迹分析的结果。将使用对于hMPV的L和N基因有特异性的引物的RT-PCR产物转移到膜上，然后用对于L基因和N基因分别具有特异性的寡核苷酸进行探测。使用链霉抗生物素蛋白过氧化物酶检测杂交。结果表明，该测定能够敏感地测定hMPV的L和N基因。图59:用于检测hMPV的Taqman测定。A)在得自四种hMPV原型病毒林的滴定的病毒RNA上进行的NL-NTaqman测定表明，该测定对于所有4种hMPV原型林具有相等的敏感性。B)RNA转录物的定量分析表明，在TaqmanRT-PCR测定中，少至5个RNA拷贝产生正信号。C)对于所测试的不同引物/探针组，四种原型hMPV林的寡核苷酸位点的熵图。D)使用以前出版的测定来扩增四种原型cDNA林的病毒cDNA表明，其敏感度低于针对hMPVA病毒的NL-N测定，并且缺乏对于hMPVB病毒的检测。图60:通过替换不同的病毒基因而实现的人间质肺病毒的减毒。A)表明了hMPV的不同嵌合形式中CAT酶的水平，所述hMPV的不同嵌合形式是通过将hMPV的分离株99-1的不同基因(SEQIDNO:18)用hMPV的分离林00-1的各个类似基因(SEQIDNO:19)替换而产生的。B)表明了hMPV的不同嵌合形式中CAT酶的水平，所述hMPV的不同嵌合形式是通过将hMPV的分离林00-1的不同基因(SEQIDNO:19)用hMPV的分离林99-1的各个类似基因(SEQIDNO:18)替换而产生的。图61:M2缺失突变体的产生。图62:A:表明了野生型hMPV(wthMPV/NL/l/00)、在F蛋白的101位具有脯氨酸的重组hMPV(rechMPV/101P)和在F蛋白的101位具有丝氨酸的重组hMPV(rechMPV/101S)在Vero细胞中的嗟斑。病毒生长是在或不在胰蛋白酶存在下进行的。B:表明了感染6天后，野生型hMPV、在F蛋白的101位具有脯氨酸的重组hMPV和在F蛋白的101位具有丝氨酸的重组hMPV在甲基纤维素下面的噬斑。病毒生长是在或不在胰蛋白酶存在下进行的。图63:表明了野生型hMPV(wthMPV)、在F蛋白的101位具有脯氨酸的重组hMPV(rechMPV)和在F蛋白的101位具有丝氨酸的重组hMPV(P101SinF)的生长曲线。在图的顶部表明在实验的不同阶段是否存在胰蛋白酶。图64:用以下病毒感染的Vero细胞的上清液(A)或细胞(B)的Western印迹分析野生型hMPV(wtPro)、在F蛋白的101位具有脯氨酸的重组hMPV(#5Pro)和在F蛋白的101位具有丝氨酸的重组hMPV(#7Ser)，所述病毒的生长是在或不在胰蛋白酶存在下进行的。韦裂解的蛋白F。和裂解产物R用箭头表示。图65:在和不在胰蛋白酶存在下，重组hMPV/NL/1/00的生长曲线。wthMPV=野生型hMPV/NL/1/00;rechMPV(#21)=具有hMPV/NL/1/00的序列的重组病毒；rechMPV(C4A)(#5)=具有hMPV/NL/1/00的序列的重组蛋白。图66:野生型和重组hMPV在仓鼠的上呼吸道和下呼吸道中的复制。图67:在和不在胰蛋白酶存在下，重组hMPV/NL/1/00的生长曲线。wthMPV=野生型hMPV/NL/1/00;rechMPV(#21)=具有hMPV/NL/1/00的序列的重组病毒；rechMPV(C4A)(#5)=具有hMPV/NL/1/00的序列的重组蛋白。图68:使用hMPV/GFP2的嗟斑减少与微中和之间的线性关系。5.发明详述本发明涉及一种分离的哺乳动物负链RNA病毒，间质肺病毒(MPV)及其变种，该病毒属于副粘病毒科肺病毒亚科。本发明还涉及一种分离的哺乳动物负链RNA病毒及其组分，该病毒从系统发育学上可鉴定为对应或属于间质肺病毒属。本发明的哺乳动物MPV可以是哺乳动物MPV的变种Al、A2、B1或B2。但是，本发明的哺乳动物MPV可包括有待鉴定的其它变种，而不仅限于变种A1、A2、Bl或B2。本发明涉及哺乳动物间质肺病毒(MPV)分离林各种变种的基因组核苦酸序列，所述病毒具体为人间质肺病毒，包括变种A1、A2、Bl和B2。本发明涉及哺乳动物间质肺病毒不同分离林的序列信息在诊断和治疗方法中的应用。本发明涉及不同间质肺病毒分离林间基因组核苷酸序列的差异，及其在本发明所述诊断和治疗方法中的用途。具体而言，本发明涉及使用不同间质肺病毒分离林间单核苷酸多态性(SNP)用于诊断和治疗方法。本发明还涉及利用哺乳动物间质肺病毒不同分离林的血清学特性，单独或与不同分离林的序列信息结合，用于诊断和治疗方法。本发明涉及编码间质肺病毒基因组或其部分，包括哺乳动物和禽类间质肺病毒(APV)的核苷酸序列。本发明涉及编码间质肺病毒基因产物的核苦酸序列，包括哺乳动物和禽类间质肺病毒。本发明进一步还涉及核酸，包括DNA和RNA，所述核酸编码间质肺病毒基因组或其部分，包括哺乳动物和禽类间质肺病毒，除相对于病毒基因组为异源或非天然的核苷酸序列外。本发明进一步涉及由所述核苷酸序列编码的重组或嵌合病毒。本发明所述的重组病毒是一种源自哺乳动物MPV或APV由内源或天然基因组序列或非天然基因组序列编码的病毒。本发明所述的非天然序列是指由于一处或多处突变而有别于天然或内源基因组序列的序列，包括但不限于点突变、重排、插入、缺失等，该基因组序列能或不能导致表型改变。本发明所述的嵌合病毒是一种重组的MPV或APV，其中另含有异源核苷酸序列。本发明所述的嵌合病毒是由具有下述特性的核苷酸序列序列编码基因组中添加了异源核苷酸序列或者基因组中的内源或天然核苷酸序列被异源核苷酸序列所替换。本发明进一步还涉及含有哺乳动物或禽类间质肺病毒的疫苗制剂，所述病毒包括所述病毒的重组体。具体而言，本发明涉及含有MPV或APV重组或嵌合体的疫苗制剂，该重组或嵌合体表达抗原性糖蛋白，包括MPV或APV糖蛋白，以及/或者非天然的MPV或APV糖蛋白。本发明还涉及含有MPV或APV重组体的疫苗制剂，该重组体编码另一种负链RNA病毒，包括PIV或RSV的抗原性序列，或者另一种或另一林间质肺病毒的糖蛋白。本发明进一步还涉及含有嵌合hMPV的疫苗，其中所述嵌合hMPV编码一种或多种APV蛋白，并且其中所述嵌合hMPV可任选地另外表达一种或多种异源或非天然序列。本发明还涉及含有嵌合APV的疫苗，其中所述嵌合APV编码一种或多种hMPV蛋白，其中所述嵌合APV可任选地另外表达一种或多种异源或非天然序列。本发明还涉及多价疫苗，包括二价和三价疫苗。具体而言，本发明的二价及三价疫苗包括由同一或不同肺病毒载体表达的两种或多种抗原性多肽，该载体编码MPV、APV、PIV、RSV、流感病毒或另一种负链RNA病毒或麻療病毒的抗原性多肽。5.1哺乳动物间质肺病毒哺乳动物间质肺病毒的结构特征本发明提供了一种哺乳动物MPV。该哺乳动物MPV是一种负链单链RNA病毒，属于副粘病毒科肺病毒亚科。而且，该哺乳动物MPV在系统发育学上可鉴定为对应或属于间质肺病毒属，其中该哺乳动物MPV在系统发育学上与巴黎CNCM中保藏号为1-2614病毒分离林(SEQIDNO:19)的相关程度比其与禽类鼻气管炎致病因子火鸡鼻气管炎病毒间相关程度更密切。通过例如获取病毒核酸序列信息并对其进行系统发育测试可鉴定一种病毒系统发育学上对应于间质肺病毒属。本领域技术人员已知的任一技术都可用于测定两林病毒间的系统发育相互关系。例如方法参见章节5.9。其它技术公开于国际公开号为WOO2/057302的专利申请PCT/NLOMMMMO,在此引入作为参考。具体而言，PCT/NL02/00040在第12页第27行至第19页第29行公开了适于系统发育分析的核酸序列，在此引入作为参考。另外也可根据序列相似度将一种病毒鉴定为哺乳动物MPV,更详细描述见下文。除了本申请公开的病毒与哺乳动物MPV系统发育相关度及序列相似度外，本申请公开的病毒的基因组组成与哺乳动物MPV病毒的基因组组成的相似度也可用于将病毒鉴定为哺乳动物MPV。哺乳动物MPV的一种代表性基因组组成参见图27。在一些实施方案中，所述哺乳动物MPV的基因组组成有别于副粘病毒科肺病毒亚科中肺病毒的基因组组成。间质肺病毒和肺病毒这两个属的划分主要是依据它们的基因星座(constellation);间质肺病毒通常缺乏非-结构蛋白例如NS1或NS2(还参见，Randhawa等人，1997，J.Virol.71:9849-9854)，基因顺序不同于肺病毒(RSV:'3-NSl-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5'，APV:'3-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5')(Lung,等人，1992，J.Gen.Virol.73:1709-1715;Yu，等人，1992，Virology186:426-434;Randhawa,等人，1997，J.Virol.71:9849-9854)。另外，本发明的哺乳动物MPV可通过其免疫学特性来鉴定。在一些实施方案中，用哺乳动物MPV制备的特异性抗-血清能中和哺乳动物MPV。产生的抗MPV的单克隆及多克隆抗体能中和哺乳动物MPV(参见，PCTWO02/057302第—页至第—页，在此引入作为参考。另外，本发明哺乳动物MPV的特性还在于其能感染哺乳动物宿主，即，哺乳动物细胞培养物或哺乳动物。与APV不同，哺乳动物MPV在鸡和火鸡内不复制或仅仅低水平复制。但是，哺乳动物MPV能够在哺乳动物细胞宿主，例如cynomolgousmacaques中复制。在一些更具体的实施方案中，哺乳动物MPV的特性还在于其能在哺乳动物宿主中复制。在一些更具体的实施方案中，哺乳动物MPV的特性还在于其能导致哺乳动物宿主表达哺乳动物MPV基因组编码的蛋白质。在一些更具体的实施方案中，哺乳动物表达的病毒蛋白被插入哺乳动物宿主的细胞质膜内。在一些实施方案中，本发明的哺乳动物MPV能够感染哺乳动物宿主，并且导致哺乳动物宿主产生新的哺乳动物MPV感染性病毒颗粒。本发明哺乳动物MPV功能特性的进一步描述见章节5丄2。在一些实施方案中，电镜下病毒形态或其对氯仿的敏感度可用于鉴定病毒为哺乳动物MPV。本发明的哺乳动物在电镜下的形态为副粘病毒-样颗粒。一致地，哺乳动物MPV对于氯仿处理敏感；哺乳动物MPV最适培养于tMK细胞或与之功能相同的细胞，该病毒在大多数细胞培养中基本上是胰蛋白酶依赖性的。另外，哺乳动物MPV具有典型细胞病变效应(CPE)，缺乏抗红细胞的血凝活性。MPV导致的CPE与hRSV的CPE类似，其特征为细胞形成合胞体后快速内部裂解，随之从培养平板上脱落下来。尽管大多数副粘病毒具有血凝活性，但是大部分肺病毒不具有血凝活性(Pringle，C.R.In:Theparamyxoviruses;(ed.D.W.Kingsbury)1-39(PlenumPress,NewYork,1991))。哺乳动物MPV在核酸片段中含有编码M2蛋白的第二重叠ORF(M2-2)。这种第二重叠ORF还出现于其它肺病毒，见Ahmadian等人，1999，J.Gen.Vir.80:2011-2016。在一些实施方案中，本发明提供了鉴定病毒是否为哺乳动物MPV的方法。例如，可以从动物或人获取测试样本。然后测试样本中是否存在肺病毒亚科的病毒。如果存在肺病毒亚科的病毒，那么可以按照本申请所述方法测试该病毒是否具有哺乳动物MPV的任一特性，例如，但不限于，与哺乳动物MPV的系统发育相关程度，与哺乳动物MPV核苷酸序列的核苷酸序列同一性，与哺乳动物MPV氨基酸序列的氨基酸序列同一性/同源性，以及基因组组成。另外，可以通过下列试验鉴定病毒是否为哺乳动物MPV:使用来自MPV分离林的核酸序列的交叉杂交试验，使用哺乳动物MPV特异性引物的RT-PCR，或者使用抗哺乳动物MPV分离林抗体的常规交叉-血清学试验。在一些实施方案中，可以根据其免疫学特性鉴定哺乳动物MPV，通过使用动物抗血清的定量中和试验测定。所述抗血清可获自，例如感染了哺乳动物MPV的雪貂、猪或猿(参见，例如，实施例8)。在一些实施方案中，血清型不与除哺乳动物MPV之外的其它病毒交叉反应。其它实施方案中，血清型在双向都表现出同源-异源滴度之比〉l6。如果中和试验两个病毒在单向或双向都表现出一定程度的交叉反应(同源-异源滴度之比为8或16)，血清型的独特性可被认为是DNA序列存在实质性的生物物理/生物化学差异。如果中和试验两个病毒在单向或双向都表现出显著程度的交叉反应(同源-异源滴度之比小于8)，那么可以认定被研究分离林的血清型是同一血清型。分离林1-2614在本申请中又称作MPV分离林00-1，可以用其作为原型。在一些实施方案中，可以通过下述方法鉴定病毒是否为哺乳动物MPV:将病毒蛋白或核酸与本申请中公开序列的或保藏的病毒分离林的氨基酸序列或核苷酸序列进行序列同源性/同一性比较。具体而言，当病毒基因组中含有的核酸序列与巴黎CNCM中保藏号为1-2614的病毒分离抹的核酸同一性百分比较本申请中确定的下文所鉴定的编码L蛋白、M蛋白、N蛋白、P蛋白或F蛋白的核酸与APV-C间的核酸序列同一性百分比更高时，那么就可以把病毒鉴定为哺乳动物MPV，(参见，表l)。(参见，PCTWO02/05302，pp.12-19，在此引入作为参考。不受理论的束绰，我们通常都知道病毒种，特别是RNA病毒种，往往是一种准种，其中一病毒簇的成员表现出序列异质性。因此，可以预料到每一单个毒林与APV-C间的序列同一性都可能具有一定程度的差异。迄今为止，MPV蛋白与任一已知同科其它病毒之间氨基酸序列同一性最高的是APV-C与人MPV之间的同一性。人MPV与APV-C之间，基质蛋白的氨基酸序列同一性为87%，核蛋白为88%，磷蛋白为68%，融合蛋白为81%，部分聚合酶蛋白为56-64%，这可在比较与图30(也参见表l)给出的序列时推断出。含有编码与这些最大值相比同源性更高的蛋白的ORF的病毒分离林被认为是哺乳动物MPV。值得注意的是，与其它病毒类似，哺乳动物MPV不同分离林之间也发现了一定程度的差异。表l:MPV的ORF与其他副粘病毒ORF之间的氨基酸序列同一性<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>注解1.与已知G和SH蛋白之间没有发现任何序列同源性，因此可被排除2.序列未获得。3.其他人副流感病毒2型和3型、仙台病毒、麻療病毒、宜麦(nipah)病毒、海豹瘟热病毒以及新城疫病毒。4.病毒基因组中没有ORF。在一些实施方案中，本发明提供了一种哺乳动物MPV，其中哺乳动物MPVSH蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO:382所示氨基酸序列(分离林NL/l/00的SH蛋白；见表14)之间同一性为至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50n/、至少55%、至少60°/o、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%。含有的SH蛋白与SEQIDNO:382(分离林NL/l/00的SH蛋白；见表14)之间的序列同一性为至少30%的分离的负链单链RNA间质肺病毒能够感染哺乳动物宿主。在一些实施方案中，含有的SH蛋白与SEQIDNO:382(分离林NL/1/00的SH蛋白；见表14)之间的序列同一性为至少30%的分离的负链单链RNA间质肺病毒能够在哺乳动物宿主中复制。在一些实施方案中，哺乳动物MPV含有编码与SEQIDNO:382(分离林NL/1/00的SH蛋白；见表14)之间的序列同一性为至少30%的SH蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种哺乳动物MPV，其中哺乳动物MPVG蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO:322所示氨基酸序列(分离林NL/1/00的G蛋白；见表14)氨基酸序列之间同一性为至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或至少99.5%。含有的G蛋白与SEQIDNO:322(分离林NL/1/00的G蛋白；见表14)之间的序列同一性为至少20%的分离的负链单链RNA间质肺病毒能够感染哺乳动物宿主。在一些实施方案中，含有的G蛋白与SEQIDNO:322(分离林NL/1/00的G蛋白；见表14)之间的序列同一性为至少20%的分离的负链单链RNA间质肺病毒能够在哺乳动物宿主中复制。在一些实施方案中，哺乳动物MPV含有编码与SEQIDNO:322(分离林NL/1/00的G蛋白；见表14)之间的序列同一性为至少20%的G蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种哺乳动物MPV，其中哺乳动物MPVL蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO:330所示氨基酸序列(分离林NL/1/00的L蛋白；见表14)氨基酸序列之间同一性为至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或至少99.5%。含有的L蛋白与SEQIDNO:330(分离林NL/1/00的L蛋白；见表14)之间的序列同一性为至少85%的分离的负链单链RNA间质肺病毒能够感染哺乳动物宿主。在一些实施方案中，含有的L蛋白与SEQIDNO:330(分离林NL/1/00的L蛋白；见表14)之间的序列同一性为至少85%的分离的负链单链RNA间质肺病毒能够在哺乳动物宿主中复制。在一些实施方案中，哺乳动物MPV含有编码与SEQIDNO:330(分离林NL/1/00的L蛋白；见表14)之间的序列同一性为至少20%的L蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了一种哺乳动物MPV，其中哺乳动物MPVN蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO:366氨基酸序列之间同一性为至少卯％、至少95%、至少98%。含有的N蛋白与SEQIDNO:3"之间氨基酸序列同一性为至少90%的分离的负链单链RNA间质肺病毒能够感染哺乳动物宿主。在一些实施方案中，含有的N蛋白与SEQIDNO:366之间的氨基酸序列同一性为至少90%的分离的负链单链RNA间质肺病毒能够在哺乳动物宿主中复制。氨基酸同一性是根据N蛋白全长序列计算得出的。在一些实施方案中，哺乳动物MPV含有编码与SEQIDNO:366氨基酸序列之间序列同一性为至少90%、至少95或至少98%的N蛋白的核普酸序列。本发明还提供了一种哺乳动物MPV，其中哺乳动物MPVP蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO:374氨基酸序列之间同一性为至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或至少98%。含有的P蛋白与SEQIDNO:374之间氨基酸序列同一性为至少70%的哺乳动物MPV能够感染哺乳动物宿主。在一些实施方案中，含有的P蛋白与SEQIDNO:374之间的氨基酸序列同一性为至少70%的哺乳动物MPV能够在哺乳动物宿主中复制。氨基酸同一性是根据P蛋白全长序列计算得出的。在一些实施方案中，哺乳动物MPV含有编码与SEQIDNO:374氨基酸序列之间序列同一性为至少70%、至少80%、至少卯％、至少95或至少98%的P蛋白的核苷酸序列。本发明还提供了一种哺乳动物MPV，其中哺乳动物MPVM蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO:358氨基酸序列之间同一性为至少90%、至少95%、至少98%。含有的M蛋白与SEQIDNO:358之间氨基酸序列同一性为至少90%的哺乳动物MPV能够感染哺乳动物宿主。在一些实施方案中，含有的M蛋白与SEQIDNO:358之间的氨基酸序列同一性为至少卯％的分离的负链单链RNA间质肺病毒能够在哺乳动物宿主中复制。氨基酸同一性是根据M蛋白全长序列计算得出的。在一些实施方案中，哺乳动物MPV含有编码与SEQIDNO:358氨基酸序列之间序列同一性为至少卯％、至少95或至少98%的M蛋白的核苷酸序列。本发明还提供了一种哺乳动物MPV，其中哺乳动物MPVF蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO:314氨基酸序列之间同一性为至少85%、至少90°/、至少95%或至少98%。含有的F蛋白与SEQIDNO:314之间氨基酸序列同一性为至少85%的哺乳动物MPV能够感染哺乳动物宿主。在一些实施方案中，含有的F蛋白与SEQIDNO:314之间的氨基酸序列同一性为至少85%的分离的负链单链RNA间质肺病毒能够在哺乳动物宿主中复制。氨基酸同一性是根据F蛋白全长序列计算得出的。在一些实施方案中，哺乳动物MPV含有编码与SEQIDNO:314氨基酸序列之间序列同一性为至少85%、至少90%、至少95%或至少98%的F蛋白的核苷酸序列。本发明还提供了一种哺乳动物MPV，其中哺乳动物MPVM2-l蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO:338氨基酸序列之间同一性为至少85%、至少卯％、至少95%或至少98%。含有的M2-l蛋白与SEQIDNO:338之间氨基酸序列同一性为至少85%的哺乳动物MPV能够感染哺乳动物宿主。在一些实施方案中，含有的M2-l蛋白与SEQIDNO:338之间的氨基酸序列同一性为至少85%的分离的负链单链RNA间质肺病毒能够在哺乳动物宿主中复制。氨基酸同一性是根据M2-l蛋白全长序列计算得出的。在一些实施方案中，哺乳动物MPV含有编码与SEQIDNO:338氨基酸序列之间序列同一性为至少85%、至少90°/、至少95%或至少98%的M2-l蛋白的核苷酸序列。本发明还提供了一种哺乳动物MPV，其中哺乳动物MPVM2-2蛋白的氨基酸序列与SEQIDNO:346氨基酸序列之间同一性为至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少98%。含有的M2-2蛋白与SEQIDNO:346之间氨基酸序列同一性为至少60%的分离的哺乳动物MPV能够感染哺乳动物宿主。在一些实施方案中，含有的M2-2蛋白与SEQIDNO:346之间的氨基酸序列同一性为至少60%的分离的负链单链RNA间质肺病毒能够在哺乳动物宿主中复制。氨基酸同一性是根据M2-2蛋白全长序列计算得出的。在一些实施方案中，哺乳动物MPV含有编码与SEQIDNO:346氨基酸序列之间序列同一性为至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95或至少98%的M2-2蛋白的核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供了哺乳动物MPV，其中所述负链单链RNA间质肺病毒编码选自下列蛋白中的至少2种蛋白、至少3种蛋白、至少4种蛋白、至少5种蛋白或6种蛋白(i)与SEQIDNO:366具有至少90%氨基酸序列同一性的N蛋白；(ii)与SEQIDNO:374具有至少70%氨基酸序列同一性的P蛋白；(iii)与SEQIDNO:358具有至少90%氨基酸序列同一性的M蛋白；(iv)与SEQIDNO:314具有至少85%氨基酸序列同一性的F蛋白；(v)与SEQIDNO:338具有至少85%氨基酸序列同一性的M2-l蛋白；以及(vi)与SEQIDNO:346具有至少60%氨基酸序列同一性的M2-2蛋白。本发明提供了哺乳动物MPV的两个亚组，A亚组和B亚组。本发明还提供了4种变种Al、A2、B1和B2。一种哺乳动物MPV如果与分离林00-l(SEQIDNO:19)的系统发育学关系比与分离林99-1(SEQIDNO:18)更密切，那么就可以认定其为A亚组的成员。一种哺乳动物MPV如果与分离林99-1(SEQIDNO:18)的系统发育学关系比00-l(SEQIDNO:19)与分离林更密切，那么就可以认定其为B亚组的成员。在其它实施方案中，个体ORF的核苷酸或氨基酸序列同源性可用于划分哺乳动物MPV是属于A亚组或者B亚组。哺乳动物MPV的分离林可以划分为4种不同变种，变种Al、A2、Bl和B2(参见，图21和22)。分离林00-1(SEQIDNO:19)是哺乳动物MPV变种Al的一个实例。分离林99-l(SEQIDNO:18)是哺乳动物MPV变种Bl的一个实例。使用系统发育分析可将哺乳动物MPV归类到4种变种之一。因此，如果一种哺乳动物MPV与哺乳动物MPV—种变种已知成员与哺乳动物MPV另一种变种已知成员的系统发育相关程度更密切，那么就可认为该哺乳动物MPV属于这一特定种类的变种。任一ORF的序列及其编码的多肽可用于将MPV分型入具体的亚组或变种，包括N,P，L，M，SH，G，M2或F多肽。一个具体实施方案中，哺乳动物MPV是根据G蛋白的序列进行变种的划分。不受理论的束绰，G蛋白序列特别适于系统发育分析，因为在哺乳动物MPV不同变种之间G蛋白的变化程度很高。在本发明的在一些实施方案中，序列同源性可以根据两序列在一些条件下杂交的能力来测定，如下文所述。能够与哺乳动物MPV核酸杂交，或能与其反向互补链杂交，或能与其互补链杂交的核酸可用于本发明的方法，测定彼此间的序列同源性。在一些实施方案中，所述核酸能够在高度严格条件下杂交。本领域技术人员众所周知杂交条件，例如，但不限于，温度、盐浓度、pH、甲酰胺浓度(参见，例如，Sambrook等人，1989，第9-11章，MolecularCloning,ALaboratoryManual,2dEd.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork,在此引入作为参考)。在一些实施方案中，杂交是在水溶液中完成的，溶液离子强度保持恒定，而杂交温度随待杂交序列间同源性不同而作出调整。对于彼此100%相同以及长度大于200碱基对的DNA序列而言，杂交应当在低于最佳杂合体解链温度(Tm)约15-25。C的温度下进行。解链温度(Tm)可以用下列公式计算出来(BoltonandMcCarthy,1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:1390):Tm=81.5°C-16.6(1ogl0[Na+)+(%G+C)-0.63(%曱酰胺)-(600/1)，其中(Tm)是解链温度，[Na+为钠浓度，G+C是鸟嘌呤和胞嘧啶的含量，l为杂交碱基对的长度。序列间的错配结果可以用Bonner等人的公式(Bonner等人，1973，J.Mol.Biol.81:123-135)计算当杂交体中每错配1%碱基，那么解链温度便降低1-1.5。C。因此，通过测定两序列杂交的温度，本领域技术人员就能测算出一序列与已知序列间的相似度。这一点可以通过例如将根据经验确定的杂交温度与从最佳匹配杂交的已知序列计算出来的温度进行比较来完成。通过使用Bonner等人的公式，杂交温度和错配百分比之间的相关程度可以用于提供序列相似度的有关信息。例如但不限于，使用下述高严格度条件的方法。含有DNA的滤膜在由下述成分组成的緩冲液中于65°C预杂交8小时至过夜6XSSC，50mMTris-HCI(pH7.5)，1mMEDTA，0.02%PVP，0.02%Ficoll,0.02%BSA和500pg/ml变性鲑精DNA。然后将滤膜在含有lOOjig/ml鲑精DNA和5-20X106cpm"P-标记探针的预杂交混合物中于65°C下杂交48小时。将膜在含有下列成分的溶液中37°C下洗涤l小时2XSSC，0.01。/oPVP，0.01%Ficoll和0.010/0BSA。接着在0.1XSSC中50°C下洗涤45分钟，然后进行放射自显影。其它可以使用的高度严格条件已为本领域技术人员所熟知。本发明的其它实施方案中，杂交是在中度或低度严格条件下进行的，这些条件已为本领域技术人员所熟知(参见，例如，Sambrook等人，1989，MolecularCloning，ALaboratoryManual，2dEd.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork;还参见，Ausubel等人，eds"intheCurrentProtocolsinMolecularBiologyseriesoflaboratorytechniquemanuals,1987-1997CurrentProtocols,(D1994-1997JohnWileyandSons,Inc.,所有文献在此引入作为参考)。一种举例性低度严格条件是由下述緩冲液系统提供的在含有35%曱酰胺，5XSSC，50mMTris-HCI(pH7.5)，5mMEDTA，0.02%PVP，0.02%Ficoll，0.2%BSA,lOOjig/ml变性鲑精DNA，和10。/o(wt/vo1)硫酸葡聚糖的緩冲液中于40°C下杂交18-20小时，然后在下述组成的緩冲液中于55°C下洗涤1.5小时2XSSC、25mMTris-HCI(pH7.4)、5mMEDTA和0."/0SDS;在下述组成的緩冲液中于60°C下洗涤1.5小时2XSSC、25mMTris-HCI(pH7.4)、5mMEDTA和0.1%SDS。在一些实施方案中，可以使用特异于哺乳动物MPV特定种类变种的探针，将哺乳动物MPV归类为变种中的一种。所述探针包括RT-PCR引物和抗体。用于鉴定哺乳动物MPV为特定变种成员的范例性方法描述见下文章节。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV不同变种可以通过不同病毒蛋白的氨基酸序列彼此区分开来(参见，例如，图42b)。在其它实施方案中，哺乳动物MPV不同变种可以通过病毒基因组编码ORF的核苷酸序列彼此区分开来(参见，例如，图42b)。哺乳动物MPV的变种可以是，但不限于，Al、A2、Bl或B2。但是，本发明还涉及是另一有待鉴定变种成员的哺乳动物MPV分离林。本发明还涉及具有与一变种较相关的一种或多种ORF的病毒，和具有与另一变种系统发育学上较相关的一种或多种ORF的病毒。这样的病毒应该被归类为这样的变种，即其大部分ORF在系统发育上都较相关。也可用非编码序列测定系统发育相关程度。一种哺乳动物MPV如果与病毒分离林NL/1/99(SEQIDNO:18)比与下列任一其它病毒分离抹在系统发育上更相关，那么该病毒就可被归类为Bl变种NL/l/00(SEQIDNO:19),NL/17/00(SEQIDNO:20)和NL/1/94(SEQIDNO:21)。可以利用哺乳动物MPV的一个或多个ORF将哺乳动物MPV划分为变种。一种哺乳动物MPV满足下述条件就可将其划分为MPVBl变种如果其G蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVBl变种代表性原型毒株NL/1/99G蛋白(SEQIDNO:324)之间的同一性为至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%或至少99.5%;如果其N蛋白氨基酸序列与哺乳动物MPVBl变种代表性原型毒林NL/1/99N蛋白(SEQIDNO:368)之间的同一性为至少98.5°/。、或至少99%或至少99.5%;如果其P蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVBl变种代表性原型毒林NL/1/99P蛋白(SEQIDNO:376)之间的同一性为至少96%、至少98%、或至少99%、或至少99.5%;如果其M蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVBl变种代表性原型毒林NL/1/99M蛋白(SEQIDNO:360)相同；如果其F蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVBl变种代表性原型毒林NL/1/99F蛋白(SEQIDNO:316)之间的同一性为至少99%;如果其M2-l蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVB1变种代表性原型毒林NL/1/99M2-l蛋白(SEQIDNO:340)之间的同一性为至少98%、或至少99%、或至少99.5%;如果其M2-2蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVBl变种代表性原型毒林NL/1/99M2-2蛋白(SEQIDNO:348)之间的同一性为至少99%或至少99.5%;如果其SH蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVBl变种代表性原型毒林NL/1/99SH蛋白(SEQIDNO:384)之间的同一性为至少83%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%;和/或如果其L蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVBl变种代表性原型毒林NL/1/99L蛋白(SEQIDNO:332)之间的同一性为至少99%或至少99.5%。一种哺乳动物MPV如果与病毒分离林NL/1/00(SEQIDNO:19)比与下列任一其它病毒分离株在系统发育上更相关，那么该病毒就可被归类为Al变种NL/l/99(SEQIDNO:18)，NL/17/00(SEQIDNO:20)和NL/1/94(SEQIDNO:21)。可以利用哺乳动物MPV的一个或多个ORF将哺乳动物MPV划分为变种。一种哺乳动物MPV满足下述条件就可将其划分为MPVAl变种如果其G蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVA1变种代表性原型毒林NL/1/00G蛋白(SEQIDNO:322)之间的同一性为至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%或至少99.5%;如果其N蛋白氨基酸序列与哺乳动物MPVAl变种代表性原型毒林NL/1/00N蛋白(SEQIDNO:366)之间的同一性为至少99.5%;如果其P蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVAl变种代表性原型毒林NL/1/00P蛋白(SEQIDNO:374)之间的同一性为至少96%、至少98%、或至少99%、或至少99.5%;如果其M蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVAl变种代表性原型毒林NL/l/OOM蛋白(SEQIDNO:358)之间的同一性为至少99%或至少99.5%;如果其F蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVAl变种代表性原型毒林NL/1/00F蛋白(SEQIDNO:314)之间的同一性为至少98%或至少99%或至少99.5%;如杲其M2-l蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVAl变种代表性原型毒林NL/1/00M2-l蛋白(SEQIDNO:338)之间的同一性为至少99°/。、或至少99.5%;如果其M2-2蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVAl变种代表性原型毒林NL/1/00M2-2蛋白(SEQIDNO:346)之间的同一性为至少96%或至少99%或至少99.5°/。；如果其SH蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVAl变种代表性原型毒林NL/1/00SH蛋白(SEQIDNO:382)之间的同一性为至少84%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%;和/或如果其L蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVAl变种代表性原型毒林NL/1/00L蛋白(SEQIDNO:330)之间的同一性为至少99°/。或至少99.5%。一种哺乳动物MPV如果与病毒分离林NL/17/00(SEQIDNO:20)比与下列任一其它病毒分离林在系统发育上更相关，那么该病毒就可被归类为A2变种NL/1/99(SEQIDNO:18)、NL/1/00(SEQIDNO:19)和NL/1/94(SEQIDNO:21)。可以利用哺乳动物MPV的一个或多个ORF将哺乳动物MPV划分为变种。一种哺乳动物MPV满足下述条件就可将其划分为A2变种如果其G蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVA2变种代表性原型毒林NL/17/00G蛋白(SEQIDNO:332)之间的同一性为至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%或至少99.5%;如果其N蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVA2变种代表性原型毒林NL/17/00N蛋白(SEQIDNO:367)之间的同一性为至少99.5%;如果其P蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVA2变种代表性原型毒林NL/17/00P蛋白(SEQIDNO:375)之间的同一性为至少96%、至少98°/、至少99%或至少99.5%;如果其M蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVA2变种代表性原型毒林NL/17/00M蛋白(SEQIDNO:359)之间的同一性为至少99%或至少99.5%;如果其F蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVA2变种代表性原型毒林NL/17/00F蛋白(SEQIDNO:315)之间的同一'性为至少98%、至少99%或至少99.5%;如果其M2-l蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVA2变种代表性原型毒林NL/17/00M2-l蛋白(SEQIDNO:339)之间的同一性为至少99%或至少99.5%;如果其M2-2蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVA2变种代表性原型毒林NL/17/00M2-2蛋白(SEQIDNO:347)之间的同一性为至少96%、至少98%、至少99%或至少99.5%;如果其SH蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVA2变种代表性原型毒林NL/17/00SH蛋白(SEQIDNO:383)之间的同一性为至少84%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%;如果其L蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVA2变种代表性原型毒林NL/17/00L蛋白(SEQIDNO:331)之间的同一性为至少99°/或至少99.5%。一种哺乳动物MPV如果与病毒分离林NL/1/94(SEQIDNO:21)比与下列任一其它病毒分离林在系统发育上更相关，那么该病毒就可被归类为B2变种NL/1/99(SEQIDNO:18)，NL/1/00(SEQIDNO:19)和NL/17/00(SEQIDNO:20)。可以利用哺乳动物MPV的一个或多个ORF将哺乳动物MPV划分为变种。一种哺乳动物MPV满足下述条件就可将其划分为MPVB2变种如果其G蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVB2变种代表性原型毒株NL/1/94G蛋白(SEQIDNO:325)之间的同一性为至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、或至少99%或至少99.5%;如果其N蛋白氨基酸序列与哺乳动物MPVB2变种代表性原型毒林NL/1/94N蛋白(SEQIDNO:369)之间的同一性为至少99%或至少99.5%;如果其P蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVB2变种代表性原型毒林NL/1/94P蛋白(SEQIDNO:377)之间的同一性为至少96%、至少98%、或至少99%、或至少99.5%;如果其M蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVB2变种代表性原型毒株NL/1/94M蛋白(SEQIDNO:361)相同；如果其F蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVB2变种代表性原型毒林NL/1/94F蛋白(SEQIDNO:317)之间的同一性为至少99%或至少99.5%;如果其M2-l蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVB2变种代表性原型毒林NL/1/94M2-l蛋白(SEQIDNO:341)之间的同一性为至少98%、或至少99%、或至少99.5%;如果其M2-2蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVB2变种代表性原型毒株NL/1/94M2-2蛋白(SEQIDNO:349)之间的同一性为至少99%或至少99.5%;如果其SH蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVB2变种代表性原型毒林NL/1/94SH蛋白(SEQIDNO:385)之间的同一性为至少84%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%;和/或如果其L蛋白的氨基酸序列与哺乳动物MPVB2变种代表性原型毒林NL/1/94L蛋白(SEQIDNO:333)之间的同一性为至少99%或至少99.5%。在一些实施方案中，序列同一性百分比是根据蛋白全长序列比对得到的。其它实施方案中，序列同一性百分比是根据蛋白连续氨基酸序列比对得到的。其中所述氨基酸序列的长度可以是25个氨基酸、50个氨基酸、75个氨基酸、100个氨基酸、125个氨基酸、150个氨基酸、175个氨基酸、200个氨基酸、225个氨基酸、250个氨基酸、275个氨基酸、300个氨基酸、325个氨基酸、350个氨基酸、375个氨基酸、400个氨基酸、425个氨基酸、450个氨基酸、475个氨基酸、500个氨基酸、750个氨基酸、1000个氨基酸、1250个氨基酸、1500个氨基酸、1750个氨基酸、2000氨基酸或2250个氨基酸。5.2哺乳动物MPV的功能特性除了哺乳动物MPV的结构特性外，哺乳动物MPV还可通过功能特性来限定。在一些实施方案中，本发明的哺乳动物MPV能够感染哺乳动物宿主。所述哺乳动物宿主可以是哺乳动物细胞、组织、器官或哺乳动物。一个具体实施方案中，所述哺乳动物宿主是人或人细胞、组织或器官。本领域技术人员已知的任一方法都可用于检测哺乳动物是否已经感染了哺乳动物MPV。在一些实施方案中，对病毒粘附哺乳动物细胞的能力进行了测试。其它实施方案中，对病毒将其基因组转入哺乳动物细胞的能力进行了测试。在一个范例性的实施方案中，病毒的基因组做了可检测的标记，例如放射性标记。然后将该病毒与哺乳动物细胞孵育至少1分钟、至少5分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少5小时、至少12小时或至少1天。然后洗涤细胞将任一病毒颗粒从细胞中移出，然后利用可检测标记物检测细胞中病毒基因组的存在。另一实施方案中，用哺乳动物MPV特异性引物通过RT-PCR检测细胞中病毒基因组的存在。(参见，PCTWO02/057302第37-44，在此引入作为参考)。在一些实施方案中，哺乳动物病毒能够感染哺乳动物宿主使得哺乳动物MPV蛋白插入到哺乳动物宿主的细胞质膜。所述哺乳动物宿主可以是培养的哺乳动物细胞、器官、组织或哺乳动物。在一个范例性实施方案中，用哺乳动物病毒孵育哺乳动物细胞。随后在能从细胞表面移出病毒的条件下洗涤细胞。本领域技术人员任一已知技术都可以用于检测插入于哺乳动物细胞的细胞质膜中的新表达的病毒蛋白。例如，细胞被病毒表达后，将细胞保持在含有可检测标记氨基酸的培养基中。然后收获细胞，裂解，将细胞质级分同膜级分分离开来。然后溶解膜级分中的蛋白质，然后用哺乳动物MPV蛋白的特异性抗体进行免疫沉淀，所述蛋白是例如，但不限于F蛋白或G蛋白。然后将免疫沉淀的蛋白进行SDS-PAGE分析。然后可通过放射自显影检测病毒蛋白的存在。在另一实施方案中，可以通过使用哺乳动物MPV蛋白的一种或多种特异性抗体的免疫细胞化学试验检测宿主细胞的细胞质膜中病毒蛋白的存在。在其他实施方案中，本发明的哺乳动物MPV能够感染哺乳动物宿主，并能在哺乳动物宿主中复制。所述哺乳动物宿主可以是培养的哺乳动物细胞、器官、组织或哺乳动物。本领域技术人员任一已知技术都可用于测定病毒能否感染哺乳动物细胞以及能否在哺乳动物宿主中复制。在一个特定实施方案中，用病毒感染哺乳动物细胞。然后将该细胞保持至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少5小时、至少12小时、至少1天或至少2天。细胞中病毒基因组RNA的水平可以通过Northern印迹、RT-PCR或使用特异于病毒基因组的原位杂交来检测。病毒基因组RNA的提高表明该病毒能感染哺乳动物细胞并能在哺乳动物细胞中复制。在其他实施方案中，本发明的哺乳动物MPV能够感染哺乳动物宿主，其中所述感染能导致所述哺乳动物宿主产生新的感染性哺乳动物MPV。所述哺乳动物宿主可以是培养的哺乳动物细胞或哺乳动物。本领域技术人员任一已知技术都可用于测定病毒能否感染哺乳动物细胞以及能否导致哺乳动物宿主产生新的感染性病毒颗粒。一个特定实施例中，用病毒感染哺乳动物细胞。然后洗涤该细胞并培养至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少5小时、至少12小时、至少1天，至少2天，至少1周，或至少12天。病毒滴度可以用本领域技术人员任一已知方法测定。范例性方法见章节5.8。在一些特定实施方案中，所述哺乳动物MPV是人MPV。该章节中描述的试验也可用人MPV完成。在一些实施方案中，人MPV能够感染哺乳动物宿主，例如哺乳动物或哺乳动物培养细胞。在一些实施方案中，人MPV能够感染哺乳动物宿主使得人MPV蛋白插入到哺乳动物宿主的细胞质膜。在另一实施方案中，本发明的人MPV能够感染哺乳动物宿主并在哺乳动物宿主中复制。在另一实施方案中，本发明的人MPV能够感染哺乳动物宿主，并能在所述哺乳动物宿主中复制，其中所述感染和复制导致所述哺乳动物宿主产生及包装新的感染性人MPV。在一些实施方案中，哺乳动物MPV，即使其能够感染哺乳动物宿主，但是还能感染禽类宿主，例如禽类或禽类培养细胞。在一些实施方案中，哺乳动物MPV能够感染禽类宿主使得哺乳动物MPV蛋白插入到禽类宿主的细胞质膜。另一实施方案中，本发明的哺乳动物MPV能够感染禽类宿主，并能在所述禽类宿主中复制。另在一些实施方案中，本发明的哺乳动物MPV能够感染禽类宿主，并能在所述禽类宿主中复制，其中所述感染和复制使得所述禽类宿主产生及包装出新的感染性哺乳动物MPV。5.3重组及嵌合间质肺病毒本发明涉及源自间质肺病毒基因组的病毒栽体编码的重组或嵌合病毒，包括哺乳动物和禽类变种。本发明所述的重组病毒是一种源自哺乳动物MPV或APV的由内源或天然基因组序列或非天然基因组序列编码的病毒。本发明所述的非天然序列是指由于一处或多处突变而有别于天然或内源基因组序列的序列，包括但不限于基因组序列中能或不会导致表型改变的点突变、重排、插入、缺失等。本发明所述的重组病毒包括那些由源自间质肺病毒基因组的病毒载体编码的病毒，包括哺乳动物和禽类变种，可包括或不包括相对于病毒基因组为非天然的核酸。本发明所述的源自间质肺病毒基因组的病毒载体中含有编码哺乳动物间质肺病毒1个ORF至少一部分的核酸，其中该ORF编码的多肽具有的氨基酸序列同一性列于章节5丄上文，和表l。本发明所述的重组病毒包括由源自哺乳动物间质肺病毒(MPV)，具体为人间质肺病毒基因组的病毒载体编码的病毒。在本发明具体实施方案中，病毒栽体源自间质肺病毒Al、A2、Bl或B2变种的基因组。根据本发明，这些病毒载体可以含有或也可以不含有相对于病毒基因组为非天然的核酸。本发明所述的重组病毒包括由源自禽类间质肺病毒(MPV)基因组的病毒载体编码的病毒，其中禽类间质肺病毒又称火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)。在本发明具体实施方案中，病毒载体源自APVA、B、C或D亚组的基因组。在一个优选实施方案中，病毒栽体源自APVC亚组的基因组。根据本发明，这些病毒栽体可以含有或也可以不含有相对于病毒基因组为非天然的核酸。在另一优选实施方案中，本发明的重组病毒包括那些由源自APV基因组的病毒栽体编码的病毒，该病毒载体中含有编码APVC亚组的F-ORF的核酸序列。在一些实施方案中，源自APV基因组的病毒栽体中含有编码至少APV的N-ORF、P-ORF、M-ORF、F-ORF、M2-l-ORF、M2-2-ORF或L-ORF的核酸序列。本发明所述的嵌合病毒是一种重组的MPV或APV，其中另含有异源核苦酸序列。本发明所述的嵌合病毒是由具有下述特性的核香酸序列序列编码基因组中添加了异源核苷酸序列或者基因组中的内源或天然核苷酸序列被异源核苷酸序列所替换。本发明所述的嵌合病毒是由本发明的病毒栽体编码的嵌合病毒，该病毒载体另外含有源核苷酸序列。本发明所述的嵌合病毒是由病毒载体编码的，该病毒栽体可以包括或不包括相对于病毒基因组为非天然的核酸。本发明所述的嵌合病毒是由病毒栽体编码的，该病毒栽体中添加、插入或替换了天然或非天然序列。本发明所述的嵌合病毒可以由源自不同哺乳动物MPV分离林的核苷酸序列编码。具体而言，所述嵌合病毒是由编码源自MPV不同毒林的抗原性多肽的核普酸序列编码的。本发明所述的嵌合病毒可由源自APV，特别是C亚组的基因组的病毒载体编码，该病毒载体另外含有编码源自一或多林MPV的抗原性多肽的异源序列。嵌合病毒可以用于制备重组疫苗预防两种或多种病毒(Tao等人，J.Viro1.72,2955-2961;Durbin等人，2000，J.Virol.74，6821-6831;Skiadopoulos等人，1998，J.Virol.72，1762-1768;Teng等人，2000，J.Virol.74，9317-9321)，例如，可以预见，表达另一种负链RNA病毒如RSV的一种或多种蛋白的MPV或APV病毒栽体，或者表达MPV一种或多种蛋白的RSV栽体，它们都可以保护接种了所述栽体的个体免受两种病毒的感染。可以预见类似操作也适用于PIV或其它副粘病毒。减毒及复制缺陷病毒可作为活疫苗用于接种目的，这一点在其它病毒已有描述(参见，PCTWO02/057302，pp.6和23，在此引入作为参考)。本发明所述的掺入编码重组或嵌合病毒的病毒栽体的异源序列包括获自或源自间质肺病毒、禽类肺病毒及其它负链RNA病毒不同林的序列，包括，但不限于，RSV、PIV和流感病毒，以及其它病毒，包括麻渗病毒。在本发明的一些实施方案中，本发明所述的嵌合或重组病毒是由源自病毒基因组的病毒载体编码的，该病毒栽体中一个或多个序列、基因间隔区、终止序列、或者部分或完整ORF已被异源或非天然序列所替换。本发明的在一些实施方案中，本发明所述的嵌合或重组病毒是由源自病毒基因组的病毒载体编码的，其中该载体中已加入了一个或多个异源序列。在一些实施方案中，本发明所述的病毒含有异源核酸。在一个优选实施方案中，所述异源核苷酸序列插入或加入病毒基因组的位置1。另一个优选实施方案中，所述异源核苷酸序列插入或加入病毒基因组的位置2。一个优选实施方案中，所述异源核苷酸序列插入或加入病毒基因组的位置3。由于病毒基因组存在转录梯度，所以异源核脊酸序列插入或添加在序号靠前位置比插入在序号靠后位置表达水平更强或更高。因此如果期望异源核苷酸序列高水平表达，那么在序号靠前的位置插入或添加异源核苷酸序列是本发明的优选实施方案。不受理论限制，异源序列插入或添加的位置影响重组或嵌合病毒的复制率。如果将异源序列插入或添加到病毒基因组的位置2或位置1，就可以实现较高的复制率。如果将异源序列插入或添加到病毒基因组的位置3、位置4、位置5或位置6，复制率下降。不受理论的限制，病毒基因和异源序列之间的基因间隔区的大小也决定病毒的复制率和异源序列的表达水平。在一些实施方案中，本发明的病毒载体含有两种或多种不同异源核苷酸序列。一个优选实施方案中，一个异源核苷酸序列位于病毒基因组的位置1，第二异源核苷酸序列位于病毒基因组的位置2。另一优选实施方案中，一个异源核苷酸序列位于病毒基因组的位置1，第二异源核苷酸序列位于病毒基因组的位置3。另一优选实施方案中，一个异源核苷酸序列位于病毒基因组的位置2，第二异源核苷酸序列位于病毒基因组的位置3。另在一些实施方案中，异源核苷酸序列被插入病毒基因组中其它序号更靠后的位置。本发明中，异源序列的位置是指该序列从病毒基因组转录的顺序，例如，位置1的异源序列是从病毒基因组转录的第一个基因序列。病毒栽体的选择取决于被治疗或预防病毒感染的个体的物种。如果个体是人，那么可以用减毒的哺乳动物间质肺病毒或禽类肺病毒提供抗原序列。在本发明中，可以构建病毒载体提供抗原序列赋予抗间质肺病毒感染的保护，包括源自哺乳动物间质肺病毒、人间质肺病毒、MPV变种A1、A2、B1或B2的序列，源自禽类肺病毒，包括APV亚组A，B，C或D的序列，尽管C是优选的。可以构建病毒栽体提供抗原序列赋予抗另一病毒感染的保护，包括负链RNA病毒，包括流感、RSV或PIV，包括PIV3。可以构建病毒栽体提供1、2、3或多个抗原序列。本发明所述的抗原序列可以源自同一病毒，源自同一型病毒不同林或不同变种，或源自不同病毒，包括麻渗病毒。在本发明的一些实施方案中，插入本发明病毒基因组内的异源核苷酸序列源自间质肺病毒。在本发明的一具体实施方案中，异源核苷酸序列源自人间质肺病毒。在另一具体实施方案中，异源核苷酸序列源自禽类肺病毒。更具体地，本发明的异源核苷酸序列编码人间质肺病毒的F基因。更具体地，本发明的异源核苷酸序列编码人间质肺病毒的G基因。更具体地，本发明的异源核苷酸序列编码禽类间质肺病毒的F基因。更具体地，本发明的异源核苷酸序列编码禽类间质肺病毒的G基因。在具体实施方案中，异源核苷酸序列可以是SEQIDNO:1至SEQIDNO:5、SEQIDNO:14和SEQIDNO:15中的任一序列。一些具体实施方案中，异源核苷酸序列编码SEQIDNO:6至SEQIDNO:13、SEQIDNO:16和SEQIDNO:17中的任一蛋白。在本发明的一个具体实施方案中，异源核苷酸序列编码嵌合F蛋白。在一个范例性实施方案中，嵌合F-蛋白的胞外结构域是人MPV胞外结构域，而跨膜结构域及鲁米那(luminal)结构域源自禽类间质肺病毒F-蛋白。不受理论的限制，一种编码由人胞外结构域和禽鲁米那/跨膜结构域组成的嵌合F蛋白的嵌合人MPV，由于F蛋白中的禽源部分所以它是是减毒的，而由于人的胞外结构域，所以它是高免疫原性的。在一些实施方案中，将两个不同的异源核苷酸序列插入或添加到源自间质肺病毒，包括哺乳动物和禽类间质肺病毒的基因组的病毒栽体中。例如，所述异源核苷酸序列是源自人间质肺病毒、禽类肺病毒、RSV、PIV或流感病毒。在一个优选实施方案中，所述异源序列分别编码人间质肺病毒，禽类肺病毒，RSV或PIV的F蛋白。另一个实施方案中，所述异源序列编码流感病毒的HA蛋白。在一些实施方案中，本发明的病毒载体中含有两个不同的异源核苷酸序列，其中第一异源核苷酸序列源自间质肺病毒，例如人间质肺病毒或禽类肺病毒，第二核苷酸序列源自呼吸道合胞病毒(见表2)。在具体实施方案中，所述源自呼吸道合胞病毒的异源核苷酸序列是呼吸道合胞病毒的F基因。其它具体实施方案中，所述源自呼吸道合胞病毒的异源核苷酸序列是呼吸道合胞病毒的G基因。一个具体实施方案中，源自间质肺病毒的异源核苷酸序列与源自呼吸道合胞病毒的异源核苷酸序列相比，插入到序号更为靠前的位置处。另一具体实施方案中，源自间质肺病毒的异源核苷酸序列与源自呼吸道合胞病毒的异源核苷酸序列相比，插入到序号更为靠后的位置处。在一些实施方案中，本发明的病毒含有两个不同的异源核苷酸序列，其中第一异源核苷酸序列源自间质肺病毒，例如人间质肺病毒或禽类肺病毒，第二核苷酸序列源自副流感病毒，例如但不限于PIV3(见表2)。在具体实施方案中，所述源自PIV的异源核苷酸序列是PIV的F基因。其它具体实施方案中，所述源自PIV的异源核苷酸序列是PIV的G基因。一个具体实施方案中，源自间质肺病毒的异源核苷酸序列与源自PIV的异源核苷酸序列相比，插入到序号更为靠前的位置处。另一具体实施方案中，源自间质肺病毒的异源核苷酸序列与源自PIV的异源核苷酸序列相比，插入到序号更为靠后的位置处。本发明中的表达产物以及/或者重组或嵌合毒粒可以有效的用于疫苗制剂。本发明中的表达产物以及/或者重组或嵌合毒粒可以构建制造成抗广谦病原体的疫苗，包括病毒和细菌抗原、肿瘤抗原、变应原抗原和自身免疫疾病涉及的自身抗原。具体而言，本发明所述的嵌合毒粒可以构建制造出保护个体免受PIV、RSV和/或间质肺病毒感染。在另一实施方案中，本发明所述的嵌合毒粒可以工程改造以产生抗-HIV疫苗，其中将源自HIVgpl60和/或源自内源蛋白的免疫原性多肽构建入糖蛋白HN蛋白构建出能激发脊推动物体液免疫应答和细胞介导免疫应答。在另一实施方案中，本发明涉及经工程改造而编码突变抗原的重组间质肺病毒载体和病毒。突变抗原相对于其所起源的野生型病毒蛋白具有至少一个氨基酸替换、缺失或添加。在一些实施方案中，本发明涉及含有本发明重组或嵌合病毒的三价疫苗。在一个具体实施方案中，用于三价疫苗核心的病毒为嵌合禽-人间质肺病毒或嵌合人-禽类间质肺病毒，其中所述嵌合病毒含有源自RSV的第一异源核苷酸序列和源自PIV的第二异源核苷酸序列。在一个范例性实施方案中，所述三价疫苗特异性含有下述成分(a)人间质肺病毒或禽类肺病毒的F基因和/或G基因，这取决于使用的是嵌合禽类-人还是嵌合人-禽类间质肺病毒；(b)源自RSV的异源核苷酸序列编码的蛋白质；以及(c)源自PIV的异源核苷酸序列编码的蛋白质。在一个具体实施方案中，所述第一异源核苷酸序列是呼吸道合胞病毒的F基因且被插入位置1，第二异源核苷酸序列为PIV的F基因且被插入位置3。本发明包含许多种组合，表2中例举了其中的一些。另外，编码嵌合F蛋白的核苷酸序列也可使用(参见，同上)。在一些较不优选的实施方案中，可将异源核苷酸序列插入病毒基因组中较为靠后的位置。表2.三价疫苗中所使用病毒异源核苷酸序列排列实例。<table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table>在一些实施方案中，本发明的表达产物以及重组或嵌合毒粒可被工程改造以产生抗多种病原的疫苗，包括病毒抗原、肿瘤抗原以及自身免疫疾病中的自身抗原。实现这一目标的一种方法包括修饰现存间质肺病毒基因使其相应外显结构域中包含外源序列。其中所述外源序列是病原体的表位或抗原，这些嵌合病毒可被用来诱导抗这些决定簇所来源的致病因子的保护性免疫应答。因此，本发明涉及使用病毒载体以及重组或嵌合病毒配置疫苗抗多种病毒和/或抗原。本发明的病毒载体及嵌合病毒可用于调节个体免疫系统，通过刺激体液免疫应答、细胞免疫应答或者通过激发对抗原的耐受。本发明中，个体是指人、灵长类、马、牛、羊、猪、山羊、狗、猫、禽类和啮齿类。将本发明分为下述阶段只是为了描述的方便，而不应形成对本发明的限制(a)构建重组cDNA和RNA模板；(b)使用重组cDNA和RNA模板表达异源基因产物；(c)在重组病毒颗粒中拯救异源基因；以及(d)制备和使用含有本发明重组病毒颗粒的疫苗。5.4重组cDNA和RNA构建在一些实施方案中，病毒栽体源自本发明的人或哺乳动物间质肺病毒基因组。在其他实施方案中，病毒载体源自禽类肺病毒基因组。在一些实施方案中，病毒载体含有源自哺乳动物MPV和APV的序列，所述病毒栽体编码嵌合的人MPV/APV病毒。在一个范例实施方案中，人间质肺病毒F-基因和/或G-基因被禽类肺病毒F-基因和/或G-基因替换用于构建嵌合的hMPV/APV病毒。在其他实施方案中，病毒载体含有源自APV和哺乳动物MPV的序列，所述病毒载体编码嵌合的APV/hMPV病毒。在更加范例的实施方案中，禽类肺病毒的F-基因和/或G-基因被人间质肺病毒的F-基因和/或G-基因替换用于构建嵌合的APV/hMPV病毒。本发明也涉及包含源自哺乳动物MPV或APV基因组病毒的栽体的重组病毒，所述病毒载体含有内源或天然病毒基因组序列，和可以含有或可以不含有相对于病毒基因组是非天然的序列。非天然序列包本发明的重组病毒含有源自病毒的序列，所述病毒具有更适合用于疫苗制剂的表型，如，减毒表型或增强的抗原性。突变和修饰可存在于病毒编码区、基因间隔区和前导及尾随序列中。在一些实施方案中，本发明病毒栽体包含源自hMPV、APV、hMPV/APV或APV/hMPV的核苷酸序列，其中天然核苷酸序列被异源序列所替换或天然间质肺病毒序列添加了异源序列。在一个更特定实施方案中，嵌合病毒包含源自MPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV的病毒载体，其中添加了源自PIV的异源序列。在一个更特定实施方案中，重组病毒包含源自MPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV的病毒载体，其中所述序列被源自PIV的异源序列替换。在其他特定实施方案中，嵌合病毒包含源自MPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV的病毒栽体，其中添加了源自RSV的异源序列。在一个更特定实施方案中，嵌合病毒包含源自MPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV的病毒栽体，其中所述序列被源自RSV的异源序列替换。通过病毒聚合酶结合位点/启动子的互补链，如本发明的3'-hMPV病毒末端互补链，或用本领域已知技术构建的3'-和5'-hMPV病毒末端互补链，异源基因编码序列被侧接。在更特定实施方案中，本发明重组病毒含有hMPV或APV的前导和尾随序列。在一些实施方案中，基因间隔区源自hMPV或APV。产生的RNA模板可以是负极性和含有适当的末端序列，所述末端序列可使病毒RNA合成仪识别该模板。可替换地，也可用含有适当末端序列的负极性RNA模板，所述末端序列可使病毒RNA合成仪识别该模板。通过DNA指导的RNA聚合酶，如噬菌体T7，T3，SP6聚合酶或真核聚合酶如聚合酶I和同类物，在体外或体内产生重组RNA模板，所述模板具有可使得病毒聚合酶识别和有活性的适当病毒序列，含有这些杂交序列的重组DNA分子可被克隆和转录。在更特定实施方案中，RNA聚合酶是禽痘病毒T7RNA聚合酶或MVAT7RNA聚合酶。一种构建这些杂交分子的范例方法是在hMPV、APV、APV/hMPV或hMPV/APV基因组的DNA互补链中插入异源核苷酸序列，通过病毒聚合酶活性所需的病毒序列；即，病毒聚合酶结合位点/启动子，在下文中指病毒聚合酶结合位点和多腺苷酸化位点，使异源序列侧接。在一个优逸实施方案中，通过包含5'和3'末端复制启动子、起始基因和基因结束序列及在5'和/或3'末端发现的包装信号的病毒序列，使异源编码序列侧接。在一个可替换的方法中，编码病毒聚合酶结合位点如病毒基因组片段3'末端或两末端的互补链的寡核苷酸能被连接到异源编码序列上以构建杂交分子。在靶序列中的外源基因或外源基因片段的放置是通过靶序列中所存在的适当的限制性内切酶位点而事先指定的。然而，分子生物学近来的发展已经大大减轻了这种问题。通过使用定点诱变，限制性内切酶位点能容易地被置于靶序列中的任何地方(如，参见，例如，Kunkel描述的技术，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82;488)。下文中所述的不同的聚合酶链式反应(PCR)技术也能用于序列的特定插入(即，限制性内切酶位点)并容易构建杂交分子。可替换地，PCR反应可被用于制备重组模板而无需克隆。例如，PCR反应可被用于制备含有DNA指导的RNA聚合酶启动子(如，噬菌体T3，T7或SP6)的双链DNA分子和含有异源基因和PIV聚合酶结合位点的杂交序列。然后，RNA模板能直接从该重组DNA转录。在另一个实施方案中，可以通过使用RNA连接酶将特异于异源基因负极性的RNA与病毒聚合酶结合位点连接在一起，从而制备出重组RNA模板。此外，一或更多个核苷酸可添加到非翻译区中，但要遵守"六倍法则"("RuleofSix")，所述法则对于获得病毒拯救可能是重要的。"六倍法则"应用于许多副粘病毒中并规定RNA核苷酸基因组应被6整除才有功能。完成核苷酸的添加可通过使用本领域已知技术，如使用商品化的谦变试剂盒如QuikChangei秀变试剂盒(Stratagene)。在添加适当数目核苷酸后，合适的DNA片段能接着通过用适当的限制性内切酶消化和凝胶纯化被分离。对于可用于本发明的病毒聚合酶活性及构建体的序列要求将在下面章节中进行描述。不受理论限制，一些参数影响重组病毒复制速率和异源序列表达水平。具体而言，异源序列在hMPV，APV,hMPV/APV或APV/hMPV中的位置和侧接异源序列的基因间隔区长度决定了复制速率和异源序列表达水平。在一些实施方案中，相对于野生型病毒，病毒的前导和/或尾随序列被修饰。在一些更特定实施方案中，前导和/或尾随序列的长度被改变。在其他实施方案中，相对于野生型病毒，前导和/或尾随序列被突变。更详细内容见5.7节。本发明重组病毒的产生依赖于负链病毒RNA(vRNA)基因组部分或全长拷贝或它的互补拷贝(cRNA)的复制。所述vRNA或cRNA能从有感染性的病毒中被分离，通过体外转录产生，或在细胞中通过转染核酸来产生。其次，重组负链病毒的产生依赖于功能聚合酶的复合物。典型地，但于此不受限制地，肺病毒聚合酶复合物由N，P，L和可能的M2蛋白组成。聚合酶复合物或其组分能从病毒颗粒中分离、从表达一或多种组分的细胞中分离或通过特定表达载体的转染来产生。当上述提及的vRNA，cRNA或表达这些RNAs的载体通过上述提及的聚合酶复合物16被复制时，能获得MPV的有感染力的拷贝(Schnell等人，1994，EMBOJ13:4195-4203;Collins,等人，1995，PNAS92:11563-11567;Hoffmann,等人，2000，PNAS97:6簡画6113;Bridge,等人，1996，PNAS93:15400-15404;Palese，等人，1996，PNAS93:11354-11358;Peeters，等人，1999，丄Virol.73:5001-5009;Durbin，等人，1997，Virology235:323-332)。本发明提供了一种包含本发明核酸或栽体的宿主细胞。含有MPV聚合酶组分(但于此不受限制地，估计可能是N，P，L和M2)的质粒或病毒栽体在原核细胞中产生，用于在相关细胞型(细菌、昆虫细胞、真核细胞)中表达上述组分。含有MPV基因组全长或部分拷贝的质粒或病毒载体可在原核细胞中产生，用于在体外或体内表达病毒核酸。后者的栽体可含有其它的病毒序列，用于产生嵌合病毒或嵌合病毒蛋白，可缺失部分的病毒基因组，用于产生复制缺损型病毒，和可含有用于产生减毒型病毒的突变，缺失或插入。根据上述的本领域技术，通过聚合酶组分的共表达能产生MPV的有感染力的拷贝(是野生型、减毒型、复制缺陷型或嵌合型)。此外，可使用短暂或稳定表达一种或多种全长或部分MPV蛋白的真核细胞。这样的细胞可通过转染(蛋白或核酸载体)、感染(病毒栽体)或转导(病毒载体)来获得，且可用于补偿所述野生型、减毒型、复制缺陷型或嵌合病毒。5.4.1要被插入的异源基因序列根据本发明的内容，本发明的病毒载体可进一步改造以用于表达异源序列。在本发明的一个实施方案中，异源序列的来源不同于病毒载体。作为实例，且不受限制，异源序列编码病毒的抗原蛋白、多肽或肽，该病毒属于不同于病毒栽体所源自的种、亚组或变种的不同间质肺病毒的种、亚组或变种。作为实例，且不受限制，异源序列编码不同于间质肺病毒的病毒的抗原蛋白、多肽或肽。作为实例，且不受限制，异源序列不是源病毒。根据该实施方案，异源序列可编码具有期望的生物学特性或活性的部分、肽、多肽或蛋白。所述异源序列可编码标签或标记。所述异源序列可编码生物反应调节物，包括例如，淋巴因子、白介素、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和粒细胞集落刺激因子。在一些实施方案中，要被插入的异源核苷酸序列源自间质肺病毒。具体而言，要被插入的异源核苷酸序列源自人间质肺病毒和/或禽类肺病毒。在一些实施方案中，异源序列编码PIV核壳磷蛋白、PIVL蛋白，PIV基质蛋白，PIVHN糖蛋白，PIVRNA依赖性RNA聚合酶，PIVYl蛋白，PIVD蛋白，PIVC蛋白，PIVF蛋白或PIVP蛋白。在一些实施方案中，异源核苷酸序列编码的蛋白是至少90%,至少95%，至少98%，或至少99%同源于PIV核壳磷蛋白、PIVL蛋白，PIV基质蛋白，PIVHN糖蛋白，PIVRNA依赖性RNA聚合酶，PIVYl蛋白，PIVD蛋白，PIVC蛋白，PIVF蛋白或PIVP蛋白。异源序列源自1型PIV、2型PIV或3型PIV。在更特定实施方案中，异源序列源自人1型PIV、2型PIV或3型PIV。在其他实施方案中，异源序列编码RSV核蛋白、RSV磷蛋白、RSV基质蛋白，RSV疏水小蛋白、RSVRNA依赖性RNA聚合酶，RSVF蛋白、RSVG蛋白，或RSVM2-l或M2-2蛋白。在一些实施方案中，异源序列编码的蛋白是至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源于RSV核蛋白、RSV磷蛋白、RSV基质蛋白，RSV疏水小蛋白、RSVRNA依赖的RNA聚合酶，RSVF蛋白或RSVG蛋白。异源序列源自RSV亚型A和RSV亚型B。在更特定实施方案中，异源序列源自人RSV亚型A和RSV亚型B。在其他实施方案中，异源序列编码APV核蛋白、APV磷蛋白、APV基质蛋白，APV疏水小蛋白、APVRNA依赖性RNA聚合酶、APVF蛋白、APVG蛋白或APVM2-l或M2-2蛋白。在一些实施方案中，异源序列编码的蛋白是至少90%、至少95%、至少98%，或至少99%同源于APV核蛋白、APV辯蛋白、APV基质蛋白，APV疏水小蛋白、APVRNA依赖性RNA聚合酶、APVF蛋白，或APVG蛋白。禽类肺病毒可以是APV亚组A、APV亚组B或APV亚组C。在其他实施方案中，异源序列编码hMPV核蛋白、hMPV磷蛋白、hMPV基质蛋白、hMPV疏水小蛋白、hMPVRNA依赖性RNA聚合酶、hMPVF蛋白、hMPVG蛋白或hMPVM2-l或M2-2。在一些实施方案中，异源序列编码的蛋白是至少90%、至少95%、至少98%，或至少99%同源于hMPV核蛋白、hMPV磷蛋白、hMPV基质蛋白、hMPV疏水小蛋白、hMPVRNA依赖性RNA聚合酶、hMPVF蛋白、或hMPVG蛋白。人间质肺病毒可以是hMPVAl变种，hMPVA2变种，hMPVBl变种，或hMPVB2变种。在一些实施方案中，源自PIV，RSV，人间质肺病毒或禽类肺病毒的不同异源序列的任何组合可被插入到本发明的病毒中。一些优选的本发明的实施方案中，要被插入的异源核苷酸序列源自RSV，PIV，APV或hMPV的F基因。在一些实施方案中，异源核苷酸序列编码嵌合蛋白。在更特定实施方案中，异源核苷酸序列编码RSV，PIV，APV或hMPV的嵌合F蛋白。嵌合F蛋白可包含源自不同病毒，如人间质肺病毒，禽类肺病毒，呼吸道合胞病毒和副流感病毒的F蛋白部分。在一些其他实施方案中，异源序列编码嵌合G蛋白。嵌合G蛋白包含源自不同病毒，如人间质肺病毒，禽类肺病毒，呼吸道合胞病毒和副流感病毒的G蛋白部分。在一个特定实施方案中，F蛋白包含间质肺病毒F蛋白的胞外结构域，副流感病毒F蛋白的跨膜结构域，和副流感病毒F蛋白的鲁米那结构域。在一些特定实施方案中，本发明的异源核苷酸序列是SEQIDNO:1至SEQIDNO:5，SEQIDNO:14和SEQIDNO:15中的任一序列。在一些特定实施方案中，核苷酸序列编码SEQIDNO:6至SEQIDNO:13，SEQIDNO:16，和SEQIDNO:17中任一的蛋白。源自呼吸道合胞病毒的异源核苷酸序列参见，如PCT/US98/20230，文献全文在此引入作为参考。在一个优选的实施方案中，在本发明的重组病毒中可被表达的异白，如流行性感冒病毒糖蛋白，具体而言，血凝素H5，H7，呼吸道合胞病毒表位，新城疫病毒表位，仙台病毒和传染性喉气管炎病毒(ILV)。一个优选的实施方案中，异源核苷酸序列源自RSV或PIV。也在本发明的另一个实施方案中，可改造引入本发明的嵌合病毒内的异源基因序列包括，但不限于病毒表位和病毒糖蛋白，如乙肝病毒表面抗原，甲肝或丙肝病毒表面EB病毒糖蛋白，人乳头瘤状病毒的糖蛋白，猿猴病毒5或流行性腮腺炎病毒，西尼罗河病毒，登革热病毒，疱渗病毒糖蛋白，脊髓灰质炎病毒的VPI，和源自慢病毒的序列，优选但不限于1型或2型人免疫缺陷症病毒(HIV)。也在另一个实施方案中，能被改造引入本发明嵌合病毒的异源基因序列包括，但不限于马雷克氏病疱渗病毒(MDV)表位，传染性囊病病毒(IBDV)表位，鸡贫血病毒表位，禽传染性喉气管炎病毒(ILV)，禽流感病毒(AIV)，狂犬病病毒，猫白血病病毒，犬瘟热病毒，水泡性口膜炎病毒和猪痘病毒(参见，Fields等人，(ed.)，1991,FundamentalVirology,SecondEdition,RavenPress,NewYork,文献全文在此引入作为参考)。本发明其它异源序列包括自身免疫性疾病特有的抗原。这些抗原通常来自细胞表面、细胞质、细胞核、线粒体和哺乳动物组织的同类物，包括糖尿病、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、恶性贫血、阿狄森氏综合征、硬皮症、自身免疫萎缩性胃炎、青少年糖尿病和盘状红斑性狼疮所特有的抗原。作为过敏原的抗原通常包括蛋白或糖蛋白，包括来自花粉、尘埃、霉菌、孢子、头皮屑、昆虫和食物的抗原。此外，肿瘤抗原特有的抗原通常来自细胞表面、细胞质、细胞核、细胞器和肿瘤组织细胞中的同类物。实例包括肿瘤蛋白特有的抗原，包括突变的致癌基因编码的蛋白；与肿瘤有关的病毒蛋白；和糖蛋白。肿瘤包括，但不限于那些来自以下类型的癌症唇，鼻咽，咽和口腔，食道，胃，结肠，直肠，肝，胆嚢，胰，喉，肺和支气管，皮肤黑素瘤，乳腺，子宫颈，子宫，卵巢，膀胱，肾，子宫，脑和神经系统其它部位，甲状腺，前列腺，睾丸，何杰金病，非何杰金(氏)淋巴瘤，多发性骨髄瘤和白血病。在本发明的一个特定实施方案中，异源序列源自人免疫缺陷症病毒(HIV)的基因组，优选人免疫缺陷症病毒-1或人免疫缺陷症病毒-2。在本发明的另一个实施方案中，异源编码序列可以插入病毒骨架的基因编码序列中，使在间质肺病毒蛋白中含有异源肽序列的嵌合基因产物被表达。在本发明这样一个实施方案中，异源序列也可以来自人免疫缺陷症病毒的基因组，优选人免疫缺陷症病毒-1或人免疫缺陷症病毒-2。在异源序列源自HIV的例子中，所述的序列可以包括，但不限于来自env基因(即编码gp160，gp120，和/或gp41的全部或部分的序列)，pol基因(即编码逆转录酶，核酸内切酶，蛋白酶和/或整合酶的全部或部分的序列)，gag基因(即编码p7,p6，p55，p17/18，p24/25的全部或部分的序列)，tat，rev，nef，vif，vpu，vpr，和/或vpx的序列。也在另一个实施方案中，异源基因序列能被改造引入嵌合病毒中，所述嵌合病毒包括那些编码蛋白具有免疫增强活性的病毒。免疫增强蛋白的例子包括，但不限于，细胞因子，1型干扰素，，干扰素，集落刺激因子和白介素-1、-2、-4、-5、-6、-12。此外，其它异源基因序列可被改造引入嵌合病毒中，包括来自细菌如细菌表面糖蛋白的抗原，来自真菌的抗原，和来自许多种其它病原体和寄生虫的抗原。来自细菌病原体的异源基因序列的例子包括包括，但不限于来自以下属的种的抗原沙门氏菌属，志贺菌属，衣原体属，缠绕杆菌属，耶尔森氏菌属，博德特氏菌属，假单胞菌属，奈瑟氏菌属，弧菌属，嗜血杆菌属，支原体属，链霉菌属，密螺旋体属，立克次体属，埃里希体属，布氏菌属，链杆菌属，梭-螺菌丛，螺菌属，脲原体属，螺旋体属，支原体属，放线菌类，疏螺旋体属，类杆菌属，Trichomoras，布兰汉球菌属，巴斯德菌属，梭菌属，棒状杆菌属，李斯特菌属，芽孢杆菌属，丹毒丝菌属，红球菌属，埃希氏菌属，克雷白氏杆菌属，假单胞菌属，肠杆菌属，沙雷氏菌属，葡萄球菌属，链球菌属，军团杆菌属，分枝杆菌属，变形菌属，弯曲杆菌属，肠球菌属，不动杆菌属，摩根氏菌属，莫拉氏菌属，柠檬酸杆菌属，立克次氏体属，Rochlimeae，以及如下的细菌种类铜绿假单胞菌；大肠杆菌，洋葱假单胞菌，S.epidermis,粪肠球菌，肺炎链球菌，金色链球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，酿脓链球菌，多杀巴斯德氏菌，梅毒螺旋体和奇异变形杆菌。来自致病性真菌的异源基因序列的例子包括但不限于来自如下真菌的抗原新型隐球菌；皮炎芽生菌；Aiellomycesdermatitidis;夹膜组织胞浆菌；粗球孢子菌；假丝酵母，包括白色假丝酵母，热带假丝酵母，近平滑假丝酵母，季也蒙氏假丝酵母和克鲁斯氏假丝酵母，曲霉，包括烟曲霉，红黄曲霉和黑色曲霉，根霉；根毛霉；小克银汉霉；蜱质霉，包括A.saksenaea，A.mucor和A.absidia;申氏孢子丝菌，巴西芽生菌；波氏足肿菌，光滑球拟酵母；发癣菌，小孢子菌和脚癣菌，和任何其它已知或将被鉴定具有致病性的酵母或真菌。最后，来自寄生虫的异源基因序列的例子包括但不限于来自顶复门成员的抗原，例如，巴贝西虫属，弓形体属，疟原虫属，艾美球虫属，等孢子球虫属，Atoxoplasma，嚢等孢虫属，哈蒙德虫属，贝诺孢子虫属，肉孢子虫属，弗伦克虫属，变形血原虫属，住白虫属，泰勒虫属，伯金斯虫属和簇虫；卡氏肺嚢虫；微孢子门成员的抗原，例如，小孢子虫属，肠胞虫属，脑胞内原虫属，Septata，Mrazekia，钝孢子属，格留虫属，具褶孢虫属和Microsporidiumspp.;和囊孢子虫亚门成员的抗原，例如，单孢子虫，也包括镰状痴原虫、间日痴原虫，卵形痴原虫，痴原虫；鼠弓形体；墨西哥利什曼原虫，热带利什曼原虫，硕大利什曼原虫，埃塞俄比亚利什曼原虫，杜氏利什曼原虫，克氏锥虫，布氏锥虫，曼森氏血吸虫，埃及血吸虫，日本血吸虫，旋毛虫，斑氏线虫，布鲁丝虫属；^9疾变形虫；Enterobiusvermiculoarus;猪肉绦虫，牛肉绦虫，阴道毛滴虫，人毛滴虫，口腔毛滴虫；兰伯贾第虫；小球隐孢子虫；卡式肺嚢虫，牛巴贝虫，分歧巴贝虫，果氏巴贝虫，贝氏等孢子球虫，L.Hominis;脆双核阿米巴虫；旋盘尾丝虫；蛔虫；美国板口线虫；十二指肠钩虫；粪类圃线虫；菲律宾毛细线虫；广州圓线虫；短膜壳绦虫；阔节裂头绦虫；细粒棘球绦虫，多房棘球绦虫；卫氏并殖吸虫，卡里并殖吸虫；chlonorchissinensis;opisthorchisfelineas，G.Viverini，肝片吸虫，济螨，人虱；phthirhispubis;和人皮蝇和任何其它已知或将被鉴定具有致病性的寄生虫。5.4.2异源基因序列的插入用异源序列完全替换或部分替换病毒编码区，或在病毒基因组中添加异源核苷酸序列。最好可通过使用PCR指导的突变来实现完全替换。简而言之，PCR引物A含有从5'到3'端单一限制性内切酶位点，如IIS类限制性内切酶位点(即，"移位"酶；其识别特定序列仅仅切割该序列上游或下游的DNA);—段与要被替换的基因区互补的核苷酸；和一段与异源序列的羧基末端编码区互补的核苷酸。PCR引物B含有从5'到3'端单一限制性内切酶位点；一段与要被替换的基因互补的核苷酸；和一段相应于异源或非天然基因5'编码区的核苷酸。在使用这些具有异源或非天然基因克隆拷贝引物的PCR反应后，产物可被切除并使用单一限制性位点克隆。用IIS类内切酶消化和用纯化的噬菌体聚合酶转录，将产生含有携带有异源或非天然基因插入的病毒基因正确的未翻译末端RNA分子。在另一个实施方案中，PCR引物反应可被用于制备含有噬菌体启动子序列的双链DNA，和使RNA模板能被直接转录而无须克隆的杂交基因序列。异源核苷酸序列可添加或插入到本发明病毒的不同位置。在一个实施方案中，异源核苷酸序列添加或插入到位置1。在另一个实施方案中，异源核苷酸序列添加或插入到位置2。在另一个实施方案中，异源核苷酸序列添加或插入到位置3。在另一个实施方案中，异源核苷酸序列添加或插入到位置4。在另一个实施方案中，异源核苷酸序列添加或插入到位置5。也在另一个实施方案中，异源核苷酸序列添加或插入到位置6。在本文中所用的术语"位置"指异源核苷酸序列在被转录的病毒基因组中的位置，如，位置1表示被转录的第一个基因的位置，位置2表示被转录的第二个基因的位置。相对于在越高数目位置的插入，在病毒越低数目位置插入的异源核苷酸序列通常会产生越强的异源核苷酸序列表达，其归结于存在于病毒基因组中的转录梯度。然而，转录梯度也产生特定比率的病毒mRNAs。外源基因插入将干扰该比率并导致合成不同数量的可能会影响病毒复制的病毒蛋白。因而，当选择插入位置时，转录梯度和复制动力学都要被考虑。如果期望得到强的异源核苷酸序列表达，本发明的优选实施方案是在较低数目位置插入异源核苷酸序列。一个优选实施方案中，异源序列添加或插入到位置l，2或3中。当插入异源核苷酸序列到本发明病毒中时，可改变在异源基因编码序列末端和下游基因编码序列起点之间的基因间隔区以达到期望的效果。在本文中所用的术语"基因间隔区"指在一种在基因停止信号和与其连接的下游开放阅读框编码序列的起始密码子(如，AUG)之间的核苷酸序列。基因间隔区可以包含基因的非编码区，即，在转录起始位点和基因编码序列起始位点(AUG)之间的区域。该非编码区天然存在于一些病毒基因中。在许多实施方案中，在异源核苷酸序列和下游基因之间的基因间隔区可彼此独立地被工程改造成具有至少10nt长度，至少20nt长度，至少30nt长度，至少50nt长度，至少75nt长度，至少100nt长度，至少125nt长度，至少150nt长度，至少175nt长度或至少200nt长度。在一些实施方案中，在异源核苷酸序列和下游基因之间基因的间隔区可彼此独立地被工程改造成具有至多10nt长度，至多20nt长度，至多30nt长度，至多50nt长度，至多75nt长度，至多100nt长度，至多125nt长度，至多150nt长度，至多175nt长度或至多200nt长度。在一些实施方案中，病毒基因组中期望基因的非编码区也可彼此独立地被工程改造成，具有至少10nt长度，至少20nt长度，至少30nt长度，至少50nt长度，至少75nt长度，至少100nt长度，至少125nt长度，至少150nt长度，至少175nt长度或至少200nt长度。在一些实施方案中，病毒基因组中期望基因的非编码区也可彼此独立地被工程改造成，具有至多10nt长度，至多20nt长度，至多30nt长度，至多50nt长度，至多75nt长度，至多100nt长度，至多125nt长度，至多150nt长度，至多175nt长度或至多200nt长度。当插入异源核苷酸序列时，位置的影响和基因间隔区操纵可被组合使用以达到期望的效果。例如，异源核苷酸序列可添加或插入到选自以下的位置中位置1，2，3,4，5和6，和可改变在异源核苷酸序列和与其连接的下游基因之间的基因间隔区(参见，表3)。本发明所涉及的一些组合在表3中作为例子被公开。表3.异源核苷酸序列插入方式的例子<table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>a基因间隔区，以核苷酸计算基于插入异源核苷酸序列的目的(如，具有强免疫原性)，可通过不同指标确定插入位置和插入异源核苷酸序列的基因间隔区长度，包括但不限于，复制动力学和蛋白质或mRNA表达水平，可通过以下非限制性分析实施例测定噬斑测定，荧光聚焦测定，感染中心测定，转化分析，终点稀释试验，成斑率，电子显微镜，血凝反应，测定病毒酶活性，病毒中和作用，血凝抑制反应，补体结合作用，免疫染色，免疫沉淀和免疫印迹法，酶联免疫吸附测定，核酸检测(如，DNA印迹分析，RNA印迹分析，蛋白印迹分析)，生长曲线，使用报道基因(如，使用一种报道基因，如绿色荧光蛋白(GFP)或增强型绿色荧光蛋白(eGFP)，以同样方式整合到病毒基因组中，通过蛋白表达可观察到感兴趣的异源基因)，或它们的组合。进行这些分析方法的步骤是本领域已知的(参见，如Flint等，PRINCIPLESOFVIROLOGY,MOLECULARBIOLOGY,PATHOGENESIS,ANDCONTROL,2000，ASMPresspp25-56，文献全文在此引入作为参考)，和下文中实施例部分所给出的非限制性例子。例如，用本发明病毒感染培养基中细胞，并随后测定蛋白表达水平，通过如，蛋白印迹分析或使用特异于异源序列基因产物的抗体的ELISA，或测定RNA表达水平，通过如，使用特异于异源序列探针的RNA印迹分析，表达水平可被测定。同样地，通过感染动物模型和测定来自动物模型中本发明重组病毒异源序列蛋白表达水平可测定异源序列的表达水平。通过获得来自感染动物组织样本和然后将该组ELISA可进行蛋白水平测定:此外，如果使用动物模型，通过任何本领域技术人员已知技术可测定产生自动物抗异源基因产物抗体的浓度，包括但不限于ELISA。当异源序列可能与病毒基因组中的核苷酸序列同源时，应注意探针和抗体要真正特异于异源序列或其基因产物。在一些特定实施方案中，通过任何本领域技术人员已知技术可测定来自嵌合的禽类-人间质肺病毒的hMPVF-蛋白的表达水平。通过用本发明的嵌合病毒感染培养基中的细胞和测定蛋白表达水平，通过如，蛋白质印迹分析或使用特异于hMPV的F-蛋白和/或G-蛋白的抗体的ELISA，或测定RNA的表达水平，通过如，使用特异于人间质肺病毒的F-基因和/或G-基因的探针的RNA印迹分析F-蛋白的表达水平也可被测定。同样地，使用动物模型，通过感染动物和测定动物模型中的F-蛋白和/或G-蛋白的水平，异源序列的表达水平可被测定。通过获得来自感染动物的组织样本和然后将该组织样本进行蛋白质印迹分析或使用特异于异源序列的F-蛋白和/或G-蛋白的抗体的ELISA可测定蛋白水平。此外，如果使用动物模型，通过任何本领域技术人员已知技术可测定源自动物的抗F-蛋白和/或G-蛋白的抗体滴度，包括但不限于ELISA。通过任何本领域技术人员已知技术可测定本发明重组病毒的复制速率。在一些实施方案中，为方便鉴定异源序列在病毒基因组中最佳位置和基因间隔区最佳长度，异源序列编码一个报道基因。一旦确定了最佳参数，即用编码所选择抗原的异源核苷酸序列替换上述报道基因。任何本领域技术人员已知的报道基因都能被用在本发明方法中。更详细内容，见5.8节。通过任何本领域技术人员已知标准技术可测定重组病毒复制速率。所述复制速率由病毒的生长速率代表和可通过将病毒滴度与感染后时间绘图来确定。通过任何本领域技术人员已知技术可测定病毒滴度。在一些实施方案中，含有病毒的悬浮液与病毒易感的细胞孵育。可用于本发明方法的细胞类型包括但不限于，非洲绿猴肾细胞(Verocells),LLC-MK-2细胞，Hep画2细胞，LF1043(HEL)细胞，MRC-5细胞，WI-38细胞，tMK细胞，293T细胞，QT6细胞，QT35细胞或鸡胚成纤维细胞(CEF)。在病毒与细胞孵育后，测定感染细胞的数量。一些特定实施方案中，病毒包含报道基因。因而，表达报道基因的细胞数量代表了感染细胞的数量。一个特定实施方案中，病毒包含编码eGFP的异源核苷酸序列，并FACS测定表达eGFP的细胞数量，即被病毒感染的细胞数量。在一些实施方案中，同样条件下，本发明重组病毒复制速率至多是该重组病毒所源自的野生型病毒复制速率的20%。该同样条件指相同的病毒初始滴度，相同的细胞林，相同的孵育温度，生长培养基，细胞数量和其它可能影响复制速率的测试条件。例如，在位置1具有PIV的F基因的APV/hMPV复制速率至多是APV复制速率的20%。在一些实施方案中，在同样条件下，本发明重组病毒复制速率是该重组病毒所源自的野生型病毒复制速率的至多5%，至多10%，至多20%、至多30%、至多40%、至多50%、至多75%、至多80%、至多90%。在一些实施方案中，在同样条件下，本发明重组病毒复制速率是该重组病毒所源自的野生型病毒复制速率的至少5%、至少10%、至少20°/、至少30%、至少40%、至少50%、至少75%、至少80%、至少90%。在一些实施方案中，在同样条件下，本发明重组病毒的复制速率是该重组病毒所源自的野生型病毒复制速率的5%-20%,10%-40%,25%-50%,40%-75%,50%-80%,或75%-卯％。在一些实施方案中，在同样条件下，本发明重组病毒的异源序列表达水平至多是该重组病毒所源自的野生型病毒F-蛋白表达水平的20%。该同样条件指相同的病毒初始滴度，相同的细胞林，相同的孵育温度，生长培养基，细胞数量和其它可能影响复制速率的测试条件。例如，在hMPV位置1中的PIV3F-蛋白异源序列的表达水平至多是hMPVF-蛋白表达水平的20%。在一些实施方案中，在同样条件下，本发明重组病毒异源序列的表达水平是该重组病毒所源自的野生型病毒F-蛋白表达水平的至多5%、至多10%、至多20%、至多30%、至多40%、至多50%、至多"％、至多80%、至多90%。在一些实施方案中，本发明重组病毒异源序列表达水平是该重组病毒所源自的野生型病毒F-蛋白表达水平的至少5%、至少10°/。、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少"％、至少80°/0、至少卯％。在一些实施方案中，本发明重组病毒异源序列表达水平是该重组病毒所源自的野生型病毒F-蛋白表达水平的5%-20%，10%-40%，25%-50%，40%-75%，50%-80%,或在75%-90%。5.4.3插入异源基因序列到G基因中G蛋白是间质肺病毒的跨膜蛋白。在一个特定实施方案中，异源序列插入到G-ORF区域中，所述G-ORF编码胞外结构域，并使其在病毒包膜表面表达。在一种方法中，异源序列插入到抗原位点中而无需删除任何病毒序列。在另一种方法中，异源序列替换了G-ORF的序列。该构建体的表达产物在抗外来抗原的疫苗中可能有用，和实际上可能解决与在已接种过的宿主体内重组病毒增殖相关的问题。仅在抗原位点具有替换的完整G分子可保留G功能，和因而可以构建有活力的病毒。因此，所述病毒无需额外的辅助功能就能生长。上述病毒也可通过其它方式来减毒以避免任何意外发生的危险。其它杂交构建体可被制备以在细胞表面上表达蛋白或使得这些蛋白从细胞中释放。5.4.4构建双顺反于RNA可以构建双顺反子mRNA，使得病毒序列翻译从内部起始，而让外源蛋白的编码序列从常规末端起始位点表达。反之，也可构建双顺反子mRNA序列，其中病毒序列从常规末端开放阅读框翻译，而让外源序列从内部位点启动。可利用一些内部核糖体进入位点(IRES)序列。所选择的IRES序列应该是足够短的以致不影响MPV包装的限度。因而，用于该双顺反子方法的IRES优选不超过500个核苷酸长度。一个特定实施方案中，IRES来自小核糖核酸病毒且不包括任何额外的小核糖核酸病毒序列。特定的IRES元件包括但不限于哺乳动物BiPIRES和丙型肝炎病毒IRES。可替换地，夕卜源蛋白从新的内部转录单位(internaltranscriptionalunit)上表达，其中该转录单位具有一个起始位点和多腺苷酸化位点。在另一个实施方案中，外源基因被插入到MPV基因中使表达蛋白的结果是融合蛋白。5.5使用重组cDNA和RNA模板表达异源基因产物在适当的宿主细胞中表达异源基因产物和创建表达异源基因产物的嵌合病毒的不同方法中可使用上述制备的病毒载体和重组模板。在一个实施方案中，重组cDNA可用于转染适当的宿主细胞和所产生的RNA可指导异源基因产物进行高水平表达。提供高水平表达的宿主细胞系统包括可提供病毒功能的传代细胞系，如用APV或MPV分别再度感染的细胞系，改造的具有互补APV或MPV功能的细胞系，等等。在本发明一个可选的实施方案中，重组模板可用于转染表达病毒聚合酶蛋白的细胞系以实现表达异源基因产物目的。最后，表达聚合酶蛋白如L蛋白的转化细胞系可作为适当的宿主细胞。同样地，可改造宿主细胞以提供其它的病毒功能或额外的功能如G或N。在另一个实施方案中，辅助病毒可提供RNA聚合酶蛋白，其被细胞所利用以达到表达异源基因产物目的。也在另一个实施方案中。编码病毒蛋白如N，P，L和M2-1蛋白的栽体可用于转染细胞。5.6重组病毒颗粒的拯救为制备本发明的嵌合和重组病毒，编码本发明的重组或嵌合病毒的基因组的正义或负义cDNA可用于转染细胞，所述转染细胞提供为复制和拯救所必需的病毒蛋白和功能。可替换地，在用编码本发明重组病毒的DNA或RNA分子转染前，转染过程中，或转染后，可用辅助病毒转染细胞。本发明合成的重组质粒DNA和RNA可被复制和拯救入感染的病毒颗粒中，其使用任何种类的本发明已知技术，所述如下，1992年11月24日出版的美国专利5，166，057;1998年12月29日出版的美国专利5,854,037;1996年2月20日出版的欧洲专利出版物EP0702085A1;美国专利申请09/152，845;1997年4月3日出版的国际专利出版物PCTW097/12032;1996年11月7日出版的W096/34625;欧洲专利出版物EP-A780475;1999年1月21日出版的WO99/02657;1998年11月26日出版的WO98/53078;1998年1月22日出版的WO98/02530;1999年4月1日出版的WO99/15672;1998年4月2日出版的WO98/13501;1997年2月20日出版的WO97/06270;和1997年6月25日出版的EPO78047SA1,其中任一文献全文在此引入作为参考。在本发明一个实施方案中，可制备含有负链病毒RNA的非编码区(前导区和尾随区)的合成的重组病毒RNA，所述的非编码区是被病毒聚合酶识别和包装产生成熟病毒颗粒所需信号所必需的。已有许多种不同方法可用于施用反求遗传学方法以拯救负链RNA病毒。首先，从重组DNA模板合成重组RNA,并用纯化的病毒聚合酶复合物在体外重建以形成可用于转染细胞的重组核蛋白(RNPs)。在另一种方法中，如果在体外或体内合成的RNA的转录过程中，病毒聚合酶蛋白存在，则能更有效地转染。在该方法中，合成的RNA可从cDNA质粒转录，所述cDNA质粒可在体外与编码聚合酶蛋白的cDNA质粒共转录或在体内在存在聚合酶蛋白的条件下转录，即在暂时或连续表达聚合酶蛋白的细胞中转录。在本文所述额外方法中，在表达间质肺病毒聚合酶蛋白的宿主细胞系统(如，在病毒/宿主细胞表达系统中；在被改造以表达聚合酶蛋白的转化细胞系，等等中)中可复制产生有感染力的嵌合或重组病毒，从而使有感染力的嵌合或重组病毒被拯救。在该例子中，不需要使用辅助病毒，因为通过病毒聚合酶蛋白表达提供了该功能。根据本
发明内容，任何本领域技术人员已知技术可用于复制和拯救重组和嵌合病毒。其中一种方法包括在感染宿主细胞前，提供体外复制所必需的病毒蛋白和功能。在这样一个实施方案中，病毒蛋白可以以野生型病毒、辅助病毒、纯化病毒蛋白或重组表达的病毒蛋白形式提供。可在编码嵌合病毒的合成cDNA或RNA转录前，转录过程中或转录后，提供病毒蛋白。全混合物可用于转染宿主细胞。在另一种方法中，可在编码嵌合病毒的合成cDNA或RNA转录前，转录过程中或转录后，提供复制所必需的病毒蛋白和功能。在这样一个实施方案中，复制所必需的病毒蛋白和功能以野生型病毒、辅助病毒、病毒提取物、表达病毒蛋白的合成的cDNA或RNA的形式被提供，所述合成的cDNA或RNA通过感染或转染导入宿主细胞。所述的感染/转染发生在编码该嵌合病毒的合成cDNA或RNA导入之前或同时。在一种特定期望的方法中，细胞被改造以表达所有的病毒基因或本发明的嵌合或重组病毒，即APV、MPV、MPV/APV或APV/MPV，可导致产生感染的病毒，该病毒含有期望的基因型；因而不需要选择系统。理论上，可用外源序列替换任何一种ORF或任何一种ORF的一部分，所述ORF编码MPV的结构蛋白。然而，上述替换的必要部分是能够缺损型病毒(缺损是因为常规的病毒基因产物缺失或改变)。存在许多可能解决该问题的方法。在其中一种方法中，具有突变蛋白的病毒可在细胞系中生长，所述细胞系被构建以组成性地表达同样蛋白的野生型。通过这种方法，所述细胞系补偿了病毒中的突变。类似技术可用于构建转化细胞系，所述细胞系能组成性地表达任何一种MPV基因。这些细胞系用于表达病毒蛋白，所述病毒蛋白可用于补充嵌合或重组病毒缺损并因此使之增殖。可替换地，一些天然宿主排列系统(rangesystems)可用于增殖嵌合或重组病毒。也在另一个实施方案中，复制所必需的病毒蛋白和功能作为合成cDNA或RNA形式的遗传物质提供，使它们与编码嵌合病毒的合成cDNA或RNA共转录。在一种特定期望的方法中，表达嵌合病毒和病毒聚合酶和/或其它病毒功能的质粒共转录入宿主细胞中。例如，具有或不具有一或更多个异源序列的编码基因组或反基因组APV、MPV、MPV/APV或APV/MPVRNA的质粒，可与编码间质肺病毒聚合酶蛋白N、P、L、或M2-l的质粒共转录入宿主细胞中。可替换地，通过使用编码T7RNA聚合酶的修饰的痘苗病毒安卡拉林(ModifiedVacciniaVirusAnkara)(MVA)或MVA和编码聚合酶蛋白(N、P和L)的质粒的组合可实现本发明重组病毒的拯救。例如，可将MVA-T7或禽Pox-T7感染到Vero细胞、LLC-MK-2细胞、Hep-2细胞、LF1043(HEL)细胞、tMK细胞、LLC-MK2、HUT292、FRHL陽2(恒河猴)、FCL-1(绿猴)、WI-38(人)、MRC-5(人)细胞、293T细胞、QT6细胞、QT35细胞和CEF细胞内。在用MVA-T7或禽Pox-T7感染后，可将编码本发明重组病毒的全长反基因组cDNA与编码N、P、L和M2-1的表达质粒一起转染入细胞中。替换地，可通过质粒转染提供聚合酶。随后收获细胞和细胞上清液并进行一次冻融循环。然后，在存在l-(5-D-阿拉伯呋喃糖胞嘧啶(araC)、痘苗病毒复制抑制剂条件下，产生的细胞裂解液用于感染新鲜的单层HeLa或Vero细胞以产生病毒原种。而后，收获源自这些平板的上清液和细胞，冻融一次，本发明的重组病毒颗粒可通过使用特异于特定病毒的抗血清的病毒噬斑免疫染色来分析其存在。另一种用于增殖嵌合或重组病毒的方法包括与野生型病毒共培养。可通过简单地将重组病毒及共感染细胞与这种或其它种野生型病毒一起放置而进行。野生型病毒可补充缺损型病毒基因产物并使野生型和重组病毒都生长。可替换地，辅助病毒可用于维持重组病毒的增殖。在另一种方法中，合成模板可在用表达间质肺病毒聚合酶蛋白的重组病毒共感染的细胞中复制。实际上，该方法可用于拯救本发明的重组感染病毒。最后，间质肺病毒聚合酶蛋白可在任何表达载体/宿主细胞系统中表达，包括但不限于病毒表达载体(如，痘苗病毒、腺病毒、杆状病毒等等)或表达聚合酶蛋白的细胞系(如，参见Krystal等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:2709-2713)。此外，表达所有间质肺病毒蛋白的宿主细胞的感染可导致产生有感染力的嵌合病毒颗粒。应注意无需改变病毒的活力就可以构建重组病毒。然后，这些改变的病毒将是有能力生长并且不需要辅助功能来复制。为了根据本发明方法重组产生病毒，必须将编码病毒基因组的基因材料转录(转录步骤)。该步骤可以在体外(在宿主细胞外)或者在体内(在宿主细胞中)来完成。可以将病毒基因组从基因材料中转录以产生病毒基因组的正义拷贝(反基因拷贝)或病毒基因组的负义拷贝(基因拷贝)。下一步骤需要病毒基因组的复制以及将复制的基因组包装到病毒颗粒内(复制和包装步骤)。这一步骤在宿主细胞内发生，所述宿主细胞已经进行过改造，以提供足以满足病毒复制和包装需要的水平的病毒聚合酶和结构蛋白。当转录步骤在体外发生时，在其之后发生病毒基因组的细胞内复制和包装。当转录步骤在体内发生时，病毒基因组的转录可以在编码病毒基因组的病毒基因材料的表达之前、同时或之后进行，所述病毒生。基因材料可以由病毒自身产生。例如，病毒RNA基因组和聚合酶蛋白、核糖核酸蛋白(RNP)的复合物可以由全病毒分离得到。将病毒RNA基因组与结合的蛋白例如病毒RNA聚合酶和核蛋白剥离开。编码病毒基因组的基因材料可以使用标准重组技术来产生。基因材料可以编码全长病毒基因组或其一部分。或者，基因材料可以编码被病毒基因组的前导序列和/或尾随序列侧接的异源序列。可从一些小PCR片段组装成全长的病毒基因组。图28中显示了不同的hMPV分离林的限制性图谱。限制性位点可用于组装全长构建物。在一些实施方案中，PCR引物被设计使源自PCR反应的片段具有接近其5'末端的限制性位点和接近其3'末端的限制性位点。然后，PCR产物可分别被限制性内切酶消化并随后连接相邻的PCR片段。为了实现病毒基因组的复制和包装，前导序列和尾随序列保持病毒聚合酶识别所需的信号是很重要的。可将用于病毒RNA基因组的前导序列和尾随序列优化或者改变以改善和增强病毒复制和拯救。或者，可以将前导序列和尾随序列修饰以降低病毒复制和包装的效力，获得具有减毒表型的拯救的病毒。不同前导序列和尾随序列的实例包括但不限于副粘病毒的前导序列和尾随序列。在本发明的一个具体实施方案中，前导序列和尾随序列是野生型或突变的hMPV的前导序列和尾随序列。在本发明的另一个实施方案中，前导序列和尾随序列是PIV、APV或RSV的前导序列和尾随序列。在本发明的再一个实施方案中，前导序列和尾随序列是不同病毒起源的组合的前导序列和尾随序列。例如但不限于可能的组合，前导序列和尾随序列可以是hMPV、PIV、APV、RSV或任何其它副粘病毒的任何前导序列和尾随序列的组合。对前导序列和尾随序列的修饰的实例包括改变相对于病毒启动子的的间距，改变序列，例如改变G残基的数目(通常是0-3)，以及使用核酶序列和使用用于在体外产生的失控RNA的限制酶来限定5'或3'末端，所述核酶序列包括5肝炎病毒(HDV)核酶序列Hammerhead核酶序列或其保留核酶催化活性的片段。在另一个实施方案中，如果病毒基因组的长度是六聚体，可以提高病毒复制和拯救的效率。为了保证病毒基因组具有适当长度，可以使用核酶序列和使用用于在体外产生的失控RNA的限制酶来限定5'或3'末端，所述核酶序列包括5肝炎病毒(HDV)核酶序列、Hammerhead核酶序列或其保留核酶催化活性的片段。为了将编码病毒基因组的基因材料转录，将基因材料进行改造，以处于适当转录调控序列例如被聚合酶识别的启动子序列的控制下。在优选的实施方案中，启动子序列被T7、Sp6或T3聚合酶识别。在另一个实施方案中，启动子序列被细胞DNA依赖性RNA聚合酶例如RNA聚合酶I(PolI)或RNA聚合酶II(PolII)识别。可以使编码病毒基因组的基因材料处于转录调控序列的控制下，这样转录病毒基因组和正链或负链拷贝。将编码病毒基因组的基因材料进行重组改造，以在表达载体中与转录调控序列可操纵地连接，所述表达栽体是例如基于质粒的载体，例如具有polII启动子如CMV的立即早期启动子的质粒，具有T7启动子的质粒，或基于病毒的栽体，例如pox病毒栽体，包括牛痘载体、MVA-T7和Fowlpox载体。可将编码病毒基因组的基因材料修饰以提高表达，这可通过选择聚合酶，例如改变前导序列或尾随序列下游的G残基的数目(通常0-3个)以优化从T7启动子开始的表达来实现。病毒基因组的复制和包装在容许病毒复制和包装的宿主细胞内进行。有多种方法，通过这些方法可以对宿主细胞进行改造，以使其提供足以满足复制和包装所需水平的病毒聚合酶和结构蛋白，包括用适当辅助病毒感染的宿主细胞，经过改造从而能稳定或组成性地表达病毒聚合酶和结构蛋白的宿主细胞，或结构改造从而能短暂或诱导性地表达病毒聚合酶和结构蛋白的宿主细胞。MPV病毒复制和包装所需的蛋白功能包括但不限于聚合酶蛋白P、N、L和M2-1。在一个实施方案中，表达的蛋白是天然或野生型MPV蛋白。在另一个实施方案中，可以使用标准重组技术将所表达的蛋白进行修饰以提高其表达水平和/或聚合酶活性。或者，可以表达保留聚合酶活性的聚合酶蛋白的片段、衍生物、类似物或截短变型。在另一个实施方案中，可以表达源自其它肺病毒例如APV或任何其它副粘病毒的类似聚合酶蛋白。此外，减毒的病毒可以通过一起表达一种MPV林的蛋白和另一种病毒林的基因组来产生。例如，可以一起表达一种MPV林的聚合酶蛋白与另一个病毒林的基因组，以产生减毒的表型。可以通过辅助病毒来提供病毒聚合醉蛋白。可以根据本发明使用的辅助病毒包括天然表达聚合酶病毒蛋白的辅助病毒例如MPV或APV。或者，可以使用已经进行过重组改造以表达聚合酶病毒蛋白的辅助病毒。或者，可以通过表达栽体来提供病毒聚合酶蛋白。将编码病毒聚合酶蛋白的序列进行改造，以处于适当转录调控序列例如被聚合酶识别的启动子序列的控制下。在优选的实施方案中，启动子序列被T7、Sp6或T3聚合酶识别。在另一个实施方案中，启动子序列被PolI或PolII聚合酶识别。或者，启动子序列被病毒聚合酶例如CMV识别。将编码病毒聚合酶蛋白的序列进行重组改造，以在表达栽体中与转录调控序列可操纵地连接，所述表达载体是例如基于质粒的栽体，例如CMV驱动的质粒，T7驱动的质粒，或基于病毒的栽体，例如pox病毒栽体，包括牛痘载体、MVA-T7和Fowlpox载体。为了实现有效的病毒复制和包装，高水平的聚合酶蛋白表达是优选的。这样的水平是这样实现的使用100-200ngL/pCITE、200-400ngN/pCITE、200-400ngP/pCITE和100-200ngM2-l/pCITE编码副粘病毒蛋白的质粒以及2-4|Lig编码全长病毒cDNA的质粒，其转染到用MVA-T7感染的细胞内。在另一实施方案中，使用0.1-2.0jigpSH25(CAT表达)、0.1-3.0pgpRF542(表达T7聚合酶)、0.1-0.8fig具有NcDNA插入片段的pCITE载体以及0.1-1.0ng分别含有P、L和M2-1cDNA插入片段的pCITE载体。或者，可以将一种或多种聚合酶和结构蛋白引入到细胞内，同时通过用纯化的核糖核蛋白转染细胞来引入基因材料。容许MPV病毒复制和包装的宿主细胞是优选的。优选的宿主细胞的实例包括但不限于293T、Vero、tMK和BHK。宿主细胞的其它实例包括但不限于LLC-MK-2细胞、Hep-2细胞、LF1043(HEL)细胞、LLC-MK2、HUT292、FRHL-2(恒河猴)、FCL-1(绿猴)、WI-38(人)、MRC-5(人)细胞、QT6细胞、QT35细胞和CEF细胞。在本发明的另一个实施方案中，可以^_用多种方法来处理宿主细胞以提高转染水平和/或感染效率，蛋白表达，以优化病毒复制和包装。这样的处理方法包括但不限于超声、冷冻/融化和热激。此外，可使用本领域技术人员已知的标准技术来优化转染和/或感染方案，包括但不限于DEAE-右旋糖酐介导的转染、磷酸钙沉淀、lipofectin处理、脂质体介导的转染和电穿孔。本领域技术人员还熟悉可用于优化转染/感染方案的标准技术。例如但不限于可利用的技术，可以使用的方法包括，当使用病毒来提供必需蛋白时，操纵相对于转染的感染时间，操纵不同质粒转染的时间，以及影响病毒和转染的质粒的相对量。在另一个实施方案中，本发明涉及使用源自除了被拯救的病毒之外的病毒的聚合酶来由cDNA拯救或产生活病毒。在一些实施方案中，使用任何多种聚合酶，包括但不限于物种间和物种内聚合酶来由cDNA拯救hMPV。在一些实施方案中，在表达hMPV复制所需的最小复制单元的宿主细胞中拯救hMPV。例如，可以使用多种聚合酶，包括但不限于RSV、APV、MPV或PIV的聚合酶来由cDNA拯救hMPV。在本发明的一个具体实施方案中，使用RNA病毒的聚合酶来拯救hMPV。在本发明的一个更具体的实施方案中，使用负链RNA病毒的聚合酶来拯救hMPV。在本发明的一个甚至更具体的实施方案中，使用RSV聚合酶来拯救hMPV。在本发明的另一个实施方案中，使用APV聚合酶来拯救hMPV。在本发明的另一个实施方案中，使用MPV聚合酶来拯救hMPV。在本发明的另一个实施方案中，使用PIV聚合酶来拯救hMPV。在本发明的另外一些实施方案中，使用hMPV聚合酶蛋白的复合物来由cDNA拯救hMPV。例如，可以使用由L、P、N和M2-l蛋白组成的聚合酶复合物来拯救hMPV微复制子。在本发明的另一个实施方案中，聚合酶复合物由L、P和N蛋白组成。在本发明的另一个实施方案中，可以使用由源自其它病毒例如但不限于RSV、PIV和APV的聚合酶蛋白组成的聚合酶复合物来由cDNA拯救hMPV。特别是，可以使用由RSV、PIV、APV、MPV或其任何组合的L、P、N和M2-l蛋白组成的聚合酶复合物来由cDNA拯救hMPV。在本发明的另一个实施方案中，使用由RSV、PIV、APV、MPV或其任何组合的L、P和N蛋白组成的聚合酶复合物来由cDNA拯救hMPV。在本发明的另一个实施方案中，可以使用源自不同病毒的聚合酶蛋白来形成聚合酶复合物。在这样的实施方案中，用于拯救hMPV的聚合物可以由RSV、PIV、APV或MPV聚合酶的不同组分形成。例如但不限于形成复合物的可能组合，N蛋白可以由RSV、APV、PIV或MPV的N基因编码，而L蛋白可以由RSV、APV、PIV或MPV的L基因编码，并且P蛋白可以由RSV、APV、PIV或MPV的P基因编码。本领域技术人员应当能够确定可用于形成由cDNA拯救hPMV所需的聚合酶复合物的可能组合。在一些实施方案中，优化用于繁殖病毒的条件以产生稳健且高产率的细胞培养物(对于例如生产本发明的病毒疫苗候选物，这将是有利的)。可以鉴定关键参数，并且可以首先在小规模实验中优化生产方法以确定规模的可变性、稳健性和再现性，以及随后调节以适于病毒的大规模生产。在一些实施方案中，使用本发明方法繁殖的病毒是hMPV。在一些实施方案中，使用本发明方法繁殖的病毒是重组或嵌合hMPV。实施方案中，使用本发明方法繁殖的病毒是下列病毒科的病毒腺病毒科(Adenoviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、星状病毒科(Astroviridae)、杆状病毒科(Baculoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、杆状病毒科(Caliciviridae)、花椰菜花叶病毒科(Caulimovirus)、冠状病毒科(Coronaviridae)、嚢状病毒科(Cystoviridae)、线状病毒科(Filoviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、疱渗病毒科(Herpesviridae)、Hypoviridae、Idaeovirus、丝状病毒科(Inoviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、轻小病毒科(Leviviridae)、月旨毛病毒科(Lipothrixviridae)、黄矮病毒科(Luteovirus)、Machlomovirus、玉米雷亚多非纳病毒科(Marafivirus)、微小病毒科(Microviridae)、肌尾病毒科(Myoviridae)、坏死病毒科(Necrovirus)、野田村病毒(Nodaviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、分病毒科(Partitiviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、藻DNA病毒科(Phycodnaviridae)、小RNA病毒科(Picornaviridae)、芽生病毒科(Plasmaviridae)、短尾病毒科(Podoviridae)、多DNA病毒科(Polydnaviridae)、马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、呼肠病毒科(Reoviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、Sequiviridae、长尾病毒科(Siphoviridae)、南方菜豆花叶病毒科(Sobemovirus)、复层病毒科(Tectiviridae)、细病毒科(Tenuivirus)、四病毒科(Tetraviridae)、烟草花叶病毒科(Tobamovirus)、烟草脆裂病毒科(Tobravirus)、披膜病毒科(Togaviridae)、番痴丛矮病毒科(Tombusviridae)、全病毒科(Totiviridae)、Trichovirus、Mononegavirales。在一些实施方案中，病毒不是疱渗病毒科的病毒。在一些实施方案中，病毒不是HSV。在一些实施方案中，将用所需病毒或病毒构建物感染的细胞培养物在较低的感染后培养温度下培养(与对于细胞在培养物中的标准培养温度相比)。在具体实施方案中，将用所需病毒构建物感染的细胞培养物在33°C或约33°C(例如33±1°C)培养。在一些实施方案中，感染后培养温度是约25°C、26°C、27°C、28°C、29°C、30°C、31。C、32。C、33。C、34。C、35。C、36。C或37。C。在一些实施方案中，通过以下方式来繁殖病毒在用病毒感染之前，将细胞在对于细胞的生长来说是最佳的温度下培养，然后将细胞与病毒，即在感染之后，在变化至较低温度的温度下培养。在一些实施方案中，温度变化是至少1°C、2。C、3°C、4。C、5。C、6°C、7°C、8°C、9°C、10。C、11°C或至少12。C。在一些实施方案中，温度变化是至多1。C、2。C、3。C、4。C、5。C、6。C、7°C、8。C、9。C、10。C、11。C或至多12°C。在一个具体实施方案中，温度变化是4。C。在一些实施方案中，在用所需病毒或病毒构建物感染之前，将细胞在含有血清的培养基中培养，在用所需病毒或病毒构建物感染之后，将细胞在不含血清的培养基中培养。关于感染的细胞在没有血清条件下的生长的详细描述，参见题为"在不含血清的培养基中仅质粒的病毒回收，，的章节。在具体的实施方案中，血清是胎牛血清，并且以占培养物体积的5%、占培养物体积的2%或占培养物体积的0.5%的浓度存在。在一些实施方案中，通过将用病毒感染的细胞在没有血清存在的条件下培养来繁殖病毒。在一些实施方案中，通过将用病毒感染的细胞在含有低于5%血清、低于2.5%血清、低于1%血清、低于0.1%血清、低于0.01%血清或低于0.001%血清的培养基中培养来繁殖病毒。在一些实施方案中，在用病毒感染之前，将细胞在含有血清的培养基中培养。在一些实施方案中，在用病毒感染细胞之后，将细胞在没有血清存在的条件下培养。在其它实施方案中，首先将细胞在含有血清的培养基中培养；然后将细胞转移到不含血清的培养基中；然后用病毒感染细胞，进一步在没有病毒存在的条件下培养。在一些实施方案中，通过将含有血清的培养基从细胞中除去，并且加入不含血清的培养基，来将细胞从含有血清的培养基中转移到不存在血清的培养基中。在其它实施方案中，将细胞离心，除去含有血清的培养基，加入不含血清的培养基。在一些实施方案中，将细胞用不含血清的培养基洗涤以确保用病毒感染的细胞在没有血清存在的条件下培养。在一些更具体的实施方案中，将细胞用不含血清的培养基洗涤至少1次、2次、3次、4次、5次或至少10次。在其它实施方案中，在用病毒或病毒构建物感染之前，将细胞在含有血清的培养基中于最佳细胞生长温度下培养，在用所需病毒或病毒构建物感染之后，将细胞培养物在较^f氏温度下(相对于相应的病毒或病毒载体的标准培养温度)培养。在具体实施方案中，在用所需病毒构建物感染之前，将细胞在含有血清的培养基中于37。C培养，在用所需病毒构建物感染之后，将细胞培养物在33°C或约33°C(例如33土1。C)培养。在其它实施方案中，在用病毒或病毒构建物感染之前，将细胞在含有血清的培养基中于最佳细胞生长温度下培养，在用所需病毒或病毒构建物感染之后，将细胞培养物在较低温度下(相对于相应的病毒或病毒栽体的标准培养温度)于不含血清的条件下培养。在具体实施方案中，在用所需病毒构建物感染之前，将细胞在含有血清的培养基中于37。C培养，在用所需病毒构建物感染之后，将细胞培养物在33。C或约33。C(例如33土1。C)于不含血清的条件下培养。本发明的细胞构建物和方法可用于在商业上生产病毒，例如用于疫苗生产。对于疫苗的商业生产，优逸疫苗仅含有灭活的病毒或病毒蛋白，所述灭活的病毒或病毒蛋白完全不含感染病毒或污染性病毒核酸，或者含有不能恢复毒力的活的减毒疫苗。在生产期间，偶然引入的物质对疫苗的污染也可以避免。本领域已知的用于大规模生产病毒或病毒蛋白的方法可用于在商业上生产本发明的疫苗。在一个实施方案中，对于本发明疫苗的商业生产，将细胞在生物反应器或发酵器中培养。生物反应器的可利用体积为1升至超过100升，例如Cyto3生物反应器(Osmonics,Minnetonka，MN);NBS生物反应器(NewBrunswickScientific,Edison，N.J.);以及得自B.BraunBiotechInternational的实验室和商业规模的生物反应器(B.BraunBiotech,Melsungen,Germany)。在另一个实施方案中，在商业生产病毒之前，进行小规模的方法优化，星族最佳的条件，并用于病毒的商业生产。在不含血清的培养基中质粒-拯救在本发明的一些实施方案中，可以不使用辅助病毒来回收病毒。更具体地^兌，病毒可以通过以下方式回收将编码病毒基因组的质粒与编码复制和拯救所需的病毒蛋白的质粒引入到细胞内。在一些实施方案中，将细胞在不含血清的培养基中生长和维持。在一些实施方案中，通过电穿孔将质粒引入到细胞内。在一个具体的实施方案中，将在T7启动子控制下编码病毒的反基因组cDNA的质粒，编码T7RNA聚合酶的质粒，以及在T7启动子控制下分别编码N蛋白、P蛋白和L蛋白的质粒通过电穿孔引入到SFVero细胞内。Vero细胞得自ATCC，并且根据以下步骤(由MikeBerry's实验室开发)让其适于在不含血清的培养基中生长。1.将ATCCCCL81Vial在DMEM+5%v/vFBS中，在T-25烧瓶P121内融化；2.在DMEM+5%v/vFBSP126中扩展5代；3.直接将FBS生长的细胞转移到在T-225烧瓶内的OptiPRO(InvitrogenCorporation)中；4.在OptiPRO中扩展7代；5.在133-7代冷冻Pre-MasterCellBankStock;6.在OptiPRO中扩展4代；7.在137代冷冻MasterCellBankStock;8.在OptiPRO中扩展4代；9.在141代冷冻WorkingCellBankStock;和10.融化和扩展以用于电穿孔和扩增。用于拯救病毒颗粒的方法描述欲题为"重组病毒颗粒的拯救"的章节5.6。在一些实施方案中，用于病毒拯救的细胞是可以在不加入源自动物或人的组分的情况下生长和维持的细胞。在一些实施方案中，用于病毒拯救的细胞是适于在没有血清存在的情况下生长的细胞。在一个具体实施方案中，SFVero细胞用于拯救病毒。在一些实施方案中，将细胞在补充了4mML-谷氨酰胺的OptiPROSFM(InvitrogenCorporation)中生长和维持。在一些实施方案中，将细胞在补充血清的培养基中生长，但是对于病毒颗粒的拯救，将细胞转移到不含血清的培养基中。在一个具体实施方案中，将细胞用不含血清的培养基洗涤，以确保病毒拯救在不含血清的环境中发生。通过本领域技术人员已知的任何方法将质粒引入到细胞内，所述方法是例如磷酸钓转染、DEAE-右旋糖酐转染、电穿孔或脂质体介导的转染(参见ShortProtocolsinMolecularBiology的第9章，Ausubel等人(editors)，JohnWiley&Sons,Inc.,1999)。在具体的实施方案中，使用电穿孔将质粒DNA引入到细胞内。SFVero细胞能够抵抗脂质转染。为了选择已经用所需质粒转染的细胞，质粒还可以携带一些标记物。这样的标记物包括但不限于抗一些抗生素(例如卡那霉素、杀稻瘟菌素、氨苄青霉素、潮霉素B、嘌罗霉素和ZeocinTM)，给予细胞一些自养性的标记物，所述细胞在没有标记物的情况下缺乏该自养性，或者标记物也可以是细胞生长所需的，但是在向其中进入质粒的细胞中突变的基因。病毒基因组和/或病毒基因的转录在启动子的转录控制下进行。因此，将编码病毒基因组或病毒蛋白的序列与启动子序列可操纵地连接。本领域技术人员已知的然后启动子/RNA聚合酶系统可用于本发明方法。在一些实施方案中，启动子可以是容许通过细胞内源性RNA聚合酵转录的启动子，例如能够被细胞DNA依赖性RNA聚合酵例如RNA聚合酶I(PolI)或RNA聚合酶II(PolH)识别的启动子序列。在一些实施方案中，启动于可以是诱导型启动子。在一些实施方案中，启动子可以是容许通过不是细胞的内源性酶的RNA聚合酶转录的启动子。在一些更具体的实施方案中，启动子是T3启动子、T7启动子、SP6启动子或CMV启动子。根据所用启动子的类型，还可以将编码能够识别启动子的RNA聚合酶的质粒引入到细胞内以提供合适的RNA聚合酶。在具体的实施方案中，RNA聚合酶是T3RN聚合酶、T7RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶或CMVRNA聚合酶。在一个具体实施方案中，将病毒基因和病毒基因组在T7启动子的控制下转录，并且引入编码T7RNA聚合酶的质粒以提供T7RNA聚合酶。聚合酶的转录可以在能够在所用细胞类型中起作用的任何启动子系统的控制下进行。在一个具体实施方案中，使用CMV启动子。病毒基因组可以呈正或负方向。因此，病毒基因组可以从基因材义拷贝(基因拷贝)。在一些实施方案中，病毒基因《且是本发明的重组、嵌合和/或减毒病毒。在一些实施方案中，如果病毒基因组的长度是六聚体，则可以提高病毒复制和拯救的效率。为了保证病毒基因组具有合适的长度，可以使用核酶序列来限定5，或3'末端，所述核酶序列包括5肝炎病毒(HDV)核酶序列、Hammerhead核酶序列或其保留核酶催化活性的片段。在一些实施方案中，复制和拯救所需的病毒蛋白包括N、P和L基因。在一些更具体的实施方案中，复制和拯救所需的病毒蛋白包括N、P、M2陽l和L基因。5.7重组病毒的减毒本发明的重组病毒在遗传学上可进一步被改造为减毒表型。具体而言，本发明的重组病毒在施用作为疫苗的该病毒的个体中表现出减毒表型。可通过任何本领域技术人员已知方法进行减毒。不受理论限制，如，通过使用一种病毒，该病毒在预期宿主中天然地没有充分复制(如，在人类中使用APV)，通过减少病毒基因组的复制，通过降低病毒感染宿主细胞能力，或通过降低病毒蛋白组装为有感染力病毒颗粒能力(相对于病毒野生型林而言)，可产生重组病毒减毒表型。使用小型基因(minigenome)组试验测试一些病毒序列，如前导和尾随序列的生存力(参见，5.8节)。通过任何本领域技术人员已知方法测试本发明重组病毒减毒表型(参见，如5.8节)。例如，可测试一种候选病毒感染宿主能力或在细胞培养系统中复制速率。在一些实施方案中，当改变的基因是N、P、L、M2、F、G、M2-l、M2-2或它们的组合时，用小型基因组系统测试减毒病毒。在一些实施方案中，用不同温度下的生长曲线测试病毒减毒表型。例如，一种减毒病毒能在35。C下生长，但在"。C或40。C下无法生长。在一些实施方案中，用不同细胞系评估病毒减毒表型。例如，一种减毒病毒仅在猴细胞系中生长，而无法在人细胞系中生长，或对于减毒病毒而言，在不同细胞系中可达到的病毒滴度是不同的。在一些实施方案中，在小动物模型，包括但不限于仓鼠、棉鼠、小鼠和豚鼠呼吸道中的病毒复制被用于评估病毒减毒表型。在其他实施方案中，病毒诱导的免疫响应，包括但不限于，抗体滴度(如，通过噬斑还原中和分析或ELISA测定)被用于评估病毒减毒表型。在特定实施方案中，在低剂量下进行噬斑减小中和分析或ELISA。在一些实施方案中，可测定重组病毒在动物模型中诱发病症能力。重组病毒在动物模型中诱发病症能力的降低意味着其是减毒表型。在一个特定实施方案中，在猴模型中进行候选病毒鼻感染测试，通过产生的粘液来指示。本发明病毒可以是减毒型，使所述病毒一或更多种功能特性被削弱。在一些实施方案中，通过与减毒型病毒所源自的野生型病毒林相比，可测定减毒。在其他实施方案中，通过在不同宿主系统中比较减毒型病毒的生长，可测定减毒。因而，作为一个非限制性例子，当APV在人宿主中生长时，如果与APV在禽类宿主中生长相比，APV在人宿主中生长降低时，则APV被认为是减毒型。在一些实施方案中，本发明的减毒病毒能够感染宿主，能够在宿主中复制产生有感染力的病毒颗粒。然而，与野生型林相比，减毒型林生长至更低的滴度或生长更慢。任何本领域技术人员已知技术可被用于测定减毒型病毒生长曲线并用于与野生型病毒生长曲线作比较。举例方法见下文实施例部分。在特定实施方案中，在如实施例22所描述的条件下，在Vero细胞中减毒型病毒生长至的滴度小于105pfu/ml，小于104pfu/m1,小于103pfu/m1,或小于102pfu/ml。在一些实施方案中，本发明减毒型病毒(如，嵌合的哺乳动物MPV)与野生型病毒(如，野生型哺乳动物MPV)—样无法在人细胞中复制。然而，减毒型病毒可在缺乏干扰素功能的细胞系如Vero细胞中4艮好地复制。在另一个实施方案中，本发明减毒型病毒能够感染宿主，能够在宿主中复制并能够使本发明的病毒蛋白插入细胞质膜中，但所述减毒型病毒不会使宿主产生新的有感染力的病毒颗粒。在一些实施方案中，减毒型病毒感染宿主，并在宿主中复制，及以与野生型哺乳动物病毒同样的效率将病毒蛋白插入宿主细胞质膜中。在另一个实施方案中，减毒型病毒与野生型病毒相比，病毒蛋白插入宿主细胞的细胞质膜的能力降低了。在一些实施方案中，减毒型病毒与野生型病毒相比在宿主中的复制能力降低了。任何本领域技术人员已知技术可用于测定是否病毒能够感染哺乳动物细胞，能够在宿主中复制，和能够使病毒蛋白插入宿主细胞质膜中。范例的方法见5.8节。在一些实施方案中，本发明减毒型病毒能够感染宿主。然而，与哺乳动物野生型MPV不同，减毒的哺乳动物MPV无法在宿主中复制。在一个特定实施方案中，减毒的哺乳动物病毒可感染宿主并使病毒蛋白插入宿主细胞质膜中，但减毒型病毒无法在宿主中复制。任何本领域技术人员已知方法可用于测试减毒的哺乳动物MPV是否已感染宿主和已使病毒蛋白插入宿主细胞质膜中。在一些实施方案中，与感染同样宿主的野生型病毒相比，减毒的哺乳动物病毒感染宿主的能力降低了。任何本领域技术人员已知技术可用于测定病毒是否能感染宿主。范例的方法见5.8节。在一些实施方案中，突变(如错义突变)被导入病毒基因组中以产生具有减毒表型的病毒。突变(如错义突变)可导入重组病毒的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因内。突变可以是添加、替换、缺失或它们的组合。一个特定实施方案中，单氨基酸缺失突变导入N、P、L、F、G、M2-l、M2-2或M2蛋白，其在小基因组分析系统中被功能性地筛选出并被评估在病毒中具有预计的功能。在更特定实施方案中，错义突变是冷敏感突变。在其他实施方案中，错义突变是热敏感突变。在一个实施方案中，病毒P蛋白的主要磷酸化位点被除去。在另一个实施方案中，单一突变或多突变导入病毒L基因中以产生温度敏感型林。也在另一个实施方案中，通过切割不发生或发生效率非常低的这样一种方式，F基因切割位点被突变。在一些更具体的实施方案中，在hMPV的F蛋白的氨基酸位置99-102上具有氨基酸序列RQSR的基元发生突变(参见图9)。突变可以是但不限于删除一个或多个氨基酸、加入一个或多个氨基酸、一个或多个氨基酸被替换(保守或非保守)或其组合。在hMPV的一些毒株中，切割位点是RQPR(参见实施例"P101S")。在一些实施方案中，具有氨基酸序列RQPR的切割位点发生突变。在更基团的实施方案中，hMPV的F蛋白的切割位点发生突变，这样hMPV的感染性降低。在一些实施方案中，hMPV的感染性降低了至少5、10、50、100、500、103、5xl03、104、5x104、105、5x105或至少106倍。在一些实施方案中，hMPV的感染性降低了至多5、10、50、100、500、103、5xl03、104、5xl04、105、5xl()5或至多106倍。在其他实施方案中，缺失导入重组病毒的基因组中。在更特定实施方式中，缺失可导入重组病毒的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因。在特定实施方案中，缺失发生在本发明重组病毒M2-基因中。在其他特定实施方案中，缺失发生在本发明重组病毒SH-基因中。也在另一个特定实施方案中，M2-基因和SH-基因都被缺失。在一些实施方案中，重组病毒基因间隔区被改变。在一个实施方案中，间隔区长度被改变。在另一个实施方案中，间隔区从病毒基因组的5'末端被移动到3'末端。在其他实施方案中，重组病毒单个基因或多个基因在基因组中的位置被改变。在一个实施方案中，F或G基因被移动到基因组3'末端。在另一个实施方案中，N基因被移动基因组S'末端。在一些实施方案中，通过用不同种类(例如RSV、APV、PIV3或小鼠肺病毒)、或不同亚组或不同变种的病毒的类似基因替换野生型病毒的基因可达到病毒减毒的目的。在范例的实施方案中，哺乳动物MPV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因分别被APV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因替换。在其他范例的实施方案中，APV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因分别被哺乳动物MPV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因或L-基因替换。在一个优选实施方案中，通过用不同种类的病毒基因替换一或多个聚合酶相关基因(如N、P、L或M2)可达到病毒减毒的目的。在一些实施方案中，通过用不同种类病毒的相应蛋白的结构域替换野生型病毒蛋白的一或多个特殊结构域可达到病毒减毒的目的。在一个范例的实施方案中，APVF蛋白的胞外结构域被哺乳动物MPVF蛋白的胞外结构域替换。在一个优选的实施方案中，L、N或P蛋白的一或多个特殊结构域被源自不同种类病毒的相应蛋白的结构域替换。在一些另外的实施方案中，通过缺失野生型病毒蛋白的一或多个特殊结构域可达到病毒减毒的目的。在一个特定实施方案中，缺失F蛋白的跨膜结构域。在本发明一些实施方案中，本发明重组病毒的前导和/或尾随序列可被修饰以得到减毒表型。在一些更特定实施方案中，前导和/或尾随序列的长度相对与野生型病毒减少了至少1个核苷酸，至少2个核苷酸，至少3个核苷酸，至少4个核苷酸，至少5个核苷酸或至少6个核苷酸。在一些另外更特定实施方案中，重组病毒的前导和/或尾随序列被突变。在一个特定实施方案中，前导和尾随序列是100%互补。在其他实施方案中，前导和尾随序列相互之间有1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸或IO个核苷酸不互补，其中前导和尾随序列中其余核苷酸是互补的。在一些实施方案中，非互补的核苷酸彼此相同。在一些其它的实施方案中，非互补的核苷酸相互不同。在其他实施方案中，如果尾随序列中非互补核苷酸是嘌呤，则前导序列中相应核苷酸也是嘌呤。在其他实施方案中，如果尾随序列中非互补核苷酸是嘧啶，则前导序列中的相应核苷酸也是噤呤。在本发明的一些实施方案中，本发明重组病毒的前导序列和/或尾随序列可以用另一病毒的前导序列和/或尾随序列替换，例如用以下序列替换RSV、APV、PIV3、小鼠肺病毒的前导序列和/或尾随序列，或与该重组病毒的蛋的前导i列和;或尾随序列。、5一、当使用活的减毒疫苗时，也必须考虑其安全性。该疫苗不能导致疾病。任何本领域已知的可使疫苗安全的技术可用于本发明中。除减毒技术外，还可使用其它技术。一个非限制性例子是使用可溶性异源基因，所述异源基因无法被整合入病毒颗粒膜中。例如，使用可溶性RSVF基因单拷贝，这是一种缺乏跨膜和胞质结构域的RSV基因类型。因为其无法被整合入病毒颗粒膜中，预计病毒嗜性不改变。许多分析方法可用于测试疫苗的安全性。参见下文5.8节。具体而言，蔗糖梯度和中和试验可用于测试安全性。蔗糖梯度试验可用于测定异源蛋白是否插入到病毒颗粒中。若异源蛋白插入到病毒颗粒中，该病毒颗粒应测试出具有致病能力，即使其亲本林无法致病。不受理论限制，如果异源蛋白整合入病毒颗粒中，该病毒可获得新的、病理上可能的特性。在一些实施方案中，一个或多个基因从hMPV基因组中缺失，以产生减毒的病毒。在更具体的实施方案中，M2-20RF、M2-lORF、M2基因、SH基因和/或G2基因缺失。在其它实施方案中，小的单氨基酸缺失发生于涉及病毒复制的基因以产生减毒的病毒。在更具体的实施方案中，小的单氨基酸缺失发生于N、L或P基因。在一些具体的实施方案中，在重组hMPV的L基因中，一个或多个下列氨基酸发生突变在氨基酸位置456的Phe，在氨基酸位置749的Glu，在氨基酸位置1246的Tyr，在氨基酸位置1094的Met和在氨基酸位置746的Lys，以产生减毒的病毒。突变可以是例如氨基酸的缺失或替换。氨基酸替换可以是保守的氨基酸替换或非保守的氨基酸替换。对于保守的氨基酸交换，示例性实例是保持氨基酸侧链的结构和/或功能性质的氨基酸替换，例如芳族氨基酸被另一芳族氨基酸替换，酸性氨基酸被另一酸性氨基酸替换，碱性氨基酸被另一碱性氨基酸替换，以及脂族氨基酸被另一脂族氨基酸替换。相反，非保守的氨基酸交换的实例是不保持氨基酸侧链的结构和/或功能性质的氨基酸替换，例如芳族氨基酸被碱性、酸性或脂族氨基酸替换，酸性氨基酸被芳族、碱性或脂族氨基酸替换，碱性氨基酸被酸性、芳族或脂族氨基酸替换，以及脂族氨基酸被芳族、酸性或碱性氨基酸替换。在甚至更具体的实施方案中，在氨基酸位置456的Phe被Leu替换。在一些实施方案中，一个核酸被替换以编码一个氨基酸交换。在其它实施方案中，两个或三个核酸被替换以编码一个氨基酸交换。优选两个或三个核酸被替换以降低复原成野生型蛋白序列的危险性。在其它实施方案中，小的单氨基酸缺失发生于涉及病毒装配的基因中以产生减毒的病毒。在更具体的实施方案中，小的单氨基酸缺失发生于M基因或M2基因。在优选的实施方案中，M基因发生突变。在其它实施方案中，病毒基因组中的基因次序发生改变而不同于野生型病毒的基因次序，以产生减毒的病毒。在更具体的实施方案中，F、SH和/或G基因移动至病毒基因组的3'末端。在另一个实施方案中，N基因移动至病毒基因组的5'末端。在其它实施方案中，一个或多个基因起始位点(关于基因起始位点的位置参见例如表8)发生突变或者被另一病毒(例如RSV、PIV3、APV或小鼠肺病毒)或与该重组病毒的蛋白编码部分所源自的人间质肺病毒不同的亚组或变种的人间质肺病毒的类似基因起始位点替换。在更具体的实施方案中，N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和/或L-基因的基因起始位点分别被另一病毒(例如RSV、PIV3、APV或小鼠肺病毒)或与该重组病毒的蛋白编码部分所源自的人间质肺病毒不同的亚组或变种的人间质肺病毒的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和/或L-基因的基因起始位点替换。5.7.1通过替换病毒基因来减毒在本发明的一些实施方案中，减毒是通过将病毒的一个或多个基因用不同病毒、不同林或不同病毒分离林的类似基因替换而实现的。在一些实施方案中，将间质肺病毒，例如哺乳动物间质肺病毒如hMPV或APV的一个或多个基因用另一副粘病毒的类似基因替换。在一个更具体的实施方案中，将哺乳动物间质肺病毒如hMPV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、M2-lORF、M2-2ORF、SH-基因、G-基因或L-基因或两个或更多个这些基因的任何组合用另一病毒物种、毒林或分离抹的类似基因替换，其中所述其它病毒物种可以是但不限于另一哺乳动物间质肺病毒、APV或RSV。在更具体的实施方案中，将人间质肺病毒的一个或多个基因用人间质肺病毒的另一分离林的类似基因替换。例如，将分离抹NL/1/99(99-1)、NL/1/00(OO-l)、NL/17/00或NL/1/94的N画基因、P-基因、M画基因、F-基因、M2-基因、M2-lORF、M2-2ORF、SH-基因、G-基因或L-基因或两个或更多个这些基因的任何组合用不同分离抹例如NL/1/99(99-1)、NL/1/00(00-1)、NL/17/00或NL/1/94的类4以基因或基因组合，即N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、M2-lORF、M2-20RF、SH-基因、G-基因或L-基因替换。在一些实施方案中，将病毒基因组的一个或多个区域用不同病毒物种、毒林或分离林的基因组的类似区域替换。在一些实施方案中，所述区域是病毒基因组的编码区域中的区域。在其它实施方案中，所述区域是病毒基因组的非编码区域中的区域。在一些实施方案中，如果两个区域支持两种病毒中的相同或类似功能，则两种病毒的两个区域彼此类似。在一些其它实施方案中，如果两个区域提供两种病毒中的同样的类似结构元件，则两种病毒的两个区域是类似的。在更具体的实施方案中，如果两个区域编码两种病毒中的类似蛋白结构域，则这两个区域是类似的，其中类似的蛋白结构域是具有相同或类似功能和/或结构的结构域。在一些实施方案中，间质肺病毒例如哺乳动物间质肺病毒如hMPV或APV的基因组的一个或多个区域被另一副粘病毒的基因组的类似区域替换。在一些实施方案中，副粘病毒的基因组的一个或多个区域被哺乳动物间质肺病毒例如hMPV或APV的基因组的类似区域替换。在更具体的实施方案中，哺乳动物间质肺病毒例如hMPV的N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、M2-lORF、M2-2ORF、SH-基因、G-基因或L-基因的区域或这些基因的两个或更多个区域的任何组合用另一病毒物种、毒林或分离林的类似区域替换。另一病毒物种可以是但不限于另一哺乳动物间质肺病毒、APV或RSV。在更具体的实施方案中，将人间质肺病毒的一个或多个区域用人间质肺病毒的另一分离林的类似区域替换。例如，将分离林NL/1/99(99-1)、NL/1/00(00-1)、NL/17/00或NL/1/94的N-基因、P誦基因、M曙基因、F-基因、M2-基因、M2-lORF、M2-2ORF、SH-基因、G國基因或L-基因的一个或多个区域或两个或更多个区域的任何组合用hMPV的不同分离林例如NL/1/99(99-1)、NL/1/00(00-1)、NL/17/00或NL/1/94的类似区域替换。在一些实施方案中，该区域的长度是至少5个核苷酸、至少10nt、至少25nt、至少50nt、至少75nt、至少100nt、至少250nt、至少500nt、至少750nt、至少1kb、至少1.5kb、至少2kb、至少2.5kb、至少3kb、至少4kb或至少5kb。在一些实施方案中，该区域的长度是至多5个核苷酸、至多10nt、至多25nt、至多50nt、至多75nt、至多100nt、至多250nt、至多500nt、至多750nt、至多1kb、至多1.5kb、至多2kb、至多2.5kb、至多3kb、至多4kb或至多5kb。5.8用于本发明的分析方法根据本
发明内容，许多方法可用于测定嵌合或重组病毒在细胞培养系统、动物模型或在个体中的生长速率。根据本
发明内容，许多方法也可用于确定嵌合或重组病毒达到感染、复制和病毒颗粒包装目的所必需的条件。本文中所述方法可用于全程分析病毒滴度以测定病毒生长特性，一个特定实施方案中，通过获得源自被感染细胞或被感染个体样本，制备一系列样本稀释物，并在能出现单噬斑的病毒稀释度下，感染对病毒易感的单层细胞，可测定病毒滴度。然后，噬斑计数且病毒滴度可表示为每亳升样本的噬斑形成单位。本发明一个特定实施方案中，根据抗个体中病毒抗体滴度估计本发明个体中病毒生长速率。不受理论限制，个体体中抗体滴度不但包括个体中病毒滴度而且还包括抗原性。如果病毒抗原性不变，个体中增加的抗体滴度可用于测定个体中病毒生长曲线。在一个优选实施方案中，动物或人体中病毒生长速率最好的测定方法是通过在感染前的多时间点在宿主中取样生物液体并测定病毒滴度。通过任何本领域技术人员已知技术可测定细胞培养系统或个体中异源基因序列表达量。在一些实施方案中，异源基因表达可通过定量转录水平来测定。通过分别使用特异于转录物的探针或引物的RNA印迹或RT-PCR可测定转录水平。因为病毒是反义方向而转录物是有义方向，所以转录物可区别于病毒基因组。在一些实施方案中，异源基因表达可通过定量异源基因蛋白产物水平来测定。通过使用特异于该蛋白的抗体的蛋白质印迹可测定蛋白水平。在一个特定实施方案中，异源基因被标记一个肽标记。所述肽标记可用抗该肽标记的抗体检测。检测的肽标记水平代表异源基因表达蛋白的水平。可替换地，由于具有肽标记的优点，异源基因表达蛋白可被分离。纯化蛋白的数量与异源基因的表达水平相关。所述肽标记和结合有所述一个肽标记的蛋白的分离方法在本领域中众所周知。本领域中已知许多肽标记可用于修饰异源基因，例如，但不限于免疫球蛋白恒定区，多组氨酸序列(Petty,1996，Metal國chelateaffinitychromatography,inCurrentProtocolsinMolecularBiology,1-3巻(1994-1998).Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kunston，R.E.，Moore,D.D.，Seidman，J.G.，Smith,J.A.和Struhl，K编.JohnWileyandsons,Inc，USA,GreenePublish.Assoc.&WileyInterscience出版.)，谷胱甘肽S-转移酶(GST;Smith,1993,MethodsMol.CellBio.4:220-229)，大肠杆菌麦芽糖结合蛋白(Guan等，1987，Gene67:21-30)，不同的纤维素结合域(美国专利5，496，934;5,202,247;5，137，819;Tomme等，1994，ProteinEng.7:117-123)，和FLAG表位(ShortProtocolsinMolecularBiology,1999，Ed.Ausubel等.，JohnWiley&Sons,Inc"Unit10.11)等。通过特定的结合伴侣，其它的肽标记被识别，并因而有利于通过与结合伴侣的结合被亲和分离，该结合伴侣优选固定化的和/或在固体栽体上。本领域中那些技术人员能意识到许多方法可用于获得上述肽标记的编码区，包括但不限于，DNA克隆，DNA扩增，和合成的方法。一些肽标记和用于检测及分离它们的试剂可从市场上购买到。源自个体的样本可通过任何本领域技术人员已知方法获得。在一些实施方案中，该样本由鼻抽吸物、咽拭子、痰或支气管肺泡灌洗液组成。5.8.1微复制子构建物由cDNA产生活病毒提供了用于确定hMPV的特征以及产生减毒的疫苗林和免疫原性化合物的方法。为了完成该目标，编码含有报道基因的vRNA的cDNA或微复制子构建物可用于拯救病毒以及鉴定参与RNA扩增、表达和引入到病毒颗粒内的核苷酸序列和蛋白。任何本领域技术人员已知的报道基因都可用于本发明(参见，5.8.2节)。例如，可以使用的报道基因包括但不限于编码GFP、HRP、LUC和AP的基因(还参见5.8.2节对于报道基因的实例的更广泛列出。在一个实施方案中，所使用的报道基因编码CAT。在本发明的另一个具体实施方案中，报道基因侧接在前导序列和尾随序列上。可用于側接报道基因的前导序列和尾随序列是任何负链病毒，包括但不限于MPV、RSV和APV的前导序列和尾随序列。例如，报道基因可侧接在连接有肝炎S核酶(Hep-dRibo)和T7聚合酶终止(T-T7)信号的负链hMPV或APV前导序列上，和位于T7RNA聚合酶启动子后面的hMPV或APV尾随序列上。在一些实施方案中，编码微复制子的质粒转染到宿主细胞内。在本发明的更具体的实施方案中，在表达T7RNA聚合酶、N基因、P基因、L基因和M2.1基因的宿主细胞中拯救hMPV。在一些实施方案中，用编码T7RNA聚合酶、N基因、P基因、L基因和M2.1基因的质粒转染宿主细胞。在其它实施方案中，将编码微复制子的质粒转染到宿主细胞内并用辅助病毒感染该宿主细胞。可使用多种聚合酶，包括但不限于种间或种内聚合酶来拯救hMPV微复制子。在一些实施方案中，在表达hMPV复制所需的最小复制单位的宿主细胞中拯救hMPV微复制子。例如，hMPV可使用多种聚合酶来从cDNA拯救，所述聚合酶包括但不限于RSV、APV、MPV或PIV的聚合酶。在本发明的一个具体实施方案中，使用RNA病毒的聚合酶来拯救hMPV。在本发明的一个更具体的实施方案中，使用负链RNA病毒的聚合酶来拯救hMPV。在本发明的一个甚至更具体的实施方案中，使用RSV聚合酶来拯救hMPV。在本发明的另一个实施方案中，使用APV聚合酶来拯救hMPV。在本发明的另一个实施方案中，使用MPV聚合酶来拯救hMPV。在本发明的另一个实施方案中，使用PIV聚合酶来拯救hMPV。在本发明的另一个实施方案中，使用hMPV聚合酶蛋白的复合物来由cDNA拯救hMPV。例如，可以使用由L、P、N和M2-1蛋白组成的聚合酶复合物来拯救hMPV微复制子。在本发明的另一个实施方案中，聚合酶复合物由L、P和N蛋白组成。在本发明的另一个实施方案中，可以使用由源自其它病毒例如但不限于RSV、PIV和APV的聚合酶蛋白组成的聚合酶复合物来由cDNA拯救hMPV微复制子。特别是，可以使用由RSV、PIV或APV的L、P、N和M2-l蛋白组成的聚合酶复合物来拯救hMPV微复制于。在本发明的另一个实施方案中，使用由RSV、PIV或APV的L、P和N蛋白组成的聚合酶复合物来拯救hMPV微复制子。在本发明的另一个实施方案中，可以使用源自不同病毒的聚合酶蛋白来形成聚合酶复合物。在这样的实施方案中，用于拯救hMPV微复制子的聚合物可以由RSV、PIV或APV聚合酶的不同组分形成。例如但不限于形成复合物的可能组合，N蛋白可以由RSV、APV或PIV的N基因编码，而L蛋白可以由RSV、APV或PIV的L基因编码，并且P蛋白可以由RSV、APV或PIV的P基因编码。本领域技术人员应当能够确定可用于形成拯救hPMV微复制子所需的聚合酶复合物的可能组合。在微复制子系统中，测定报道基因的表达来证实病毒的成功拯救以及确定病毒的特征。通过任;如，但不限于:5.8.2节中所-述的方法。，、一些更特定实施方案中，微复制子包含如下元件，按顺序列出T7RNA聚合酶或RNA聚合酶I，前导序列，基因起点(genestart)，GFP，尾随序列，肝炎5核酶或RNA聚合酶I终止序列。如果T7被用作为RNA聚合酶，肝炎S核酶序列应被用作为终止序列。如果RNA聚合酶I被使用，RNA聚合酶I终止序列可被用作为终止信号。依赖于拯救系统，微复制子序列可以是有义或反义方向。在一些实施方案中，相对于hMPV的野生型前导序列，该前导序列可被修饰。任选地，前导序列可位于AC之后。T7启动子序列可结合或不结合G偶联体或三联体，其中G偶联体或三联体提供了增加的转录活性。在一个特定实施方案中，用hMPV在T0感染一个细胞。24小时后，在T24，用微复制子构建物转染该细胞。T0的48小时后和TO的72小时后，测试该细胞报道基因的表达。如果使用荧光报道基因产物(例如GFP)，可使用FACS测定报道基因的表达。在另一个实施方案中，用六个质粒在T=0小时转染一个细胞。然后，在T=40小时和T=60小时收获细胞并分析CAT或GFO的表达(参见，图25)。在另一个特定实施方案中，用MVA-T7在TO感染一个细胞。1小时后，在T1，用微复制子构建物转染该细胞。T0的24小时后，用hMPV感染该细胞。TO的72小时后，测试该细胞报道基因的表达。如果使用荧光报道基因产物(例如GFP)，可使用FACS测定报道基因的表达。5.8.2才艮道基因在一些实施方案中，使用本发明方法可分析组织培养物或动物模型中的报道基因表达量。报道基因的核苷酸序列被克隆进病毒中，如APV，hMPV，hMPV/APV或APV/hMPV，其中(i)报道基因位置被改变和(ii)侧接报道基因的基因间隔区长度是不同的。不同组合被测试以确定报道基因最佳表达率和包含该报道基因的病毒的最佳复制速率。在一些实施方案中，产生包括报道基因的微复制子构建物。本文中描述了该微复制子构建物的构建过程。通过任何本领域技术人员已知技术可测定大量不同的报道基因产物。所述技术包括但不限于分别使用特异于报道基因的探针或抗体的RNA印迹或蛋白质印迹。在一些实施方案中，报道基因发出在FACS中可被检测到的萸光信号。FACS可用于检测表达报道基因的细胞。除非另有说明，用于解决本发明具体问题的技术将包括，分子生物学、微生物学和重组DNA操作和生产的常规技术，本领域技术人员可熟练i也操作上述4支术。参见，如，Sambrook等，Molecularcloning,alaboratorymanual,seconded.，vol.1-3.(ColdSpringHarborLaboratory,1989)，ALaboratoryManual,SecondEdition;DNACloning,VolumesIandII(Glover,Ed.1985);和TranscriptionandTranslation(Hames&Higgins，Eds.1984)。报道基因产物的生化活性代表报道基因的表达水平。报道基因活性的总水平也依赖于本发明重组病毒的复制速率。因而，要测定报道基因在重组病毒中的实际表达水平，应把总的表达水平除以在细胞培养物中的或在动物模型中的重组病毒的滴度。可用于本发明方法的报道基因包括但不限于列在如下表4中的基因表4:报道基因及其各自报道基因产物的生化性质<table>tableseeoriginaldocumentpage112</column></row><table>转移放射性标记的乙酰基团到氯霉素上或通过薄层色谱法和放射自显影法测定水解无色半乳糖苷以产生有色产物水解无色葡糖苷酸以产生有色产物氧化虫荧光素，发出光子无需底物的荧光蛋白与适合的底物发生发光反应或与底物反应产生生色团在存在氢氧化物下，氧化3，3'，5,5'-四甲基联苯胺形成有色的复合物与适合的底物发生发光反应或与底物反应产生生色团大量的报道基因可通过，尤其是蛋白质印迹或RNA印迹或任何其它用于定量核苷酸序列转录、其mRNA其蛋白的丰度的技术被测定(参见，ShortProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等，(编辑)，JohnWiley&Sons,Inc.,4thedition,1999)。在一些实施方案中，报道基因产物的活性被测定作为来自重组病毒的报道基因表达的示值读数。报道基因产物的生化性质可用于定量报道基因产物的活性(参见，表4)。用于测定报道基因产物生化活性的方法对于本领域技术人员而言是众所周知的。可用于本发明方法的范例的报道基因的更详细描述见下文。5.8.3感染发病率的测定通过任何本领域众所周知的方法可测定感染发病率，例如但不限于，分别使用抗-APV-抗原的抗体，和/或特异于异源核苷酸序列的基因产物的抗体，临床测试样本(例如鼻拭子)可用于通过免疫焚光测定(IFA)本发明病毒的存在。在一些实施方案中，含有完整细胞的样本可直接被处理，而分离的无完整细胞的样本首先应在容许的细胞系(permissivecellline)上培养(如，HEp-2细胞)。一个范例实施方案中，培养的细胞悬浮物应通过离心清除，如在，室温，300xg，5分钟条件下，接着在同样条件下用PBS，pH7.4(无€3++和^^++)洗涤。细胞沉淀在小体积的PBS中再悬浮用于透析。含有完整细胞的初步临床分离物与PBS混合并在室温300xg条件下离心5分钟。用无菌吸液管从分界面除去粘液，并在同样条件下，再次用PBS洗涤细胞沉淀。然后，沉淀再悬浮在小体积PBS中用于透析。5到10微升的每种细胞悬液点在丙酮洗涤的12孔HTC超硬栽玻片的每个5mm孔中并在空气中干燥。载玻片在冷(-20。C)丙酮中固定10分钟。室温下孵育10分钟后，添加PBS-1%BSA到每个孔中封闭反应。载玻片在PBS-0.1。/。Tween-20中洗涤3次并在空气中干燥。向每孔中滴入10微升用封闭緩冲液稀释至250ng/ml的各种第一抗体试剂，在37°C湿润环境孵育30分钟进行反应。然后，换液3次用PBS-0.1%Tween-20彻底洗涤栽玻片，并在空气中干燥。IO微升在封闭緩沖液中被稀释到250ng/ml的适当的第二连接抗体(secondaryconjugatedantibody)试剂分另'J点在每个孔中并在潮湿的37°C环境中孵育额外30分钟进行反应。然后，交替使用PBS-0.1%Tween-20洗涤栽玻片3次。5微升的PBS-50%甘油-10mMTrispH8.0-1mMEDTA点在每个反应孔中，并在栽玻片上盖上盖玻片。随后通过萸光显微镜在200X倍下使用B-2A滤光器(EX450-490nm)分析每个反应孔。阳性反应不同于源自未染色的细胞或用第二试剂单独染色的细胞的自身荧光背景。阳性可通过被感染细胞细胞质中小包涵体特有的亮萸光标记被鉴定。5.8.4血清滴度的测定可通过任何本领域众所周知的方法测定抗体血清滴度，例如但不限于，可通过夹心酶联免疫分析来定量血清样本中的抗体或抗体片段的数量。简而言之，ELISA包括用识别血清中抗体或抗体片段的抗体在4°C下包被微滴定板过夜。然后，该滴定板用PBS-Tween-0.5%BSA在室温下封闭大约30分钟。使用在PBS-TWEEN-BSA中稀释的纯化的抗体或抗体片段构建标准曲线，和样本在PBS-BSA中稀释。样本和标准品被加到分析滴定板的两个孔中并在室温下孵育大约1小时。接下来，用PBS-TWEEN洗去没有结合的抗体和结合的抗体用标记的第二抗体(如与辣根过氧化物酶连接的羊抗人IgG)在室温下处理大约1小时。通过添加特异于标记物的显色底物和如，通过分光光度计测定底物转化率的方法，可检测标记抗体的结合。通过在一些稀释物中比较底物对样本的转化率和底物对标准曲线的转化率可测定血清中抗体或抗体片段的浓度水平。5.8.5血清学试验在本发明的一些实施方案中，可检测与哺乳动物MPV组分结合的抗体存在。具体而言，可通过检测个体中与哺乳动物MPV直接作用的抗体存在以诊断在个体中哺乳动物MPV的存在。任何本领域技术人员已知的方法可用于检测能直接结合哺乳动物MPV组分的抗体存在。在另一个实施方案中，血清学试验可这样进行将得自被怀疑感染了MPV的宿主的样本与抗MPV或其组分的抗体接触，并检测复合物的形成。在这样的实施方案中，血清学试验可检测对MPV暴露起反应的宿主抗体的存在。可用于本发明的测定中来检测宿主抗体或MPV组分的抗体可以使用本领域已知的方法制得。可对这样的抗体进行改造以检测多种不同表位，包括但不限于核酸、氨基酸、糖、多核苷酸、蛋白、碳水化合物或其组合。在本发明的另一个实施方案中，血清学试验可这样进行将得自被怀疑感染了MPV的宿主的样本与MPV的组分接触，并检测复合物的形成。这样的方法的实例是本领域众所周知的，包括但不限于直接免疫荧光法、ELISA、western印迹、免疫色镨法。在一个范例实施方案中，将哺乳动物MPV组分连接于固相栽体。在一个特定实施方案中，哺乳动物MPV组分可以是，但不限于，F蛋白或G蛋白。然后，在有利于抗体和哺乳动物MPV组分结合条件下，要用于测试抗哺乳动物MPV抗体存在的物质与固体载体孵育。随后，在除去任何非特异性结合抗体条件下，洗涤所述固体载体。在洗涤步骤后，使用任何本领域技术人员已知技术可测定结合抗体的存在。一个特定实施方案中，哺乳动物MPV蛋白-抗体复合物与可检测的标i己抗体孵育，该标记抗体识别不同种类个体产生的抗体，如，如果被试个体是棉鼠，在有利于可检测的标记抗体和与哺乳动物MPV组分结合的抗体的结合条件下，所述可检测的标记抗体结合鼠抗体。一个特定实施方案中，可检测的标记抗体连接一种酶活性。另一个实施方案中，可检测的标记抗体被放射性标记。然后，洗涤哺乳动物MPV蛋白-抗体-可检测的标记抗体的复合物，和随后通过任何本领域技术人员已知技术定量可检测的标记抗体的存在，其中所使用的技术依赖于可检测的标记抗体的标记类型。5.8.6BIACORE分析抗体结合的动力学参数的测定可通过例如，注射250pL不同浓度的在含有0.05%TWEEN-20的HBS緩冲液中的单克隆抗体("mAb")到传感器芯片表面，在所述表面上固定有抗原。所述抗原可以是哺乳动物MPV的任何组分。一个特定实施方案中，该抗原可以是，但不限于，哺乳动物MPV的F蛋白或G蛋白。流速保持在75jiL/min不变。解离数据收集持续15分钟，或视需要更久。随后的每次注射/解离循环，结合的mAb从抗原表面上被除去，虽然其它试剂在该环境下也可正常使用，但主要使用稀酸的1分钟脉冲，尤其是10-100mMHCl。更特殊地，为测定结合速率，k。n，和解离速率，k。ff，通过使用标准的胺偶联化学反应，命名为EDC/NHS方法(EDC-N-二乙氨基丙基)-碳二亚胺)，抗原直接固定在传感器芯片表面上。简单而言，制备5-100nM在10mMNaOAc，pH4或pH5中的抗原溶液并流过EDC/NHS-活化的表面直至大约30-50RU(Biacore共振单位)值的抗原被固定为止。接下来，通过注射1MEt-NH2，未反应的活化的酯被"加帽"除去。在同样的固定化条件下，制备不含有抗原的空白表面作为对照。一旦合适的表面被制备，在HBS/Tween-20中制备每种抗体试剂适当的稀释物系列，并抗原和对照细胞的表面，所述过程是串联的。制备不同范围抗体浓度依赖于平衡结合常数，KD，的估计值。如上所述，在每次注射/解离循环后使用适当的再生剂除去结合抗体。一旦一组完整数据被收集，使用由设备制造厂商BIAcore，Inc.(Piscataway，NJ)提供的算法进行整体拟合所产生的结合曲线。根据1:1Langmuir结合模型所有数据被拟合。这些算法同时计算knn和k。ff，从结果中近似的平衡结合常数KD被推导作为两个速率常数的比值(即，k。n/k,，ff)。如何得到单独速率常数的更详细处理方法可在BIAevaluation软件手册上发现(BIAcore，Inc.,Piscataway，NJ)。5.8.7微量中和试验通过微量中和试验测定抗体或抗原结合片段抑制病毒感染力能力。所述微量中和测定是Anderson等(1985，J.Clin.Microbiol.22:1050-1052，文献全文在此引入作为参考)所述方法的改进。该方法也描述于Johnson等，1999，J.InfectiousDiseases180:35-40，文献全文在此引入作为参考。使用96孔平板制备三份抗体稀释物。1(^TCID^的哺乳动物MPV与抗体或抗原结合片段的系列稀释物孵育，在96孔平板孔中37°C下反应2小时。然后，易感哺乳动物MPV细胞，例如但不限于，Vero细胞(2.5x104)添加到每个孔中并在37。C下，5%C02中培养5天。5天后，吸出培养基，洗涤细胞，用80%甲醇和20%PBS固定平板。然后，通过病毒抗原，如F蛋白的表达测定病毒的复制。固定的细胞与生物素结合的抗病毒抗原孵育，如洗涤抗F蛋白单克隆抗体(如，panF蛋白，C位点特异的Mab133-1H)并添加辣根过氧化物酶结合的抗生物素蛋白到孔中。再次洗涤这些孔并在450nm下测定TMB(硫代硝基苯甲酸)的转换率。被表示为抗体浓度的中和滴度导致源自反含病毒的对照细胞在450nm的吸光度(OD45。)至少50%的减少。本文所述的微量中和试验仅作为一个例子。可替换地，标准的中和试验可用于测定抗体影响病毒的有效程度。5.8.8病毒融合抑制试验除在添加抗体前用相应的病毒感染细胞4小时和示值读数是依据于不融合细胞的存在外，该试验方法原理上和微量中和试验一样。(Taylor等，1992，J.Gen.Virol.73:2217-2223)。5.8.9等温滴定热量测定法通过抗体与它们相应的抗原之间相互作用时的等温滴定热量测定法(ITC)测定热力学亲和力和焓。抗体在透析液中稀释，使用Perkin-ElmerLambda4B分光光度计测量的UV分光吸收值确定其浓度，所述分光光度计使用在280nm的最大峰处的217,000M、m"肖光系数。因为稀释样本的消光系数太低以致无法测定精确浓度，所以可通过原始样本与稀释样本质量比来计算稀释的哺乳动物MPV-抗原的浓度，这样做可以避免使用和浪费大量的样本。等温滴定热量测定法测定使用Microcal，Inc.VP滴定热量计的等温滴定热量测定法可测定抗体的结合热力学。所述VP滴定热量计由比对的样本和附有绝热套的参比容器(1.409ml)及用于滴定配体溶液到样本容器中的旋转搅拌注射器组成。在25°C和35°C下进行等温滴定热量测定法。样本容器含有在磷酸盐緩冲液中的抗体，而参比容器仅含有该緩冲液。磷酸盐緩冲液是来自HyClone，Inc的pH7.4的67mMP04盐。5或lO^il等分试样的0.05-O.lmMRSV-抗原、PIV-抗原和/或hMPV-抗原溶液被分别滴定到样本溶液中3-4分钟直到结合饱和，缺少热交换信号作为结合饱和的证据。一种来自Microcal，Inc的非线性、最小二乘法软件程序Origin5.0被用于拟合i-th滴定总热Qt的增加热(AQ(i)),与总的滴定浓度，Xt，根据如下方程式(1)，Qt=nCtAHb。V{l+Xt/nCt+l/nKbQ-[(l+Xt/nCt+l/nKbCt)2-4Xt/nCt]1/2}/2(la)△Q(i)=Q(i)+dVi/2V(Q(i)+Q(")}-Q(i-l)(lb)其中Ct是样本容器中起始抗体浓度，V是样本容器体积，相对于Kb、AHJ和n的初始值，n是结合反应的化学计量。测定Kb用样本浓度的最佳范围取决于Kb值并为如下关系式所限定。CtKbn^500(2)所以最佳Kb在lfiM时，Kh被测定小于2.5XIOSM1。如果第一次滴定添加物无法拟合结合等温线，其在最后分析中可被忽略，因为其可能反映了在注射器开放溶液界面处的气泡的释放。5.8.10免疫试验免疫沉淀试验通常包含在裂解緩冲液如补充有蛋白磷酸酶和/或蛋白酶抑制剂(如，EDTA，PMSF，159抑肽酶，钒酸钠)的RIPA緩冲液(1%NP-40或TritonX-IOO，1%去氧胆酸钠，0.1%SDS，0.15MNaCl，pH7.2、0.01M磷酸钠，l%Trasylol)中裂解细胞，添加感兴趣的抗体到细胞裂解液中，在4。C下孵育一段时间(如，4小时)，添加蛋白A和/或蛋白G琼脂糖珠到细胞裂解液中，在4°C下孵育大约1小时或更久，在裂解緩冲液中洗涤该珠子并在SDS/样本緩冲液中再悬浮该柱子。感兴趣的抗体和特定抗原的免疫沉淀反应能力可通过如蛋白质印迹分析来评定。本领域技术人员知道可被改良以增加抗体和抗原结合和减少背景的因素(如，用琼脂糖珠预清洗细胞裂解液)。关于免疫沉淀试验的进一步讨论参见，如Ausubel等，编，1994，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.1，JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork的10.16.1页。蛋白质印迹分析通常包含制备蛋白质样本，蛋白质样本在聚丙烯酰胺凝胶中电泳(如，依赖于抗原分子量的8%-20%SDS-PAGE)，从聚丙烯酰胺凝胶上转移蛋白质样本到膜上，如硝酸纤维素膜、PVDF膜或尼龙膜，在封闭溶液(如，含3%BSA的PBS或脱脂奶)中封闭该膜，在洗涤緩冲液(如，PBSTween20)中洗涤该膜，该膜与在封闭緩冲液中稀释的第一抗体(感兴趣的抗体)孵育，在洗涤緩冲液中洗涤该膜，该膜与在封闭緩冲液中稀释的结合有酶底物(如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)或放射性分子(如，12P或121I)的第二抗体(其识别第一抗体，如抗人抗体)孵育，在洗涤緩冲液中洗涤该膜，并检测抗原的存在。本领域技术人员知道可被改良以增加信号检测和减少背景噪声的因素。关于蛋白质印迹方法的进一步讨论参见，如Ausubel等，编，1994，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.1，JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork的10.8.1页。ELISA包含制备抗原，用抗原包被96孔微量滴定板的孔，洗去没有与孔结合的抗原，添加感兴趣的结合有可检测的化合物如酶底物(如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的抗体到孔中并孵育一段时间，洗去未结合的抗体或非特异性结合的抗体，和检测特异性结合包被在孔中的抗原的抗体的存在。在ELISA中感兴趣的抗体可不需要连接可检测的化合物，而连接有可检测的化合物二抗(其识别感兴趣的抗体)可添加到孔中。进一步地，除了用抗原包被孔外，抗体可包被到孔中。因此，可检测的分子可以是连接有可检测化合物如酶底物(如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的抗原。对于本领域技术人员而言，可被改良以增加信号检测的因素和其它不同类型的ELISAs是众所周知的，参见，如Ausubel等，编，1994，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.1，JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork的11.2.1页。抗体(包括scFv或其它包含，或可替换地由抗体片段或其变种组成的分子)对于抗原的亲和力和抗体抗原相互作用的解离速率可通过竟争性结合试验而被测定。竟争性结合试验的一个例子是放射性免疫试验，包含在存在增加的未标记的抗原数量的条件下，标记抗原(如311或1211)与感兴趣的抗体孵育，并检测抗体与标记抗原的结合。5.8.11蔗糖梯度试验可进一步通过使用任何本领域技术人员已知的生化分析方法来研究是否异源蛋白被整合入病毒体中。一个特定实施方案中，蔗糖梯度试验被用于测定是否异源蛋白整合入病毒体中。被感染的细胞的裂解液在20-60%的蔗糖梯度中被分级，选择不;。级分和病毒蛋白通过i斑测定也能;析病毒滴度峰值。如果异源蛋白和病毒体共迁移，那么该异源蛋白与该病毒体相关。5.9鉴定MPV新分离林的方法
技术领域：
：本发明涉及哺乳动物MPV，具体而言是hMPV。虽然本发明提供了鉴定两种血清学亚组MPVA和B，和鉴定四种MPV变种Al、A2、B1和B2的方法，但是本发明不限于那些亚组和变种。本发明包含了迄今为止被鉴定为MFV分离林的任何病毒，包括那些被鉴定属于本文中所述的亚组和变种，或属于迄今为止被鉴定为亚组或变种的病毒。可使用免疫试验来鉴定存在于给定样品中的蛋白质组分。免疫试验是一种有效地比较病毒分离林的方法，其使用病毒肽组分用于鉴定。例如，本文中本发明提供了一种进一步鉴定MPV分离株的方法，本文中所提供的这种方法包含用分离林原型1-2614或相关的分离林接种实质上未感染MPV的或不含有特定病菌的豚鼠或雪貂(详细描述了动物鼻内接种，但其它如肌肉或皮内接种，和使用另外的试验动物，也是可行的)。在0日、接种两周和三周后收集来自动物的血清。在病毒中和(VN)试验(关于VN试验的实施例，见实施例16)和间接IFA(关于IFA的实施例，见实施例11或14)中动物特定的血清转化被测定为抗相应的分离林1-2614和来自血清转化动物的血清被用于免疫学试验所述更多的分离林。作为一个实例，本发明提供了副粘病毒科新成员-人间质肺病毒(MPV)或间质肺病毒样病毒-的特性，该病毒能导致人体严重呼吸道感染(RTI)(因为其最终分类学地位有待于病毒分类学委员会讨论，所以例如本申请中按照相应于APV的方法对MPV特性进行了描述)。MPV所导致疾病的临床症状实质上类似于hRSV所导致的那些症状，如咳嗽、肌痛、呕吐、发热性细支气管炎或肺炎、可能的结膜炎、或其组合。hRSV感染的儿童，特别是年龄很小的儿童可能需要住院治疗。作为一个例子，MPV在2001年1月19日以1-2614保藏号保藏在CNCM，巴斯德研究所，巴黎或于此提供与之系统发育学上相应的病毒分离林。因此，本发明提供了一种包含系统发育学上相应于SEQIDNO:19所示的核酸序列或与之结构上相应的核酸或功能片段的病毒。具体而言，本发明提供了一种在系统发育树分析中测定后被鉴定的病毒，其中使用100次bootstraps和3次jumbles产生了最大似然进化树，发现其在系统发育学上更接近相应于巴黎CNCN中以1-2614保藏号保藏的病毒分离林，而不是接近于也已知为禽鼻气管炎病因的火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)的禽类肺病毒(APV)的病毒分离林。有用的是使用AVP-C病毒分离林在所述的系统发育树分析中作为外类群，虽然其实质上是非哺乳动物病毒，但其是最接近的相关物。5.9.1序列的生物信息学比对两个或更多个氨基酸序列可通过BLAST(Altschul，S.F.等人，1990，J.Mol.Biol.215:403-410)来比对确定它们互相之间的序列同源性和序列同一性。两个或更多个核苷酸序列可通过BLAST(Altschul，S.F.等人，1990，J.Mol.Biol.215:403-410)来比对确定它们互相之间的序列同源性和序列同一性。可使用ClustalW方法(MacVector(tm))进行BLAST比对。一些特定实施方案中，通过电脑程序进行的两个或更多个序列的比对可接着通过手工来再调节。可使用数学算法完成在两个序列之间的同一性百分比的测定。一种优选的，非限制性的用于比对两个序列的数学算法是Karlin和Altschul算法，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268，在Karlin和Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-5877中改良了该算法。所述算法与Altschul等.，1990，J.Mol.Biol.215:403-410.的NBLAST和XBLAST程序结合。用NBLAST程序可进行BLAST核苷酸比对。用XBLAST程序可进行BLAST氨基酸序列比对。要获得用于比对目的的空位比对(gappedalignments),可使用GappedBLAST,其描述于Altschul等人，1997，NucleicAcidsRes.25:3389-3402.。可替换地，PSI-Blast可用于进行检测分子之间远距离关系的叠代搜寻(Altschul等，1997，同上)。当使用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序时，可使用各程序(如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数(参见，http-.〃www.ncbi.nlm.nih.gov)。另一个优选的，非限制性的用于比对序列的数学算法的例子是Myers和Miller算法1988，CABIOS4:11-17。该算法被整合入ALIGN程序(2.0版)，所述ALIGN程序是GCG序列对比软件包的一部分。当使用ALIGN程序比对氨基酸序列时，可使用PAM120重要性残基表。本领域技术人员可设置罚分空位长度。用或不用允许的空位，使用与上述那些技术类似的技术可以测定两个序列之间的同一性百分比。在计算同一性百分比中，典型地只有精确配对被计算在内。5.9.2杂交条件可与哺乳动物MPV的核酸或其反向互补链或其互补链杂交的核酸可用于本发明方法中以测定它们序列相互之间的同源性和同一性。在一些实施方案中，核酸在高严格度条件下杂交。例如但不限于，该方法使用如下所述的高严格度条件。含有DNA的滤膜在由下述成分组成的緩冲液中65°C下预杂交8小时至过夜6XSSC，50mMTris-HCl(pH7.5)，1mMEDTA，0.02%PVP，0.02。/。Ficoll，0.02%BSA，和500|ug/ml变性鲑精DNA。然后将滤膜在含有lOOjig/ml鲑精DNA和5-20X106cpm"P-标记探针的预杂交混合物中65°C下杂交48小时。将膜在含有下列成分的溶液中37。C下洗涤1小时2XSSC,0.01%PVP，0.01%Ficoll和0.01%BSA。接着在0.1XSSC中50°C下洗涤45分钟，然后进行放射自显影。其它可以使用的高度严格条件已为本领域技术人员所熟知。本发明的其它实施方案中，杂交是在中度或低度严格条件下进行的，这些条件已为本领域4支术人员所熟知(参见，如，Sambrook等，1989，MolecularCloning，ALaboratoryManual，2dEd.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork;也参见，Ausubel等人等.，intheCurrentProtocolsinMolecularBiologyseriesoflaboratorytechniquemanuals,1987-1997CurrentProtocols,1994-1997JohnWileyandSons,Inc.)。5.9.3系统发育分析本发明涉及在哺乳动物MPV分离林之间的系统发育关系的推断。有许多方法或手段可用于分析系统发育关系；这些包括距离法(distance),最大似然法(maximumlikelihood),和最大节约法(maximumparsimony)(Swofford，DL，等人，PhylogeneticInference.InMolecularSystematics.Eds.Hillis，DM,Mortiz，C，和Mable，BK.1996.SinauerAssociates:Massachusetts,USA.pp.407-514;Felsenstein,J.，1981，J.Mol.Evol.17:368-376)。此外，bootstrapping技术是一种制备和检查生成的系统发育树的置信区间的有效方法(Felsenstein,J"1985,Evolution.29:783-791).任何使用核苷酸或肽序列信息来比对哺乳动物MPV分离林的方法或手段可用于确定系统发育关系，包括但不限于，距离法，最大似然法，和最大节约法。任何本领域技术员已知方法可用于分析定性系统发育学数据，包括但不限于自举法。用于系统发育学方法的核苷酸或肽序列数据的比对包括但不限于，人工比对，计算机比对比对和计算机多重比对。基于所必需的信息和所考虑的时间，本领域的技术人员应该熟悉优选的要使用的比对方法或系统发育学方法。一个实施方案中，DNA最大似然法用于推断hMPV分离抹之间的关系。另一个实施方案中，bootstrapping技术用于测定使用一种所述的系统发育方法所得到的系统发育学数据的可靠性。另一个实施方案中，为了将序列录入顺序对系统发育分析的影响降至最低，在输入数据前，将跳查技术用于系统发育分析。一个特定实施方案中，DNA最大似然法与bootstrapping技术一起使用。另一个特定实施方案中，DNA最大似然法与bootstrapping技术及jumbling—起使用。另一个更特定实施方案中，DNA最大似然法与50次bootstrap—起使用。另一个特定实施方案中，DNA最大似然法与50次bootstrap及3次jumbles—起使用。另一个特定实施方案中，DNA最大似然法与100次bootstrap及3次jumbles—起4吏用。一个实施方案中，源自hMPV分离林的核酸或肽序列信息与其它hMPV分离林的序列进行比对或比对。氨基酸序列可以是L蛋白、M蛋白、N蛋白、P蛋白或F蛋白的氨基酸序列。另一个实施方案中，源自一个hMPV分离林或许多hMPV分离林核酸或肽序列信息与其它病毒的序列进行比对或比对。另一个实施方案中，系统发育学方法被用于序列比对数据使得系统发育学关系能被推断和/或构建系统发育树。任何使用核苷酸或肽序列信息来比对hMPV分离林的方法或手段可被用于推断所述的系统发育关系，包括但不限于、距离法、最大似然法和最大节约法。其它用于系统发育分析的方法公开于国际专利申请PCT/NL02/00040,公开号为WO02/057302，文献全文在此引入作为参考。具体而言，PCT/NL02/00040在12页27行至19页29行中公开了适合用于系统发育分析的核酸序列，在此引入作为参考。为进行系统发育分析，最有用的是获得作为外类群的将被用于比较的非MPV核酸序列，一个十分有用的外类群分离林可从禽类肺病毒血清型C(APV-C)中获得，参见，如图l6。许多方法和程序是本领域公知的并可用于推断系统发育关系，包括但不限于BioEdit，ClustalW，TreeView，和NJPlot。将被用于比对序列和产生系统发育树或关系的方法应需要输入要比对的序列信息。许多方法或格式是本领域公知的和可被用于输入序列信息，包括但不限于FASTA,NBRF，EMBL/SWISS，GDE蛋白质，GDE核苦酸，CLUSTAL，和GCG/MSF。将被用于比对序列和产生系统发育树或关系的方法应需要输出结果。许多方法或格式可被用于输出信息或结果，包括但不限于CLUSTAL，NBRF/PIR，MSF，PHYLIP，和GDE。在一个实施方案中，ClustalW和DNA最大似然法、100次bootstrap及3次jumbles联合使用以生成系统发育关系。5.10抗体的产生本发明还涉及抗哺乳动物MPV编码的蛋白抗体的产生。具体而言，本发明涉及抗所有MPV抗原抗体的产生，所述抗原包括哺乳动物MPV的F蛋白，N蛋白，M2-l蛋白，M2-2蛋白，G蛋白或P蛋白。根据本
发明内容，任何哺乳动物MPV编码的蛋白，衍生物，类似物或它们的片段可被用于作为免疫原以产生能免疫专一结合该免疫原的抗体。本发明的抗体包括但不限于多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化或嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、Fab表达文库产生的片段、抗个体基因型(抗-Id)抗体(包括，如抗本发明抗体的抗-Id抗体)和表位结合片段。本文中所用的术语"抗体"指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即，含有抗原结合位点可免疫专一结合抗原的分子。本发明的免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，种类(例如IgG,、IgG2、IgG3、IgG4、IgAp和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的例子包括F(ab)和F(ab')2片段，所述片段可通过用酶如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶处理抗体得到。一个特定实施方案中，产生抗人MPV编码蛋白的抗体。另一个实施方案中，产生抗人MPV编码蛋白的结构域的抗体。本领域中已知的许多方法可被用于生产抗哺乳动物MPV编码蛋白的多克隆抗体、衍生物、类似物或它们的片段。为生产抗体，可通过注射天然蛋白或合成的蛋白或它们的衍生物(例如片段)免疫不同的宿主动物，包括但不限于兔、小鼠、大鼠等等。基于宿主的种类，不同的佐剂可被用于增加免疫响应，和包括但不限于弗氏佐剂(完全和不完全)、无机凝胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磚脂、普卢兰尼克多元醇(pluronicpolyols)、聚阴离子、肽、油乳胶、匙孔血蓝蛋白、二硝基盼和潜在的有用的人佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌。为制备抗哺乳动物MPV编码蛋白的单克隆抗体、衍生物、类似物或它们的片段，任何通过培养基中传代细胞系提供用于生产抗体分子的才支术可被4吏用。例如，最初由Kohler和Milstein开发的杂交瘤技术(1975,Nature256:495-497),还有用于产生人单克隆抗体的三元杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等，1983，ImmunologyToday4:72)，和EBV杂交瘤技术(Cole等，1985,inMonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,Inc.,pp.77-96)在本发明一个额外实施方案中，使用新技术在无菌动物体内可生产单克隆抗体(PCT/US卯/02545)。根据本发明的内容，人抗体可被使用和可通过使用人杂交瘤(Cote等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:2026-2030)或通过用EBV病毒在体外转化人B细胞来获得(Cole等，1985，inMonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss，pp.77-96)。实际上，根据本发明的内容，通过剪接来自特异于哺乳动物MPV编码蛋白的鼠抗体分子的基因、衍生物、类似物或它开发了用于产生"嵌合抗体"的技术(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81:6851-6855;Neuberger等，1984，Nature312:604-608;Takeda等.，1985，Nature314:452-454);所述的抗体在本发明范围内。根据本发明的内容，所述的用于产生单链抗体的技术(美国专利4,946,778)可适合用于产生特定的单链抗体。在本发明一个额外实施方案中使用了所述的用于构建Fab表达文库的技术(Huse等，1989，Science246:1275-1281)以快速容易地鉴定具有期望的特异于哺乳动物MPV编码蛋白的单克隆Fab片段、衍生物、类似物或它们的片段。含有个体基因型分子的抗体片段可通过已知的技术来产生。例如，该片段包括但不限于可通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab')2片段；可通过还原F(ab')2片段的二硫键产生的Fab'片段，可通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段，和Fv片段。在生产抗体的过程中，可通过本领域已知的技术来筛选期望得到的抗体，如，ELISA(酶联免疫吸附反应)。例如，要选择识别哺乳动物MPV编码蛋白的特定结构域的抗体，可存在一种产生杂交瘤的方法，其产物结合含有该结构域的哺乳动物MPV编码蛋白的片段。本发明提供的抗体可用于检测MPV和用于治疗MPV感染的治疗方法。人员公知的方法来测定。在一些实施方案中，测试本发明方法产生的抗体的特异性和亲和力如5.8.5，5.8.6，5.8.7，5.8.8或5.8.9节所述。5.11用于鉴定抗病毒剂的筛选方法
技术领域：
：本发明提供了用于鉴定可抑制哺乳动物MPV感染宿主或宿主细胞能力的化合物的方法。在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定可削弱哺乳动物MPV在宿主或宿主细胞中复制能力的化合物的方法。任何本领域技术人员众所周知的技术可被用于筛选可消除或削弱哺乳动物MPV感染宿主和/或在宿主中或在宿主细胞中复制的能力的化合物。一个定实施方案中，该哺乳动物MPV是人MPV。在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定可抑制哺乳动物MPV在哺乳动物或哺乳动物细胞中复制能力的化合物的方法。更特殊地，本发明提供了用于鉴定可抑制哺乳动物MPV感染哺乳动物或哺乳动物细胞能力的化合物的方法。在一些实施方案中，本发明提供了用于鉴定可抑制哺乳动物MPV在哺乳动物细胞中复制能力的化合物的方法。一个特定实施方案中，哺乳动物细胞是人细胞。可用于测定病毒滴度的试验方法详细的描述参见5.7节。在一些实施方案中，细胞与测试化合物接触并用哺乳动物MPV感染。在一些实施方案中，在缺少测试化合物的条件下，对照的培养物用哺乳动物病毒感染。在哺乳动物MPV感染前、感染过程中或感染后细胞可与测试物质接触。一个特定实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。甚至在一个更特定实施方案中，所述细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞与测试化合物孵育至少1分钟、至少5分钟、至少15分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少5小时、至少12小时或至少1天。在试验过程中的任何时间病毒滴度可被测定。在一些实施方案中，在培养物中病毒生长的时间过程被测定。如果在存在测试化合物的条件下，病毒生长被抑制或削弱，该测试化合物被鉴定为能有效地抑制或削弱哺乳动物mpv的生长或感染。一个特定实施方案中，可抑制或削弱哺乳动物mpv生长的化合物被测试其抑制或削弱其它病毒生长速率的能力以测试其对哺乳动物mpv的特异性。在一些实施方案中，模式动物施用一种测试化合物并用哺乳动物mpv感染该模式动物。在一些实施方案中，用哺乳动物病毒感染没有给予测试化合物的对照模式动物。该测试化合物可在哺乳动物mpv感染前、感染过程中或感染后施用。一个特定实施方案中，模式动物是哺乳动物。甚至在一个更特定实施方案中，该模式动物可以是但不限于，棉鼠、小鼠或猴子。在试验过程中的任何时间模式动物中的病毒滴度可被测定。在一些实施方案中，在培养物中病毒生长的时间过程被测定。如果在存在测试化合物的条件下，病毒生长被抑制或削弱，该测试化合物被鉴定为能有效地抑制或削弱哺乳动物mpv的生长或感染。一个特定实施方案中，可抑制或削弱在模式动物中哺乳动物mpv生长的化合物被测试其抑制或削弱其它病毒生长速率的能力以测试其对哺乳动物mpv的特异性。5.12疫苗、抗体及抗病毒药物的配制在一个优选实施方案中，本发明提供了一种由本发明核酸编码的蛋白质样分子或间质肺病毒-特异性病毒蛋白或其功能片段。有用的蛋白质样分子例如源自可获自本发明病毒的任一基因或基因组片段。本及药:"合物如亚-单一位疫^r尽管sh和;或^蛋白或i抗原片段引入作为抗原或亚单位免疫原是特别有用的，但是也可使用灭活的全病毒。特别有用的还有那些由系统发育分析鉴定的重组核酸片段编码的蛋白质样物质，当然优选在可用于系统发育分析鉴定的orf的优选范围和边界内的那些，特别是能够激发mpv特异性抗体或t细胞应答，无论体内(例如，为了保护或者为了提供诊断抗体)还是体外(例如，通过噬菌体展示技术或用于制备合成抗体的任一技术)。另外本申请还提供了抗体，其可以是天然多克隆或单克隆或合成(例如(噬菌体)文库-得到的结合分子)抗体，该抗体与含有本发明所述蛋白质样分子或mpv-特异性功能片段的抗原特异性反应。所述抗体可用于鉴定病毒分离林为MPV的方法，该方法包括让病毒分离林或其组分与本发明提供的抗体反应。这一点可以使用例如纯化或非纯化MPV或其部分(蛋白质、肽)通过ELISA，RIA，FACS或各种形式抗原检测试验(免疫学中现有方法)。可替换地，也可用感染细胞或细胞培养物通过常规免疫荧光或免疫组化技术鉴定病毒抗原。含有本发明所述病毒、核酸、蛋白质样分子或其片段、抗原和/或抗体的药物组合物例如可用于治疗或预防MPV感染和/或呼吸道疾病的方法，该方法包括向个体提供本发明的药物组合物。当所述个体是人的时候这是最有用的。特别是所述人的年龄低于5岁时，因为嬰幼儿最有可能被本发明提供的人MPV所感染。通常，在急性期患者表现出常见于其它呼吸道疾病及其它疾病的上呼吸道症状。另外，也可能下呼吸道疾病，发生常见于更严重及其它严重病症的。本发明的组合物可以用于治疗免疫受损个体，包括癌症患者、移植接受者及老年人。本发明还提供了获得可用于治疗呼吸道疾病的抗病毒药物的方法，该方法包括建立一种含本发明病毒的细胞培养物或实验动物，用候选抗病毒药物治疗所述培养物或动物，测定所述药物对所述病毒或其感染所述培养物或动物的效果。这类抗病毒药物的实例包括MPV-中和抗体或其功能部分，但是其它性质的抗病毒药物也获得。本发明还提供了本发明抗病毒药物用于制备一种药物组合物的用途，具体而言，是用于制备用于治疗呼吸道疾病的药物组合物，特别是因MPV感染或相关疾病引发时，本发明提供了一种含有本发明抗病毒药物的药物组合物，该组合物可用于治疗或预防MPV感染或呼吸道疾病，所述方法包括向个体提供这类药物组合物。本发明的在一些实施方案中，本发明的疫苗含有本发明定义的哺乳动物间质肺病毒。一些更具体的实施方案中，所述哺乳动物间质肺病毒人间质肺病毒。一个优选实施方案中，所述疫苗制剂用哺乳动物间质肺病毒具有减毒的表型。获得减毒表型的方法，参见章节5.6.。本发明提供了用于预防和治疗PIV、RSV、APV和/或hMPV感染的疫苗制剂。在一些实施方案中，本发明的疫苗含有本发明所述重组及嵌合病毒。在一些实施方案中，该病毒是减毒林。在一个具体实施方案中，所述疫苗含有APV，所述疫苗用于预防和治疗人体的hMPV感染。不受理论的限制，由于APV的F蛋白与hMPV的F蛋白高度同源，所以APV感染会导致宿主产生能与hMPV交叉反应的抗体，并保护宿主免受hMPV感染及相关疾病。另一具体实施方案中，所述含有hMPV，该疫苗可用于预防和治疗禽类的APV感染，例如，但不限于火鸡。不受理论的限制，由于APV的F蛋白与hMPV的F蛋白高度同源，所以hMPV感染会导致宿主产生能与APV交叉反应的抗体，并保护宿主免受hMPV感染及相关疾病。在一个具体实施方案中，本发明涉及已经修饰于疫苗制剂中的重组和嵌合APV/hMPV病毒在赋予抗APV和/或hMPV感染方面的用途。在一些实施方案中，APV/hMPV用于禽类施用的疫苗，保护禽类免受APV感染。不受理论的限制，用hMPV基因或核苷酸序列替换APV基因或核苷酸序列导致减毒表型出现使得嵌合病毒可用作疫苗。其它实施方案中，所述APV/hMPV嵌合病毒施用于人。不受理论限制，所述APV病毒栽体在人体内提供减毒表型，hMPV序列的表达激发hMPV特异性免疫应答。在一个具体实施方案中，本发明涉及已经修饰于疫苗制剂中的重组和嵌合hMPV/APV病毒在赋予抗APV和/或hMPV感染方面的用途。在一些实施方案中，hMPV/APV用于人施用的疫苗，保护人免受APV感染。不受理论的限制，用APV基因或核苷酸序列替换hMPV基因或核苷酸序列导致减毒表型出现使得嵌合病毒可用作疫苗。其它实施方案中，所述hMPV/APV嵌合病毒施用于禽类。不受理论限制，hMPV骨架在禽类体内提供减毒表型，APV序列的表达激发APV特异性免疫应答。在一些优选实施方案中，本发明的疫苗制剂用于保护间质肺病毒感染及相关疾病。更具体地，本发明所述的疫苗制剂可用于提供抗人间质肺病毒和/或禽类肺病毒感染及相关疾病的保护。在一些实施方案中，本发明的疫苗制剂用于提供抗下述病毒感染的保护(a)人间质肺病毒和呼吸道合胞病毒；和/或(b)禽类肺病毒和呼吸道合胞病毒。在一些实施方案中，本发明的疫苗制剂用于提供抗下述病毒感染(a)人间质肺病毒及人副流感病毒；和/或(b)禽类肺病毒人副5危感病毒，及相关疾病的保护。在一些实施方案中，本发明所述疫苗制剂用于提供抗由下述病毒感染的保护(a)人间质肺病毒、呼吸道合胞病毒、和人副流感病毒；和/或(b)禽类肺病毒、呼吸道合胞病毒、和人副流感病毒，以及相关疾病的保护。在一些实施方案中，本发明的疫苗制剂用于提供抗人间质肺病毒、呼吸道合胞病毒和人副流感病毒感染及相关疾病的保护。在一些其它实施方案中，本发明的疫苗制剂用于提供抗禽类肺病毒、呼吸道合胞病毒、和人副流感病毒以及相关疾病的保护。由于不同病毒种的F蛋白间高度同源，列举的氨基酸比较参见图9，本发明的疫苗制剂可用于提供针对与编码F蛋白异源核苷酸序列所来源病毒不同的病毒的保护。一个具体的范例性实施方案中，疫苗制剂中含有包含源自禽类肺病毒A型异源核苷酸序列的病毒，所述疫苗制剂用于提供抗禽类肺病毒A型和禽类肺病毒B型的感染。本发明涉及人和动物施用的疫苗制剂，该制剂可用于提供抗APV，包括APV-C、APV-D、hMPV、PIV、流感病毒、RSV、仙台病毒、腮腺炎病毒、喉气管炎病毒、猴病毒5、人乳头状瘤病毒、麻療病毒、腮腺炎病毒、及其它病毒和病原体，以及相关疾病。本发明涉及人和动物施用的疫苗制剂，该制剂可用于提供抗人间质肺病毒感染和禽类肺病毒感染及相关疾病的保护。在一个实施方案中，本发明涉及可用于抗家养动物致病因子的疫苗制剂，包括狂犬病病毒、猫白血病病毒(FLV)以及犬痙热病毒。另一实施方案中，本发明涉及可用于提供家畜抗下述病毒保护的疫苗制剂水泡性口膜炎病毒、狂犬病病毒、牛瘟病毒、猪痘病毒，并且保护野生动物抗狂犬病病毒。用反向遗传学方法获得的减毒病毒可用于本发明所述的疫苗和药物制剂。也可以用反向遗传学向其它病毒基因构建另外对疫苗制备有重要意义的突变-即，可以将有用疫苗林变种的表位构建入减毒病毒。可替换地，可将完整的外源表位包括源自其它病毒或非病毒病原体的抗原，构建入减毒林。例如，将非相关病毒如HlV的抗原(gp160、gpl20、gp41)、寄生虫抗原(例如疟疾)、细菌或真菌抗原或者肿瘤抗原构建入减毒林。可替换地，可将能改变病毒体内嗜性的表位本发明所述的嵌合减毒病毒。实际上，任一异源基因序列都可构建入本发明所述嵌合病毒用于疫苗。优选能作为生物反应调节剂的基元及肽。优选地，可以将能诱导针对大量病原体中任一种的免疫应答的表位或者能与中和抗体结合的抗原通过嵌合病毒或作为其一部分来表达。例如，可以构建入本发明嵌合病毒的异源基因序列包括但不限于流感及副流感病毒的血凝素神经氨酸酶及融合糖蛋白如人PIV3的HN和F基因。另一实施方案中，可构建入嵌合病毒中的异源基因序列包括那些编码具有免疫-调节活性的蛋白的基因序列。具有免疫-调节活性的蛋白的实例包括但不限于细胞因子、1型干扰素、y干扰素、集落刺激因子、白介素-1，-2，-4，-5，-6，-12，以及这些因子的拮抗剂。此外，可以构建入本发明嵌合病毒用于疫苗的异源基因序列包括但不限于源自人免疫缺陷病毒(HIV)的序列，优选1型或2型。在一个优选实施方案中，将一种可作为抗原来源的免疫原性HIV-源的肽构建入嵌合PIV，然后可用其激发脊推动物免疫应答。所述HIV-源的肽可以包括但不限于env基因(即，编码gpl60，gpl20，和/或gp41全长或部分的序列)、pol基因(即，编码反转录酶、内切酶、蛋白酶和/或整合酶全长或部分的序列、gag基因(即，编码p7，p6,p55，p17/18，p24/25全长或部分的序列)，tat，rev，nef，vif，vpu，vpr，和/或vpx。其它异源序列可以源自乙肝病毒表面抗原(HBsAg)、甲肝或丙肝病毒表面抗原、EB病毒糖蛋白、人乳头状瘤病毒糖蛋白；呼吸道合胞病毒、副流感病毒、仙台病毒、猴病毒5或腮腺炎病毒糖蛋白；流感病毒糖蛋白；疱療病毒糖蛋白；脊髓灰质炎病毒的VP1;非病毒病原体如细菌和寄生虫的抗原决定簇，等。另一实施方案中，可以将免疫球蛋白的全部或部分表达。例如，模拟那些可构建入本发明嵌合病毒的表位的抗-独特性免疫球蛋白的可变区。其它异源序列可以源自肿瘤抗原，得到的嵌合病毒用于产生抗肿瘤细胞的免疫应答使得体内肺瘤衰退。这些疫苗可与用于治疗肺瘤的其它治疗方案联用，包括但不限于化疗、放疗、骨髓移植等。依照本发明，可以构建重组病毒表达肿瘤-相关抗原(TAAs)，包括但不限于，T细胞识别的人肿瘤抗原(RobbinsandKawakami，1996，Curr.Opin.Immunol.8:628-636,在此引入作为参考)，黑素细胞世系蛋白(melanocytelineageproteins)，包括gaplOO、MART陽l/MelanA、TRP-l(gp75)、酪氨酸酶；肿瘤-特异性泛在(widelyshared)抗原，MAGE國l，MAGE-3，BAGE，GAGE-1，GAGE-1，N-乙酰葡糖胺转移酶-V，pi5;肿瘤特异性突变抗原，p-连环蛋白，MUM-1，CDK4;乳腺、子宫、子宫颈和胰腺癌的非黑色素瘤抗原，HER-2/neu，人乳头状瘤病毒-E6，-E7，MUC-l。另一实施方案中，异源核苷酸序列源自间质肺病毒，例如人间质肺病毒和/或禽类肺病毒。另一实施方案中，本发明所述病毒含有两不同异源核苷酸序列，其中一个源自间质肺病毒，如人间质肺病毒和/或禽类肺病毒，另一个源自呼吸道合胞病毒。所述异源核苷酸序列各自编码不同病毒的F蛋白或G蛋白。一个具体实施方案中，异源核普酸序列编码F蛋白，其中所述嵌合F蛋白包含间质肺病毒F蛋白的胞外结构域和副流感病毒F蛋白的跨膜结构域及鲁米那结构域。可以配制活重组病毒疫苗也可以配制灭活重组病毒疫苗。优选活疫苗，这是由于宿主体内增殖导致与自然发生感染类型和程度近似的长效刺激，从而赋予充分长效的免疫。这类活重组病毒疫苗制剂的制备可以通过常规方法，包括在细胞培养基或鸡胚尿嚢中增殖病毒，然后进行纯化。在一个具体实施方案中，所述重组病毒对于要施用的宿主来说是非-病原性的。在这点上，使用疫苗用的基因构建病毒需要这些毒林具有减毒特性。将合适突变(例如缺失)引入转染用模板可以提供具有减毒特性的新病毒。例如，可以将与温度敏感或寒冷适应相关的特异性错义突变制成缺失突变。这些突变应该比与冷或温度敏感突变林相关的点突变更稳定，且反转频率极低。或者，可以构建具有"自杀"特性的嵌合病毒。这类病毒只在宿主体内运行1个或数个复制循环。当用作疫苗时，所述重组病毒运行有限复制循环而且引发足够水平的免疫应答但是在人体内不再继续而且不会引发疾病。缺失野生型APV和hMPVl个或多个基因的或者具有相对于野生型毒林而言突变基因的重组病毒，不能进行连续的复制循环。可以用永久表达所述基因的细胞系制备缺陷病毒。缺乏重要基因的病毒可以在这些细胞系中复制，但是当施用给人宿主时则不能完成一个复制循环。所述制剂能够-在这种中断的循环中-转录及翻译出诱导免疫应答足量的基因。替换地，可以施用更大量毒林，所以这些制剂可以灭活(杀死)疫苗使用。对于灭活疫苗而言，优选所述异源基因作为病毒成分表达，以使所述基因产物与毒粒结合在一起。这类制剂的优势是它们含有天然蛋白，而且不必通过福尔马林或制备灭活疫苗用其它试剂灭活。替换地，本发明由cDNA制备的重组病毒可以高度减弱以使其只复制少数几个循环。在一些实施方案中，本发明的疫苗含有减毒的哺乳动物MPV。所述减毒病毒可以用作疫苗，即使该减毒病毒不能使得细胞生成新的感染性病毒颗粒，因为病毒蛋白插入了宿主胞质膜内因而激发了免疫应答。本发明这一方面的另一实施方案，可以通过常规技术"杀死"嵌合病毒制备出灭活的疫苗制剂。灭活疫苗是"死的"，即他们的感染活性已被破坏。理想的，病毒的感染活性被破坏但不影响其免疫原性。为了制备灭活疫苗，可以用细胞培养基或鸡胚的尿囊培养嵌合病毒，通过区带超速离心纯化，用甲醛或p-丙内酯灭活，然后存储起来。得到的疫苗通常通过肌肉内接种。为了增强免疫应答可以用合适的佐剂配制灭活的病毒。所述佐剂包括但不限于矿物胶，例如氢氧化铝；表面活性物质如溶血卵磷脂、pluronic多元醇、聚阴离子；肽；油乳化剂；以及潜在有效人用佐剂，如BCG、小棒状杆菌、ISCOMS及病毒体。许多方法可用于导入上述疫苗制剂，这些方法包括但不限于口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、经皮以及鼻内和吸入途径。优选通过制疫苗用病原体自然感染途径导入嵌合病毒疫苗。在一些实施方案中，本发明涉及免疫原性组合物。所述免疫原性组合物含有哺乳动物MPV。在一个具体实施方案中，所述免疫原性组合物含有人MPV。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物含有减毒的哺乳动物MPV或减毒的人MPV。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物进一步还含有药物学可接受栽体。5.13剂量方案、给药和制剂本发明提供了含有MPV和APV的疫苗和免疫制剂，包括病毒的减毒形式，MPV和APV的重组形式，以及表达一种或多种异源或非天然抗原序列的嵌合MPV和APV。本发明的疫苗或免疫制剂涉及单价或多价疫苗，包括双价及三价疫苗。本发明所述疫苗或免疫制剂用于提供宿主抗呼吸道感染的保护。本发明的重组病毒和/或疫苗或免疫制剂可以单独施用也可与其它疫苗联用。优选地，本发明的疫苗或免疫制剂与能提供抗呼吸道疾病保护的其它疫苗或免疫制剂联用，例如但不限于，呼吸道合胞病毒疫苗、流感疫苗、麻渗病毒疫苗、腮腺炎病毒疫苗、rubella疫苗、pneumococcal疫苗、rickettsia疫苗、staphylococcus疫苗、whoopingcoughvaccines或抗呼吸道癌症的疫苗。在一优选的实施方案中，本发明的病毒和/或疫苗与相应年龄的小儿疫苗同时施用。例如，在2、4或6月龄，与本发明的病毒和/或疫苗可以与DtaP(IM),Hib(IM)，Polio(IPV或OPV)及乙肝(IM)同时施用。在12或15个月龄，本发明病毒和/或疫苗可与Hib(M)、Polio(IPV或OPV)、MMRH(SubQ);Varivax(SubQ)和乙肝(IM)同时施用。能与本发明方法使用的疫苗的综述见各种乂>开文献，例如，TheJordanR印ort2000，DivisionofMicrobiologyandInfectiousDiseases,NationalInstituteofAllergyandInfectiousDiseases,NationalInstitutesofHealth,UnitedStates,在此引入作为参考。本发明的疫苗或免疫制剂可以其本来形式或者以药物或治疗组合物的形式施用给个体。含有佐剂和本发明免疫原性抗原(例如，病毒、嵌合病毒、突变病毒)的药物组合物可以通过常规的混合、溶解、制粒、制糖衣丸剂、磨碎、乳化、包嚢、包载或冷冻加工制备而成。可以用一种或多种有助于将本发明免疫原性抗原制成药用制剂的生理学可接受栽体、稀释剂、赋形剂或辅剂以常规方式配制药物组合物。合适制剂形式依所选施用形式而定。当本发明的疫苗或免疫原性组合物含有佐剂或与一种或多种佐剂一起使用时，可用的佐剂包括但不限于无机盐或无机盐凝胶佐剂、微粒佐剂、粘膜佐剂以及免疫刺激佐剂。佐剂的实例包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝凝胶、氟氏完全佐剂、氟氏不完全佐剂、角鲨烯或角鲨烷水包油佐剂制剂、生物级及生物相容性聚酯、聚合脂质体、三薛系化合物配糖或皂角芬(例如，QuilA和QS-21，也以商标名STIMULON，ISCOPREP出售)、N-乙酰-胞壁酰-L-苏泉酖-D-异谷氨酰胺(Threonyl-MDP，以商标TERMURTIDE销售)，LPS,单磷酰脂质A(3D-MLA，以商标MPL销售)。本发明疫苗或免疫原性组合物的施用对象优选为哺乳动物，最优选为人，但也可以为非-人哺乳动物，，包括但不限于，灵长类、牛、马、绵羊、猪、禽类(例如鸡、火鸡)、山羊、猫、狗、仓鼠、小鼠和啮齿类。许多方法可用于导入本发明的疫苗或免疫组合物，这些方法包括但不限于口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、经皮、鼻内和吸入途径，以及经由刮擦给药(使用例如分叉针头刮擦皮肤上层)。对于局部施用而言，本发明的疫苗或免疫原性制剂可配制成溶液、凝胶、软膏、乳液、悬液等，这些都已为本领域所熟知。对于通过鼻内或吸入施用而言，本发明用的制剂可以通过增压装置或喷雾器以气溶胶形式方便地递送，使用合适的推进剂，例如，二氯二氟甲烷、三氯氟曱烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合适气体。就增压气溶胶而言，剂量单位可以由提供递送计算量的真空管来测定。胶囊及药包，例如吸入器或吹药器用的凝胶可以配制含有由混合物和合适粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。就注射而言，所述疫苗或免疫原性制剂可以配制成含水溶液，优选生理相容緩冲液如Hanks's溶液、林格溶液或生理盐水緩冲液。所述溶液可以含有制剂化的药物，如悬浮、稳定和/或分散的药物。替换地，所述蛋白可以是粉末，在使用前用与合适栽体配制，例如，无热原的灭菌水。疫苗或免疫原性制剂的施用有效量的测定已为本领域技术人员熟练掌握，特别是在本申请提供了详细说明的情况下。有效量起初可以通过体外试验来测定。例如，可以用本领域熟知的技术计算出在动物模型实现诱导免疫应答的量。本领域普通技术人员可以很容易地根据本发明描述的结果优化施用。剂量和给药间隔也可以根据个体作出调整。例如，当作为免疫原性组合物使用时，合适剂量就是当按照上述方法施用时能够激发抗体应答的组合物的量。当用作疫苗时，本发明的疫苗或免疫原性制剂可以在l-36周期间给与1-3份的量。优选地，施用l-2份的剂量，间隔为约2周-约4周，加强接种可以随后定期进行。也可以使用适合动物个体的其它方法。合适剂量是当按照上述方法施用时能够激发被免疫动物免疫应答足以保护该动物至少4-12个月免受感染的组合物的量。通常，剂量中的抗原量为约lpg-约100mg/kg宿主，常用为约10pg-约1mg，优选约100pg-约1Hg。合适剂量因注射途径及患者的大小而定，但是通常为约0.1mL—约5mL。在一具体实施方案中，本发明的病毒和/或疫苗施用的初始剂量为至少103TCID50，至少104TCIDS0，至少105TCIDst,，至少106TCID50。在另一具体实施方案中，本发明的病毒和/或疫苗以多剂量方式施用。在一个优选实施方案中，在2、4及6月龄时首次接种，然后在出生后第二年的年初加强免疫。更优选地，在多剂量接种方案中每一剂量为至少105TCIDsn或至少106TCIDS0。5.13.1攻毒试验该试验用于测定本发明重组病毒及本发明疫苗预防动物模型系统下呼吸道病毒感染的能力，例如，但不限于棉鼠或仓鼠。所述重组病毒和/或疫苗可通过静脉内(IV)途径、肌肉内(IM)途径或鼻内(IN)途径施用。所述重组病毒和/或疫苗可通过本领域任一熟知^支术施用。该试验也可用于分析抗体血清浓度与该抗体所结合病毒的肺滴度减小之间的相互关系。在第0天时，向动物组，例如但不限于棉鼠(Sigmodonhispidi，平均体重綱g)和食蟹猴(cynomolgousmacacque)(平均体重2.0kg)，施用目的重组或嵌合病毒或疫苗或者BSA，通过静脉内注射或鼻内途径。在施用本发明重组病毒或疫苗之前、同时或者之后，使动物感染野生型病毒，其中所述野生型病毒是制备疫苗所用的病毒。在一些实施方案中，用野生型病毒感染所述动物是在施用了本发明重组病毒和/或疫苗后至少1天，至少2天，至少3天，至少4天，至少5天，至少6天、l周或者l或多个月。感染后，宰杀棉鼠，收集其肺组织，通过噬斑滴度测定肺病毒滴度。用牛血清白蛋白(BSA)10mg/kg作为阴性对照。攻毒时血清中抗体浓度用夹层ELISA测定。类似地，在食蟹猴中，可以测定鼻内及肺清洗液中的病毒滴度。5.13.2目标群体在本发明的一些实施方案中，本发明治疗及诊断方法的目标群体是通过年龄限定的。在一些实施方案中，本发明治疗及诊断方法的目标群体特征为除呼吸道感染外的疾病或病症。在一个具体实施方案中，目标群体包括幼儿、低于2岁。更具体实施方案中，为低于2岁且不患有除呼吸道感染外的其它疾病。其它实施方案中，目标群体包括5岁以上患者。更具体实施方案中，5岁以上的患者患有其它疾病或病症包括嚢性纤维化、白血病和非霍奇金淋巴瘤、或者新近接受骨髓或肾移植。在本发明的一具体实施方案中，所述目标群体包括那些hMPV感染与宿主免疫抑制有关的患者。在一具体实施方案中，所述患者为免疫受损个体。在一些实施方案中，本发明目标方法的目标群体包括老年人。在一个具体实施方案中，用本发明方法治疗或诊断的患者在冬季月份感染了hMPV。5.13.3临床试验可以将体外试验及动物模型测试的本发明疫苗或其片段在正常健康成人志愿者中进一步进行安全性、耐受性及药物动力学评价。通过肌肉内、静脉内或者肺部递送系统向志愿者施用单剂量的本发明重组病毒和/或本发明疫苗。所有志愿者在接受单剂量本发明重组病毒和/或本发明疫苗之前至少24小时便开始监测，所有志愿者在临床位置接受单剂量之前至少48小时便开始监测。然后，在接种后的第3、7、14、21、28、35、42、49和56天将志愿者作为门诊病人进行监测。通过流置导液管或用10ml红顶Vacutainer管直接穿刺按下述间隔收集血样(1)施用本发明的的重组病毒和/或本发明的疫苗之前；(2)施用本发明的的重组病毒和/或本发明的疫苗过程中；(3)施用本发明的的重组病毒和/或本发明的疫苗之后的第5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、l小时、2小时、4小时、8小时、12小时、24小时、和48小时；以及(4)施用本发明的的重组病毒和/或本发明的疫苗之后的第3天、7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天和56天。让样本在室温下凝集然后通过离心收集血清。来自患者样本中的抗本发明的重组病毒和/或本发明疫苗的抗体的量可以通过ELISA定量。也可以对PBMC和肺及鼻腔洗液中的T-细胞免疫(细胞毒性T细胞及辅助T细胞应答)进行监测。志愿者血清中抗体浓度水平可以通过下述方法校准将施用本发明的的重组病毒和/或本发明的疫苗后每一收集间隔的血清水平减去前剂量血清水平(背景水平)。对于所有志愿者而言，药物动力学参数可以采用模型-非依赖性方法(Gibaldi等人，eds.，1982，Pharmacokinetics,2ndedition,MarcelDekker，NewYork)从校准后的血清抗体或抗体片段浓度计算得出。5.14检测及诊断哺乳动物MPV的方法
技术领域：
：本发明提供了诊断和/或检测MPV的方式和方法，所述方式及方法用于检测MPV、其组分，以及其转录、翻译产物，表达，增殖及代谢过程。更具体地，本发明提供了用于诊断动物和任MPV感染的方式和方法，所述方式和方法包括但不限于检测MPV组分，MPV生命循环中的产物，以及宿主应答MPV接触或感染的产物。可用于检测MPV或其组分以及其转录、翻译、表达、繁殖和代谢过程的产物的方法是本领域众所周知的，并且包括但不限于基于分子的方法、基于抗体的方法和基于细胞的方法。基于分子的方法的实例包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶PCR(RT-PCR)、实时RT-PCR、基于核酸序列的扩增(NASBA)、寡核苷酸探测、southern印迹杂交、northern印迹杂交以及包括将样本和与MPV互补或者与MPV类似或相同的核酸接触的任何方法，以及这些方法彼此之间或者与本领域已知方法的任何组合。可以使用的相同或类似的核酸如本文所述，并且是本领域众所周知的，能够鉴别MPV与其它病毒和生物体的基因材料或相关产物。基于抗体的方法的实例包括但不限于将怀疑含有MPV的样本与抗体接触，直接免疫荧光法(DIF)，酶联免疫吸附测定(ELISA)，western印迹，免疫色谱法。基于细胞的方法的实例不可但不限于，当暴露于MPV、其组分或其产物时能够发出信号的报道基因测定。在另一个实施方案中，报道基因测定是体外测定，由此报道基因在暴露于MPV、其组分或其产物时表达。上述方法的实例是本领域众所周知的，并且也描述于本文中。在一个更具体的实施方案中，使用NASBA来从总核酸集合扩增特异性RNA或DNA。在一个实施方案中，本发明提供了诊断和检测MPV的方式和方法，所述方式和方法包括但不限于检测与MPV结合或互补的基因组物质或其它核酸，检测MPV的转录及翻译产物，所述产物处理后及未经处理的均可，检测宿主对MPV接触或感染应答的成分。在一个实施方案中，本发明涉及通过下述方法检测MPV:制备和利用互补于核酸序列的寡核苦酸以及存在于MPV基因组中的核酸序列的转录产物。另外，本发明涉及检测存在于MPV基因组中的核酸或其序列及其转录产物，使用所述寡核苷酸作为引物拷贝或扩增MPV的特定区域及其转录物。可被拷贝或扩增的MPV基因组区域及其转录物包括但不限于下列一种或多种基因的全长及非全长序列N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因以及L-基因。一个具体实施方案中，用寡核苷酸作为引物与拷贝或扩增MPVN-基因或其转录物的方法结合，用于鉴定目的。所述方法包括但不限于PCR试验、RT-PCR试验、实时RT-PCR试验、引物延伸或连缀试验、NASBA以及利用MPV的基因材料或其转录物及其互补链作为模板从所述寡核苷酸延伸出核酸序列的其他方法。在另一个实施方案中，使用方法的组合来检测样本中MPV的存在。本领域技术人员熟悉每一试验的需要和可适用性。例如，PCR和RT-PCR可用于扩增或检测核酸。在更具体的实施方案中，使用实时RT-PCR来进行PCR产物的常规且可靠的定量测定。在另一实施方案中，本发明涉及通过下述方法检测MPV:制备和利用与存在于MPV基因组中的核酸序列及其转录产物互补的寡核苷酸。另外，本发明涉及检测存在于MPV基因组或与MPV基因组互补的核酸或其序列及其转录产物，使用所述核苷酸序列作为杂交探针检测存在于或互补于MPV基因组的特定区域及其转录物。能用杂交探针检测的MPV基因组区域及其转录物包括但不限于下列1种或多种基因的全长及非全长序列N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因。一个具体实施方案中，用寡核苷酸作探针与检测、退火或杂交MPVN-基因的方法结合，用于检测目的。所述方法包括但不限于Northern印迹、Southern印迹以及用MPV遗传物质或其转录物及互补链作为杂交、退火或检测存在于或互补于MPV基因组中的序列或部分序列的靶标。能与哺乳动物MPV的核酸或其反向互补链或其互补链杂交的核酸可用于本发明的方法检测哺乳动物MPV的存在。在一些实施方案中，所述核酸在高度严格条件下杂交。例如但不限于，在如下所述的高度严格条件下进行。将含DNA的滤膜在由下列成分组成的緩冲液中65°C下预杂交8小时至过夜6XSSC，50mMTris-HCl(pH7.5)，1mMEDTA，0.02%PVP，0.02%Ficoll，0.02%BSA，和500ng/ml变性鲑精DNA。将滤膜在含有100g/ml变性鲑精DNA和5-20X106cpm"P-标记探针的与杂交混合物中65°C下预杂交48小时。37°C下在含有下列成分的溶液中洗涤滤膜2XSSC，0.01%PVP，0.01%Ficoll，和0.01%BSA。然后50°C下用0.1XSSC洗涤45分钟后进行放射自显影。其它可以使用的高度严格条件已为本领域熟知。在本发明其它实施方案中，在中低度严格条件下进行杂交，这类条件为本领域技术人员熟知(参见，例如，Sambrook等人，1989，MolecularCloning，ALaboratoryManual，2dEd.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork;还参见，Ausubel等人，eds.，theCurrentProtocolsinMolecularBiologyseriesoflaboratorytechniquemanuals，1987-1997CurrentProtocols，1994-1997JohnWileyandSons,Inc.)。在本发明方法中可使用任何大小的寡核苷酸。如本文所述，这样的寡核苷酸可用于多种不同方法中，例如作为引物或探针用于多种不同检测或分析方法中。在优选的实施方案中，寡核苷酸探针和引物为至少5个、至少8个、至少10个、至少12个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少70个、至少80个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少1000个、至少2000个、至少3000个、至少4000个或至少5000个碱基。在另一些实施方案中，寡核苷酸探针和引物包含至少5个、至少8个、至少10个、至少12个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个、至少70个、至少80个、至少100个、至少200个、至少300个、至少400个、至少500个、至少1000个、至少2000个、至少3000个、至少4000个或至少5000个碱基，所述碱基与靶序列例如MPV基因组序列或其补体具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少99%、至少99.5%的同源性。在另一个具体实施方案中，用作引物或探针的寡核苷酸具有任何长度，并且在严格条件下，通过至少8个其最3，末端的碱基与靶序列特异性地杂交。在另一个具体实施方案中，用作引物或探针的寡核苷酸具有任何长度，并且在严格条件下，通过至少10个其最3，末端的碱基与靶序列特异性地杂交。在另一个具体实施方案中，用作引物或探针的寡核苷酸具有任何长度，并且在严格条件下，通过至少12个其最3，末端的碱基与靶序列特异性地杂交。在另一个具体实施方案中，用作引物或探针的寡核苷酸具有任何长度，并且在严格条件下，通过至少15个其最3，末端的碱基与靶序列特异性地杂交。在另一个具体实施方案中，用作引物或探针的寡核苷酸具有任何长度，并且在严格条件下，通过至少20个其最3，末端的碱基与靶序列特异性地杂交。在另一个具体实施方案中，用作引物或探针的寡核苷酸具有任何长度，并且在严格条件下，通过至少25个其最3'末端的碱基与靶序列特异性地杂交。在另一个实施方案中，使用一套简并的寡核苷酸(oligos)，这样特定的位置或核苷酸被替换。简并可在任何位置或任何数目的位置上，最优选至少一个位置，以及至少2个位置，至少3个位置，至少IO个位置上，在能够于严格条件下与靶序列杂交的区域中发生。通过本领域已知的试验，本领域技术人员能够知道对于寡核苷酸的结构要求。还可以使用更系统的方法来设计寡核苷酸探针和引物。例如，根据优选的测定或退火温度以及寡核苷酸的结构，即序列，本领域技术人员能够确定寡核苷酸引物或探针的适当长度和序列。此外，通过调节测定的温度以根据温度提高或降低寡核苷酸对于靶序列的特异性，本领域技术人员能够确定采用寡核苷酸引物或探针的试验的特异性。在优选的实施方案中，使用本领域已知的方法确定引物或探针的退火温度，并且在所述温度进行试验。本领域技术人员熟悉计算与寡核普酸有关的退火温度一对于其特定靶序列。例如，退火温度可以这样粗略计算给与靶序列杂交的寡核苷酸中的每个G或C核苷酸指定4°C的退火温度。在另一个实例中，退火温度可以这样粗略计算给与靶序列杂交的寡核苷酸中的每个A或T核苷酸指定2°C的退火温度。寡核苷酸的退火温度必须取决于寡核苷酸的长度和序列，以及取决于寡核苷酸与靶序列的互补性，这样只有寡核苷酸引物或探针之间的结合事件作为退火温度的考虑要素。本文所述的计算退火温度的实例仅是举例，不是限制本发明不能采用其它确定退火温度的方法。本领域技术人员熟悉可使用的其它方法，并且此外，本文已经描述了计算寡核苷酸的退火或熔化温度的更精确的方法。在一个更具体的实施方案中，寡核苷酸探针和引物在以下温度退火至少30。C，至少35°C，至少40°C，至少45°C，至少50°C，至少55°C，至少60°C，至少65°C，至少70°C，至少80°C，至少90°C或至少99°C。本发明提供了用于鉴定或检测样本中MPV的基于细胞或无细胞的试验。可使用多种不同方法来进行本发明的基于细胞或无细胞的试验，包括但不限于使用报道基因的那些。本文描述了报道基因的实例，并且其可用于使用高输出量筛选的MPV的鉴定或检测，以及用于本领域技术人员已知的任何其它目的。有多种方法可用于本发明的报道基因试验。例如，基于细胞的试验可通过将样本与含有包含报道基因的核酸序列的细胞接触来进行，其中报道基因与MPV基因的启动子连接，或者与能够被MPV基因产物识别的MPV基因的启动子连接，并且在暴露于MPV或MPV的组分时测定报道基因的表达。在基于细胞的试验的另一实施方案中，将能够被MPV感染的宿主细胞用编码一个或多个报道基因的核酸构建物转染，这样在MPV或MPV的组分存在下，发生从报道基因的表达。在这样的实施方案中，报道基因的表达与能够被MPV或其组分识别的核酸序列可操纵地连接，由此引起报道基因的表达。样本中存在的MPV诱导报道基因的表达，这可使用本领域已知的以及本文描述(5.8.2节)的任何方法来检测。可于Vero、tMK、COS7细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是可以用MPV感染的任何细胞。由此，报道基因的表达成为MPV或其组分存在的指示。在无细胞的试验中，将样本与包含报道基因的核酸接触，所迷报道基因与核酸序列可操纵地连接，这样存在的MPV或其组分诱导报道基因在体外的表达。例如，无细胞的试验可以通过将被怀疑含有MPV或其组分的样本与包含报道基因的核酸接触，其中所述报道基因与MPV基因的启动子连接或者与能够被MPV基因产物识别的启动子连接，并且在暴露于MPV或MPV的组分时测定报道基因的表达。由此，报道基因的表达成为MPV或其组分存在的指示。虽然有大量报道基因是本领域已知的，但是本文提供了多个实例(参见例如5.8.2节)。在另一个实施方案中，本发明涉及使用微复制子系统来检测MPV感染。例如，可以使用编码一个或多个报道基因的hMPV微复制子构建物来转染宿主细胞，这样在hMPV或hMPV聚合酶存在下发生报道基因的表达。本文在5.8.2节描述了报道基因的实例。在这样的实施方案中，hMPV起辅助病毒的作用以促进报道基因或微复制子系统所编码的基因的表达。不限于此，hMPV提供了驱动微复制子系统的拯救，并由此驱动报道基因或基因表达的聚合酶。在一些实施方案中，将已经用编码报道基因的hMPV微复制子转染的宿主细胞与被怀疑含有hMPV的样本接触。样本中存在的hMPV诱导报道基因的表达，这可使用本领域已知的以及本文描述(5.8.2节)的任何方法来检测。宿主细胞的实例包括但不限于Vero、tMK、COS7细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是可以被hMPV感染的任何细胞。在另一实施方案中，本发明涉及通过制备和使用抗体检测动物或人宿主的MPV感染，例如特异性针对并且能识别MPV特征肽或核酸或者其基因产物的单克隆抗体(MAb)。被所述MAb识别的表位或抗原决定簇包括但不限于MPV增殖涉及的生命循环及代谢过程合成的蛋白及核酸产物。可用作抗原决定簇制备合适抗体的蛋白或核酸产物包括但不限于下列一种或多种下列MPV成分的完全及不完全转录和表达产物N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因。在一个具体实施方案中，将用G-基因或其部分的蛋白质产物产生的MAb与其它方法结合使用以检测或确证生物样本例如体液中存在表达G肽的MPV。所述方法包括但不限于ELISA、放射-免疫或竟争试验、免疫-沉淀以及用转录或表达的MPV行检测的其它方法。在本发明的另一个实施方案中，可用于检测hMPV的抗体识别所有4种亚型的F、G、N、L、M、M2-l、P和SH蛋白。在另一实施方案中，本发明涉及检测与宿主对MPV接触或感染应答相关且为其特征的因子。当接触或感染MPV时，宿主的免疫系统启动针对所述接触或感染的应答，宿主产生抗体消除或减弱病毒的效力和/或增殖。本发明提供了通过检测所述抗体诊断MPV相关疾病的器具和方法，该抗体因宿主接触或感染MPV而产生。被所述抗体识别的表位包括但不限于能接触宿主免疫应答且能充当宿主产生抗病毒免疫应答的抗原决定簇的肽及其暴露表面。被宿主免疫应答用作表位制备抗体的蛋白及核酸物质包括但不限于下列一种或多种MPV组分的产物N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因以及L-基因。在一个实施方案中，对宿主样本中MPVN-基因编码肽的部分或完全可接触部分的抗体进行检测。在一个具体实施方案中，G-基因或其部分的蛋白质产物与其它方法结合使用，检测生物样本例如体液中宿主来源抗体的存在。所述方法包括但不限于ELISA、放射-免疫或竟争试验、免疫-沉淀以及用MPV转录和表达的基因产物作为靶标通过可识别所述产物且发现于生物样本中的抗体进行检测的其它方法。本发明还提供了诊断试验或测试试剂盒用的方式和方法，以及用于检测各种来源包括但不限于生物样本如体液的MPV感染因子的方法。在一个实施方案中，本发明涉及适于鉴定MPV核酸或其互补链的试验、试剂盒、程序以及方法。在另一实施方案中，本发明涉及适于鉴定宿主对MPV接触或感染应答的试验、试剂盒、程序以及方法。除诊断确证宿主MPV感染外，本发明还提供了将MPV分离林化分为不同系统发育组或亚组的方式和方法。在一个实施方案中，为了设计出更有效且具亚组特异性的治疗方法，用这特征可以方便地区分MPV不同变种，变种A1、A2、B1和B2。可以根据一种或多种下列基因的核苷酸或氨基酸序列对MPV的变种加以区分N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因以及L-基因。一个具体实施方案中，可以用G基因的核苷酸或氨基酸序列或者糖蛋白以及使用还识别G糖蛋白的单克隆抗体的中和试验，将MPV化分为特异性亚组。在一个实施方案中，人类MPV感染的诊断可以采用本领域技术人员熟知的任一技术，例如免疫测定。可用于分析免疫特异性结合及交叉反应的免疫测定包括但不限于竟争性及非竟争性测定系统，使用例如western印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)，夹层免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散反应、免疫扩散试验、凝集试验、补体结合试验以及免疫荧光免疫测定等技术。这些测定试验是常规的并且已为本领域熟知(参见，例如，Ausubel等人，eds，1994，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.1，JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,在此引入作为参考)，免疫测定的非限制性实例描述见章节5.8。在一个实施方案中，本发明涉及用寡核苷酸与拷贝或扩增MPV基因组区域的PCR或引物引伸方法结合检测MPV感染，所述区域包括但不限于基因或基因的部分，例如N，M，F，G，L，M，P，和M2基因。在一个具体实施方案中，将寡核苷酸与RT-PCR方法结合使用。在另一实施方案中，用互补于特异性序列的寡核苷酸作为探针对扩增产物和/或遗传物质进行探测，该特异性序列可以是各个hMPV毒林共有的保守序列也可以是不同hMPV毒林的独特序列。后一套寡核苷酸可以对引发宿主感染的hMPV特异性毒林进行鉴定。本发明提供了对能够感染宿主的hMPV的不同亚组及变种加以区分的方法。一个具体实施方案中，对宿主感染负责的hMPV被化分为特异性亚组，例如亚组A和亚组B。另一个具体实施方案中，对宿主感染负责的hMPV被化分为亚组的特异性变种，例如变种Al、A2、Bl或B2。另一实施方案中，本发明提供了将对宿主感染负责的hMPV被化分为新的亚组和/或新的或已有亚组的新变种的器具和方法。能将hMPV毒林化分为亚组和/或变种组的方法已为本领域所知。在一个实施方案中，用多克隆抗体将感染的致病因子鉴定为hMPV毒林，用第二抗体将所述毒林区分为新的或已知的亚组和/或hMPV新的或已知的变种。在一个实施方案中，将选择性针对hMPV的抗体与免疫测定，例如ELISA或RIA结合使用，检测生物样本存在hMPV接触或感染。在另一实施方案中，用选择性针对hMPV蛋白肽序列中特异性表位的第二抗体将所述鉴定了的hMPV感染的致病因子进一步化分为亚组或变种。在一个具体实施方案中，用hMPV所有亚组共有的肽表位产生抗体，用该抗体鉴定感染的致病因子为hMPV。在另一个具体实施方案中，用hMPV不同亚组和/或变种所独有的肽表位产生抗体，用该抗体将引发宿主感染的hMPV区分为已知或新亚组和/或变种。在一个具体实施方案中，能够区分hMPV不同亚组和/或变种的抗体能够识别被该亚组或变种特有的hMPV肽节段，所述肽包括但不限于由N,M，F，G，L，M,P，和M2基因编码的肽。用于产生能区分hMPV不同亚组和/或变种的抗体的肽或肽节段的选择可以通过下述方法完成将不同hMPV蛋白已知肽序列间的差异与能鉴定出可溶剂暴露或者可为诊断试验获得的合适肽节段的亲水图谱结合使用。在一个实施方案中，能区分hMPV不同亚组的抗体能够识别F蛋白间的差异，hMPV不同亚组的F蛋白各不相同，例如，全长F蛋白的第286、296、312、348和404位氨基酸。在另一具体实施方案中，能区分hMPV不同亚组和/或变种的抗体能够识别hMPVG蛋白的节段，这些节段对于特定亚组或变种来说各不相同，例如，可以用对应于SEQID:119第50-60位氨基酸的G肽序列区分亚组A和B以及变种Al、A2、Bl，和B2。本发明的另一实施方案中，利用hMPV分离林的核苷酸序列区分hMPV的不同亚组和/或不同变种。一个实施方案中，利用与hMPV基因组中序列互补的寡核苷酸序列、引物和/或探针将hMPV感染的致病因子化分为不同亚组和/或变种，与本领域技术人员已知的方法结合进行，例如RT-PCR、PCR、引物连缀测定以及各种印迹技术。在一个具体实施方案中，通过RT-PCR用生物样本拷贝或扩增出hMPV基因组的特异性节段。另一实施方案中，获得所述节段的序列并将其与hMPV已知序列进行比较，通过所述比较将hMPV毒林划分为不同亚组或变种或者将hMPV毒林区分为一种新的亚组或变种。在另一实施方案中，本发明涉及诊断试剂盒，用该试剂盒可以区分hMPV的不同亚组和/或变种。在一个优选的实施方案中，特定病毒感染的诊断和/或治疗利用试剂来完成，这些试剂针对导致所述感染的所述特定病毒具有最强的特异性。这种情况下，这就意味着优选用MPV最特异性的试剂诊断和/或治疗MPV感染。但是这决不排除使用特异性较差但足以交叉反应试剂的可能，例如因为它们更容易获得且能迅速充分完成任务。本申请例如提供了用源自APV的试剂完成哺乳动物MPV感染的病毒学和/或血清学诊断，具体而言是用源自APV-C的试剂，从本申请详述部分可以看出MPV感染的充分可信的血清学诊断可以通过为检测禽类APV抗体专门设计的ELISA试验来完成。实现该目的特别有效的试验是为检测APV抗体(例如，在血清或蛋黄中)设计的ELISA试验，该试验的一种商业化形式被称为APV-AbSVANOVIR⑧，由SVANOVABiotechAB，UppsalScienceParkGIuntenSE-75183UppsalaSweden制造。反之亦然，本申请例如提供了用源自MPV的试剂完成哺乳动物APV感染的病毒学和/或血清学诊断，从本申请详述部分可以看出APV感染的充分可信的血清学诊断可以通过为检测禽类MPV抗体专门设计的ELISA试验来完成。考虑到抗原与抗体间存在着如同一把钥匙对应一把锁的关系，所以，可以各种抗原的检测通过选用具有充分交叉反应性的合适抗体来完成。当然，由于依赖于这种交叉-反应性，所以最好选择体现不同病毒的不同(糖)蛋白间氨基酸同源性的试剂(例如抗原或抗体)，因此与最同源蛋白相关的试剂在依赖所述交叉-反应性的试验中最有用。就核酸检测而言，就更加直接，根据不同病毒的同源核酸序列设计引物或探针，从而检测绝大部分哺乳动物或禽类间质肺病毒之间的差异，根据那些高度同源的病毒特异性核酸序列设计或选择引物或探针是切实可行的。通常，就核酸序列而言，90%或更高同原性能够确保使用严格条件杂交的诊断试验所依赖的足够的交叉反应性。本发明提供了一种病毒学诊断动物MPV感染的方法，所述动物具体为哺乳动物，更具体为人，该方法包括通过让所述样本与本发明的MPV特异性蛋白分子或其片段或者抗原反应，测定所述动物的样本中是否存在病毒分离林或其组分。本发明提供了一种用于诊断MPV感染的诊断试剂盒，其中包括本发明所述的MPV、MPV特异性核酸、蛋白分子或其片段、抗原和/或抗体，以及优选的一种用于检测所述MPV、MPV特异性核酸、蛋白分子或其片段、抗原和/或抗体的器具，该器具例如含有本领域使用的可活化基团如荧光或酶促检测系统(合适的诊断试剂盒模式的实例包括IF，ELISA，中和试验，RT-PCR试验)。为了证实一种还未经鉴定的病毒成分或其合成类似物如核酸、蛋白分子或其片段是否能鉴定为MPV特异性的，需要对所述成分的核酸或氨基酸序列进行分析，例如对一段所述的核酸或氨基酸进行分析，优选至少10个，较优选至少25个，更优选至少40个核苷酸或氨基酸(分别)，通过本发明提供的系统发育分析与已知的MPV序列以及与已知的非MPV序列(优选使用APV-C)进行同源性分才斤。根据与所述MPV或非MPV序列之间的相关程度可以对所述组分或合成类似物实现鉴定。本发明还提供了一种病毒学诊断哺乳动物MPV感染的方法，该方法包括通过让所述样本与源自APV(优选血清型C)的交叉反应性核酸或者与可与所述APV交叉反应的抗体反应，测定所述哺乳动物的样本中是否存在病毒分离林或其组分；以及一种血清学诊断哺乳动物MPV感染的方法，该方法包括通过让所述样本与源自APV的蛋白分子或其片段或者抗原反应，测定所述哺乳动物的样本中是否存在还针对APV或其组分的交叉反应性抗体。另外，本发明还提供了原本为APV或APV抗体检测而设计的诊断试剂盒在诊断MPV感染中的用途，具体为用于检测人体的所述MPV感染。本发明还提供了一种病毒学诊断禽类APV感染的方法，该方法包括通过让所述样本与源自MPV的核酸或与所述MPV交叉反应的抗体反应，测定所述禽类样本中是否存在病毒分离林或其组分；以及一种血清学诊断禽类APV感染的方法，该方法包括通过让所述样本与源自MPV的蛋白分子或其片段或者抗原反应，测定所述哺乳动物的样本中是否存在还针对MPV或其组分的交叉反应性抗体。另外，本发明还提供了原本为MPV或MPV抗体检测而设计的诊断试剂盒在诊断APV感染中的用途，具体为用于检测家禽的所述APV感染，如鸡、鸭或火鸡。对于为治疗目的而进行的诊断，可以利用不同哺乳动物MPV之间以及MPV与其它病毒如APV之间的高度同源性，特别是当周围环境使得更同源的方法使用更为繁瑣时。紧急接种，例如抗MPV的紧急接种可以用例如源自APV(优选C型)分离林的疫苗制剂实现，特别是当同源性更高的MPV疫苗无法获得时，反之亦然，抗APV的接种可以用例如源自MPV的疫苗制剂实现。另外，反向遗传技术使得制备可用作疫苗的嵌合型APV-MPV病毒构建体成为可能，该构建体与被减毒至期望水平的每种毒林的野外分离组具有足够的相异性。类似的反向遗传技术还使得制备嵌合型副粘病毒-间质肺病毒构建体成为可能，例如用于疫苗制剂的RSV-MPV或P13-MPV构建体。所述构建体尤其可用作联合疫苗对抗呼吸道疾病。由于MPV与hRSV或hPIV-1在tMK或其它细胞培养物上的CPE无法区分，所以直到现在MPV还不能很好的观察。优先使用tMK(第三代猴肾细胞即在细胞培养物传至第三代的MK细胞)，这是因为其与第一或第二代培养物相比成本较低。所述CPE与一些常见副粘病毒的CPE相同，特征为当细胞表现出快速内部裂解后形成合胞体，接着细胞从培养物单层上脱落下来。细胞通常(但不总是)在病毒从原代物质传三代后显示CPE，在接种后10至14天，其它病毒如hRSV或hPIV-l出现CPE的时间稍晚。作为一个实例，本发明提供了一种此前还未鉴定的副粘病毒，该病毒出自28名患有严重RTI的患儿的鼻咽吸气样本。这些患儿的临床症状与hRSV引发的症状大体相似。其中的27个患儿年龄小于5岁，他们中的一半为1-12月龄。另一个患者为18岁。所有个体患有上RTI，症状从咳嗽、肌痛，呕吐和发烧直到支气管炎及严重肺炎。这些患者中的大部分入院1-2周。来自这些患者的病毒分离林在负对比电子显微镜下呈现副粘病毒的形态，但是不与抗已知的人及动物副粘病毒的特异性抗血清反应。它们彼此间都紧密相关，当用抗其中两分离林的血清进行间接免疫荧光试验1FA)测定时。这些分离林中的9林的序列分析表明该病毒与APV有些相关。根据病毒学数据、序列同源性以及基因组组成，我们指出该病毒是间质肺病毒属的成员。血清学调查显示该病毒是一种很常见的病原体，因为在荷兰5岁人群的血清阳性率近乎100%。另外，1958年收集的人体血型也发现了同样高的血清阳性率，这说明该病毒在人群周围已经存在了40年以上。这种间质肺病毒属性成员的鉴定还为开发诊断试验或测试试剂盒所用的器具和方法以及对抗病毒呼吸道感染的疫苗或血清或抗体组合物提供了可能，以及为发展用于测试或筛选治疗MPV感染用抗病毒药物的方法提供了可能。本发明提供的方法和器具特别是可用于诊断MPV感染用的诊断试剂盒，不管是病毒学还是血清学诊断。所述试剂盒或测定可以例如包括本发明所述的病毒、核酸、蛋白分子或其片段、抗原和/或抗体。本发明还提供了本发明所述的病毒、核酸、蛋白分子或其片段、抗原和/或抗体用于制备药物组合物的用途，所述组合物是例如用于治疗或预防MPV感染和/或用于治疗或预防呼吸道疾病的药物组合物，特别是人。病毒的减毒可以通过建立用于该目的的方法实现，包括但不限于其它种类相关病毒的使用，通过实验动物和/或组织/细胞培养物连续传代，分子克隆的定点诱变或者相关病毒间基因或基因片段的交换。已经描述了hMPV的4种不同亚型，称为亚型Al、A2、B1和B2。本发明涉及使用对所有4种亚型都敏感的单一试验来检测宿主中的hMPV。可使用本领域已知的任何方法来检测宿主中hMPV的存在。在本发明的一个更具体的实施方案中，使用敏感的Taqman试验来检测宿主中hMPV的存在。本领域技术人员熟悉用于这样的测定的寡核苷酸和探针的设计的要求。可以设计这样的寡核苷酸和探针以特异性地识别hMPV基因组的任何区域、其转录物或加工和未加工的产物。在本发明的一个更具体的实施方案中，本发明寡核苷酸和探针与hMPV的所有亚型、其转录物或加工和未加工的产物例如Al、Bl、A2和B2互补或相同或类似。特别是，寡核苷酸和探针与hMPV的所有亚型、其转录物或加工和未加工的产物具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99°/。或99.5%的同一性。在另一个实施方案中，其与hMPV的所有四种亚型中的序列的正或负拷贝互补。在本发明试验的检测中可使用任何长度的寡核苷酸和探针。可使用的典型的杂交和洗涤条件是本领域已知的。优选地，条件使得能够让探针特异性地结合以及防止非特异性结合或易于除去非特异性结合。在本发明的另一个更具体的实施方案中，本发明的寡核苷酸和探针与hMPV基因组内的任何开放读框，包括但不限于N-基因、P-基因、F-基因、M-基因、M2-基因、SH-基因、G-基因和L-基因，或其加工和未加工的产物互补。在本发明的一个甚至更具体的实施方案中，本发明的寡核苷酸和探针识别N-基因、其转录物或加工和未加工的产物。在另一个实施方案中，所有4种亚型的hMPV以相同的特异性被识别。病毒可以从可得自宿主的任何生物样本中分离出来。在本发明的一个更具体的实施方案中，从宿主中收集鼻咽样本，以用于本发明的检测试验。可以在能够支持hMPV的多种不同细胞系，包括但不限于Vero和tMK细胞中繁殖病毒以用于检测目的。病毒RNA的检测可以使用本领域技术人员已知的多种方法来进行。在一个更具体的实施方案中，使用基于TaqmanPCR的方法来进行病毒RNA检测。5.15本发明的组合物以及哺乳动物间质肺病毒的组分本发明涉及哺乳动物MPV的核酸序列、哺乳动物MPV的蛋白质、以及抗哺乳动物MPV的蛋白质的抗体。本发明进一步还涉及哺乳动物MPV核酸序列的同系物以及哺乳动物MPV蛋白质的同系物。本发明进一步还涉及编码融合蛋白的核酸序列，其中所述融合蛋白含有哺乳动物MPV蛋白质或其片段以及一种或多种非源自哺乳动物MPV的肽或蛋白质。在一个具体实施方案中，本发明的融合蛋白质含有哺乳动物MPV蛋白质或其片段以及一种肽标记物，例如，但不限于一种聚组氨酸标记物。本发明进一步还涉及融合蛋白，其中所述融合蛋白含有哺乳动物MPV蛋白质或其片段以及一种或多种非源自哺乳动物MPV的肽或蛋白质。本发明还涉及编码哺乳动物MPV蛋白质的核酸的衍生物。本发明还涉及哺乳动物MPV蛋白质的衍生物。衍生物可以是，但不限于，该蛋白的突变形式，例如，但不限于添加、缺失、截短、替换和反转。衍生物还可以是哺乳动物MPV蛋白质的嵌合形式，其中所述蛋白的至少1个结构域源自不同的蛋白质。衍生物还可以是哺乳动物MPV蛋白质与另一分子如药物共价或非共价连接的一种形式。名为NL/1/00(又名00-1)的病毒分离林是哺乳动物MPV变种Al，其基因组序列如SEQIDNO:19所示。名为NL/17/00的病毒分离林是哺乳动物MPV的变种A2，其基因组序列如SEQIDNO:20所示。名为NL/1/99(又名99-1)的病毒分离林是哺乳动物MPV的变种Bl，基因组序列如SEQIDNO:18所示。名为NL/1/94的病毒分离林是哺乳动物MPV的变种B2，基因组序列如SEQIDNO:21所示。本申请公开的一系列序列及其相应的序列编号列于表14。哺乳动物MPV的蛋白质可以是N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-l蛋白或M2-2蛋白或其片段。哺乳动物MPV蛋白质的片段的长度可以为至少25个氨基酸、至少50个氨基酸、至少75个氨基酸、至少100个氨基酸、至少125个氨基酸、至少150个氨基酸、至少175个氨基酸、至少200个氨基酸、至少225个氨基酸、至少250个氨基酸、至少275个氨基酸、至少300个氨基酸、至少325个氨基酸、至少350个氨基酸、至少375个氨基酸、至少400个氨基酸、至少425个氨基酸、至少450个氨基酸、至少475个氨基酸、至少500个氨基酸、至少750个氨基酸、至少1000个氨基酸、至少1250个氨基酸、至少1500个氨基酸、至少1750个氨基酸、至少2000个氨基酸或至少2250个氨基酸。哺乳动物MPV蛋白质的片段的长度可以为至多25个氨基酸、至多50个氨基酸、至多75个氨基酸、至多100个氨基酸、至多125个氨基酸、至多150个氨基酸、至多175个氨基酸、至多200个氨基酸、至多225个氨基酸、至多250个氨基酸、至多275个氨基酸、至多300个氨基酸、至多325个氨基酸、至多350个氨基酸、至多375个氨基酸、至多400个氨基酸、至多425个氨基酸、至多450个氨基酸、至多475个氨基酸、至多500个氨基酸、至多750个氨基酸、至多IOOO个氨基酸、至多1250个氨基酸、至多1500个氨基酸、至多1750个氨基酸、至多2000个氨基酸或至多2250个氨基酸。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为N蛋白，其中所述N蛋白与哺乳动物MPV的N蛋白，例如SEQIDNO:18，SEQIDNO:19，SEQIDNO:20或SEQIDNO:21，(参见，表14对这些SEQIDNO的描述)所示病毒基因组编码的N蛋白，在系统发育上的相关程度比与APVC型的N蛋白在系统发育上的相关程度更密切。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为P蛋白，其中所述P蛋白与哺乳动物MPV的P蛋白，例如SEQIDNO:18，SEQIDNO:19，SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因组编码的P蛋白，在系统发育上的相关程度比与APVC型的P蛋白在系统发育上的相关程度更密切。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为M蛋白，其中所述M蛋白与哺乳动物MPV的M蛋白，例如SEQIDNO:18，SEQIDNO:19，SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因组编码的M蛋白，在系统发育上的相关程度比与APVC型的M蛋白在系统发育上的相关程度更密切。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为F蛋白，其中所述F蛋白与哺乳动物MPV的F蛋白，例如SEQIDNO:18，SEQIDNO:19，SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因组编码的F蛋白，在系统发育上的相关程度比与APVC型的F蛋白在系统发育上的相关程度更密切。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为M2-l蛋白，其中所述M2-l蛋白与哺乳动物MPV的M2-1蛋白，例如SEQIDNO:18，SEQIDNO:19,SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因组编码的M2-l蛋白，在系统发育上的相关程度比与APVC型的M2-l蛋白在系统发育上的相关程度更密切。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为M2-2蛋白，其中所述M2-2蛋白与哺乳动物MPV的M2-2蛋白，例如SEQIDNO:18,SEQIDNO:19，SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因组编码的M2-2蛋白，在系统发育上的相关程度比与APVC型的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度更密切。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为G蛋白，其中所述G蛋白与哺乳动物MPV的G蛋白，例如SEQIDNO:18，SEQIDNO:19，SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因组编码的G蛋白，在系统发育上的相关程度比与APVC型的任一蛋白在系统发育上的相关程度更密切。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为SH蛋白，其中所述SH蛋白与哺乳动物MPV的SH蛋白，例如SEQIDNO:18，SEQIDNO:19，SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因组编码的SH蛋白，在系统发育上的相关程度比与APVC型的任一蛋白在系统发育上的相关程度更密切。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为L蛋白，其中所述L蛋白与哺乳动物MPV的L蛋白，例如SEQIDNO:18，SEQIDNO:19，SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒基因组编码的L蛋白，在系统发育上的相关程度比与APVC型的任一蛋白在系统发育上的相关程度更密切。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为N蛋白，其中所述N蛋白与SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20，或SEQIDNO:21所示病毒基因组编码的N蛋白的氨基酸序列(各个N蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:366-369所示；也参见表14)之间具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为P蛋白，其中所述P蛋白与SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、或SEQIDNO:21所示病毒基因组编码的P蛋白的氨基酸序列(各个P蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:374-377所示；也参见表14)之间具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85/、至少卯％、至少95%、至少98%、至少99%或至少".5%的序列同一性。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为M蛋白，其中所述M蛋白与SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20，或SEQIDNO:21所示病毒基因组编码的M蛋白的氨基酸序列(各个M蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:358-361所示；也参见表14)之间具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为F蛋白，其中所述F蛋白与SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20，或SEQIDNO:21所示病毒基因组编码的F蛋白的氨基酸序列(各个F蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:314-317所示；也参见表14)之间具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或99.5%的序列同一性。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为M2-l蛋白，其中所述M2-1蛋白与SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20，或SEQIDNO:21所示病毒基因组编码的M2-l蛋白的氨基酸序列(各个M2-l蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:338-341所示；也参见表14)之间具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为M2-2蛋白，其中所述M2-2蛋白与SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20，或SEQIDNO:21所示病毒基因组编码的M2-2蛋白的氨基酸序列(各个M2-2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:346-349所示；也参见表14)之间具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5°/的序列同一性。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为G蛋白，其中所述G蛋白与SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、或SEQIDNO:21所示病毒基因组编码的G蛋白的氨基酸序列(各个G蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:322-325所示；也参见表14)之间具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为SH蛋白，其中所述SH蛋白与SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20，或SEQIDNO:21所示病毒基因组编码的SH蛋白的氨基酸序列(各个SH蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:382-385所示；也参见表14)之间具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV的蛋白质为L蛋白，其中所述L蛋白与SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20,或SEQIDNO:21所示病毒基因组编码的L蛋白的氨基酸序列(各个L蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:330-333所示；也参见表14)之间具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80°/o、至少85°/o、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性。哺乳动物MPV蛋白的片段与SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示的病毒编码的同源性蛋白之间在该蛋白与所述片段同源的那部分具有至少60%、至少65fl/、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性。在一个具体的范例性实施方案中，本发明提供了哺乳动物MPVF蛋白的片段，其中包括F蛋白的胞外结构域及其同系物。含有胞外结构域的F蛋白的片段的同系物与含有SEQIDNO:18，SEQIDNO:19，SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示病毒编码的F蛋白的胞外结构域(各个F蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:314-317所示；也参见表14)的相应片段之间具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少卯％、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性。在一些实施方案中，本发明提供了哺乳动物MPVA亚组的蛋白质及其片段。本发明提供了哺乳动物MPVA亚组的N蛋白，其中所述N蛋白与SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒编码的N蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒编码的N蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPVA亚组的G蛋白，其中所述G蛋白与SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒编码的G蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒编码的G蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPVA亚组的P蛋白，其中所述P蛋白与SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒编码的P蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒编码的P蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPVA亚组的M蛋白，其中所述M蛋白与SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒编码的M蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒编码的M蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPVA亚组的F蛋白，其中所述F蛋白与SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒编码的F蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒编码的F蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPVA亚组的M2-l蛋白，其中所述M2-l蛋白与SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒编码的M2-l蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒编码的M2-l蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPVA亚组的M2-2蛋白，其中所述M2-2蛋白与SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒编码的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒编码的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPVA亚组的SH蛋白，其中所述SH蛋白与SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒编码的SH蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒编码的SH蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPVA亚组的L蛋白，其中所述L蛋白与SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒编码的L蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒编码的L蛋白在系统发育上的相关程度更密切。在其它实施方案中，本发明提供了哺乳动物MPVB亚组的蛋白质及其片段。本发明提供了哺乳动物MPVB亚组的的N蛋白，其中所述N蛋白与SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒编码的N蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒编码的N蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPVB亚组的G蛋白，其中所述G蛋白与SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒编码的G蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒编码的G蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPVB亚组的P蛋白，其中所述P蛋白与SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒编码的P蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒编码的P蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPVB亚组的M蛋白，其中所述M蛋白与SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒编码的M蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒编码的M蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPVB亚组的F蛋白，其中所述F蛋白与SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒编码的F蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒编码的F蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPVB亚组的M2-l蛋白，其中所述M2-l蛋白与SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒编码的M2-1蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒编码的M2-l蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPVB亚组的M2-2蛋白，其中所述M2-2蛋白与SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒编码的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒编码的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPVB亚组的SH蛋白，其中所述SH蛋白与SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒编码的SH蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒编码的SH蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPVB亚组的L蛋白，其中所述L蛋白与SEQIDNO:18或SEQIDNO:21所示病毒编码的L蛋白在系统发育上的相关程度，比与SEQIDNO:19或SEQIDNO:20所示病毒编码的L蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明进一步还提供了哺乳动物MPV变种Al、A2、Bl或B2的蛋白质。在本发明的一些实施方案中，哺乳动物MPV不同变种的蛋白质可以通过其氨基酸序列同一性(参见例如图42b)区分开来。哺乳动物MPV的变种可以是，但不限于A1、A2、B1或B2。但是，本发明还包括为另一种变种成员的哺乳动物MPV分离林。本发明提供了哺乳动物MPV变种Bl的G蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种Bl的G蛋白与变种Bl的原型分离林NL/1/99的G蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Al的原型分离林NL/1/00、变种A2的原型分离林NL/17/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的G蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种Bl的G蛋白，其中所述G蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/99为代表的哺乳动物MPV变种Bl的G蛋白(SEQIDNO:324)之间具有至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种Bl的N蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种Bl的N蛋白与变种Bl的原型分离林NL/1/99的N蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Al的原型分离林NL/1/00、变种A2的原型分离株NL/17/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的N蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种Bl的N蛋白，其中所述N蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/99为代表的哺乳动物MPV变种Bl的N蛋白(SEQIDNO:368)之间具有至少98.5%或至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种Bl的P蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种Bl的P蛋白与变种Bl的原型分离林NL/1/99的P蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Al的原型分离林NL/1/00、变种A2的原型分离林NL/17/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的P蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种Bl的P蛋白，其中所述P蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/99为代表的哺乳动物MPV变种B1的P蛋白(SEQIDNO:376)之间具有至少96%、至少98%或至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种Bl的M蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种Bl的M蛋白与变种Bl的原型分离抹NL/1/99的M蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Al的原型分离林NL/1/00、变种A2的原型分离林NL/17/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的M蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种Bl的M蛋白，其中所述M蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/99为代表的哺乳动物MPV变种B1的M蛋白(SEQIDNO:360)相同。本发明提供了哺乳动物MPV变种Bl的F蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种Bl的F蛋白与变种Bl的原型分离林NL/1/99的F蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Al的原型分离林NL/1/00、变种A2的原型分离林NL/IWOO或变种B2的原型分离林NL/1/94的F蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种Bl的F蛋白，其中所述F蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/99为代表的哺乳动物MPV变种B1的F蛋白(SEQIDNO:316)之间具有至少99%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种Bl的M2-l蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种Bl的M2-l蛋白与变种Bl的原型分离林NL/1/99的M2-1蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Al的原型分离林NL/l/00、变种A2的原型分离林NL/17/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的M2-l蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种Bl的M2-l蛋白，其中所述M2-1蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/99为代表的哺乳动物MPV变种Bl的M2-l蛋白(SEQIDNO:340)之间具有至少98%或至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种Bl的M2-2蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种Bl的M2-2蛋白与变种Bl的原型分离林NL/1/99的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Al的原型分离林NL/1/00、变种A2的原型分离株NL/17/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种Bl的M2-2蛋白，其中所述M2-2蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/99为代表的哺乳动物MPV变种Bl的M2-2蛋白(SEQIDNO:348)之间具有至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B1的SH蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种Bl的SH蛋白与变种Bl的原型分离林NL/1/99的SH蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Al的原型分离林NL/l/00、变种A2的原型分离林NL/17/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的SH蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种Bl的SH蛋白，其中所述SH蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/99为代表的哺乳动物MPV变种Bl的SH蛋白(SEQIDNO:384)之间具有至少83%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B1的L蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种Bl的L蛋白与变种Bl的原型分离林NL/1/99的L蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Al的原型分离株NL/l/00、变种A2的原型分离林NL/17/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的L蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种Bl的L蛋白，其中所述L蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/99为代表的哺乳动物MPV变种B1的L蛋白(SEQIDNO:332)之间具有至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种Al的G蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种Al的G蛋白与变种Al的原型分离林NL/1/00的G蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离林NL/1/99、变种A2的原型分离林NL/17/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的G蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种Al的G蛋白，其中所述G蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/00为代表的哺乳动物MPV变种Al的G蛋白(SEQIDNO:322)之间具有至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种Al的N蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种Al的N蛋白与变种Al的原型分离林NL/1/00的N蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离林NL/1/99、变种A2的原型分离林NL/17/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的N蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种Al的N蛋白，其中所述N蛋白的氨基酸序列与以原型NL/l/00为代表的哺乳动物MPV变种Al的N蛋白(SEQIDNO:366)之间具有至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种Al的P蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种Al的P蛋白与变种Al的原型分离林NL/1/00的P蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Bl的原型分离林NL/l/99、变种A2的原型分离林NL/17/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的P蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种Al的P蛋白，其中所述P蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/00为代表的哺乳动物MPV变种Al的P蛋白(SEQIDNO:374)之间具有至少96%、至少98%或至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种Al的M蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种Al的M蛋白与变种Al的原型分离林NL/1/00的M蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Bl的原型分离林NL/l/99、变种A2的原型分离林NL/17/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的M蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A1的M蛋白，其中所述M蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/00为代表的哺乳动物MPV变种Al的M蛋白(SEQIDNO:358)之间具有至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种Al的F蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种Al的F蛋白与变种Al的原型分离林NL/1/00的F蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Bl的原型分离林NL/l/99、变种A2的原型分离林NL/17/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的F蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种Al的F蛋白，其中所述F蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/00为代表的哺乳动物MPV变种Al的F蛋白(SEQIDNO:314)之间具有至少98%或至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种Al的M2-l蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种Al的M2-l蛋白与变种Al的原型分离林NL/1/00的M2-l蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Bl的原型分离株NL/l/99、变种A2的原型分离林NL/17/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的M2-l蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种Al的M2-1蛋白，其中所述M2-l蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/00为代表的哺乳动物MPV变种Al的M2-l蛋白(SEQIDNO:338)之间具有至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种Al的M2-2蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种Al的M2-2蛋白与变种Al的原型分离林NL/1/00的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Bl的原型分离林NL/l/99、变种A2的原型分离林NL/17/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种Al的M2-2蛋白，其中所述1VH-2蛋白的氨基酸序列与以原型NL/l/OO为代表的哺乳动物MPV变种Al的M2-2蛋白(SEQIDNO:346)之间具有至少96%或至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种Al的SH蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种Al的SH蛋白与变种Al的原型分离林NL/l/00的SH蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Bl的原型分离林NL/l/99、变种A2的原型分离林NL/n/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的SH蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种Al的SH蛋白，其中所述SH蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/00为代表的哺乳动物MPV变种Al的SH蛋白(SEQIDNO:382)之间具有至少84%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%或至少99.5°/0的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种Al的L蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A1的L蛋白与变种A1的原型分离林NL/1/00的L蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Bl的原型分离林NL/l/99、变种A2的原型分离林NL/17/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的L蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种Al的L蛋白，其中所述L蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/00为代表的哺乳动物变种A1的L蛋白(SEQIDNO:330)之间具有至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的G蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A2的G蛋白与变种A2的原型分离林NL/17/00的G蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离林NL/1/99、变种Al的原型分离林NL/1/00或变种B2的原型分离抹NL/1/94的G蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的G蛋白，其中所述G蛋白的氨基酸序列与以原型NL/17/00为代表的哺乳动物MPV变种A2的G蛋白(SEQIDNO:332)之间具有至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的N蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A2的N蛋白与变种A2的原型分离抹NL/17/00的N蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Bl的原型分离林NL/1/99、变种Al的原型分离林NL/1/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的N蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的N蛋白，其中所述N蛋白的氨基酸序列与以原型NL/17/00为代表的哺乳动物MPV变种A2的N蛋白(SEQIDNO:367)之间具有至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的P蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A2的P蛋白与变种A2的原型分离林NL/17/00的P蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Bl的原型分离林NL/l/99、变种Al的原型分离林NL/1/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的P蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的P蛋白，其中所述P蛋白的氨基酸序列与以原型NL/17/00为代表的哺乳动物MPV变种A2的P蛋白(SEQIDNO:375)之间具有至少96%、至少98%或至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的M蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A2的M蛋白与变种A2的原型分离林NL/17/00的M蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离林NL/l/99、Al的原型分离林NL/1/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的M蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的M蛋白，其中所述M蛋白的氨基酸序列与以原型NL/17/00为代表的哺乳动物MPV变种A2的M蛋白(SEQIDNO:359)之间具有至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的F蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A2的F蛋白与变种A2的原型分离林NL/17/00的F蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Bl的原型分离林NL/1/99、变种Al的原型分离林NL/1/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的F蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的F蛋白，其中所述F蛋白的氨基酸序列与以原型NL/17/00为代表的哺乳动物MPV变种A2的F蛋白(SEQIDNO:315)之间具有至少98°/0或至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的M2-l蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A2的M2-l蛋白与变种A2的原型分离林NL/17/00的M2-l蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Bl的原型分离林NL/1/99、变种Al的原型分离抹NL/1/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的M2-l蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的M2-l蛋白，其中所述M2-1蛋白的氨基酸序列与以原型NL/17/00为代表的哺乳动物MPV变种A2的M2-l蛋白(SEQIDNO:339)之间具有至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的M2-2蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A2的M2-2蛋白与变种A2的原型分离林NL/17/00的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Bl的原型分离林NL/1/99、变种A的原型分离林NL/1/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的M2-2蛋白，其中所述M2-2蛋白的氨基酸序列与以原型NL/17/00为代表的哺乳动物MPV变种A2的M2-2蛋白(SEQIDNO:347)之间具有至少96%、至少98%或至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的SH蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A2的SH蛋白与变种A2的原型分离林NL/17/00的SH蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离林NL/1/99、变种A1的原型分离林NL/1/00或变种B2的原型分离株NL/1/94的SH蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的SH蛋白，其中所述SH蛋白的氨基酸序列与以原型NL/17/00为代表的哺乳动物MPV变种A2的SH蛋白(SEQIDNO:383)之间具有至少84%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的L蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种A2的L蛋白与变种A2的原型分离林NL/17/00的L蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Bl的原型分离林NL/l/99、变种Al的原型分离林NL/1/00或变种B2的原型分离林NL/1/94的L蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种A2的L蛋白，其中所述L蛋白的氨基酸序列与以原型NL/17/00为代表的哺乳动物MPV变种A2的L蛋白(SEQIDNO:331)之间具有至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的G蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B2的G蛋白与变种B2的原型分离林NL/1/94的G蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离林NL/1/99、变种Al的原型分离林NL/1/00或变种A2的原型分离林NL/17/00的G蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的G蛋白，其中所述G蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/94为代表的哺乳动物MPV变种B2的G蛋白(SEQIDNO:325)之间具有至少66%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的N蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B2的N蛋白与变种B2的原型分离林NL/1/94的N蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离林NL/1/99、变种A1的原型分离林NL/l/00或变种A2的原型分离株NL/:H/00的N蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的N蛋白，其中所述N蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/94为代表的哺乳动物MPV变种B2的N蛋白(SEQIDNO:369)之间具有至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的P蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B2的P蛋白与变种B2的原型分离林NL/1/94的P蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Bl的原型分离林NL/1/99、变种Al的原型分离林NL/1/00或变种A2的原型分离林NL/17/00的P蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的P蛋白，其中所述P蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/94为代表的哺乳动物MPV变种B2的P蛋白(SEQIDNO:377)之间具有至少96%、至少98%或至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的M蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B2的M蛋白与变种B2的原型分离林NL/1/94的M蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Bl的原型分离林NL/1/99、Al的原型分离林NL/1/00或变种变种A2的原型分离林NL/17/00的M蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的M蛋白，其中所述M蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/94为代表的哺乳动物MPV变种B2的M蛋白(SEQIDNO:361)相同。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的F蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B2的F蛋白与变种B2的原型分离林NL/1/94的F蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Bl的原型分离林NL/1/99、变种Al的原型分离抹NL/1/00或变种A2的原型分离林NL/H/00的F蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的F蛋白，其中所述F蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/94为代表的哺乳动物MPV变种B2的F蛋白(SEQIDNO:317)之间具有至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的M2-l蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B2的M2-l蛋白与变种B2的原型分离林NL/1/94的M2-l蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Bl的原型分离林NL/1/99、变种Al的原型分离林NL/1/00或变种A2的原型分离林NL/17/00的M2-l蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的M2-l蛋白，其中所述M2-l蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/94为代表的哺乳动物MPV变种B2的M2-l蛋白(SEQIDNO:341)之间具有至少98%或至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的M2-2蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B2的M2-2蛋白与变种B2的原型分离林NL/l/94的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种B1的原型分离林NL/1/99、变种A的原型分离林NL/1/00或变种A2的原型分离林NL/17/00的M2-2蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的M2-2蛋白，其中所述M2-2蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/94为代表的哺乳动物MPV变种B2的M2-2蛋白(SEQIDNO:350)之间具有至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的SH蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B2的SH蛋白与变种B2的原型分离林NL/1/94的SH蛋白在系统发育上的扭关程度，比与变种Bl的原型分离林NL/1/99、变种Al的原型分离林NL/1/00或变种A2的原型分离林NL/17/00的SH蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的SH蛋白，其中所述SH蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/94为代表的哺乳动物MPV变种B2的SH蛋白(SEQIDNO:385)之间具有至少84%、至少85%、至少90°/。、至少95%、至少98%或至少99%或至少99.5%的序列同一性。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的L蛋白，其中所述哺乳动物MPV变种B2的L蛋白与变种B2的原型分离林NL/1/94的L蛋白在系统发育上的相关程度，比与变种Bl的原型分离抹NL/l/99、变种Al的原型分离林NL/1/00或变种A2的原型分离林NL/17/00的L蛋白在系统发育上的相关程度更密切。本发明提供了哺乳动物MPV变种B2的L蛋白，其中所述L蛋白的氨基酸序列与以原型NL/1/94为代表的哺乳动物MPV变种B2的L蛋白(SEQIDNO:333)之间具有至少99%或至少99.5%的序列同一性。在一些实施方案中，序列同一性的百分比是以蛋白全长比对为基础的。其它实施方案中，序列同一性的百分比是以蛋白的连续氨基酸序列的比对为基础的，其中所述氨基酸序列长度可以为25个氨基酸、50个氨基酸、75个氨基酸、100个氨基酸、125个氨基酸、150个氨基酸、175个氨基酸、200个氨基酸、225个氨基酸、250个氨基酸、275个氨基酸、300个氨基酸、325个氨基酸、350个氨基酸、375个氨基酸、400个氨基酸、425个氨基酸、450个氨基酸、475个氨基酸、500个氨基酸、750个氨基酸、1000个氨基酸、1250个氨基酸、1500个氨基酸、1750个氨基酸、2000个氨基酸或2250个氨基酸。在一些具体实施方案中，本发明提供了哺乳动物MPV的G蛋白，其中所述G蛋白具有一个SEQIDNO:119-153;SEQIDNO:322-325所示的氨基酸序列或其片段。在一些具体实施方案中，本发明提供了哺乳动物MPV的F蛋白，其中所述F蛋白具有一个SEQDNO:234-317所示的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，本发明提供了哺乳动物MPV的L蛋白，其中所述L蛋白具有一个SEQIDNO:330-3332所示的氨基酸序列或其片段。在一些具体实施方案中，本发明提供了哺乳动物MPV的M2-l蛋白，其中所述M2-l蛋白具有一个SEQIDNO:338-341所示的氨基酸序列或其片段。在一些具体实施方案中，本发明提供了哺乳动物MPV的M2-2蛋白，其中所述M2-2蛋白具有一个SEQIDNO:346-349所示的氨基酸序列或其片段。在一些具体实施方案中，本发明提供了哺乳动物MPV的M蛋白，其中所述M蛋白具有一个SEQIDNO:358-361所示的氨基酸序列或其片段。在一些具体实施方案中，本发明提供了哺乳动物MPV的N蛋白，其中所述N蛋白具有一个SEQIDNO:366-369所示的氨基酸序列或其片段。在一些具体实施方案中，本发明提供了哺乳动物MPV的P蛋白，其中所述P蛋白具有一个SEQIDNO:374-377所示的氨基酸序列或其片段。一些具体实施方案中，本发明提供了哺乳动物MPV的SH蛋白，其中所述SH蛋白具有一个SEQIDNO:382-385所示的氨基酸序列或其片段。在本发明的在一些实施方案中，片段的长度为至少25个氨基酸、50个氨基酸、75个氨基酸、100个氨基酸、125个氨基酸、150个氨基酸、175个氨基酸、200个氨基酸、225个氨基酸、250个氨基酸、275个氨基酸、300个氨基酸、325个氨基酸、350个氨基酸、375个氨基酸、400个氨基酸、425个氨基酸、450个氨基酸、475个氨基酸、500个氨基酸、750个氨基酸、1000个氨基酸、1250个氨基酸、1500个氨基酸、1750个氨基酸、2000个氨基酸或2250个氨基酸。本发明的在一些实施方案中，片段的长度为至多25个氨基酸、50个氨基酸、75个氨基酸、IOO个氨基酸、125个氨基酸、150个氨基酸、175个氨基酸、200个氨基酸、225个氨基酸、250个氨基酸、275个氨基酸、300个氨基酸、325个氨基酸、350个氨基酸、375个氨基酸、400个氨基酸、425个氨基酸、450个氨基酸、475个氨基酸、500个氨基酸、750个氨基酸、1000个氨基酸、1250个氨基酸、1500个氨基酸、1750个氨基酸、2000个氨基酸或2250个氨基酸。本发明进一步还提供了源自哺乳动物MPV的核酸序列。本发明还提供了源自哺乳动物MPV的核酸序列的衍生物。在一些具体实施方案中，所述核酸经过了修饰。在一些实施方案中，本发明的核酸编码上文定义的哺乳动物MPV的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-l蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在一些实施方案中，本发明的核酸编码上文定义的哺乳动物MPV亚组A的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-l蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在一些实施方案中，本发明的核酸编码上文定义的哺乳动物MPV亚组B的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-l蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在一些实施方案中，本发明的核酸编码上文定义的哺乳动物MPV变种Al的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-l蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在一些实施方案中，本发明的核酸编码上文定义的哺乳动物MPV变种A2的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-l蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在一些实施方案中，本发明的核酸编码上文定义的哺乳动物MPV变种Bl的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-l蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在一些实施方案中，本发明的核酸编码上文定义的哺乳动物MPV变种B2的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-l蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在一些实施方案中，本发明提供了一种核苷酸序列，该序列与SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示核苷酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5°/的序列同一性。在一些实施方案中，本发明的核酸序列与SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示核苷酸序列的片段具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少75%、至少80%、至少85%、至少卯％、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.5%的序列同一性，其中所述片段的长度为至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少750个核苷酸、至少1，000个核苷酸、至少1，250个核苷酸、至少1，500个核苷酸、至少1,750个核苷酸、至少2,000个核苷酸、至少2,00个核苷酸、至少3，000个核苷酸、至少4,000个核苷酸、至少5,000个核苷酸、至少7，500个核苷酸、至少10,000个核苷酸、至少12,500或至少15,000个核苷酸。在一个具体实施方案中，本发明的核苷酸序列与SEQIDNO:84118;SEQIDNO:154233;SEQIDNO:318-321;SEQIDNO:326-329;SEQIDNO:334-337;SEQIDNO:342-345;SEQIDNO:350353;SEQIDNO:354-357;SEQIDNO:362365;SEQIDNO:370-373;SEQIDNO:378-381;或SEQIDNO:386-389所示的核苷酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%、或至少99.5%或100%的序列同一性。在本发明的具体实施方案中，本发明的核酸序列能够在低度严格、中度严格或高度严格条件下与SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示的核酸序列杂交。在本发明的具体实施方案中，本发明的核酸序列能够在低度严格、中度严格或高度严格条件下与SEQIDNO:84-118;SEQIDNO:154-233;SEQIDNO:318-321;SEQID緣326-329;SEQIDNO:334-337;SEQIDN0342-345;SEQIDNO:350-353;SEQIDNO:354-357;SEQIDNO:362-365;SEQID隐370373;SEQIDNO:378-381;或SEQIDNO:386-389所示的核酸序列杂交。在一些实施方案中，核酸与SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21所示的核苦酸序列杂交部分的长度为至少25个核苷酸、至少50个核苷酸、至少75个核苷酸、至少100个核苷酸、至少150个核苷酸、至少200个核苷酸、至少250个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少750个核苷酸、至少1,000个核苷酸、至少1,250个核苷酸、至少1，500个核苷酸、至少1,750个核苷酸、至少2，000个核苷酸、至少2,00个核苷酸、至少3,000个核苷酸、至少4,000个核苷酸、至少5,000个核苷酸、至少7,500个核苷酸、至少10,000个核苷酸、至少12,500个核苷酸或至少15,000个核苷酸。本发明进一步还提供了抗体以及能特异性结合哺乳动物MPV的蛋白质的抗原-结合片段。本发明的抗体能够特异性结合哺乳动物MPV的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-l蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在具体实施方案中，所述抗体为人抗体或人源化抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体能够特异性结合哺乳动物MPV亚组A的病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-l蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。一些其它实施方案中，本发明的抗体能够特异性结合哺乳动物MPV亚组B的病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-l蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在一些实施方案中，本发明的抗体能够特异性结合哺乳动物MPV变种Al的病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-l蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。其它实施方案中，本发明的抗体能够特异性结合哺乳动物MPV变种A2的病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-l蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。在一些实施方案中，本发明的抗体能够特异性结合哺乳动物MPV变种Bl的病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-l蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。一些其它实施方案中，本发明的抗体能够特异性结合哺乳动物MPV变种B2的病毒的G蛋白、N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、M2-l蛋白、M2-2蛋白、SH蛋白或L蛋白。5.16使用七氨基酸重复肽(heptadrepeat)抑制病毒细胞融合病毒-宿主细胞融合是多种披膜病毒，包括MPV的感染生命周期中的必需步骤。这样，对病毒细胞融合的抑制代表控制这些病毒的新方法。该抑制方法代表防止MPV在宿主中繁殖和MPV感染宿主的另一方法。病毒-细胞融合的抑制取决于所需附着蛋白的类型。Wang等人，BiochemBiophysResComm302(2003)469-475。因此，在本发明的一个实施方案中，使用测定来确定病毒细胞融合对不同附着蛋白的依赖性。在一些实施方案中，本发明提供了预防、治疗或控制个体中hMPV感染的方法，所述方法包括给予药理有效量的七氨基酸重复(HR)肽。在一些实施方案中，药理有效量的HR肽将病毒宿主细胞融合降低了至少10%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40°/、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少99%、至少99.5%。在一个具体的实施方案中，HR是引起个体中感染的病毒的HR。在一些实施方案中，HR是亚型Al的hMPV的HR。在一个更具体的实施方案中，HR序列是hMPV的F蛋白的一个HR序列，称为HRA或HRB，其中HRA是接近该肽的N-末端的七肽重复序列，HRB是接近C-末端的七肽重复序列。在一些实施方案中，用于预防、治疗或控制个体中hMPV感染而施用的HR是亚型Al、Bl、A2或B2的hMPV的HR。在一些实施方案中，HR与引起个体感染的病毒感染的HR具有至少50%、60%、70%、80%、90。/o、95%、98。/、99%或至少99.5%的序列同一性。在一些实施方案中，HR的衍生物可用于阻止病毒融合。这样的衍生物包括但不限于这样的HR肽，其已经被非天然氨基酸替换，截短以除去氨基酸的伸长部分，或延长，这样可以加入单一氨基酸或其伸长部分。在另一个实施方案中，使用羊一HR肽来预防、治疗或控制hMPV感染。在另一个实施方案中，施用HR肽的组合来预防、治疗或控制hMPV感染。下面描述的试验可用于确定HR在阻止hMPV与细胞融合方面的有效性，并因此可用于确定最适于预防、治疗或控制个体中hMPV感染的HR或其类似物或衍生物。在本发明的另一个实施方案中，试验可溶性合成HR肽来确定肽是否能够预防病毒-细胞融合。任何HR序列可用于抑制hMPV病毒-细胞融合，包括但不限于抗RSV、PIV、APV和hMPV的序列。在优选的实施方案中，HR序列是hMPV的HR序列。在一个更具体的实施方案中，HR序列是hMPV的F蛋白的一个HR序列，称为HRA或HRB，其中HRA是接近该肽的N-末端的七肽重复序列，HRB是接近C-末端的七肽重复序列。在本发明的另一个实施方案中，可用于抑制hMPV病毒-细胞融合的HRA和HRB衍生的肽包括但不限于源自RSV、APV和PIV的HRA和HRB肽。在本发明的另一个实施方案中，使用HRA和HRB肽的衍生物来抑制hMPV病毒-细胞融合。例如，使用通过HRA或HRB肽中的至少一个氨基酸残基的突变而获得的衍生物来抑制hMPV病毒-细胞融合。在本发明的另一个实施方案中，衍生物是通过将HRA或HRB肽的特定区域截短或切除而获得的。在另一个实施方案中，使用的HRA或HRB肽是在内源性HR序列方面延长的肽。在另一个实施方案中，使用由HRA或HRB肽的不同区域的序列组成的短肽组来抑制hMPV病毒-细胞融合。在本发明的另一个实施方案中，使用hMPVHRA和HRB衍生的肽来抗hMPV的同源毒林或抗hMPV的异源毒林。在本发明的另一个实施方案中，一起使用HRA和HRB肽或其类似物或衍生物来抑制病毒-细胞融合。在更优选的实施方案中，单独使用HRA或HRB肽或其类似物或衍生物。在另一个实施方案中，使用的HRA或HRB肽与内源性HR肽具有至少90%、80%、70%、60°/或50%的序列同一性。为了测定七氨基酸重复肽抑制病毒融合的能力，可以表达和纯化七氨基酸重复肽，这样可以测试它们的病毒融合抑制能力。可以表达和纯化可溶性七氨基酸重复肽，然后将其用于试验中以与内源性七氨基酸重复肽竟争，从而测试其阻断病毒融合。在本发明的一个实施方案中，可以制备编码分别称为HRA和HRB的hMPV的F蛋白的七氨基酸重复肽的合成重组DNA。在另一个实施方案中，可以制备编码还含有可用于促进纯化的序列tag的七氨基酸重复肽的合成重组DNA。在本发明的一个优选的实施方案中，促进七氨基酸重复肽的纯化的tag不干扰其活性。在本发明的另一个实施方案中，tag由在一个肽末端的一系列组氨酸残基，例如六个连续组氨酸组成，并且称为组氨酸tag。有多种不同方法可用于表达和纯化可溶性HRA和HRB。首先，使用本领域技术人员已知的方法制备编码HRA和HRB的DNA栽体。然后将质粒转化到合适的表达宿主细胞例如大肠杆菌菌株BL21(DE3)内，使用本领域常规方法表达和纯化蛋白。例如，编码具有组氨酸tag的HR肽的基因的表达可以使用IPTG从pET载体诱导。然后可以将细胞裂解，固定在Ni-螯合的琼脂糖亲合柱上，用带有反电荷的物质例如咪唑洗脱，分离出表达的肽。为了确定表达的七氨基酸重复肽在抑制病毒融合方面的潜在有效性，可使用试验来证实在HR肽之间的复合物的装配。该方法优于基于细胞的试验，因为其能够无细胞地筛选肽，从而确定在病毒融合方面的效力。在本发明的一个实施方案中，将HR肽同时培养足以形成复合物的一段时间。在更具体的实施方案中，容许在28°C形成复合物的时间是1小时。复合物的形成可使用本领域已知的任何方法来检测，包括但不限于色谱法、UV-vis光谱法、NMR光谱法、X-射线晶体学方法、离心或电泳法。在本发明的另一个具体实施方案中，使用与电泳偶联的凝胶过滤法来检测复合物的形成，以确定复合物的分子量。在本发明的另一个实施方案中，使用该复合物形成试验来鉴定可用于抑制病毒融合的候选物，例如确定突变的HR肽在病毒融合抑制方面的有效性。在本发明的另一个实施方案中，使用该复合物形成试验来测定HR肽的衍生物在病毒融合抑制方面的有效性。已知肽的七氨基酸重复片段是螺旋的。出于该原因，可使用多种方法来确定表达的HR肽是否形成a螺旋，以鉴定可用于病毒融合抑制的合适的候选物。这样的方法包括但不限于光谱法、X-射线晶体学方法和显微镜方法。在本发明的一个实施方案中，使用CD(圃二色谱)光谱法来确定HR肽的结构特征。可使用基于细胞的试验来确定HR肽在病毒融合抑制方面的有效性。可用MPV感染的任何细胞可用于该测定，包括但不限于tMK、Hep2或Vero细胞。在一个具体的实施方案中，所使用的细胞类型是Hep2细胞。通过用MPV感染宿主细胞，将细胞与HR蛋白培养，培养适当时间之后，对融合进行计分。然后将细胞进行针对合胞体/多核细胞形成的染色，以确定病毒-细胞融合是否成功。6.病毒分离及鉴定6.1实施例1:样本收集，病毒分离，病毒鉴定从宿主获得鼻咽吸出物样品以分析病毒的存在，并鉴定它们。从患呼吸道感染(RTI)的儿童中收集鼻咽吸出物。为了确定病因的一致性，利用抗流感病毒A和B型，hRSV和人副流感病毒(hPIV)1，2，和3型的荧光标记抗体，所有鼻咽吸出物用直接免疫荧光实验(DIF)测试(参见实施例9的方法)。利用快速壳病毒技术，(Rothbarth等人，1999，JofVirol.Methods78:163-169)在多种细胞系上，包括VERO细胞，第三恒河猴肾(tMK)细胞，人内皮肺(HEL)细胞和marbindock肾(MDCK)细胞，从鼻咽吸出物分离出病毒。在DIF实验中呈阴性的显示细胞病变效应(CPE)的样品传代二至三次后，利用抗流感病毒AB和C型，hRSVA和B型，麻渗病毒，腮腺炎病毒，人副流感病毒(hPIV)1至4型，仙台病毒，猿病毒5型，和新城病毒的病毒特异性抗体，用间接免疫菱光实验(IFA)(参见实施例11的方法)测试。尽管许多病例的致病因不能确认，但一些样本对所有测试病毒都呈阴性。这些28个位缺人的病毒分离林在tMK细胞中生长緩慢，在VERO细胞和A^9细胞中长不好，在MDCK或鸡胚成纤维细胞中几乎不能生长。大多数病毒分离抹在十天和十四天之间在tMK细胞中诱导CPE。这有点晚于诸如hRSV或hPIV的其它病毒造成的CPE。该CPE实际上与在tMK或其它细胞培养基中的hRSV或hPIV造成的没有区别，并以合胞体形式被表征。细胞上观察到的一些效应包括快速内部分裂，接着单层细胞分开。感染的tMK细胞的上清液被用于电镜(EM)分析，它们揭示了直径150至600纳米的副粘病毒样病毒的存在，其短胞膜生出13至17纳米。与诸如副粘病毒科病毒的胞膜病毒的生化性质一致，标准氯仿或乙瞇处理(Osterhaus等人，1985，Arch.ofVirol.86:239-25)造成tMK细胞传染性的大于1041^105(,的减少。病毒感染的tMK细胞培养上清液和火鸡，鸡和豚鼠红血球并不显示血凝集活性。培养期间，病毒复制显出为胰岛素依赖的。这些组和的病毒学数据证明了新鉴定的病毒是分类学上的副粘病毒科的成员。提取用15个未确定的病毒分离林感染的tMK细胞的RNA，利用副粘病毒科专一性引物集(K.B.Chua等人，2000，Science288:1432-1435)进行提取，如hPIV1-4，仙台病毒，新城病毒，hRSV，麻渗，腮腺炎，Nipah，Hendra,Tupaia和Mapuera病毒，以进4亍反转录和聚合酶链式反应(RT-PCR)分析。为了检测到潜在相关的病毒，RT-PCR实验在低严格条件下进行。分离自同源病毒库的RNA用作为对照。尽管可用的对照与各自病毒特异的引物成阳性反应，但新确定的病毒分离抹不与任何引物集反应，显示出该病毒不与测试的病毒相关。两种病毒感染的tMK细胞培养物上清液用于鼻腔内接种豚鼠和白鼬。在接种后第零天，两周和三周从这些动物中收集血清样品。动物没有显出临床症状，可是，监测所有动物的血清转化并以针对同源病毒的病毒中和(VN)(参见实施例16的方法)试验和间接IFA进行测量。在间接IFA中，血清不与上述任何已知副粘病毒或和鼠肺炎病毒(PVM)发生反应。利用豚鼠和白鼬的前和后感染血清筛选迄今未确定的病毒分离林。用后感染血清的间接IFA，其中28个明显成阳性，暗示迄今未确定的病毒分离林是相近或相同的。为了进一步鉴定病毒，检测细胞系上病毒感染的表型效应。总之，tMK细胞培养于包含玻璃片的24孔板(Costar，Cambridge,UK中，用以下补充了10%胎牛血清(BioWhittaker，Vervier，Belgium)的培养基培养。接种前，用PBS和补充了Eagle氏和Hanks氏盐MEM(ICN，Costamesa，CA)洗板，0.5L洗液中补充了0.26gNaHC03，0.025MHepes(Biowhittaker)，2mML-谷氨酸(Biowhittaker)，100单位青霉素，100jig链霉素(Biowhittaker),0.5g乳白蛋白(Sigma-Aldrich，Zwijndrecht，荷兰)，1.0gD誦葡萄糖(Merck,Amsterdam,荷兰)，5.0g蛋白胨(Oxoid，Haarlem,荷兰)和0.02。/。胰岛素(LifeTechnologies,Bethesda，MD)。用鼻咽吸出物样品的上清液接种板(每孔0.2ml,重复三次)，接着以840xg离心一'J、时。接种后，以37°C培养平板最多H天，培养基一周换一次，同时每天检查培养基的CPE。14天后，刮下细胞第二次传代并培养14天。在第三次传代时重复该步骤。玻璃片通过如下所述的间接IFA用于证明病毒的存在。依靠分离林，一般在第三次传代后观察到CPE，即在第8至14天之间。CPE与在tMK或其它细胞培养基中的hRSV或hPIV造成的没有区别，除了hRSV在约第4天诱导出CPE。CPE通过合胞体形式表征，其后细胞显示出快速内分裂，接着细胞从单层分开。对一些分离林来说，难以观察到CPE，IFA用以确证在这些培养基中的病毒的存在。观察到的CPE没有与其它病毒的不同，显示出不能从临床症状的视觉检查进行诊断。6.2实施例2:人群中的血清阳性率为研究人群中该病毒的血清阳性率，利用感染了未确定病毒分离林之一的tMK细胞，从不同年龄组中的人的血清通过间接IFA进行分析。研究披露，对病毒的抗体可在25%的六至十二个月的儿童中被检测到。另外，到五岁时，几乎100%的儿童血清阳性了。整个地，用间接IFA和用VN试验检测56个的血清样品。对于样品中的51个或91%，VN试验的结果，也就是大于8的滴度，与用间接IFA，即大于32的滴度所获得的结果一致。用IFA发现呈阳性的四个样品用VN试验呈阴性，也就是滴度小于8，然而血清样品用IFA呈阴性，也就是滴度小于32，并且用VN试验呈阳性，也就是滴度为16(图2)。在72个1958年取自人的血清样品上进行IFA，其中年龄从8-99岁，显示出100%血清阳性率，显出了病毒已经在人群中流传了超过40年。另外，这些许多血清样品用VN试验确认IFA数据(图2)。血清流行数据显示该病毒多年来已经是显著的感染源。从严重RTI儿童的临床样品中重复分离出该病毒显示出MPV的临床和经济影响可能很高。基于病毒检测和血清学的新的诊断试验会产生更具体的发病率和病毒病原体的临床及经济影响的分析。在IFA和VN结果的细微差别(5个样品)可能是由于在IFA中，仅有IgG血清抗体被检测，而VN试验检测抗体的两种型和亚型。可选的，差别可能是由于两种试验的灵敏度差别造成的。对于IFA，使用阈值16，而对于VN使用阈值8。IFA和VN试验结果的区别也可以显示在该新确认的病毒的血清型之间的可能区别。由于MPV似乎是相近于APV，推测人病毒可能来源于鸟类。取自1958年人的血清样品的分析揭示MPV已经在人群众广泛传播了40年，显示出假设的人畜共患病事件必然在1958年前发生了。6.3实施例3:HMPV分离林00-1的基因组序列为了获得未知病毒分离林的序列信息，用随机PCR扩增策略，即RAP-PCR(Welsh等人，1992，NAR20:4965-4970)(参见实施例21)。简而言之，用一个病毒分离林(分离林00-l)感染tMK细胞，用hPIV-l作为阳性对照。两种培养基显示出相同CPE后，培养基上清液中的病毒以20-60%连续蔗糖梯度纯化。通过EM检查病毒样颗粒的梯度部分，RNA分离自包含约50%蔗糖的部分，其中核壳体被观察到了。分离自病毒部分的等量RNA被用于RAP-PCR，其后样品并排在3%NuSieve琼脂糖凝胶上试验。20条差别显示的特异于未确定病毒的条带随后从凝胶上提纯，克隆进质粒pCR2.1(Invitrogen)内并用载体特异引物测序(参见实施例22)。从Genbank数据库的序列中进行同源性检索，使用可从国家医学图书馆使用的BLAST程序，发现20个片段中的IO个显示与APV/TRTV序列有相似之处。这IO个片段位于编码核蛋白(N;片段1和2)，基质蛋白(M;片段3)，融合蛋白(F;片段4，5,6，7)以及聚合酶蛋白(L;片段8，9，10)的基因中(图3)。基于RAP-PCR片段和公开的副粘病毒前导和尾随序列(Randhawa，等人，1997，J.Virol.71:9849-9854)，设计PCR引物以完成病毒基因组3'末端的序列信息。扩增3个片段，其中片段A跨越N开放阅读框(ORF)的最后的3'末端，片段B跨越磷蛋白(F)ORF，而片段C接近M和FORF之间的缺口(图16).这3个片段的序列分析揭示在病毒基因组最后的3'末端缺少NS1和NS20RF而且F0RF位置直接与MORF相邻。该基因组组成类似于间质肺病毒APV，其也与同源序列一致。不同病毒的关系可通过比较图4的氨基酸序列与其它病毒各自N蛋白的氨基酸序列推导出来。所有N，P，M和FORF的翻译序列显示出和肺病毒属的成员有平均30-33%的同源性，而和间质肺病毒属的成员有66-68%。对于SH和GORF，与两种属的成员没有发现可识别的同源性。NORF氨基酸序列发现的氨基酸同源性显示出同hRSV有约40%的同源性，而与APV-C，其遗传近亲有88%。PORF的氨基酸序列显示出与hRSV有约25%的同源性，而与APV-C有66-68%，MORF显示出与hRSV有约36-39%，而与APV-C有约87-89%，FORF显示出与hRSV有约40%的同源性，而与APV-C有约81%，M2-lORF显示出与肺病毒有约34-36%的同源性，而与APV-C有84-86"/o的同源性，M2-2ORF显示出与肺病毒有15-17%的同源性，而与APV-C有560/0，并且从LORF获得的片段显示出与肺病毒有平均44%,而与APV-C有64°/。N，M，P和F基因的遗传分析揭示相较与肺病毒属，MPV与最近提出的间质肺病毒属有着更高的序列同源性，因此证明了基因组构成接近和类似于APV/TRTV的。与RSV的基因组构成('3-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5')相反，间质肺病毒缺少NS1和NS2基因而且也有不同的基因组构成，特别在M和L('3画N-P-M-F-M2-SH-G-L画5')基因之间。在本发明病毒分离株中的M和F基因之间缺少ORF，缺少邻接于N的NS1和NS2，并且在APV中发现的高氨基酸序列同源性造成分离自人的MPV作为哺乳动物、更特异于人的间质肺病毒属的第一个成员而被提议进行分类。系统发育分析揭示九个获得了序列信息的MPV分离林，非常接近。尽管序列信息有限，但是它们显出互相之间比之与禽类间质肺病毒更为接近。在所述的APV的四个血清型中，血清型C显出最接近于MPV。该结论基于N,P，M和F基因的核苷酸序列的相似性。可是应该指出，血清型D，F基因仅有部分序列在Genbank可得到，对于血清型B，仅有M，N和F序列可得到。我们的MPV分离林在系统发育树中形成两个群集。对于hRSV和APV，不同的遗传和学清血亚型已经被叙述过了。MPV分离林的2个遗传群集是否表示功能上也不同的血清亚型目前仍旧未知。我们的血清学研究指出MPV是一个常见的人病原体。6.4实施例4:关联基因的进一步鉴定MPV的核蛋白(N)，磷蛋白(P)，基质蛋白(M)和融合蛋白(F)基因的序列分析揭示与APV血清型C，最初在美国鸟类中发现的禽类肺病毒有着最高度的序列同源性。这些分析也揭示病毒基因组3'末端非结构蛋白NS1和NS2的缺失以及融合蛋白的位置直接邻接于基质蛋白。22K(M2)基因序列，小疏水(SH)基因，粘连(G)基因，聚合酶(L)基因，基因间区域，以及尾随序列都被确定。结合前述序列，此处提出的序列完成了MPV的基因组序列，除了基因组末端最后12-15个核苷酸，并且确定了MPV的基因组构成。并列比较MPV基因组序列与APVA，B和C亚型，RSVA和B亚型，PVM和其它副粘病毒，提供了对于间质肺病毒属中的MPV分类的强有力的证据。编码核蛋白(N)的基因如上所示，MPV基因组图谱的第一个基因编码1个394氨基酸(aa)的蛋白质并与其它肺病毒的N蛋白显示出广泛的同源性。NORF的长度与APV-C的NORF的长度一致(表5)并且小于其它副粘病毒的(Barr等人，1991，JGenVirol72:677-85)。氨基酸序列的分析表明与APV-C有最高的同源性(88%)，与其它副粘病毒仅有7-11%(表6)。属于单负链病毒(Mononegavirales)目的病毒之间的3个相似区域被确定A，B和C(图22)(Barr等人，1991，JGenVirol72:677-85)。尽管在病毒科中相似性最高，但是这些区域在观察的病毒科之间高度保守。所有3个区域中，MPV揭示了与APV-C97%的aa序列相同性，与APV-B89%，与APV-A92%，并与RSV和PYM66-73%。在aa残基第160至340位的区域在间质肺病毒之间显示高度保守，并在肺病毒中有稍'J、一些的程度(Miyahara等人，1991，ArchViral124:255-68;Li等人，1996，VirusRes41:185-91;Barr，1991,JGenVirol72:677-85)。编码磷蛋白的基因(P):基因组图谱中的第二个ORF编码294个aa的蛋白质，其与APV-C的P蛋白共享68%的aa序列同源性，而与RSV的P蛋白仅有22-26%(表7)。MPV的P包括一个实质的ORF并且因此与许多其它副粘病毒的P相似(参考Lamb等人，Fieldsvirology,(B.N.Knipe，Hawley，P.M.，ed.，LippencottRaven),Philadelphia,1996;Sedlmeier等人，1998，AdvVirusRes50:101-39)。与APVA与B和PVM相反并与RSV和APV-C相似，MPVPORF缺少半胱氨酸残基。所有肺病毒之间高相似度的区域(氨基酸185-241)在RNA合成过程中或在保持核壳复合物结构完整性上起着作用(Ling等人，1995，VirusRes36:247-57)。尤其在考虑到保守替换的时候，在MPV中也发现了该高相似性的区域(图6)，显示同APYC100%的相似性，同APV-A和B93。/。，并同RSV约81。/。。MPVP蛋白的C-末端如APV所述的一样富含谷氨酸残基(Ling，等人，1995，VirusRes36:247-57)。编码基质蛋白的基因(M):MPV基因组第三个ORF编码254aa的蛋白质，其类似于其它肺病毒的MORF。MPV的MORF恰恰与其它间质肺病毒的MORF有相同的大小，并显示出同APV的基质蛋白有高aa序列同源性(78_87%)，同iRSV和PVM则有较低的同源性(37-38%)，而且同其它副粘病毒有10%或更少的同源性(表6)。比较所有肺病毒基质蛋白的序列，发现在残基第14至19为上有一保守七肽，也在MPV中保守的(图7)(Easton等人1997,VirusRes，48:27-33)。对于RSV，PVM和APV，在或者同M的主要ORF重叠的小的第二个ORF被认定了(在bRSV中为52aa和51aa，在RSV中为75aa,在PVM中为46aa以及在APV中为51aa)(Yu等人，1992，Virology186:426-34;Easton等人，1997，VirusRes48:27-33;Samal等人，1991，JGenVirol72:715-20;Satake等人，1995，JVirol50:92-9)。在主要MORF中发现54个aa残基的小ORF(片段1，图8)，其起始于核苷酸第2281位，并且同M的主要ORF重叠部分中发现33个aa残基的小ORF，其起始于核苷酸第2893位(片段2，图8)。与RSV和APV的第二ORF相似，在这些第二ORF与其它肺病毒的第二ORF之间没有显著的同源性，缺少明显的起始或终止信号。另外，没有任何关于发生在这些第二ORF中的蛋白质合成的报道。编码融合蛋白的基因MPV的FORF邻接于MORF，这是间质肺病毒属成员的特征。MPV的F编码539aa的蛋白质，其比APV-C的F长两个aa残基。aa序列分析揭示同APV-C有81%的同源性，同APV-A和B有67%，同肺病毒F蛋白有33-39%，而同其它副粘病毒仅有10-18%(表6)。一个在副粘病毒F蛋白中的保守特征，也可在MPV中看到，是半胱氨酸残基的分布(Morrison等人，l988，VirusRes10:113-35;Yu等人，1991，J.GenVirol72:75-81)。间质肺病毒在El中有12个半胱氨酸残基(7个在所有副粘病毒中均保守)，E2中两个(l个在所有副粘病毒中均保守)。在3个出现在MPVFORF中的潜在的N-相连的糖基化位点中，没有一个与RSV相同而且两个(第74和389位)同APV相同。第三个唯一的潜在的MPVN-相连的糖基化位点位于第206位(图9)。尽管同其它副粘病毒具有低序列同源性，MPV的F蛋白揭示典型的融合蛋白特征与那些表述过的其它副粘病毒科成员的F蛋白一致(Morrison等人，1988，VirusRes10:113-35)。副粘病毒科成员的F蛋白被合成作为由宿主细胞蛋白酶裂解的无活性的前体(FO)，其生成氨基末端E2亚单位和大羧基末端Fl亚单位。提出的裂解位点(Collins等人，Fieldsvirology,(B.N.Knipe，Howley，P.M.,ed.，Lippencott-Raven)，Philadelphia,1996)在所有副粘病毒科成员中是保守的。MPV的裂解位点包含残基RQSR。两个精氨酸(R)残基与APV和RSV—样，但是谷氨酸(Q)和丝氨酸(S)残基与其它诸如副流感病毒l型，仙台病毒和麻渗病毒等的副粘病毒一样。Fl氨基末端的疏水区域被认为用作膜融合结构域的功能，并显出在副粘病毒和麻療病毒之间的高序列相似性，而与肺病毒则程度较低(Morrison等人，1988，VirusRes10:113-35)。在MPV和APV-C之间的这26个残基(第137-163位，图9)保守，其与间质肺病毒中的高保守区域一致(Naylor等人，1998，J.GenVirol79:1393-1398;Seal等人，2000，VirusRes66:139-47)。像APV和其它副粘病毒所见的一样，MPV揭示了相对于RSV有22个aa残基的缺失(第107-128位，图9)另外，对于RSV和APV，信号肽和锚定结构域被发现在亚型中是保守的并显示在亚型之间高可变型(Plows等人，1995，VirusGenes11:37-45;Naylor等人，1998，J.GenVirol79:1393-1398)。F2氨基末端的MPV的信号肽(aa10-35，图9)显得有点与APV-C序列相似(26aa残基中的18个相似)，同其它APV或RSV则较少保守性。El羧基端的膜锚定结构域的亚型之间可以见到更多的可变型，尽管仍可看到同APV-C有些同源性。编码M2蛋白的基因M2基因对肺病毒来说是唯一的并且在所有肺病毒中可观察到两个重叠的ORF。第一主要ORF表示为M2-1蛋白，其增强病毒聚合酶的进行性(Collins等人，1995，ProcNatlAcadSciUSA92:11563-7;Collins等人，Fieldsvirology(B.N.Knipe，Howley，P.M.,ed.，Lippencott-Raven),Philadelphia,1996)和其基因间隔区的通读性(Hardy等人，1998，JVirol72:520-6;Fearns等人，1999，JVirol73:5852-64)。MPVM2-l基因，邻接于F基因，编码187aa的蛋白质，并揭示同APV-C的M2-l有最高的同源性(84%)。所有肺病毒M2-1蛋白的比较揭示在蛋白质的氨基末端中间由最高的保守性(Collins等人，1990，J.GenVirol71:3015-20;Zamora等人，1992，J.GenVirol73:737-41;Ahmadian等人，1999，J.GenVirol80:2011-6)，其与)(见察到的MPV同APV-C的前80个蛋白质aa残基有100%相似性一致(图10)。MPV的M2-l蛋白包含3个位于前30aa残基中的半胱氨酸残基，这在所有肺病毒中均保守。经常在锌结合蛋白中发现如此集中的半胱氨酸(Cuesta等人，2000，GenViroI:74，9858-67)。同肺病毒M2-1ORF重叠的第二个ORFs(M2-2)位置保守但是序列上不保守，它被认为涉及控制病毒RNA复制和转录间的开关(Collins等人，1985，JVirol54:65-71;Elango等人，1985，JVirol55:101-10;Baybutt等人，1987，JGenVirol68:2789-96;Collins等人，1990，J.GenVirol71:3015-20;Ling等人，1992，J.GenVirol73:1709-15;Zamora等人，1992，丄GenVirol73:737-41;Alansari等人，1994，J.GenVirol:75:401-404;Ahmadian等人，1999,J.GenVirol80:2011-6)。对于MPV，M2-2ORF起始于M2-lORF中的核苷酸第512位(图8)，其与APV-C有完全相同的起始位点。M2-2ORF的长度与APV-C和MPV—样，也是71aa残基。M2-2ORF的序列比较(图10)显示在MPV和APV-C之间有64%的aa序列同源性，而在MPV与APV-A和B之间仅有44-48%的aa序列同源性。小疏水(SH)基因ORF:该邻接于hMPVM2的基因可能编码183aa的SH蛋白(图8)。在该ORF和其它RNA病毒基因或基因产物之间没有可识别的序列相同性。由于在肺病毒SH蛋白质间序列相似性一般很低，因此这并不令人惊讶。SHORF的aa组成与APV，RSV和PVM的相对较相似，带有高百分比的苏氨酸和丝氨酸残基(对于hMPV，AFV,RSVA，RSVB，bRSV和PVM各自有22%,18%,19%，20.0%，21%和28%)。HMPV的SHORF包括10个半胱氨酸残基，而APVSH包括16个半胱氨酸残基。hMPV的SHORF包括两个潜在的N-相连的糖基化位点(aa76和121)，而APV有一个，RSV有两或三个，而PVM有四个。推测的hMPVSH蛋白和APV与RSV的SH的亲水轮廓图揭示了相近的特征(图IIB)。APV和hMPV的SHORF有一亲水N-末端，一个能用作潜在跨膜结构域的中心疏水结构域(hMPV的aa30-53)，第二个疏水结构域(aa155-170)和亲水C-末端。相反地，RSVSH看来缺少APV和hMPVORF的C-末端部分。在所有的肺病毒SH蛋白疏水结构域侧边是碱性aa残基，其在hMPV的SHORF中也有发现(aa29和54)。编码附着糖蛋白的基因(G):hMPV推测的GORF邻接于推测的SH基因并且编码236aa的蛋白质(nt6262-6972，图8)。第二个小ORF被发现紧接于该ORF，潜在编码68aa的残基(nt6973-7179)但是缺少起始密码子。在l94aa个残基的第二阅读框中的第三个潜在ORF同这两个ORF重叠而且缺少起始密码子(nt6416-7000)。在同一个阅读框中，该ORF接着是一个潜在的65aa残基的第四ORF(nt7001-7198)，也缺少起始密码子。最后，潜在的97aa残基的ORF(但缺少起始密码子)在第三个阅读框中被发现(nt6444-6737，图8)。与第一个ORF不同，其它的ORF没有明显的基因起始或基因终止序列(参见下文)。尽管236aa的GORF可能表示hMPV粘连蛋白的至少一部分，但不能排除通过一些RNA编辑事件另外的编码序列作为分离蛋白质或作为粘连蛋白的部分被表达。应该注意到对于APV和RSV来说，在基本GORF后面没有第二个ORF被确认出来，然而APV和RSV在G的主要ORF里都有第二个ORF。可是，缺少这些ORF表达的证据而且在不同病毒的预测的aa序列之间没有序列相同的(Ling等人，1992，JGenVirol73:1709-15)。hMPVG中的第二个ORF没有揭示其它G蛋白的特征而且另外的ORF是否表达还需要进一步的研究。BLAST分析所有ORF揭示在核苷酸或aa水平同其它已知的病毒基因或基因产物没有可识别的序列一致性。这同在其它G蛋白的低百分比的序列一致性相一致(53%)，比如hRSVA和B的(Johnson等人，1987，JVirol61:163-6)以及APVA和B的(38%)(Juhasz和Easton，1994，JGenVirol75:2873-80)。然而hMPVORF中的大部分在长度和序列上类似于APV的，hMPV推测的236aa残基的GORF较之APV的GORF相当的小(表4)。aa序列揭示34%的丝氨酸和苏氨酸的成分，其甚至高于RSV的32%和APV的24%。推测的GORF也包含8.5%脯氨酸残基，其高于RSV的8。/o和APV的7。/。。APV，RSV和hMPV的G蛋白中脯氨酸残基不寻常的丰富也糖蛋白中被观察到，其中它是蛋白质三维结构的主要决定因素(Collins和Wertz，1983，PNAS80:3208-12;Wertz等人，1985，PNAS82:4075-9;Jentoft，1990，TrendsBiochemSci15:291-4.)。HMPV的GORF包括五个潜在的N-相连的糖基化位点，而hRSV有七个，bRSV有五个而且APV有三到五个。hMPVG预测的亲水轮廓图揭示了与其它肺病毒相似的特征。N-末端包含一个亲水区域接着一个短的疏水区(hMPV的aa33-53)病友一个大部分亲水的C-末端(图12B)。该全部组成与APV和RSV的G蛋白中的区域符合得很好。与RSV和APV(各有5和20个)相反，hMPV推测的GORF包括仅有1个半胱氨酸残基。注意的是，G基因中的四个次级ORF中仅有两个包含另外一个半胱氨酸残基并且这四个潜在的ORF揭示有12-20%丝氨酸和苏氨酸残基并有6-11%脯氨酸残基。聚合酶基因(L):和其它负链病毒类似，MPV基因组的最后的ORF是复制和转录复合物的RNA依赖的RNA聚合酶成分。MPV的L基因编码2005aa的蛋白质，其比APV-A蛋白长一个残基(表5)。MPV的L蛋白同APV-A有64%的同源性，同RSV有42-44%，同其它副粘病毒有约13%(表6)。在非分段负链RNA病毒的L蛋白中的六个保守结构域被确认；发现了结构域三包含四个被认为对聚合酶功能关键的核心聚合酶基元(Poch等人，1990，JGenVirol71:1153-62;Poch等人，1989，EMBOJ8:3867-74)。这些基元(A，B，C和D)在MPVL蛋白中是很保守的在基元A，B和C中MPV同肺病毒有100。/o的相似性并且在基元D中，MPV同APV有100%并同RSV有92%。对于结构域III的所有部分(LORF中的aa627-903)，MPV同APV有77%的同一'性，同RSV有61-62%并同其它副粘病毒有23-27%(图13)。除了聚合酶基元，肺病毒L蛋白包含同ATP结合基元K(X)21GEGAGN(X)2()K—致的序列(Stec等人，1991，Virology183:273-87)。MPVLORF包括与APV相似的基元，其中中间残基的间距被一个残基改变K(X)22GEGAGN(X)19K。表5:MPV和其它副粘病毒的ORF的长度N1PMFM2-lM2陽2SHGMPV394294254539187711832362005APVA391278254538186731743912004APVB39127925453818673414APVC39429425453718471串vAPVD申《■>389hRSVA391241256574194卯642982165hRSVB39124124957419593652992166bRSV39124125656918693812572162PVM3932952575371767792396其它3418-225-335-393539-5652183-5427092262N1PMFM2-lM2-2SHG<table>tableseeoriginaldocumentpage185</column></row><table>表6:MPV与其它副粘病毒的ORF之间的氨基酸序列同一性<table>tableseeoriginaldocumentpage186</column></row><table>表6图例*=在已知G和SH蛋白中没有发现序列同源性因而被排除，**=未得到的序列，***=参见表4中的行列，表示相同内容(***),****=病毒基因组缺失的ORF。6.5实施例5:HMPV分离林1-99的基因组测序hMPV其它的分离林(1-99)也被确认并测序。为此，如前所述在第三猴肾细胞中繁殖hMPV分离林l刁9(vandenHoogen等人，2001，NatureMedicine7(6):719-724)。利用MagnaPureLC分离系统(RocheAppliedScience)和总核酸试剂盒的方法分离病毒RNA。利用标准方法，用随机六聚体(ProgeniaInc.Leiden)作为引物，把RNA转化成。CDNA保存在-20。C或以下直到用于序列分析。贯穿本方案使用的引物基于可得自原型hMPV1-00林的或者利用hMPV林1-99进行序列分析后获得的可用序列。获得大到1600碱基对的PCR片段以产生重叠片段。利用标准技术和ABI3100毛细管测序仪(AppliedBiosystems,NieuwerkerkIssel)对PCR片段进行序列分析。得到的核苦酸序列同原型hMPV林1-00进行初始比较。使用Blast软件与GenBank数据库中的相关序列进行比较。为了进一步序列分析，使用DNASTAR软件(DNASTARInc，MadisonWI，II.S.A.)，而为了系统发育分析，使用ClustalW软件程序。最初，使用基于1-00分离抹的序列信息而设计的引物获得1-99分离林的序列。可是，由于基于l-00分离林信息，基因组的一些部分不能被测序，因此基于1-99分离林的信息以及通过1-00分离林3'和5'末端测序而可用的信息而得到的新引物被使用。hMPV分离林的原型序列包括13,223个碱基对，在总共227个平均长404个碱基对的序列中测得。该序列为SEQIDNO:18。hMPV1-99和其它副粘病毒的开放阅读框的长度以绝对大小和氨基酸同一性百分比的形式示于表7。观察到再在1-99和1-00林之间大部分同一的，同源性百分比超过90%的有编码N蛋白(95.2%)、M(97.3%)、F(93.7%)、L(94.1%)和M2-1(94.1%)的基因。在两个林之间的P和M2-2基因的同源性被发现各自为86.1%和88.9%。而且分离林主要与鸟类间质肺病毒的C亚型相关，其氨基酸同一性为N蛋白(88.6%)，M蛋白(87.1%)和M2-1蛋白(84.3%)。P和M2-2蛋白的同一性较低，各自在67.8%和56.9%。原型1-00和1-99林的基因在基因组图谱中一致，N，P，M，F，M21和M2-2蛋白有相同的氨基酸数量。推测的SH基因少6个氨基酸，G蛋白少12个氨基酸，而1-00和1-99林的L基因大小相同。最后，基因组图谱上的基因起始与位于基因间的非编码序列概括于表8。总之，人间质肺病毒1-99林的序列信息清楚地证实了1-99与原型林l-00的遗传构成，都有相同的遗传图谱构成。同APV的C亚型观察到较少的系统发育关系。表7:HMPVl-99和其它副粘病毒的ORF的长度(氨基酸残基的数目)NPMFM21M22SHG1-993942942545391877117722419371-00394294254539187711832362005APV-A391278254538186731743912004APV-B39127925453818673414APV-C39429425453718471hRSV-A39124125657419490642982165hRSV-B39124125657419590652992166bRSV39124125657418690812572162PVM3932952575371769892396HMPV1-99与其它副粘病毒中间的氨基酸序列同一性的百分比NPMFM21M22SHG1-0095,286,197，393，794,18S,95932，494,1APV-A68，958,176,167,5692513，114,263,7APV-B69,153，976,566,865,S26,4APV-C88,667，S87,180,584,356，9bRSV化l28,136,93532,69,712,215，646,5hRSV-A41,12637,632,235,66,21646,9hRSV-B40,62636,934,43413，921,215,647PVM43,722，439，238,85,48表8:基因图谱上的基因起始序列与位于基因间的非编码序列的概要位置ORF终止非编码序列基因起始序列起始位置ORF1JLeACGAGAAAAAAACGCGUAUAAAUUAAAUGGGACAAAUAAAAAUG54NUCCAAACAAAAC1238NUAAUUAAAAAACUGGGACAAGUCAAAIX31262P位置ORF终止非编码序列基因起始序列起始位置2146Puaguuuaaumaaauaaacaaugggacaagucaagaug2179m2943muaaaaauaacugucuuamjcaauaauugcuugggacaaauaaaaaw3船fauauaacucuagagauuaauaagcuuauuauuauaguuauauaaaaauaaauuagaauuagaagggcaucaauagaaagc4684FUAGUUAAUUAAAAAAUGGGACAAAUCAUCAUG471iM25437m2uaguaaaaaauaaaaauagaaugggmjaaaugacaaug5470sh6003shuaaaauaacacggsuuusaacauuaaaausagggacaaguggcuaug6:210ggaacaaccuccacccaggucuaucaauacagugguuuagccauuuaaaaaccgaauauuaucuaggcugcacgacacuuugcaauaauaugcaauagucaauaguuaaaccacugcugcaaacucauccauaaijauaaucacugaguaauacaaaacaagaaaau6884guagagaggugcaaaacucaaatoagcacaacgcgauaaaugacaaw7124lacacaaacauyccauccaaguaguuaacaaaaaaccacaaaauaaccuugaaaaccaaaaaaccaaaacmjaaacccagacccagaaaaacauagacaccauauggaagguucuagcauaugcaccaaugagaik3gcaucuguucauguaucaauagcaccaccaucauucaaggamjaagaagaggcgaaaauuuaa13009lugaauuaaacuaugauuucuuugaagcauuaaug13243trgagaacacal;accccaauaugmjcaagcuuauagauaauuugogaaaugcagaaauaaagaaacuaaucmaogucmcuggguauaugcuugu位置ORF终止非编码序列基因起始序列起始位置ORFGAGUAAGAAGUAAUAAUAAUGAUAAUGAUUAACCA(JAAUCUCMCMCMACUGAGAAAAUAAUCGUCUAACAGUUUAGUUGAXJC八UUAGUUAUUUAAAAUUAUAAAAUAGUAACUA6.6实施例6:系统发育关系系统发育方法可用以确认病毒组间的关系，即MPV和其它病毒间。另外，系统发育关系可用于决定同型病毒的不同分离林系统发育树以确定MPV和其它病毒之间的关系，也可以确定hMPV不同分离抹之间的关系。例如，利用核苷酸和蛋白质序列数据产生系统发育树用以阐明MPV和不同病毒之间的关系。可选地，利用核苷酸和蛋白质序列数据产生系统发育树用以阐明hMPV的各种分离林之间的关系。HMPV和不同病毒之间的系统发育关系尽管利用得自未确认病毒分离林的核苷酸序列的BLAST检索揭示主要在肺病毒成员中的同源性，基于蛋白质序列的同源性也揭示了同其它副粘病毒有一些相似。如新确认病毒分离林和肺病毒成员间的关系所示，基于这些病毒的N，P，M和FORF构建系统发育树。在所有四个系统发育树中，新确认病毒分离林最与APV相近(图14)。描述过的APV四种血清型中(Bayon-Auboyer等人，2000，JGen.Virol81:2723-2733)，APV血清型C，美国鸟类中发现的间质肺病毒，显示和新确认的病毒最相似。可是需要注意的是，APV血清型D仅有部分序列信息可用。对所有系统发育树，用ClustalW软件包把DNA序列比对并用Phylip3.5程序的DNA-ML软件包以50或100次bootstrap和3次jumble产生最大相似性树(Brandenburg等人，1997，JMedVirol52:97-104)。以前公开的用于产生系统发育树的序列可来自于Genbank，为以下登陆号对于所有ORF:hRSV:NC001781;bRSV:NC001989;对于FORF:PYM，D11128;MV-A，D00850;MV-B，Y14292;MV-C，AF187152;对于NORF:PVM，D10331;MV誦A，U39295;MV-B，膨296;MV-C，M1765卯；FortheMORF:PMV，U66893;MV画A，X58639;MV-B，U37586;MV國C，AE262571;对于PORF:PVM，09649;MV-A，U22110,MV-C，AF176591。作为MPV和肺病毒成员之间关系的指标，先构建基于N，P，M，和FORF的系统发育树(vandenHoogen等人，2001，NatMed7(6):19-24)，其揭示了MPV和APV-C之间的相近关系。因为MPVSH和G基因同其它副粘病毒基因的底同源性，不能构建这些基因的可靠的系统发育树。另外，肺病毒和间质肺病毒属成员之间截然不同的基因组成使基于整个基因组序列产生系统发育树变得不可能。除那些以前公开的之外，M2和L基因树被构建成了。这些树都证实了肺病毒亚科中的APV和MPV的近亲关系(图15)。为构建系统发育树，利用ClustalW软件包使DNA序列比对并利用Phylip3.5程序的DNA-ML软件包以100次bootstrap和3次jumble产生最大相似性树。计算bootstrap以用PHYLIP—致包创建一致树。基于至今获得的hMPV的不同分离林的系统发育分析，在病毒分离林00-l中两个主要基因型被确认，为基因型人的原型和分离林99-1的基因型B的原型。假设基因型与亚型有关并且用来自两个亚组的病毒重感染发生在先存在免疫中而且并不严格要求抗原变化从而允许重感染。另外，hMPV显得与禽类肺病毒，主要发现于家禽中的病毒，很相近。除了SH和G蛋白，两个病毒的核苷酸序列显示出高同源百分比。病毒在主要基于核蛋白和基质蛋白的测试中显出交叉反应，可是它们在基于粘连蛋白的测试中应答不同。病毒中和滴度的差异进一步提供了证明，即hMPV的两个基因型是一种病毒的两个不同血清型，而APV是不同的病毒。不同HMPV分离林间的系统发育关系系统发育方法也可用以确认MPV不同分离林的关系。例如，利用MPV的核苷酸或蛋白质序列数据可以产生系统发育树用以阐明一些从不同方面得到的MPV分离林之间的关系。该方法在理解MPV病毒群体产生的差异中是有用的。为了确定我们新确认的病毒分离抹的关系，基于从八至九个分离林(F8个，N，M和L9个)获得的序列信息构建系统发育树。用为在直接测序得到的N，M，F，P，SH和LORF中扩增短片段而设计的引物来进行RT-PCR。前面发现的血清学上相关的九个病毒分离林(见上)也被发现遗传上很相近。事实上，所有九个分离林相互之间比APV更相近。尽管用于这些系统发育树的序列信息有限，但是其显示九个分离林可以被分成两组，分离林94-1，"-l和"-2分在一组而另六个分离林(94-2;93-1;93-2;93-3;93-4;00-1)分在另一组(图16)。所有四个变种，即变种Al、A2、Bl，或B2的hMPV不同分离林的F基因的比对如图17所示。所有四个变种，即变种Al、A2、Bl，或B2的hMPV不同分离林的F蛋白的比对如图18所示。所有四个变种，即变种Al、A2、Bl，或B2的hMPV不同分离林的G基因的比对如图19所示。所有四个变种，即变种Al、A2、Bl，或B2的hMPV不同分离林的G蛋白的比对如图20所示。基于F基因序列的系统发育树显示不同hMPV分离林和它们同hMPV各变种联合的系统发育关系，这如图21所示。另外，基于G基因序列的系统发育树显示不同hMPV分离林和它们同hMPV各变种联合的系统发育关系，这如图22所示。利用DNA最大可能法以50次bootstrap和3次jumble计算出系统发育树。在hMPV分离林00-1的不同基因之间的序列同一性和hMPV分离林99-l，APV血清型C，和APV血清型A的不同基因列于表9。表9在HMPV分离林00-1和其它病毒之间的ORF序列同一性hMPV分离抹99-1APV血清型CAPV血清型AN958869PS66855M98F94M2.1M2.2SHGL959057339487818456N.A.N.A.N.A.786872251864最初，仅对九个不同分离林推导系统发育关系。用病毒分离林的N，M，F和LORF中部分核苷酸序列分析确认两个潜在的基因簇。在一个簇观察到90-100%的核苷酸同一性，而在簇之间观察到81-88"/的同一性。从更多病毒分离抹中得到的序列信息证实了两种基因型的存在。病毒分离林00-1，作为簇A的原型，而病毒分离株"-l作为簇B的原型，被用于交叉中和试验以测试基因型是否于不同血清型或亚组有关。使用RT-PCR试验，用位于聚合酶基因中的引物，从鼻咽吸出物样品中鉴定30个另外的病毒分离林。这些新分离林的基质和聚合酶的部分序列信息与前面九个分离林的被用于构建系统发育树(图15)。这些树的分析证实了两个基因簇的存在，病毒分离株00-1为组A中的原型病毒，并且病毒分离林99-1为组B中的原型病毒。组中核苷酸序列的同一性超过92%，而簇中的同一性为81-85%。6.7实施例7:人间质肺病毒(HMPV)NL/l/00基因组RNA的前导序列当确定基因组组成的大部分时，在极端末端的可信的末端序列缺少了。利用病毒RNA的连接和接着的连接点的PCR扩增和聚腺苷酸化和3'RACE方法的联合使用，可确定可信的核苷酸序列(图54)。利用病毒RNA末端连接产生的PCR片段的序列分析揭示如图26所是的前导和尾随序列(参见，SEQID18-21)。用该方法获得的尾随序列与从其它包括APV的副粘病毒尾随序列预测而来的序列一致。可是，71个测序的克隆中仅有两个前导序列包括现在在所有副粘病毒中都发现的作为末端核苷酸残基的AC。因此，接下来利用聚腺苷酸化和3'RACE方法的联合使用来确认hMPV/NL/1/OO前导的末端核苷酸序列。进一步确1^人了两个额外的hMPVNL/1/003'前导末端的核苷酸。该研究中使用Vero中生长的hMPVNL/1/00病毒。作为对照，使用相关的负义病毒，呼吸道合胞病毒(RSV)A2，其和确认的末端序列有相似的基因组大小。根据厂商的说明书，利用QIAamp病毒RNA微试剂盒(Qiagen)分离病毒。通过把病毒RNA和聚(A)聚合酶(Ambion)于37°C温浴1小时从而聚腺苷酸化病毒RNA，接着用NucAway螺旋柱(Ambion)清洗。用互补于聚(A)尾部区域的引物和反转录酶，即SuperscriptI(Invitrogen)，来反转录病毒RNA。使用与末端并列的hMPV特异性引物来进行PCR和嵌式PCR反应，从而扩增出希望大小的产物以进行序列分析。使用TA克隆试剂盒(Invitrogen),PCR产物进一步克隆进pCRII载体。为了揭示末端的可信核苷酸序列，进行PCRDNA和PCR产物的直接测序。图55仅显示hMPV的数据。使用RSV-A2RNA的对照显示，用相同的方法RSV-A2的前导序列人保持完整并可检测。PCR产物(图55)直接和用PCR克隆进行的序列分析都显示hMPV的前导区域的前导序列中的最接近3'的20个核苷酸由5'ACGCGAAAAAAACGCGTATA组成(以有义cDNA方向表示)。在图101中下划线表示两个新确认的核苷酸。6.8实施例8:MPV分离林的血清型和亚组用病毒中和试验(如参见实施例16)确定hMPV的病毒分离林是否可以通过血清型或基因型来区别。病毒分离林00-1和99-1被用来接种白鼬从而产生病毒特异性抗血清。对于00-l分离株来说，通过在加压手套盒中单独居住的两个无特异病原的白鼬和两个豚鼠的鼻内试验感染产生白鼬和豚鼠的病毒特异性抗血清。两或三周后对所有的动物进行心脏取血，它们血清用作参考血清。对前述病毒用以下所述的间接IFA进行血清测试。这些抗血清，与用99-1分离林制备的抗血清，被用于病毒的病毒中和试验(表10)。表10:病毒中和滴度<table>tableseeoriginaldocumentpage195</column></row><table>另外，六个豚鼠用00-1和99-1的病毒之一进行接种。鼻咽吸出物样品的RT-PCR试验显示感染后第2天至第10天病毒复制。感染后第70天豚鼠对同质性或异质性病毒起反应，在所有四个例子中都被注意到了。初次反应后的抗血清的病毒中和试验显示基本与白鼬进行的VN试验(VN滴度中的〉16-倍差异)有相同的结果。在本实施例中的结果证实了两个基因型的存在，其与MPV两个血清型相符，并显示同质或异质病毒重复感染的可能性(表ll)。表ll<table>tableseeoriginaldocumentpage195</column></row><table>7.诊断试验/检测方法7.1实施例9:直接免疫荧光试验(DIF)方法将RTI病人的鼻咽吸出物样品用所述DIF进行分析(Rothbarth等人，1999，J.ofVirol.Methods78:163-169)。样品储存在-70。C。总之，鼻咽吸出物用5mlDulbeccoMEM(BioWhittaker，Walkersville，MD)稀释并在涡流混合仪上彻底混合一分钟。悬浮液以840xg离心四分钟。沉淀涂布于多孔板(Nutacon，Leimuiden，荷兰)上，而上清液用于病毒分离。干燥之后，细胞用丙酮于室温固定。洗板后，它们同商品化的FITC-标记的特异于诸如流感病毒A和B,hRSV和hPIV1至3(Dako，Glostrup，丹麦)等的病毒的抗血清以37。C温浴15分钟。用PBS洗涤三次并用自来水洗涤一次之后，把板浸没在甘油/PBS溶液中(Citifluor，UKO,Canterbury,英国)并且包埋。然后用Axioscop荧光显微镜分析该板。7.2实施例10:MPV的病毒培养来自宿主的培养样品的病毒检测直接指明了宿主现在和/或过去暴露于或感染病毒的情况。首次传代后显出CPE的样品被用于接种24孔板培养基中下面聚基的单层tMK细胞。每天检测培养的CPE并且培养基每周换一次。由于每一分离林的CPE不同，用间接IFA用白鼬抗新病毒分离林的抗体在第12至14天检测培养物。阳性培养物冻溶三次，其后低速离心使上清液澄清，丰装并冷冻保存在-70。C。培养上清液中的病毒的50%组织培养感染剂量(TCID5。)以所述方法确定(Lennette，D.A.etal.In:DIAGNOSTICPROCEDURESFORVIRAL，RICKETTSIAL,ANDCHLAMYDIALINFECTIONS,7thed.(eds.Le證tte，E.H.，Le騰tte,D.A.&Lennette,E.T.)3-25;37-138;431-463;481-494;539-563(AmericanPublicHealthAssociation,Washington,1995"。7.3实施例11:通过间接免疫荧光试验(IFA)检测抗原抗体用于显现感染的细胞或组织中的病毒蛋白。间接免疫荧光试验(IFA)是一种灵敏的方法，其中偶连荧光指示剂的二抗识别病毒特异性抗体上的普通表位。由于其更高的灵敏水平，IFA比DIF更好。为了进行间接IFA，用5mlDulbeccoMEM培养基(BioWhittaker，Walkersville，MD)稀释收集的标本并用涡旋混合仪彻底混合一分钟。然后以840xg离心悬浮液十分钟。沉淀涂布于多孔板上。干燥后，细胞在室温用丙酮固定。可选的，病毒培养在含玻璃片的24孔板上的tMK细胞中。该玻璃片用PBS洗涤并用丙酮在室温固定1分钟。进行两次间接IFA。第一次间接IFA中，包含感染的tMK细胞的玻璃板用PBS洗涤，然后同病毒特异性抗血清以37°C温浴30分钟。抗流感病毒A，B和C，hPIVl至3型，和hRSV的单抗被使用。对于hPIV4型，腮腺炎病毒，麻渗病毒，仙台病毒，猿病毒5型和新城病毒，多克隆抗体(RIVM)和白鼬和豚鼠的参考血清被使用。用PBS洗涤三次并用自来水洗涤一次之后，用直接抗第一次温浴中使用的血清的二抗对玻璃板染色。多克隆抗血清的二抗为羊抗白鼬(KPL，Guilford,英国，稀释40倍)，鼠抗兔(Dako，Glostrup，丹麦，稀释20倍)，兔抗鸡(KPL，20倍稀释)和鼠抗豚鼠(Dako,稀释20倍)的。在第二次IFA中，PBS洗涤后，玻板在37。C同PBS稀释的1:50至1:100的稀释度的20个多克隆抗体温浴30分钟。免疫的白鼬和豚鼠被用于获得多抗，但是这些抗体可以用各种动物制备，而且多抗使用的稀释度可随每次免疫而变化。用PBS洗涤三次并用自来水洗涤一次之后，玻板同FITC标记的羊抗白鼬抗体于37°C温浴30分钟。(KPL，Guilford，英国，稀释40倍)。用PBS洗涤三次并用自来水洗涤一次之后，玻板浸入甘油/PBS溶液中(Citifluor，UKO,Canterbury,英国)并包被。用Axioscop萸光显微镜(CarlZeissB.V.，Weesp，荷兰)分析玻板。7.4实施例12:血细胞凝集反应试验，氯仿敏感性测试和电镜利用病毒的不同特征检测病毒。例如，许多病毒包含能够结合红血球的蛋白质从而形成格状。该性质被称为血细胞凝集反应并可被用于血细胞凝集反应试验以检测病毒。病毒也可在电镜(EM)下被看到或用PCR技术检测到。血细胞凝集反应试验和氯仿敏感性测试如述进行(Osterhaus等人，1985，Arch,ofVirol86:239-25;Rothbarth等人，JofVirolMethods78:163-169)。对于EM分析，从感染的细胞上清液中用微离心机在4C以17000xg富集病毒，然后小颗粒重悬于PBS中并用负对照EM察看。7.5实施例13:hMPV/AVP的IgG，IgA和IgM类抗体的检测病毒的特异性抗体在感染/疾病过程中上升。因此，检测宿主中的病毒特异性抗体是宿主现在和/或过去感染那种病毒的指标。间接酶免疫测定(EIA)用于检测hMPV的IgG类抗体。该试验主要如前所述在微滴定皿上进行(Rothbarth等人，1999，J.ofVir.Methods78:163-169)。简而言之，用1%TritonX-100处理来溶解富集的hMPV。在通过交错滴定确定最佳施用稀释度后，在微滴定皿中以室温用PBS覆盖16小时。接下来，EIA緩冲液中的IOOul体积的1:100稀释度的人血清加入孔中并以37。C温浴1小时。加入羊抗人IgG过氧化物酶结合体(Biosource，USA)检测人IgG结合，加入TMB作为培养基铺皿并且在450nm出测量光密度(OD)。用OD的S(信号)/N(阴性)比率来表述结果。假如S/N率超过阴性对照加上三倍标准则认为血清IgG阳性。通过主要如前所述的捕捉EIA来检测血清中hMPV的IgM和IgA类抗体(Rothbarth等人，1999，JVirMethods78:163-169)。对于IgA和IgM的检测来说，商业化的覆盖了抗人IgM或IgA特异性单抗的微滴定平皿被使用。血清以1:100稀释。37。C温浴l小时后，最佳施用稀释度的hMPV加入每个孔(lOOul)，然后37°C温浴1小时。洗涤后，加入标记过氧化物酶的多克隆抗hMPV抗体，平皿于37°C温浴1小时。加入TMB作为培养基铺皿，在450nm处测量OD。用OD的S(信号)/N(阴性)比率来表述结果。假如S/N率超过阴性对照加上三倍标准则为IgG阳性。在AVP抑制试验中检测AVP抗体。AVP抑制试验规程包括在由SVANOVABiotechAB制造的APV-AbSVANOVIIM)酶免疫试验中，该公司位于UppsalaScienceParkGluntenSE-75183Uppsala瑞典。用OD的S(信号)/N(阴性)比率来表述结果。假如S/N率超过阴性对照加上三倍标准则认为血清IgG阳性。7.6实施例14:通过间接IFA检测人，哺乳动物，反刍动物或其它动物中的抗体为了检测病毒特异性抗体，用MPV感染的tMK细胞用丙酮固定在封口罩上(如上所述)，用PBS洗涤并在37°C以1至16的稀释度和血清样品一起温浴30分钟。用PBS洗涤两次并用自来水洗涤一次之后，玻板同针对使用物种的FITC标记的二抗(Dako)—起在37。C温浴30分钟。玻片如上所述来处理。抗体可以用焚光染料直接标记，其将用于直接免疫荧光试验。FITC可以用其它荧光染料代替。7.7实施例15:通过ELISA检测人，哺乳动物，反刍动物或其它动物中的抗体在副粘病毒中，N蛋白是最丰富的蛋白质，并且针对该蛋白质的免疫应答发生在感染早期。对于这些原因，优选使用N蛋白的重组体来进行ELISA试验以检测针对MPV的抗体。适合做抗体检测的抗原包括任何MPV蛋白，其可结合暴露于或感染MPV病毒的病人的任何MPV特异性抗体。本发明优选的抗原包括暴露于MPV的病人中的主要产生免疫应答的那些抗原，其因而典型地可最容易的被病人抗体识别。尤其优选的抗原包括MPV的N，F，MandG蛋白。用于免疫学技术的抗原可以是天然抗原或是其修饰体。可用分子生物学已知的技术改变MPV抗原的氨基酸序列从而产生也可用于免疫技术的抗原的修饰体。克隆基因的方法，操纵基因到表达载体，以及在相异宿主中表达基因编码的蛋白质是公知的，而且这些技术可被用于提供表达栽体，宿主细胞，以及在宿主中表达克隆的编码抗原的基因以生产重组抗原用于诊断测试。比如，可参考《MOLECULARCLONING,ALABORATORYMANUALANDCURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY》。许多表达系统可用于生产MPV抗体。例如，许多适合在大肠杆菌，枯草杆菌，酵母，昆虫细胞和哺乳动物细胞中生产抗体的表达栽体已被描述，它们任何一个可用于生产适合在暴露的病人中检测抗MPV抗体的MPV抗原。杆状病毒表达系统具有提供必要蛋白质过程的优点，而且因而被优选。该系统利用多角体蛋白启动子直接表达MPV抗原(Matsuura等人，1987，J.Gen.Virol.68:1233-1250)。重组杆状病毒生产的抗原可用于许多免疫试验以检测病人的抗MPV抗体。已知重组抗原可被用于代替事实上的任何免疫试验中自然病毒以检测病毒特异性抗体。试验包括直接和间接试验，夹层试验，诸如那些在其它中使用盘或珠的固相试验，以及液相试验。适合的试验包括那些使用第一和第二抗体的，和那些抗体结合试剂，如蛋白A。另外，本发明可有许多检测方法，包括比色，荧光，磷光，化学发光，发光和放射方法。例如，可进行使用重组N蛋白作为抗原的间接IgGEIA(用昆虫(Sf9)细胞中的重组杆状病毒生产)。对抗原制备来说，用重组杆状病毒感染Sf9细胞并在感染后3-7天收集。细胞悬浮液用pH7.2的PBS洗涤两次，调节到5.0X106个细胞/1111的细胞密度，并冻溶三次。大细胞碎片用低速离心(500>cg15分钟)压丸并收集上清液，使用前储存于-70。C。处理未感染的细胞用作阴性对照抗原。一旦制备了抗原，100^tl冻溶的溶解产物以l:50至1:1000的稀释度范围被用于覆盖微滴定皿。在相同的孔中处理未感染的细胞的溶解产物并作为阴性对照。温浴过夜后，PBS/0.05。/o吐温洗涤平皿两次。ELISA緩冲液(PBS，补加标准羊血清到2%，并有0.5%牛血清白蛋白和0.1%牛奶)把试验血清稀释至1:50至1:200，接着37。C温浴1小时。PBS/0.05。/。吐温洗涤平皿两次。标记羊抗人(或抗其它物种)IgG的辣根过氧化物酶，用ELISA緩冲液稀释到1:3000至l:5000，加入孔中，37。C温浴1小时。然后PBS/0.05。/。吐温洗涤平皿两次，自来水洗一次，同比如从Sigma购买的酶底物TMB，3，3'，5，5'-四甲基对二氨基联苯一起室温温浴15分钟，用100^12M磷酸终止反应。用自动微滴定皿读数器在450nm处测量比色读数。7.8实施例16:病毒中和试验当物体感染了病毒时会产生一系列抗病毒抗体。这些抗体中的一部分能够结合病毒颗粒并中和它们的感染性。病毒中和试验(VN)的进行一般通过把稀释的血清或单抗同病毒混合，温浴它们，并用培养的细胞，含胚鸡蛋，或动物测试剩余的感染性。用中和抗体确定病毒颗粒上的特异类型的抗原，如中和抗体可用于确定病毒的血清型。另外也存在广泛的中和抗体。用两倍稀释度的人和动物血清在八倍稀释度开始VN试验。稀释血清同100TCIDs。的病毒温浴一'J、时，然后接种96孔板中生长的tMK细胞，其后以840xg离心平皿。在三和六天后换培养基而且接种后8天用FTIC标记的白鼬抗MPV抗体进行IFA。以最低稀释度的血清样品进行阴性IFA和细胞培养中的CPE抑制来确定VN滴度。7.9实施例17:RNA分离也可通过检测从宿主得来的样品中的病毒核酸来诊断宿主中病毒的存在(例如，参见实施例18中的RT-PCR和实施例21中的RAP-PCR)。根据厂商的说明(RocheDiagnostics,Ahnere，荷兰)，RNA用高纯度RNA分离试剂盒分离自感染细胞培养物的上清液或蔗糖梯度级分。RNA也可按照以下其它现有技术中的过程进行(比如，参见《CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY》，巻1-3(1994-1998).Ausubel，F.M.等人编辑，JohnWileyandsons,Inc.,USA出版)。7.10实施例18:检测/诊断MPV的RT-PCR用复制或扩增病毒基因组材料的方法来检测生物样品中病毒。副粘病毒的病毒特异性寡聚核苷酸序列如本实施例以下所述进行RT-PCR试验。在包含50mMpH8.5的Tris.HCl，50mMNaCl，4mMMgCl2，2mM二硫苏糖醇，200uM每种dNTP，10单位重组RNA酶(Promega，Leiden,荷兰)，10单位AMVRT(Promega，Leiden,荷兰)，5单位AmplitaqGoldDNA聚合酶(PEBiosystems，NieuwerkerkaandeIjssel，荷兰)和5filRNA的50jil反应体系进行一步RT-PCR。循环条件为42°C45分钟和95°C7分钟循环一次，95°C1分钟，42。C2分钟和72。C3分钟重复40次，并72。C10分钟一次。序列表中提供引物序列。更明确地，用于核蛋白基因的引物是N3和N4，各自具有与SEQIDNOs:28和29相同的核苷酸序列，并用于扩增151个核苷酸片段。用于基质蛋白基因的引物是M3和M4，各自具有与SEQIDNOs:30和31相同的核苷酸序列，并用于扩增252个核苷酸片段。用于聚合酶基因的引物是L6和L7，各自与SEQIDNOs:34和35相同，并用于扩增173个核苷酸片段。用于F蛋白基因的引物是F7和F8，各自与SEQISNOs:32和33相同，并用于扩增221个核苷酸片段。另外，探针被用于确证hMPV基因组序列的存在。用于检测M基因的探针具有与SEQIDNO:36相同的核苷酸序列。用于检测N基因的探针具有与SEQIDNO:37相同的核苷酸序列。用于检测L基因的探针具有与SEQIDNO:38相同的核苷酸序列。其它例子中，可基于已知的或从测序得到的MPV序列设计引物和探针。同样的，用于特定目的的不同引物序列和不同緩冲液和试验条件对本领域普通技术人员来说是公知的。RT-PCR也被用于检测已知的副粘病毒。自身并基于可用序列的比对来开发hPIV-l至4，腮腺炎，麻渗，Tupsia，Mapuera，和Hendra的引物。新城病毒的引物得自Seal,J.，J.等；Clin.Microb.,2624-2630，1995。Nipah和普通副粘病毒-PCR的引物得自Chua，等，2000,Science,288。用于检测其它已知的副粘病毒的引物如下hPIV-l用与SEQIDNO:58和59相同的序列各自来作为正向和反向引物，hPIV-2用与SEQIDNO:60和61相同的序列各自来作为正向和反向引物，hPIV-3用与SEQIDNO:62和63相同的序列各自来作为正向和反向引物，hPIV-4用与SEQIDNO:64和65相同的序列各自来作为正向和反向引物，腮腺炎用与SEQIDNO:66和67相同的序列各自来作为正向和反向引物，NDV用与SEQIDNO:68和69相同的序列各自来作为正向和反向引物，Tupaia用与SEQIDNO:70和71相同的序列各自来作为正向和反向引物，Mapuera用与SEQIDNO:72和73相同的序列各自来作为正向和反向引物，Hendra用与SEQIDNO:74和75相同的序列各自来作为正向和反向引物，Nipah用与SEQIDNO:76和77相同的序列各自来作为正向和反向引物，HRSV用与SEQIDNO:78和79相同的序列各自来作为正向和反向引物，麻渗用与SEQIDNO:80和81相同的序列各自来作为正向和反向引物，而且普通副粘病毒科病毒用与SEQIDNO:82和83相同的序列各自来作为正向和反向引物。7.11实施例19:使用PCR检效'JHMPV为了检测样本中hMPV的存在，开发基于快速且简单PCR的试验。使用以下引物组来进行靶向hMPV的L和N序列的常规RT-PCR试验L-正向(5誦CACCCCAGTCTTTCTTGAAA-3')和L-反向(5'-CATGCCCACTATAAAAGGTCAG-3')和引物N-正向(5'國CATGCTATATTAAAAGAGTCTC-3')和N-反向(5'國TCTGCAGCATATTTGTAATCA-3')。反应混合物(总体积为50jil)含有5nlRNA、200nM各种引物、AmpliTaqGold緩冲液(AppliedBiosystems，Nieuwerkerka/dIJssel，TheNetherlands)、600dNTP、2nMDTT、2mMMgCl2、20URNAsin、5UTaq聚合酶和10UAMV逆转录酶(所有酶都由Promega提供)。RT-PCR参数是在42°C进行60分钟和在95。C进行7分钟，然后是40个以下循环在95°C进行1分钟、在45°C进行2分钟和在72°C进行3分钟。包括最后在72°C进行10分钟，以确保所有新的DNA链的延长都已完成。通过以下方式进行PCR产物的检测将10piPCR反应样本转移到HybondN+膜(AmershamPharmaciabiotech)上，然后用生物素标记的探针进行杂交(对于两个试验分别采用N-探针(5，-ACAACTGCAGTGACACCTTCATCATTGCA-3')和L-探针(5，-CTGTTAATATCCCACACCAGTGGCATGC-3'))。然后将缀合物链霉抗生物素蛋白过氧化物酶与探针结合，加入检测试剂ECL(AmershamPharmaciabiotech)。通过将印迹暴露于X-射线膜来显现DNA片段(图58)。所得结果证实，该基于RT-PCR的试验可用于使用一组关于N或L序列的寡核苷酸来从所有四个变种中检测到MPV林。7.12实施例20:开发用于检测所有四种人间质肺病毒亚型的单一试验为了检测所有hMPV亚型Al、A2、Bl和B2，开发一种单一敏感试验。该试验是有利的，因为其使得能够使用一致的诊断装置和试剂组来从欲检测的不同亚型中检测hMPV株。该新的敏感性Taqman试验能够以相同敏感性确定所有四种亚型。设计两组Taqman引物和探针，来根据得自53个临床分离株的hMPV核壳基因的序列信息鉴定hMPV的所有四种亚型。所选的引物和探针位于所有亚型的最保守序列内。对于试验，设计的Taqman引物是Medi-N國正向(5'-CAACAACATAATGCTAGGACATGTATC曙3')、Medi隱N-反向(5-CCGAGAACAACACTAGCAAAGTTG國3')和探针Medi-N-探针(5'-FAM-TGGTGCGAGAAATGGGTCCTGAATCTGG-TAMRA-3')。对于试验NL-N，设计的引物是RF930(5，-CATATAAGCATGCTATATTAAAAGAGTCTC-3，)和RF931(5-CCTATTTCTGCAGCATATTTGTAATCAG誦3')以及探针RF928(5'-FAM-TGYAATGATGAGGGTGTCACTGCGGTTG-TAMRA-3)，其中Y是C或T残基。HMPV分离林得自冷冻的真的鼻咽样本。让病毒在tMK细胞上生长，并且在-70。C贮存。从所有临床hMPV分离林中选择四个作为原型分离林，一个分离林用于一种亚型，以测定设计的引物和探针。这些原型病毒的所有序列可以得自GenBank数据库用于hMPV亚型Al的原型病毒(NL/01/00抹；登记号AF371337)、A2(NL/17/00林；待提交)、Bl(NL/99/01林；待提交)和B2(NL/94/01林；待提交)。制备RNA失控转录物以产生标准曲线，从而能够定量测定病毒基因组拷贝数目。在T7启动子控制下，将hMPVAl原型病毒的N序列克隆到改性的pCITE载体内。使用RiboprobeSystem-T7系统(Promega)，根据生产商的说明，产生失控转录物。通过凝胶电泳测定RNA失控转录物的纯度，通过在光谱仪中测定A260来定量确定。4吏用高纯度RNA分离试剂盒(RocheDiagnostics,Almere，TheNetherlands),根据生产商的说明来分离RNA。使用0.2ml样本进行RNA分离。与柱结合后，进行DNase1消化和洗涤，将RNA用50fil不含核酸酶的双蒸馏水洗脱下来。使用5fdRNA样本，采用HI号逆转录酶(Invitrogen)，在20pl的最终体积中，根据生产商的说明，产生具有特异性引物的cDNA。对于每一实时PCR反应，使用5nlcDNA。使用Taqman通用PCRmastermix(AppliedBiosystems，Nieuwerkerka/dIJessel，TheNetherlands),根据单独的RT步騍，并且依据生产商的说明来进行病毒RNA的检测。对于一步反应，使用EZRT-PCR试剂盒(AppliedBiosystems)。在ABIPrism7000Taqman才几器(AppliedBiosystems)中进行扩增和检测。每一反应混合物含有500nm正向引物(RF930)、250nm反向引物(RF931)和500nM内切酶探针(RF928)，该探针在5'端用FAM(6-羧基-荧光素)标记，在3'端用TAMRA(6-羧基-四甲基-若丹明)标记。扩增参数是在95°C进行5分钟的自然化/活化，以及45个在95°C进行30秒和在60°C进行1分钟的循环。对于一步反应，在这些循环条件之前，是50。C进行2分钟和60°C进行30分钟(对于RT步骤)。设计两组引物和探针(对于试验Medi-N和NL-N)来检测hMPV的所有四种亚型。将引物和探针靶向于hMPV核壳基因内的最保守的序列，并且设计与hMPV的所有四种亚型杂交。测试两个试验的敏感性，以检测四种原型hMPV病毒的靶序列。使用得自该原型病毒林的失控转录物来确定两个试验的敏感性。比较两个试验(Medi-N和NL-N)，结果表明两个试验都能够检测hMPV的所有四种亚型的耙序列。对失控转录物和病毒分离林进行系列稀释，结果表明试验NL-N在检测Al和A2原型病毒林的靶序列方面具有更高的敏感性。因此，选择试验NL-N来进一步发展和测试。为了测试为试验NL-N设计的引物和探针对于hMPV是否有特异性，使用得自15个其它常见呼吸病毒的模板RNA进行实时RT-PCR分析。这些模板是从病毒原种分离出来的，病毒原种包括麻渗病毒，流行性腮腺炎病毒，SV5，NDV，RSVA和B，APV-A、B和C，HPIV-l、2、3和4，以及流感病毒A和B的RNA。正阳性对照样本是hMPVAlRNA模板。从非hMPV病毒原种分离出来的RNA模板都不能给出正信号，这证实了所设计的引物和探针对于hMPV有特异性。测试不同量的正向和反向引物和探针以获得最佳扩增信号。初步试验表明，与反向引物(RF931)相比，具有两倍量的正向引物(RF930)的不对称混合物给出最敏感的反应混合物。为了确定我们试验的敏感性，测试系列稀释的得自hMPV的所有四种原型病毒的病毒RNA。对hMPVAl和Bl原型林的系列稀释在最高达104的稀释给出阳性结果，而从得自hMPVA2和B2原型株的较高滴度病毒原种获得的RNA可以进行多大105倍稀释(图59A)。该测定表现出对于所有四种原型病毒具有相同敏感性，对于hMPVA2原型病毒的检测限为至少0.006TCID50，对于其它原型病毒，检测限为0.01TCID50。产生得自hMPVAlN序列的RNA失控转录物作为标准物。对这些RNA转录物进行定量测定，并进行系列稀释，在我们的TaqmanRT-PCR试验中，低至5个RNA拷贝产生阳性信号(图59B)。用于我们新的RT-PCR试验的引物和探针是基于所有四种hMPV亚型的N基因序列。上述试验靶向hMPV的N序列(MacKay等人，J.Clin.Microbiol.41:100-105)或L序列(VanDenHoogen，2003印刷)，然而仅使用基于hMPVAl病毒原型的序列的引物。在图59C中，显示了对于所测试的不同引物/探针组，四种原型hMPV林的寡核苷酸退火位点的熵图。进行这些试验以确定它们是否能够检测hMPV的所有四种亚型。对原型病毒的系列RNA稀释物进行的这些试验的结果表明，它们确实能检测到hMPVA病毒，虽然敏感性低于试验NL-N，但是不能检测到B变种病毒(图59D)。7.13实施例21:RAP-PCRMPV或其它病毒的遗传材料可用引物来检测，该引物与基因组中区域杂交并以特定方向延伸从而扩增遗传材料。这种技术在特定序列信息缺乏或者在样品中遗传材料的初始扩增的时候很有用。一个这样的技术被称为RAP-PCR。RAP-PCR主要如所述进行(Welsh等人，1992，NAR20:4965-4970)。对RT反应来说，在包含10ng/pl寡核苷酸，10mM二硫苏糖醇，500um每种dNTP，25mMpH8.3的Tris-HCl，75mMKC1以及3mMMgCl2的lOjil反应系统中使用。反应混合物在70°C温浴5分钟并在37°C温浴5分钟，其后加入200单位SuperscriptRT酶(LifeTechnologies)。在37。C持续温浴55分钟，反应用72C温浴5分钟来终止。RT混合物稀释后加进包含8ng/jU寡核苷酸，300fil每种dNTP，15mMpH8.3的Tris-HCl,65mMKCl，3.0mMMgCL2和5单位TaqDNA聚合酶(FEBiosystems)的50jdPCR反应系统中。循环条件是94。C5分钟，40。C5分钟，以及72。C1分钟，进行一次后，94°C1分钟，56。C2分钟以及72°C1分钟重复40次，而后72°C5分钟一次。用于RAP-PCR的引物是引物ZF1为与SEQIDNO:46相同的核苷酸序列，引物ZF4为与SEQIDNO:47相同的核苷酸序列，引物ZF7为与SEQIDNO:48相同的核苷酸序列，引物ZF10为与SEQIDNO:49相同的核苷酸序列，引物ZF13为与SEQIDNO:50相同的核苷酸序列，引物ZF16为与SEQIDNO:51相同的核苷酸序列，引物CS1为与SEQIDNO:52相同的核苷酸序列，CS4为与SEQIDNO:53相同的核苷酸序列，引物CS7为与SEQIDNO:54相同的核苷酸序列，引物CS10为与SEQIDNO:55相同的核苷酸序列，引物CS13为与SEQIDNO:56相同的核苷酸序列，以及引物CS16为与SEQIDNO:57相同的核苷酸序列。产物在3%NuSieve琼脂糖凝胶(FMCBioProducts，Heerhugowaard，荷兰)上并排处理。根据厂商的说明，差异显示的特异于MPV的片段用QiaquickGelExtraction试剂盒(Qiagen，Leusden，荷兰)凝胶纯化并克隆进pCR2.1载体(Invitrogen，Groningen，荷兰)。成功纯化并测序了二十个片段。在十个片段中发现了同APV的序列同源性，即用ZF7引物分离出的片段l产生了与N基因同源的335bp的片段，用ZF10引物分离出的片段2产生了与N基因同源的235bp的片段，用ZF10引物分离出的片段3产生了与M基因同源的800bp的片段，用CS1引物分离出的片段4产生了与F基因同源的1250bp的片段，用CS10引物分离出的片段5产生了与F基因同源的400bp的片段，用CS13引物分离出的片段6产生了与F基因同源的1450bp的片段，用CS13引物分离出的片段7产生了与F基因同源的750bp的片段，用ZF4引物分离出的片段8产生了与L基因(蛋白质水平)同源的780bp的片段，用ZF10引物分离出的片段9产生了与L基因(蛋白质水平)同源的330bp的片段，以及用ZF10引物分离出的片段10产生了与L基因(蛋白质水平)同源的250bp的片段。TaqMan测试用于测量基因的表达水平。TaqMan测试适合检测L基因和N基因的表达。可是，在这些测试中使用的引物不需要特异于hMPV组中的任何一个，以下给出实例。在50ul总反应体积中用500nM浓度的正向引物，250nM浓度的寡核苷酸探针，25ul通用PCR主要混合物(可得自ABI)，以及5ulcDNA进行反应。循环条件是第一步95°C10分钟，其后第二步在ABI7000序列检测系统上进行45个循环，包括95。C30秒和60。C60秒。用于TaqMan测试的hMPVN基因引物的其它例子如下对于亚组A1所有的分离林NL/1/00，BI/1/01,FI/4/01,NL/8/01,和FI/2/01，使用SEQIDNO:39的核苷酸序列的引物。对于亚组Al的分离林NL/30/01,使用SEQIDNO:40核苷酸序列的引物。对于亚组A2的分离林NL/22/01和NL/23/01，使用SEQIDNO:41的核苦酸序列的引物。对于亚组A2的分离株NL/17/01，使用SEQIDNO:42c核苷酸序列的引物。对于亚组A2的分离林NL/17/00，使用SEQIDNO:43的核苷酸序列的引物。对于亚组Bl的分离林NL/1/99,NL/5/01,NL/21/01,和NL/9/01，使用SEQIDNO:44的核苦酸序列的引物。对于亚组Bl的分离林FI/1/01和FI/10/01,使用SEQIDNO:45的核苷酸序列的引物。用于亚组Al的潜在引物与SEQIDNO:390相同，用于亚组Bl的引物与SEQIDNO:391相同，用于亚组B2的引物与SEQIDNO:392相同。7.14实施例22:RAP-PCR产物的序列分析用RAP-PCR扩增出片段后，用扩增出的片段来获得序列信息。为此，测序前把产生的片段克隆入载体更方便。克隆入栽体pCR2.1(Invitrogen)的RAP-PCR产物用M13特异寡核苷酸测序。RT-PCR获得的DNA片段用QiaquickGelExtraction试剂盒(Qiagen，Leusden，荷兰)从琼脂糖凝胶中纯^f匕出来，并直接用用于PCR的相同寡核苷酸来测序。用DyenamicET终止测序试剂盒(AmershamPharmaciaBiotech,Roosendaal，荷兰)和ABI373自动DNA测序仪(PEBiosystem)进行序列分析。根据厂商的说明施行所有4支术流程。7.15实施例23:用RT-PCR产生基因组片段RAP-PCR方法会在序列中留下不能扩增或复制的缺口。为了获得完整的序列，用RT-PCR可以获得缺口的序列信息。为产生RAP-PCR片段之间的PCR片段产生的缺口A、B和C(图3)，使用前述用于从病毒分离林00-l分离RNA样品的RT-PCR试验。以下引物被用与产生片段A:前导部分中设计的TR1与SEQIDNO:22的核苷酸序列相同，以及N中获得的RAP-PCR片段3'端所设计的Nl与SEQIDNO:23的序列相同。以下引物被用与产生片段B:N中获得的RAP-PCR片段5'端所设计的N2与SEQIDNO:24的核苷酸序列相同，以及M中获得的RAP-PCR片段3'端所设计的Ml与SEQIDNO:25的核苷酸序列序列相同。以下引物被用与产生片段C:M中获得的RAP-PCR片段5'端所设计的M2与SEQIDNO:26的核苦酸序列序列相同，以及F中获得的RAP-PCR片段3'端所设计的Fl与SEQIDNO:27的核苷酸序列序列相同。如前所述，电泳后纯化片段并克隆和测序。7.16实施例24:用重组核蛋白进行捕获抗MPVIgMEIA为了检测hMPV病毒，进行检测各种宿主中抗体存在的免疫试验。在一个例子中，使用N蛋白的抗体，因为它是产生的最丰富的蛋白质。该性质是由于发生在病毒基因组中的转录梯度造成的。用重组核蛋白或其它重组蛋白作为抗原进行的捕获抗MPVIgMEIA通过前述Erdman等，1990，J.Clin.Microb.29:1466-1471的^修正试验来进4亍。亲和性的纯化的抗人IgM捕获抗体(或抗其它物种)，如从Dako获得的，同0.1MpH9.6的碳酸盐緩沖液以250ng每孔的浓度被加入微滴定皿的孔中。室温温浴过夜之后，用PBS/0.05。/o吐温洗皿两次。用ELISA緩冲液稀释到1:200至1:1000的100|ul测试血清被加入三个孔中并于37°C温浴1小时。然后用PBS/0.0S。/o吐温洗皿两次。冻溶的(用重组病毒感染的)Sf21细胞裂解液用ELISA緩冲液稀释到1:100至1:500，其加入到孔中并于37°C温浴2小时。未感染的细胞裂解液用作阴性对照并在相同的孔中处理。然后用PBS/0.05Y。吐温洗皿三次并用以ELISA緩冲液稀释的最佳稀释度同100抗MPV的多克隆抗体一起于37。C温浴1小时。PBS/0.05。/o吐温洗涤2次后，平皿同辣根过氧化物标记的第二抗体(如兔抗白鼬的)—起温浴，平亚在37。C温浴20分钟。然后用PBS/0.05%吐温洗皿五次，同如从，，Sigma"得到的酶底物TMB，3，3,5，5-四甲基对二氨基联苯一起室温温浴15分钟，而且反应用lOOul2M磷酸终止。用自动微滴定皿读数仪在450nm处测量比色读数。用来自临床MPV病毒感染病人的急性和恢复期阶段的血清对来比较用重组核蛋白(或其它重组蛋白)与用整个MPV病毒的捕获抗MPVIgMEIA的灵敏度。用来自健康和感染其它副粘病毒的人的测试血清标本来确定重组核蛋白的捕获EIA的特异性。使用杆状病毒表达制备的重组MPV融合和糖蛋白的EIA的潜力。糖蛋白G和F是MPV病毒粒子的两个穿膜的包膜糖蛋白并且作为主要中和和保护抗原。这些糖蛋白在诸如杆状病毒系统的载体病毒系统中的表达提供了用于检测MPV特异抗原试验中的重组抗原的来源。另外例如，它们同核蛋白联合使用进一步提高了检测抗MPV抗体的酶免疫试验的灵敏度。i午多其它免疫试验(CurrentProtocolsinImmunology,巻1-3.Coligan，J.E.，Kruisbeek，A.M.,Margulies，D.H.，Shevach，E.M.andStrobe,W.编辑，JohnWileyandsons,Inc.出版，美国)可被用作为这里描述的那些方法的替换方法。为了发现病毒分离林，可以检测鼻咽吸出物，喉鼻擦拭物，支气管气泡洗出物以及喉擦拭物，最好但不限于来自人，肉食动物(狗，猫，海豹等)，马，反刍动物(牛，绵羊，山羊等)，猪，兔，鸟(家禽，ostridges等)。对于鸟类，也可以检测泄殖腔和肠擦拭物和排出物。对于所有样品，进行血清学(抗体和抗原检测等)，病毒分离和核酸检测技术用以检测病毒。用纯化的MPV或其部分(蛋白质，肽)免疫小鼠(或其它动物)并接着用已知的杂交瘤技术(CurrentProtocolsinImmunology,JohnWileyandsons,Inc,出版，美国)来制备单抗。可选地，喧菌体展示^支术可用于该目的(CurrentProtocolsinImmunology,JohnWileyandsons,Inc.出版，美国)。相4以地，可从感染的人或动物，或从免疫的人或动物中获得多抗(CurrentProtocolsinImmunology,JohnWileyandsons,Inc.出版，美国)。用各种抗体的western杂交，IFA，免疫沉淀:技术来检测NS1和NS2蛋白存在或不存在。用基于已知的NS1和/或NS2基因设计的引物集的PCR和各种核酸杂交技术来检测病毒分离林中的NS1和NS2基因或其同源体存在或不存在。为确定NS1和NS2基因是否存在于病毒基因组的3'端，用特异于基因组3'端的引物进行PCR。在我们的例子中，我们使用特异于病毒基因组的3，非翻译区地引物和NORF中的引物。I为相同的目的可设计其它引物。通过PCR产物的长度和/或核苷酸序列揭示了NS1/NS2基因的缺失。特异于NS1和/或NS2基因的引物和特异于病毒基因组3，端部分(比如非翻译区或N，M或FORF)的引物一起使用从而阳性鉴定NS1或NS2基因的存在。除了PCR，为相同目的可以用许多技术，比如分子克隆，核酸杂交。8.MPV的细胞培养系统和动物模型和MPV的重组工程8.1实施例25:不同细胞系中的HMPV生长在不同细胞系中培养病毒分离林从而检测每种病毒的特征。例如，基于培养中测得的滴度水平可以表征并区分不同病毒分离林的感染性。可选地，为了进一步分析可以使用细胞繁殖或扩增培养的病毒林。在一个例子中，第三猴肾细胞用于扩增hMPV。可是，第三猴肾细胞源于仅传代有限次数并在体内传代三次的基本细胞。还不知道哪种免疫的细胞系会支持hMPV病毒生长到高滴度。许多猴细胞系，比如Vero，LLC-MK2，HEp-2，和肺成纤维(LF1043)细胞，被测试以观察它们是否支持hMPV病毒复制(表12)。使用的胰蛋白酶是0.001mg/ml浓度的TPCK-胰蛋白酶(Worthington)。也测试病毒在受精10天的鸡蛋中的生长情况。AF收获前，37。C温浴感染的鸡蛋2和3天。Vero细胞不加胰蛋白酶的感染细胞裂解液的噬菌体试验用于确定病毒滴度，35C温浴10天，并用豚鼠抗血清进行免疫染色。结果显示Vero细胞和LLC-MK2细胞是最适合hMPV病毒复制的细胞培养基，使病毒储存滴度为106~107pfu/ml。这些滴度与那些从tMK细胞获得的相似。以0.01mg/ml浓度添加胰蛋白酶没有增加一点病毒滴度(表12)。表12:不同细胞系中的HMPV生长细胞培养基VeroLIX-MK2Hep-2LF1043(HEL)tMK鸡蛋(10天)用于生长病毒的胰蛋白酶是否是是是否是否Vero细胞中的病毒滴度(pfu/ml)2.1x1071.1x1072.3x10s细胞死亡无回收的病毒无回收的病毒1.0x107无回收的病毒为了研究Vero细胞中hMPV病毒生长的病毒动力学，用0.1的MOI绘制生长曲线(图23)。每隔24小时收集细胞和细胞上清液，并用病毒滴度定量噬菌体试验来分析。结果显示，在第5天观察到几乎最高的hMPV滴度。在第8天获得绝对最高的5.4个loginpfu/ml的滴度。到第10天病毒滴度非常稳定了。同时只用细胞上请液绘制的生长曲线，仅仅显示非常低的病度滴度。该数据证明了在使用(0.1的MOI)的条件下，hMPV复制在感染后第8天到达最高并且hMPV很大程度上是细胞关联的RNA病毒。293细胞的转染293细胞(人肾上皮细胞)传代于DMEM中，其补充了FCS(10%)，L-谷氨酰胺(l:100)和Pen/Strep(1:100)，并且每隔3-4天分离1:10。为了增加转染能力，注意不要让细胞长满。细胞不是非常贴壁的；在胰蛋白酶-EDTA中非常短的(2分钟或更少)温浴通常足以从塑料表面分开它们。胰蛋白酶处理后立即用培养基稀释细胞。转染前分开细胞。转染时细胞饱和度约为50-75%。使用胶状塑料器皿以防止转染过程中的细胞分离。平皿或烧瓶用0.1%硅胶(l:20稀释度的2°/原料)覆盖IO分钟并用PBS洗涤一次。为获得正确的细胞密度；以每T75瓶或100mm平皿(10ml)1个细胞或者6孔板(2ml)上每孔lxlO"个细胞的浓度使用细胞。感染最少持续7小时，可是，优选转染过夜。无菌管中混合入下物质30mgDNA和62ml2M的CaCl2并加水至500ml(T75)或者3mgDNA和6.2ml2M的CaCl2并加水至50ml(6孔板)；稍加混合。逐滴加入500或50ml2xHBS并且溶液混合5分钟直至沉淀形成。小心操作，也就是不用涡旋震荡。用新预热的培养基替换旧培养基(每个T75瓶10ml或者6孔板每个孔1ml。用Gilson吸量管向试管吹气泡小心混合DNA并逐滴加沉淀到覆盖细胞的培养基。细胞于37。C在C02气中温浴。细胞看上去象覆盖了小斑点(沉淀)。从细胞中去除转染培养基，小心用PBS洗涤细胞，然后代之以新鲜培养基。细胞在需要时于37。C在C02气中温浴，通常在8-24小时。用8.18%NaCl，5.94%Hepes和0.2%Na2HP04(均为w/v)制备10xHBS储存液。溶液过滤灭菌并储存于4C。用水稀释10x储存液并用1MNaOH调节pH到7.12，从而制备2x溶液。溶液分装储存于-20。C。小心正确地滴定溶液的pH值。溶液用于转染过程前立即调节pH值。8.2实施例26:MPV的微复制子构建产生的微复制子构建体包括反义报道基因。一个微复制子的实例，CAT-hMPV，如图24所示。用于产生微复制子构建体的前导和尾随序列如图26所示。为了比较，APV，RSV和PIV3前导和尾随序列的比对如图26所示。测试两种微复制子构建体一个有前导端的末端AC残基(Le+AC)，以及一个没有前导端的末端AC残基(Le-AC)。两种构建体在测试中都有功能(图25)。图25中可以见到比24小时后更高的CAT表达产生在48小时后。48小时后，观察到每500,000细胞约转染有14ngCAT。该试验完全是质粒驱动的微复制子同T7聚合酶质粒一起共转染，而且从pCITE-2a/3a(pCite质粒有一个T7启动于，接着是源于脑心肌炎病毒(EMCV)的IRES元件)中表达N、P、L、M2.1基因。当排除L，P和N时，可完全消除CAT表达。当从载体中排除M2.1的表达时，可注意到CAT表达显著减少。微复制子系统的特异性(异质病毒的属性)和前导部分的末端残基效应(同质病毒的属性)也可通过用hMPV聚合酶成分(NL/1/00和NL/1/99)或来自APV-A，APV-C，RSV或PIV的聚合酶成分重复感染微复制子转染的细胞来进行测试。为了确定最优条件也可以测试六种质粒种的每一个的不同用量。其它报道基因可用于替换CAT.在其它实例中，GFP可插入微复制子构建体代替CAT。8.3实施例27:使用RSV、APV、MPV或PIV聚合酶从微复制子拯救固PV为了拯救hMPV，可以产生微复制子来获得报道基因。微复制子的一个实例CAT-hMPV显示于图24中。可将编码报道基因蛋白氯霉素乙酰转移酶(CAT)的cDNA在负义方向上克隆在5，和3，非编码病毒序列之间。可将T7RNA聚合酶引物序列和限制酶的识别序列侧接在该构建物上。体外转录将产生病毒样RNA,当与纯化的聚合酶蛋白混合时，该病毒样RNA将形成RNA复合物。可使用例如辅助病毒将RNP转染到真核细胞内。或者，拯救可以是完全质粒驱动的，即微复制子可以用T7聚合酶质粒和从pCITE-2a/3a表达的N、P、L和M2-1基因将微复制子共转染。用于拯救hMPV的聚合酶组分可以是RSV、APV、PIV、MPV的组分或其任何组合(参见5.8.1节)。可以使用能够检测CAT活性的多个试验来检测病毒(参见实施例24)。在另一个实施方案中，使用微复制子拯救hMPV可以这样进行将微复制子转染的细胞用源自MPV、APV、RSV、PIV的hMPV聚合酶组分(NL/1/00和NL/l/99)或其任何组合超感染。更详细地说，可使用合成寡核苷酸通过诱变来修饰前导区和相邻基因的cDNA。类似地，可以修饰另一hMPV基因的下游末端例如L基因和相邻的尾随区的cDNA以使其含有相邻的T7RNA聚合酶启动子。可在CAT基因插入物的任一侧，将前导和尾随片段克隆到表达载体例如pUC19内。可以同样方法构建编码另外的hMPV病毒类似物的cDNA。可使用测序法来证实构建物结构。可用于产生微复制子构建物的前导序列和尾随序列的实例如图26所示。作为比较，图26中还显示了APV、RSV和PIV3前导和尾随序列的比对。8.4实施例28:全长感染cDNA的产生构建表达hMPV病毒基因的全长cDNA从而制备感染病毒。例如，可构建编码所有基因或所有hMPV关键基因的cDNA;然后表达基因组以产生感染病毒。为了基因操作hMPV，克隆该RNA病毒的基因组。对于hMPV的00-1分离林，产生长度变化为1-3kb的八个PCR片段(图27)PCR片段被测序并用与Genbank中储存的hMPV序列的比较来分析测序错误。两个沉默突变(SH基因的核苷酸5780位ile:ile，L基因的核苷酸12219位cys:cys)没有被纠正。其它L基因的核苷酸8352位(trp:leu)的改变没有被改过，因为该突变在两个独立产生的PCR片段(C和H)和hMPV99-l的序列中被观察到。相似的，F-M2基因间区域的核苷酸4715位上的5个核苦酸的插入没有被纠正。这些改变都可反映在hMPV野生型序列中。相反，核苷酸1242位上，N-P基因间区域中的单个A残基被消除；核苷酸3367位上，F基因中的ser:pro被纠正；核苷酸6296位上，G基因中的asp:val被改变；而且在核苷酸7332位上，L基因中的终止密码子被改成glu。hMPV不同分离林的限制性酶谱如图28所示。限制性位点可用于组装全长构建体。然后利用唯一的限制性酶切位点装配序列中八个纠正的PCR片段，(图29)。在核苷酸75位导入遗传标记产生AflII限制性酶切位点而不改变氨基酸序列。唯一的限制性酶切位点，Xhol，加入hMPV序列的3'端。接着两个G残基的T7噬菌体聚合酶启动子加入hMPV序列的3'端。在hMPV基因组的5'端，加入肝炎6核酶序列和BssHI1限制性酶切位点。pCITE质粒也可产生编码hMPVL，N，P和M2-l基因的辅助质粒。一旦产生全长hMPVcDNA，使用禽痘T7或MVA-T7作为T7RNA聚合酶来源或表达T7RNA聚合酶的细胞系或质粒在Vero细胞中进行通过反基因学来回收病毒。8.5实施例29:采用POLI-POLII启动子系统来回收HMPV与用于片段化的RNA病毒的基于具有用来表达基因组RNA的T7-启动子的质粒的反基因学系统不同，采用细胞转录机制的系统可能更有效率，并且不需要共表达源自噬菌体T7的RNA聚合酶。未定向的或双方向的polI-polII转录系统可用于在细胞内表达病毒RNA分子。经证实，该系统对于由克隆的cDNA产生流感病毒非常有效(Hoffmann等人，PNAS，976108-6113(2000)。与RNA聚合酶II转录物不同，RNA聚合酶I转录物在其5，-末端不含帽结构，并且在3，-末端不具有聚腺苷酸尾部。因此，设计采用细胞转录机制的系统来由polII启动子表达蛋白以及由polI表达不具有帽结构或聚腺苷酸尾的病毒(-)vRNA或(+)cRNA。提供不含另外的非病毒序列的病毒样初级转录物很关键，因为末端序列对于病毒复制和转录来说是至关重要的。为了评估通过RNA聚合酶I进行hMPVcDNA的(-)vRNA或(+)cRNA转录是否更有效，可设计小基因组系统来比较各自的复制效率。复制效率可通过由小基因组例如CAT基因表达的报道分子的转录来测定。在该方法中，将在polII启动子控制下表达hMPV的L、N、P和M2-l基因的质粒与CAT-小基因组-质粒一起共转染到宿主细胞内。通过测定CAT报道分子的相对表达水平来测定相对复制效率。例如，RNApolI可用于合成hMPV病毒基因组(cRNA)的正链拷贝。简言之，将病毒cDNA插在RNApolI启动子与终止子序列之间。将整个polI转录单元在正方向上插在RNApolII启动子与聚腺苷酸化位点之间。合成两类正义RNA。从polII启动子转录具有5，-帽的mRNA。从polI启动子，通过细胞RNA聚合酶I转录在5，-末端具有三磚酸基团的全长正义hMPVcRNA。可使用克隆栽体来插入人工cDNA片段，例如pHWll(Hoffmann&Webster,J.GenVirol.2000Dec81(Pt12):2843-7)。该质粒含有在polI终止子序列与聚核苷酸位点的上游的polII启动子(人巨细胞病毒的立即早期启动子)和人polI启动子。为了复制表现病毒cRNA的初级转录物，通过具有polII启动子例如人巨细胞病毒的立即早期启动子的质粒栽体提供病毒聚合酶蛋白。这些质粒含有表现hMPV的4个基因片段，即L-基因、N-基因、P-基因和M2-l基因的cDNA。将这四种质粒(l-5jig)与表现hMPV的全长基因组的polI/polII质粒(l-5ng)—起共转染到106-107个293T细胞、COS-7或Vero细胞内。为了改善该系统的效率和可靠性，可将293T细胞与容许MPV的细胞例如Vero或tMK细胞一起培养。将胰蛋白酶加到细胞培养基中，导致生成感染性病毒颗粒。采用灵长类动物细胞与MDCK细胞的共培养物来有效地拯救甲型流感病毒(Hoffmann等人，PNAS，976108-6113(2000)。将转染后不同时间(即3天-10天)的上清液滴定，并转染到新鲜的Vero细胞中以确定病毒滴度。所有病毒结构蛋白(即M、M2-2、SH、F和G)从polII启动子的共表达可改善病毒回收的效率。因为从具有全长cDNA的polI/polII质粒产生加帽和未加帽的RNA，所以预计表现N-基因的第一个开放读框被翻译成N-蛋白。因此，通过采用poll/polII方法，对于病毒拯救仅需要四种质粒表达L、P和M2-l蛋白的三种polII-质粒和表达N-蛋白以及MPV的全长RNA的一种polI/polII质粒。8.6实施例30:表达用于回收负链病毒的T7RNA聚合酶的细胞系表达T7RNA聚合酶的细胞系可用于重组MPV基因组的复制和包装。例如，可将Vero细胞加工以在CMV启动子控制下表达T7RNA聚合酶。该方法是有用的，因为其不用需要用辅助病毒例如表达T7RNA聚合酶的痘病毒共感染。该方法的另一优点是不用需要除去辅助病毒所需的选择系统。简言之，将表达hMPV的L、N、P和M2-l基因的cDNA克隆，并且在T7启动子序列的控制下重组加工到表达栽体内。将在正或负方向上编码MPV基因组的cDNA颗粒，并且在T7启动子序列的控制下重组加工到表达栽体内。这些表达系统可同时转染到T7表达细胞系，例如表达T7聚合酶的BHK细胞系内。这些cDNA构建体的体内转录是由T7RNA聚合酶介导的。可通过感染细胞的裂解物的噬斑分析来测定病毒滴度。8.7实施例31:使用质粒来由CMV或SV40启动子暂时表达T7RNA聚合酶以拯救HMPV可以将在CMV或SV40启动子控制下表达T7RNA聚合酶的质粒加工并暂时转染到细胞内，其用于重组MPV基因组的复制和包装。例如，可将Vero和293T细胞加工以在CMV启动子控制下表达T7RNA聚合酶。在一个具体实施方案中，携带在CMVMIE启动子控制下的编码T7RNA聚合酶的基因的质粒可以与由T7启动子驱动的可选择的标记物(例如新霉素)联合使用。这使得能够有效地选择表达T7RNA聚合酶的细胞系。使用表达T7RNA聚合酶的方法是有用的，因为其不用需要用辅助病毒例如表达T7RNA聚合酶的痘病毒共感染。该方法的另一优点是不用需要选择系统来消除辅助病毒的污染。而且，该方法使得能够使用具有高转染效率的细胞系例如293T和COS-7细胞。因此，被转染的细胞具有T7-聚合酶表达质粒的多个拷贝，使得每个细胞中T7-聚合酶蛋白的量高于暂时转染的细胞，与仅包含一个拷贝的稳定细胞系相比。简言之，将编码hMPV的L、N、P和M2-l基因的cDNA颗粒克隆，并且在T7启动子序列的控制下重组加工到表达载体内。或者，在RNA聚合酶II启动子例如人巨细胞病毒的立即早期启动子控制下表达这四种基因。将在正或负方向上编码MPV的基因组的cDNA克隆并且加工到在T7启动子序列控制下的表达栽体内。将这些表达栽体与表达T7聚合酶的质粒一起转染到支持hMPV复制的细胞例如Vero细胞系、tMK细胞系、293T细胞系或多个细胞系的共培养物内。这些cDNA构建物的体内转录是通过T7RNA聚合酶介导的。可通过感染细胞的裂解物的噬斑分析来测定病毒滴度。供给T7、T3或SP6RNA聚合酶的另一种方法包括将T7聚合酶蛋白转染到细胞内，这在使用液体转染试剂于T7、T3或SP6启动子控制下用N、P、L、M2-l和全长基因组或反基因cDNA质粒转染之前、同时或之后进行。8.8实施例32:HMPV的拯救开发成功的系统来拯救重组hMPV。简言之，将编码不同聚合酶蛋白的表达质粒和克隆的欲拯救的hMPV共转染到合适的宿主细胞内。收集和处理之后，使用细胞和上清液。使用免疫染色方法来检测感染性拯救病毒。为了拯救hMPV，将29JT细胞在TC6-孔板中的铺满的单层用禽痘病毒以MOI(感染复数)=0.5接种。然后将细胞在35。C培养l小时。将表达质粒和克隆的欲拯救的hMPV在100filoptiMEM(每个孔)以下列量混合0.4pg编码hMPVP基因的质粒(在pCITE2a/3a中，称为克隆#41-6)、0.4照编码hMPVN基因的质粒(在pCITE2a/3a中，称为克隆#35-11)、0.3fig编码hMPVPM2的质粒(在pCITE2a/a中，称为克隆#25-6)、0.2jig编码hMPVL基因的质粒(在pCITE2a/3a中，称为克隆#2)和4ng具有前导序列和尾随序列样APV的hMPV克隆#2或具有hMPV前导序列和尾随序列的克隆#10。值得注意的是，所使用的表达质粒具有在第二个氨基酸位置恢复的野生型序列。在下一个步骤中，将转染试剂Lipofectamine2000(8jil)混合到100HloptiMEM内，然后加到质粒混合物中。将该合并的混合物施加到293T细胞中。转染6天后，收集细胞和上清液，冷冻，融化，和用于接种Vero细胞。介质9天后，将感染的细胞在甲醇中固定，用豚鼠多克隆抗体进行免疫染色，然后用抗豚鼠HRP和DAKOAEC底物进行免疫染色。噬斑形成表明拯救的病毒是感染性的(图56)。具有克隆#2和#10的孔中有明显的阳性红色免疫染色，与具有hMPV前导序列和引物序列的克隆#10相比，具有包含APV前导序列和引物序列的hMPV克隆#2的孔中有更多的免疫染色的细胞。阳性免疫染色如附图57所示。用将在感染后10天收集的病毒进行RT-PCR，以证实拯救的序列。这些结果表明重组hMPV被成功地拯救，以及产生了感染性病毒。8.9实施例33:用hMPV的亚型感染动物宿主为了表征MPV林的毒性，可以感染动物宿主。例如，为确定每林如何感染机体的，可使用不同宿主。HMPV的小动物模型还没有被确认。用1.3x106pfu/动物的剂量的hMPV感染Balb/c小鼠，棉鼠和叙利亚金鼠和仓鼠。用0.1ml体积的1.3x106pfu的hMPV鼻内接种动物。在第九天用hMPV豚鼠抗血清通过噬菌体免疫染色试验定量组织样品。感染后四天杀死动物，分离鼻甲和肺并通过噬菌体免疫染色试验定量hMPV滴度(表13)。表13:感染动物中的HMPV滴度动物动物数量感染后4天的平均病毒滴度(log1(1PFU/g组织+/-标准差)鼻曱肺2.7+/-0.42.2+/-0.6<1.7+/-0.0<1.8+/-0.0小鼠(Balbc)6棉鼠5叙利亚金鼠6仓鼠5.3+/-0.2!.3+/-0.6结果显示叙利亚金仓鼠中的hMPV复制到高滴度。在离鼻曱和肺中各自获得5.3和2.3log1()pfu/g组织的滴度。hMPV在棉鼠的呼吸道中并不复制到可察觉的滴度水平。小鼠上和下呼吸道各自显示出2.7和2.2log1Qpfu/g组织的滴度。这些结果暗示叙利亚金仓鼠是研究hMPV复制和免疫原性以及评估hMPV候选疫苗的最合适的动物模型。豚鼠的感染。两种病毒分离林，00-1(A亚型)和99-1(B亚型)，每个亚型用于接种六个豚鼠(气管内，鼻和眼)。六个豚鼠用hMPV00-1(10e6，5TCID50)感染。六个豚鼠用hMPV99陽l(10e4，1TCID50)感染。用同源或异源亚型(10e4TCID50/ml)接种豚鼠时，使初次感染进行五十四天，即两个豚鼠用00-1进行初次感染并用99-1进行再次感染从而获得异源感染，三个豚鼠用00-1进行初次感染并用00-1进行再次感染从而获得同源感染，两个豚鼠用99-1进行初次感染并用00-1进行再次感染从而获得异源感染而且三个豚鼠用99-1进行初次感染并用99-1进行再次感染从而获得同源感染。感染后12天(初次感染)或8天(再次感染)收集喉鼻擦拭物，并用RT-PCR试验测试病毒的存在。RT-PCR试验的结果(图32)显示接种了分离林OO-l的豚鼠在感染后1至10天显出上呼吸道感染。接种了分离林99-l的豚鼠在感染后1至5天显出上呼吸道感染。用99-1感染豚鼠显得比用00-1感染的更不严重。用异源病毒再次接种的豚鼠，如上所述，在4只豚鼠中的3只中造成了重复感染。同样，同源病毒的例子中的重复感染发生在6只豚鼠中的2只上。较少或没有临床症状在那些变得重复感染的动物中被注意到，而且没有临床症状在那些受到抗重复感染保护的动物中被看到，证明了即使用野生型病毒，可以产生由初次感染获得的保护性效果。这也显示异源和同源分离林可用作疫苗。hMPV的亚型都能感染豚鼠，尽管用亚型B(99-1)的感染看上去较不严重，即，比用亚型A(00-1)的感染，鼻喉中病毒存在较短时间。这可能是因为更高剂量地施用亚型A，或者亚型B较低的毒性。尽管先存免疫的存在并不完全对同源和异源病毒的重复感染起保护作用，但感染显得较不显著，因为只看到较短病毒存在期以及并非全部动物都成病毒阳性。血清学测试感染hMPV两个亚型的豚鼠。在第0、52、70、80、90、110、126和160天，收集豚鼠血清并以1:IOO的稀释度用抗OO-1和99-1抗原的完整病毒ELISA进^f亍测试。(参见图33A和B显示的每个豚鼠个体的抗00-1和99-1的IgG应答。也可参见图34显示的00-1和99-1ELISA的特异性但注意到仅使用了来自同源重复感染豚鼠的数据。也可参见图35显示的抗00-1和99-1ELISA的平均IgG应答，其针对三个同源的，即00-1和00-1，两个同源的，即99-1和99-1，两个异源的，即99-1和00-1，以及2个异源的，即00-1和99-l感染的豚鼠)。针对两个不同的ELISA仅观察到小差异。抗00-1或99-1的完整病毒ELISA不能用于区分两种亚型。检测豚鼠中抗hMPV的血清同APV抗原的反应性。从感染的豚鼠中收集血清并用APV抑制ELISA来检测。(参见图36显示的hMPV感染的豚鼠的平均APV抑制百分比)。豚鼠中抗hMPV的血清在APV抑制测试中用与它们在hMPVIgGELISA中的反应相似的方式进行反应。抗99-1的血清在APV抑制ELISA中揭示了比抗00-1的血清更低的抑制百分比。感染99-1的豚鼠有比在hMVPELISA中所见的更低的滴度。可选的，99-1同APV的交叉反应小于00-1的。然而，APV抗体抑制ELISA可用于检测豚鼠中的hMPV抗体。用豚鼠中抗hMPV的血清进行病毒中和试验。在感染后第O天，第52天，第70天和第80天收集血清并和00-1，99-1与APV-C—起用于病毒交叉中和试验。使用的开始稀释度为1至10和每孔100TCID50病毒。中和后，病毒暴露于tMK细胞(15mm.)并以3500RPM离心，其后更新培养基。APV培养物培养4天并且hMPV培养物培养7天。细胞用80%丙酮固定，而且用标记的猴抗hMPV进行IFA。染色阴性的孔被定义为中和滴度。对于每种病毒，包括病毒储存液的10-log滴定和工作溶液的2倍滴定。(参见图37显示的00-01和99-1感染的豚鼠抗00-l，99-1和APV-C的病毒中和滴度)。感染恒河猴。病毒分离林00-1(A亚型)和"-l(B亚型)(le5TCID50)每种亚型都被用于接种两个恒河猴(气管内，鼻和眼)。初次感染后六个月，用00-1第二次接种恒河猴。感染后14天(初次感染)或8天(再次感染)收集喉擦拭物，并用RT-PCR试验检测病毒的存在(图38)。接种了病毒分离林00-1的恒河猴在感染后第1至10天显示出上呼吸道的感染。临床症状化脓性鼻炎。用同源病毒再次接种的恒河猴如PCR所证实的，出现了重复感染，可是没有见到临床症状。在初次感染(对3号猴重复感染发生在第240天而6号猴在239天)后六个月收集接受了00-1的恒河猴的血清。血清用于检测抗00-1或APV的IgG抗体的存在(图39B)和抗00-1的IgA和IgM抗体的存在(图39A)。两个恒河猴成功感染了00-1并出现感染了同源病毒的抗00-1抗体。对IgA和IgM抗体的应答显示首次感染后IgM抗体升高，并在重复感染后消失。IgA抗体仅仅在重复感染后被检测到，显示初次感染后免疫应答的直接性。在APV抑制ELISA中测试的恒河猴中的抗hMPV血清显示出与hMPVIgGELISA相似的应答。使用与hMPVELISA相似的敏感度用APV抑制ELISA检测恒河猴hMPV抗体，因而APV抑制ELISA适于检测人样品中的hMPV抗体的存在。在从hMPV感染的恒河猴中收集到的血清上进行病毒交叉中和试验。初次感染后第0至"9天取血清而且显示仅有抗00-1的低病毒中和滴度(0-80)，取自二次感染后的血清显示抗00-1的高病毒中和滴度，即大于1280。取自二次感染后的血清仅显示抗99-1的中和滴度(80-640)，而且没有血清能中和APVC病毒。病毒交叉中和试验中在APV-C和hMPV之间没有交叉反应，可是随着抗体应答，在00-1和99-l之间有交叉反应。感染人。像以前一样用抗00-1的IFA和病毒交叉中和试验年龄检测小于六个月或大于二十岁的病人的血清。用抗00-1的ELISA测试这些血清IgG，IgM和IgA抗体的存在。也测试样品抑制APVELISA的能力。进行比较使用hMPVELISA和APV抑制ELISA检测人血清的IgG抗体，发现在IgGhMPV和APV-Ab测试之间有强关联，因此APV-Ab测试基本能够检测针对人hMPV的IgG抗体(图40)。感染家禽。APV抑制ELISA和00-1ELISA用于检测鸡的抗APV的IgG抗体的存在。hMPVELISA和APV抑制ELISA都能检测抗APV的抗体。8.10实施例34:APV用作为人疫苗APV能用作为人疫苗防止被人MPV感染，或者减少人宿主中人MPV的感染性。疫苗可以是整个APV或其嵌和或重组体或其衍生体，其中除了APV序列还包含其它间质肺病毒的异源序列。APV基因组可以被用作为主链来创制重组病毒疫苗。例如，可以用人MPV的F-基因或G-基因替换APV的F-基因和/或G-基因来制备疫苗。可选的，用PIV的序列替换或加入APV主链序列来制备疫苗。对于更多的关于重组/嵌和疫苗的构建，可以参见诸如重组cDNA和RNA的构建。用本领域普通技术人员已知的方法对候选疫苗给药，(参见下文第5.13节)包括但不仅限于，皮下注射，鼻内给药，或吸入。本发明的病毒和/或疫苗以起始剂量至少在1(^TCID^和106TCIDs。之间进行给药。病毒和/或疫苗以单剂或多剂进行给药，即，初次剂量同一次或更多的在宿主生命中周期性间隔给药的后来或辅助剂剂量一起进行给药。在临床试验中，病毒的复制率可用作调节疫苗剂量的指标从而确定有效剂量的情况。可以进行比较在研究群体中的病毒复制率和预先确定的已知有效的比率。本发明不仅仅局限于明确描述出的为说明本发明的某一方面的实例，而任何功能等价的构建体，病毒或酶都在本发明的范围之内。实际上，除了在此显示或描述的那些，本发明的许多修改对于看了前述说明和附图的本领域普通技术人员来说是显然的。这些修改已落入附加的权利要求的保护范围之内了。8.11实施例35:MPV用作鸟类的疫苗人MPV可用作为鸟类的疫苗防止APV感染，或者减少鸟类宿主中的APV的感染性。疫苗可以是整个MPV或其嵌和或重组体或其衍生体，其中除了MPV序列还包含其它间质肺病毒的异源序列。人MPV基因组可以被用作为主链来创制重组病毒疫苗。例如，可以用APV的F-基因或G-基因替换人MPV的F-基因和/或G-基因来制备疫苗。对于更多的关于重组/嵌和疫苗的构建，可以参见诸如重组cDNA和RNA的构建。用许多方法对候选疫苗给药，包括但不仅限于，皮下注射，鼻内给药，或吸入。本发明的病毒和/或疫苗以起始剂量至少在103TCID5()和106TCID5之间进行给药。病毒和/或疫苗以单剂或多剂进行给药，即，初次剂量同一次或更多的在宿主生命中周期性间隔给药的后来或辅助剂剂量一起进行给药。在临床试验中，病毒的复制率可用作调节疫苗剂量的指标从而确定有效剂量的情况。可以进行比较在研究群体中的病毒复制率和预先确定的已知有效的比率。本申请中引述的各种出版物，其内容作为一个整体在此引入作为参考。8.12实施例36:使用HMPF蛋白七氨基酸重复肽抑制HMPV融合抑制病毒细胞融合代表控制有包膜病毒的新方法。为了防止hMPV病毒的感染和/或繁殖，该方法是有利的。在融合过程中，F蛋白的七氨基酸重复(HR)片段是暴露的。如果在融合过程中加入可溶性HR肽以竟争，则病毒融合将被阻断。预计通过F蛋白的HR肽来抑制hMPV-细胞融合将显示出强的病毒-细胞融合抑制活性。为了测定hMPVF蛋白七氨基酸重复肽抑制病毒融合的活性，可以将HR肽纯化，并且在多种试验中使用以确定它们对病毒融合的作用。编码hMPVF蛋白的HR片段的基因，即所谓的HRA和HRB(见下文)克隆到表达栽体例如pET30a(Novagen)内。该克隆策略将产生相当于hMPV的F蛋白的HR片段的融合蛋白。对于四个分离林，指定为HRA的接近hMPVF蛋白的氨基末端的HR片段的序列假定如下NL1/00:KTIRLESEVTAIKNALKKTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNL17艇KTIRLESEVTAIKNALKTTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKDFVSKNL1/99:KTIRLESEVNAIKGALKQTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKEFVSKNL1/94:KTIRLESEVNAIKGALKTTNEAVSTLGNGVRVLATAVRELKEFVSK同样，指定为HRB的接近hMPVF蛋白的羧基末端的HR片段的序列假定如下NL1NVALDQWESSQALVDQSNRILSSAENL17/00:NVALDQVFENffiNSQALVDQSNRILSSAENL1/99:NVALDQVFES鹏SQALVDQSNKILNSAENL1/94:NVALDQVFESIENSQALVDQSNKILNSAE蛋白表达和纯化为了测定七氨基酸重复肽抑制病毒融合的能力，可以表达和纯化七氨基酸重复肽，这样可测试它们的病毒融合抑制活性。将重组表达栽体转化到合适的细菌宿主例如E.ColiBL21(DE3)内，并且在600nm以0.8-1.0的光密度诱导表达。使用1.0mMIPTG在25°C诱导5小时，然后收获以及通过在磷酸盐緩冲盐水中超声来裂解细菌细胞。然后将TritonX-100加至终浓度为3%，将裂解物在水上培养30分钟，然后通过在4。C以12,000xg离心15分钟来让其变清。然后纯化表达的HR蛋白。复合物的装配和通过凝胶过量进行为了测定表达的七氨基酸重复肽在抑制病毒融合中的可能效力，可以使用试验来证实HR肽之间的复合物的装配。为了这样做，将等摩尔量的HRA和HRB混合，并且在室温培养l小时。评估融合蛋白形式的具有HRA和HRB的HRA/B复合物的形成。对于凝胶过滤，将样本负载在HiloadSuperdexG75柱(Pharmacia)上，该柱在AktaExplorerFPLC系统(Amersham-Pharmacia)上运行。收集峰级份，在Tris-tricineSDS-PAGE上运行。通过与在相同柱上运行的蛋白标准物(Pharmacia)来估测峰分子量。CD光谱法已知这些肽的七氨基酸重复片段在性质上是螺旋的。出于该原因，可使用多种方法来确定HR肽是否形成a螺旋，以鉴定用于病毒融合抑制的适当候选物。使用在PBS(10mM磷酸钠，pH7.3;150mMNaCl)中的蛋白在分光光度计上进行CD光谱测定。使用0.1cm通路长度的比色杯在37°C记录波长光谱。使用约20ng/ml的蛋白浓度进行分析。细胞融合试验可使用基于细胞的试验来确定HR肽在病毒融合抑制中的有效性。为了测试HRA和HRB肽对病毒-细胞融合的抑制，进行抑制试验。将单层Vero细胞用hMPV以10-100TCID50感染。感染两小时后，抽吸上清液，将细胞在磷酸盐緩冲盐水(PBS)中洗涤以除去病毒接种物。加入新鲜培养基(含有L-谷氨酰胺(2mM)、青霉素(100U/ml)、链霉素(100iug/ml)和0.3%牛血清白蛋白的Iscove改进的Dulbecco培养基(IMDM))，将细胞在37°C培养。将HRA和HRB肽单独地与hMPV感染的细胞培养。或者，将不同量的HRA和HRB肽与hMPV感染的细胞一起培养。通过与hMPV感染的细胞培养，得自APV、RSV或PIV的相应的HR肽也可用于抑制hMPV病毒融合。接种后，使用免疫荧光分析(IFA)将细胞记分24-"小时。通过以下方式来进行针对IFA的染色将感染的细胞与豚鼠抗-hMPV血清在PBS中培养1小时，然后与FITC-标记的兔子抗-豚鼠多克隆抗体制备物在PBS中培养1小时。最后用铬黑进行背景染色，然后在免疫荧光显微镜下分析。将感染的细胞于高倍放大率(320x)下在5个视野中计数。或者，在感染之后适当时间，对细胞进行细胞-细胞融合的融合。用结晶紫染色之后，通过合胞体/多核细胞形成测定细胞融合，以多核细胞中核的数目对总核数目的百分比记录。在光学显微镜下计数5个随机不同视野，并根据Reed-Muench方法计算IC50。9.减毒的病毒9.1实施例36:通过替换病毒基因而导致的减毒使用标准重组DNA技术，在病毒基因组的克隆cDNA中替换不同病毒基因的开放读框。关于不同病毒构建物的CAT活性，参见图60。9.2实施例37:M2缺失hMPV林hMPV/NL/l/00的M2基因的图谱如图61所示。为了产生M2基因的缺失，在核苷酸位置4741构建一个BspEl位点，在核苷酸位置5444构建第二个BspEl位点。通过位点特异性诱变构建限制位点。使用限制性内切核酸酶BspEl在两个BspEl位点将重组基因组进行限制消化以及随后的连接导致在核苷酸位置4741与核香酸位置5444之间的序列缺失。为了产生M2基因的M2-l开放读框的缺失，在核苷酸位置4744和5241引入NheI位点。通过位点特异性诱变构建限制位点。使用限制性内切核酸酶NheI在两个NheI位点将重组基因组进行限制消化以及随后的连接导致在核苷酸位置4744与核苷酸位置5241之间的序列缺失。为了产生M2基因的M2-2开放读框的缺失，在核苷酸位置5311和5453引入SwaI位点。通过位点特异性诱变构建限制位点。使用限制性内切核酸酶SwaI在两个SwaI位点将重组基因组进行限制消化以及随后的连接导致在核苷酸位置5311与核苷酸位置5453之间的序列缺失。使用下列引物组用于引入限制酶位点的引物对于将BspEI引入hMPV/NL/1/OO以获得从4741至5444的M2缺失引物组"liMPV，BspEI，+4741"ggacaaatcataacgttccggaaggctccgtgc"liMPV,BspEI,-474l"gcacggagccttccggaacgttatgatttgtcc和引物组"hMPV，BspEI,+5444"catagaaattatatatgtecggacttacttaagttag"hMPV，BspEI'-5444"ctaacttaagtaagtccggacatatataatttc对于将NheI位点引入hMPV以获得从4744至5241的M2-l缺失以及在nt4742起始位点从atg变为acg:引物"hMPV，NheI,+4744"ggacaaatcataacggetageaaggctccgtgc"hMPV，Miel,-4744gcaeggagecttgetagecgttatgatttgtcc引物"hMPV,Nhel,+5241cttatcageaggtgctagcaatgactcttcatatgc"hMPV，NheI，-5241gcatatgaagagtca11getagcacctgetgataag对于将SwaI位点引入hMPV以获得从5311至5453的M2-2缺引物组'1iMPV，Swal，+5311"cagtgagcatggtcca县tt幽attactatagagg'*hMPV，SwaI，-5311"cetctatagtaatttaaattggaccatgetcactg和引物组"hMPV,Swal，+5453"catagaaattatatatgtcaaggcttatttaa扭tag"hMPV,Swal,-5453"etaatttaaataagecttgacatatataatttctatg为了产生具有SH缺失的hMPV(林MPV/NL/1/00),已经回收了具有从5472至6026的缺失的克隆，并且在Vero细胞培养物中良好地生长。用于克隆具有SH缺失的hMPV/NL/l/00病毒的引物组如下引物组hMPVSacII+5472ggcttacttaagttagtaaaaacaccgeggagtgggataaatgachMPVSacII—5472gtcatttatcccactccgeggtgtttttactaacttaagtaagec引物纟且hMPVSacII+6026ctateattacccaaccgeggaaacccaatectaaatgttaacrhMPVSacII—6026gttaacatttaggattgggtttccgeggttgggtaatgatag10.实施例通过电穿孔在不含血清的VERO细胞中仅使用质粒的hMPV的回收引入该方法使得能够在没有辅助病毒存在的情况下仅使用质粒来回收重组hMPV。使用SFVero细胞进行hMPV的回收，所述细胞是于不存在源自动物和人的产物存在下繁殖的。该方法使得能够以类似于上述使用辅助病毒(重组疫苗或表达T7聚合酶的禽痘病毒)的方法的效率回收重组。因为在回收方法中不需要使用任何辅助病毒，所以疫苗病毒不含有污染物，简化了下游疫苗生产。将用于疫苗病毒回收的细胞在不含源自动物或人的产物的培养基中生长。这消除了产品最终使用者对于可传播的海绵状脑病(例如BSE)的担心。该方法能够产生重组疫苗种，其完全不含源自动物或人的组分。所述疫苗种还不含污染性辅助病毒。用于从cDNA拯救病毒的基于质粒的表达系统描述于例如RALerch等人，WyethVaccines,PearlRiverNY,USA(Abstract206，XIIInternationalConferenceonNegativeStrandViruses,June14th-19th2003，PisaItaly)和G.Neumann等人，丄Virol"76，pp406-410。方法和结果在不含血清的培养基中，使用电穿孔将使用hMPVN质粒(4pg;标记物卡那霉素抗性)、hMPVP质粒(4)iig;标记物卡那霉素抗性)、hMPVL质粒(2pg;标记物卡那霉素抗性)、编码hMPV反基因cDNA的cDNA(5pg;标记物卡那霉素抗性)和编码T7RNA聚合酶的pADT7(N)DpT7(5pg;标记物杀稻瘟菌素)引入到SFVero细胞内。为了拯救hMPV病毒，使用四种表达质粒。它们用于hMPV的基因N、P、L以及M2ofhMPV。特别使用下列质粒4|ughMPVNpCITE质粒，4hMPVPpCITE质粒，3|ughMPVM2pCITE质粒，2|aghMPVLpCITE质粒，5T7RNA聚合酶质粒，和5)ug编码欲扭救的病毒基因组的病毒cDNA。pCITE质粒具有内核糖体进入位点，该位点在Vero细胞的胞质中起作用，这样在胞质中生成N、P、M2和L的蛋白。这些蛋白形成病毒聚合酶复合物。欲拯救的病毒基因组是具有T7启动子的全长质粒。不想受绰于理论，使用该全长质粒，T7DNA-依赖性RNA聚合酶转录全长病毒RNA基因组。制得病毒基因组之后，病毒聚合酶复合物将转录病毒基因组，产生病毒信使RNA，之后回收病毒。用于电穿孔的脉冲是220V和950微法拉。每次电穿孔使用5.5x106个SFVero细胞。在OptiC(得自GIBCOInvitrogenCorporation的常规制剂)存在下，让电穿孔的细胞在33°C回收过夜。将回收的细胞用含有钙和镁的1mLPBS洗涤2次，覆盖以2mLOptiC。将电穿孔的细胞在33°C进一步培养5-7天。在培养结束时，将细胞刮到培养基内，分离总细胞裂解物中hMPV的存在。使用hMPV特异性多克隆抗体，通过噬斑分析的免疫染色来证实病毒回收。11.实施例在人间质肺病毒F蛋白切割位点废除中脯氨酸变为丝氨酸以及在VERO中的感染性人间质肺病毒(hMPV)，一种最近描述的副粘病毒，引起呼吸疾病，包括严重咳嗽、细支气管炎和肺炎。与副粘病毒亚科的其它成员禽类间质肺病毒(APV)和呼吸道合胞病毒(RSV)类似，hMPV表达两种表面糖蛋白附着糖蛋白(G)和融合蛋白(F)。虽然有关hMPV的结合以及加入研究尚未报道，但是与其它副粘病毒F蛋白的序列比对已经显示了保守的功能结构域(参见例如图9)。虽然不想受绰于理论，全长融合蛋白F裂解成F1和F2在F1片段的N-末端暴露了融合肽，这是病毒膜与宿主细胞膜融合的先决条件。虽然毒林hMPV/NL/1/OO(SEQIDNO:19)在F蛋白的切割位点含有序列RQPR，但是大多数其它hMPV林在F蛋白的切割位点含有序列RQSR。克隆在F蛋白的101位具有脯氨酸或丝氨酸的全长hMPV/NL/1/00。如实施例32所述，在胰蛋白酶存在下拯救和扩增两种病毒(图62和63)。然而，在没有胰蛋白酶存在的情况下，丝氨酸替换废除了F蛋白的裂解(图64)，并且抑制了病毒感染性。加入胰蛋白酶之后，裂解以及随后的感染性可以恢复，尽管101S突变体的噬斑尺寸小于101P病毒。这些结果表明F的裂解是hMVP/NL/1/OO具有感染性的先决条件。已经测序的hMPV的很多其它毒林在F蛋白的101位具有丝氨酸，并且可能裂解。例如，已使用Western印迹证实毒林CAN99-81的F蛋白可以裂解。12.实施例重组hMPV的生长特性如实施例28所述构建几种重组hMPV。如实施例32所述拯救几种重组hMPV。重组hMPV/NL/1/OO在以及不在胰蛋白酶存在下的生长曲线如图65所示。将细胞(Vero细胞)以0.1的MOI感染。野生型hMPV/NL/1/OO和重组hMPV/NL/1/OO在仓鼠的上和下呼吸道中的复制如图66所示。如实施例33所述感染仓鼠。其中在F蛋白的氨基酸位置93谷氨酸替换为缬氨酸的重组hMPV/NL/l/00在以及不在胰蛋白酶存在下的生长曲线如困67所示。将细胞(Vero细胞)以1的MOI感染。13.使用hMPV/GFP2的微中和试验当把病毒接种动物体内时，产生一组抗该病毒的抗体。某些抗体可以结合病毒颗粒，并且中和病毒的感染性。在该实施例中，将病毒与含有抗体的血清稀释物培养后，使用微中和试验来分析病毒的感染性。对于系列稀释，将9&孔板分成(i)行A(稀释l:32);B(I:64);C(1:128);D(1:256);E(1:512);F(1:1024);G(1:2048);和H(无抗体)以及(ii)分成用于不同样本的列1-12(第一个样本列1-3;第二个样本列4-6;第三个样本列7-9;和第四个样本列10-12)。将230pl样本稀释物加到行A中。将115plOpti-MEM加到行B-H内。然后将115)il1:32稀释的第一个样本加到孔1B、2B和3B中，第二个样本加到孔4B、5B和6B中，笫三个样本加到孔78、8B和9B中，第四个样本加到孔10B、11B和i:2B中。通过上下吸移3次将血清和培养基混合。对于行B-C、行C-D、行D-E、行E-G重复这些步骤。将稀释的样本加到行C中并混合后，从行G中取出样本并且弃去。如下所述进行微中和试验将血清进行系列稀释。通过把22.5pl血清加到697.5^1Opti-MEMMedium(lx)中来将每一测试样本和每一对照进行1:32的稀释。通过翻转3次将血清和培养基混合，并置于冰上。将每一血清稀释物与病毒hMPV/GFP2—起培养。将细胞用磷酸盐緩冲盐水("PBS")洗涤。将得自ATCC的Vero细胞在MEM(JRHBiosciences)中保持，所述MEM补充有10%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、非必需氨基酸和100单位/ml的青霉素G、100(ig/ml的硫酸链霉素。将病毒/血清混合物加到细胞中，并且在35°C培养1小时。取出含有病毒的所有培养基，将细胞用PBS洗涤。向细胞中加入Opti-MEM培养基，将细胞培养物培养3天。Opti-MEMIReduced-SerumMedium(lx)(GIBCO31985-070)含有HEPES緩冲液、2400mg/L碳酸氢钠、次黄嘌呤、雄苷、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、微量元素、生长因子和减至l.lmg/L的酴红。通过对使用荧光显微镜拍摄的图像上的eGFP绿色焦点进行定量来测定病毒的剩余感染性。还使用野生型病毒例如野生型hMPV/NL/1/00进行噬斑减小试验(参见实施例l6)，以比较该微中和试验的敏感性。结果如表16、表17、表l8、表19和图68所示。结果表明，使用hMPV/GFP2的该微中和试验提供了可靠且可再现的结果。在微中和试验中使用hMPV-GFP有助于在动物模型系统例如雪貂和猴子中以高流通量筛选不同病毒和抗体。该技术还提供了用于诊断和检测人感染的有效手段。表16:使用hMPV/GFP2微中和试验和噬斑减小试验的雪貂血清的滴度。对于噬斑减小试验，使用得自豚鼠的补体(加入100pl，在20mlOpti-MEM中)。NT50是带来50%输入病毒的中和的1/稀释。表中的数字表示血清的滴度。_<table>tableseeoriginaldocumentpage232</column></row><table>表17:使用hMPV/GFP2微中和试验和噬斑减小试验的猴子血清的滴度<table>tableseeoriginaldocumentpage233</column></row><table>18:噬斑减小试验与使用hMPV/GFP2的微中和试验之间的关系(还参见图68)___<table>tableseeoriginaldocumentpage233</column></row><table>表19:使用噬斑减小试验与微中和试验的仓鼠血清的滴度<table>tableseeoriginaldocumentpage234</column></row><table>14.实施例评估表达MPV的抗原性蛋白的b/hPIV3在非洲绿猴中的效力和免疫原性在非人灵长类动物模型例如非洲绿猴中评估二价MPV/RSV疫苗候选物，例如表达RSV的抗原性蛋白如人RSV的可溶形式的F蛋白("hMPV/RSVFsw，)的hMPV的效力和免疫原性，其中可溶形式的RSVF蛋白缺乏跨膜和鲁米那结构域。将Vero细胞保持在改进的Eagle培养基(MEM)(JRHBiosciences)中，所述MEM补充有2mML-谷氨酰胺、非必需氨基酸(NEAA)、抗生素和10%FBS。将表达RSV的抗原性蛋白例如hMPV/RSVFs°L的hMPV，野生型MPV例如hMPV/NL/100，和野生型RSV例如RSVA2在Vero细胞中繁殖。将细胞用0.1PFU/细胞的感染复数(MOI)感染。感染3-5后，收集细胞和上清液，通过加入10^SPG(10xSPG是2.18M蔗糖，0.038MKH2P04，0.072MKH2P04,0.054ML國谷氨酸)至1x的终浓度来稳定。将病毒原种在-70。C贮存。通过Vero细胞上的噬斑试验确定病毒滴度。使用PIV3(VMRD)或MPV山羊多克隆抗血清(Biogenesis)免疫染色之后，定量噬斑。使用用于在试验开始前14天收集的灵长类动物前血清的MPVFIgGELISA(Immuno-BiologicalLaboratories)和RSVFIgGELISA(Immuno陽BiologicalLaboratories)鉴定MPV-和RSV國血清负性非洲绿猴(0/rw7/^ci^a^/i/o/)s)(3.5至6.5岁，2.6-5.8kg)。如下所述进行MPVFIgGELISA:根据生产商的说明，使用ELISA试剂盒(Immuno陽BiologicalLaboratories,Hamburg,Germany),分析在第1、28和56天得自疫苗接种动物的灵长类动物血清中MPVFIgG的存在。将第二猴子抗血清(RocklandInc.)以1:1000的稀释度使用。MPVFIgG抗体滴度以1og2lgGU/ml表示。根据生产商的说明，使用ELISA试剂盒(Immuno國BiologicalLaboratories,Hamburg,Germany),分析在第1、28和56天得自疫苗接种动物的灵长类动物血清中RSVFIgG的存在。将第二猴子抗血清(RocklandInc.)以1:1000的稀释度使用。RSVFIgG抗体滴度以log2IgGU/ml表示。将灵长类动物在单独的小分离笼子中飼养。使用氯胺酮-安定混合物将猴子麻醉，分别使用表达RSV的抗原性蛋白例如hMPV/RSVFSOL的hMPV，野生型MPV例如hMPV/NL/100,和野生型RSV例如RSVA2进行鼻内和气管内感染。鼻剂量体积为每个鼻孔0.5ml，并且气管内剂量体积为lml。在第1天，每只动物接受含有2-3xl05PFU病毒的2ml剂量。安慰剂动物组接受相同剂量体积的Opti-MEM。在第28天，将所有动物用7x10sPFU野生型RSVA2(在每个点1ml)进行鼻内和气管内攻击。每天收集鼻咽(NP)拭，收集11天，在免疫接种后和攻击后的第1、3、5、7和9天，收集气管灌洗液(TL)样本。在第0、7、14、21、28、35、42、49和56天，收集得自股静脉的血样进行血清学分析。监测动物的表明发烧的体温改变、感冒征状、流鼻涕、打喷嚏、食欲和体重降低。使用通过MPV山羊多克隆抗血清进行免疫染色的Vero细胞定量测定灵长类动物NP和NL样本中存在的病毒。平均峰值病毒滴度代表在免疫接种或攻击之后11天的任一天对于每一只动物测定的峰值病毒滴度的平均值。对于在接种后第1、28和56天从用hMPV/RSVFSL感染的灵长类动物获得的血清，进行噬斑减小中和试验(PRNA)。将灵长类动物血清进行两倍系列稀释，在豚鼠补体存在下，分别与野生型RSVA2或野生型MPV例如hMPV/NL/100于4。C培养。将病毒-血清混合物转移到Vero细胞单层中，覆盖以在含有2%FBS和1%抗生素的EMEM/L-15培养基(JRHBiosciences;Lenexa，KS)中的1%甲基纤维素。在35。C培养6天后，分别使用RSV山羊多克隆抗血清或hMPV山羊多克隆抗血清对该单层进行免疫染色以定量测定。中和滴度以将病毒噬斑抑制了50。/。的最高血清稀释度的倒数log2表示。分别在Vero细胞上进行hMPV微中和试验和RSVA2微中和试验。以1:4开始，将两倍系列稀释的灵长类动物血清分别与100TCID50的hMPV或RSVA2在37°C培养60分钟。然后将病毒-血清混合物转移到在96孔平板内的细胞单层中，在37。C培养6天，然后观测所有孔的CPE。微中和滴度以抑制CPE的最高血清稀释度的倒数log2表示。Sl:4(检测的最低血清稀释度)的中和抗体滴度的倒数1og2值为为了测定二价MPV/RSV疫苗候选物的复制效率，如下所述进行试验。在第1天，将每组8只的MPV和RSV血清阴性非洲绿猴用MPV疫苗候选物例如hMPV/RSVFsol以2-3x105PFU的剂量进4亍鼻内和气管内免疫接种。用野生型MPV例如hMPV/NL/100感染一个阳性对照组，另一个阳性对照组用野生型RSVA2感染，阴性对照组是施用的安慰剂培养基。在第28天，将每组分成两部分，每一组的一个部分的所有动物用7xl05PFU的野生型MPV例如hMPV/NL/100进行鼻内和气管内攻击。每一组的另一个部分的所有动物用7xl05PFU的野生型RSVA2进行鼻内和气管内攻击。在试验期间，将动物在微隔离笼子中饲养。在免疫接种之后和攻击之后的ll天内，每天收集鼻咽拭，在免疫接种之后和攻击之后的第2、4、6、8和10天获得气管灌洗样本。在整个试验期间，每7天收集一次血样用于抗体分析。为了评估针对MPV感染和RSV感染的免疫保护，在免疫接种之后4周，将疫苗接种的灵长类动物分别用高剂量的野生型MPV例如hMPV/NL/100和高剂量的野生型RSVA2进行攻击。效率以感染动物的URT和LRT中的脱落MPV攻击病毒滴度的下降来表示效率。通过在免疫接种4周后产生的MPV中和抗体滴度和RSVFIgG血清抗体滴度进一步评估MPV/RSV二价疫苗候选物的效力。试验50y。噬斑减小中和试验(PRNA)确定MPV中和抗体滴度。还通过在免疫接种前(第1天)、免疫接种后4周(第28天)和攻击后4周(第56天)测定RSVF蛋白特异性IgG水平来分析由MPV/RSV二价疫苗候逸物引起的免疫反应。使用ELISA测定RSVFIgG血清抗体的存在。血清中MPV中和活性的存在也可以使用hMPV微中和试验来确定。为了评估MPV/RSV二价疫苗是否能够保护免于RSV感染，还使用噬斑减小中和或微中和试验分析灵长类动物血清中RSV中和的存在。表14:序列表的文字说明SEQIDNO:1人间质肺病毒分离林00-1基质蛋白(M)及融合蛋白(F)的基因SEQIDNO:2禽类肺病毒融合蛋白基因，部分cdsSEQIDNO:3禽类肺病毒分离林lb融合蛋白mRNA，完整cdsSEQIDNO:4火鸡鼻气管炎病毒融合蛋白(Fl和F2亚单位)的基因，完整cdsSEQIDNO:5禽类肺病毒基质蛋白(M)基因，部分cds以及禽类肺病毒融合糖蛋白(F)基因，完整cdsSEQIDNO:6副粘病毒F蛋白hRSVBSEQIDNO:7副粘病毒F蛋白hRSVA2SEQIDNO:8人间质肺病毒01-71(部分序列)SEQIDNO:9人间质肺病毒分离株00-1基质蛋白(M)及融合蛋白(F)的基因SEQIDNO:10禽类肺病毒融合蛋白基因，部分cdsSEQIDNO:11禽类肺病毒分离林lb融合蛋白mRNA，完整cdsSEQIDNO:12火鸡鼻气管炎病毒融合蛋白(Fl和F2亚单位)的基因，完整cdsSEQIDNO:13禽类肺病毒融合糖蛋白(F)基因，完整cdsSEQIDNO:14火鸡鼻气管炎病毒(毒林CVL14/1)附着蛋白(G)mRNA，完整cdsSEQIDNO:15火鸡鼻气管炎病毒(毒林6574)附着蛋白(G)，完整cdsSEQIDNO:16火鸡鼻气管炎病毒(毒林CVL14/1)附着蛋白(G)mRNA，完整cdsSEQIDNO:17火鸡鼻气管炎病毒(毒林6574)附着蛋白(G)，完整cdsSEQIDNO:18分离林NL/1/99(99-1)HMPV(人间质肺病毒)cDNA序列SEQIDNO:19分离林NL/1/00(00-1)HMPVcDNA序列SEQIDNO:20分离林NL/17/00HMPVcDNA序列SEQIDNO:21分离林NL/1/94HMPVcDNA序列SEQIDNO:22RT-PCRSEQIDNO:23RT陽PCRSEQIDNO:24RT-PCRSEQIDNO:25RT-PCRSEQIDNO:26RT画PCRSEQIDNO:27RT國PCRSEQIDNO:28RT誦PCRSEQIDNO:29RT-PCRSEQIDNO:30RT-PCRSEQIDNO:31RT-PCRSEQIDNO:32RT画PCRSEQIDNO:33RT-PCRSEQIDNO:34RT-PCRSEQIDNO:35RT-PCRSEQIDNO:36寡核苷酸探针MSEQIDNO:37寡核苷酸探针NSEQIDNO:38寡核苷酸探针LSEQIDNO:39分离抹NL/1/00，BI/1/01,FI/4/01,NL/8/01,FI/2/01的TaqMan引物及探针序列SEQIDNO:40分离林NL/30/01的TaqMan引物及探针序列SEQIDNO:41分离林NL/22/01和NL/23/01的TaqMan引物及探针序列SEQIDNO:42分离林NL/17/01的TaqMan引物及探针序列SEQIDNO:43分离林NL/17/00的TaqMan引物及探针序列SEQIDNO:44分离林NL/9/01,NL/21/01,和NU5/01的TaqMan引物及探针序列SEQIDNO:45FI/1/01和FI/10/01的TaqMan引物及探针序列SEQIDNO:46引物ZF1SEQIDNO:47引物ZF4引物TR1引物Nl引物N2引物Ml引物M2引物Fl引物N3引物N4引物M3引物M4引物F7引物F8引物引物L7SEQIDNO:48引物ZF7SEQIDNO:49引物ZF10SEQIDNO:50引物ZF13SEQIDNO:51引物ZF16SEQIDNO:52引物CS1SEQIDNO:53引物CS4SEQIDNO:54引物CS7SEQIDNO:55引物CS10SEQIDNO:56引物CS13SEQIDNO:57引物CS16SEQIDNO:58扩增HPIV-1用的正向引物SEQIDNO:59扩增HPIV-1用的反向引物SEQIDNO:60扩增HPIV-2用的正向引物SEQIDNO:61扩增HPIV-2用的反向引物SEQIDNO:62扩增HPIV-3用的正向引物SEQIDNO:63扩增HP1V-1用的反向引物SEQIDNO:64扩增HPIV-4用的正向引物SEQIDNO:65扩增HPIV-1用的反向引物SEQIDNO:66扩增腮腺炎病毒用的正向引物SEQIDNO:67扩增腮腺炎病毒用的反向引物SEQIDNO:68扩增NDV用的正向引物SEQIDNO:69扩增NDV用的反向引物SEQIDNO:70扩增Tupaia用的正向引物SEQIDNO:71扩增Tupaia用的反向引物SEQIDNO:72扩增Mapuera用的正向引物SEQIDNO:73扩增Mapuera用的反向引物SEQIDNO:74扩增Hendra用的正向引物SEQIDNO:75扩增Hendra用的反向引物SEQIDNO:76扩增Nipah用的正向引物SEQID緣77扩增Nipah用的反向引物SEQIDNO:78扩增HRSV用的正向引物SEQIDNO:79扩增HRSV用的反向引物SEQIDNO:80扩增麻渗病毒用的正向引物SEQIDNO:81扩增麻渗病毒用的反向引物SEQIDNO:82扩增常见副粘病毒用的正向引物SEQIDNO:83扩增常见副粘病毒用的反向引物SEQIDNO:84分离林NL/1/00(Al)的G-基因编码序列SEQIDNO:85分离林BR/2/01(Al)的G-基因编码序列SEQIDNO:86分离林FL/4/01(Al)的G-基因编码序列SEQIDNO:87分离林FL/3/01(Al)的G-基因编码序列SEQIDNO:88分离林FL/8/01(Al)的G-基因编码序列SEQIDNO:89分离林FL/10/01(Al)的G-基因编码序列SEQIDNO:90分离林NL/10/01(Al)的G-基因编码序列SEQIDNO:91分离林NL/2/02(Al)的G-基因编码序列SEQIDNO:92分离林NL/17/00(A2)的G-基因编码序列SEQIDNO:93分离林NL/1/81(A2)的G-基因编码序列SEQIDNO:94分离林NL/1/93(A2)的G-基因编码序列SEQIDNO:95分离林NL/2/93(A2)的G-基因编码序列SEQIDNO:96分离林NL/3/93(A2)的G-基因编码序列SEQIDNO:97分离林NL/1/95(A2)的G-基因编码序列SEQIDNO:98分离林NL/2/96(A2)的G-基因编码序列SEQIDNO:99分离抹NL/3/96(A2)的G-基因编码序列SEQIDNO:100分离林NL/22/01(A2)的G-基因编码序列SEQIDNO:101分离林NU24/01(A2)的G-基因编码序列SEQIDNO:102分离林NL/23/01(A2)的G-基因编码序列SEQIDNO:103分离林NL/29/01(A2)的G-基因编码序列SEQIDNO:104分离林NL/3/02(A2)的G-基因编码序列SEQIDNO:105分离林NL/1/99(B1)的G-基因编码序列SEQIDNO:106分离林NL/11/00(B1)的G-基因编码序列SEQIDNO:107分离林NL/12/00(B1)的G-基因编码序列SEQIDNO:108分离抹NU5/01(Bl)的G-基因编码序列SEQIDNO:109分离林NL/9/01(Bl)的G-基因编码序列SEQIDNO:110分离林NL/21/01(Bl)的G-基因编码序列SEQIDNO:111分离抹NL/1/94(B2)的G-基因编码序列SEQIDNO:112分离林NL/1/82(B2)的G-基因编码序列SEQIDNO:113分离林NL/1/96(B2)的G-基因编码序列SEQIDNO:114分离林NL/6/97(B2)的G-基因编码序列SEQIDNO:115分离林NL/9/00(B2)的G-基因编码序列SEQIDNO:116分离林NL/3/01(B2)的G-基因编码序列SEQIDNO:117分离林NL/4/01(B2)的G-基因编码序列SEQIDNO:118分离株UK/5/01(B2)的G-基因编码序列SEQIDNO:119分离株NL/1/00(Al)的G-蛋白的序列SEQIDNO:120分离林BR/2/01(Al)的G-蛋白的序列SEQIDNO:121分离株FL4/01(Al)的G-蛋白的序列SEQIDNO:122分离林FL/3/01(Al)的G-蛋白的序列SEQIDNO:123分离林FL/8/01(A1)的G-蛋白的序列SEQIDNO:124分离林FL/10/01(Al)的G-蛋白的序列SEQIDNO:125分离抹NL/10/01(Al)的G-蛋白的序列SEQIDNO:126分离林NL/2/02(Al)的G-蛋白的序列SEQIDNO:127分离林NL/17/00(A2)的G-蛋白的序列SEQIDNO:128分离林NL/1/81(A2)的G-蛋白的序列SEQIDNO:129分离林NL/1/93(A2)的G-蛋白的序列SEQIDNO:130分离林NL/2/93(A2)的G-蛋白的序列SEQIDNO:131分离林NL/3/93(A2)的G-蛋白的序列SEQIDNO:132分离抹NL/1/95(A2)的G-蛋白的序列SEQIDNO:133分离林NL/2/96(A2)的G-蛋白的序列SEQIDNO:134分离林NL/3/96(A2)的G-蛋白的序列SEQIDNO:135分离林NL/22/01(A2)的G-蛋白的序列SEQIDNO:136分离林NL/24/01(A2)的G-蛋白的序列SEQIDNO:137分离林NL/23/01(A2)的G-蛋白的序列SEQIDNO:138分离林NL/29/01(A2)的G-蛋白的序列SEQIDNO:139分离林NL/3/02(A2)的G-蛋白的序列SEQIDNO:140分离林NL/1/99(Bl)的G-蛋白的序列SEQIDNO:141分离林NL/11/00(Bl)的G-蛋白的序列SEQIDNO:142分离林NL/12/00(Bl)的G-蛋白的序列SEQIDNO:143分离株NL/5/01(B1)的G-蛋白的序列SEQIDNO:144SEQIDNO:145SEQIDNO:146SEQIDNO:147SEQID緣148SEQIDNO:149SEQIDNO:150SEQIDNO:151SEQIDNO:152SEQIDNO:153SEQIDNO:154SEQIDNO:155SEQIDNO:156SEQIDNO:157SEQIDNO:158SEQIDNO:159SEQIDNO:160SEQIDNO:161SEQIDNO:162SEQIDNO:163SEQIDNO:164SEQIDNO:165SEQIDNO:166SEQIDNO:167SEQIDNO:168SEQIDNO:169SEQIDNO:170SEQIDNO:171SEQIDNO:172SEQIDNO:173SEQIDNO:174SEQIDNO:175分离林NL/9/01(Bl)的G-蛋白的序列分离林NL/21/01(Bl)的G-蛋白的序列分离林NL/1/94(B2)的G-蛋白的序列分离林NL/1/82(B2)的G-蛋白的序列分离林NL/1/96(B2)的G-蛋白的序列分离林NL/6/97(B2)的G-蛋白的序列分离林NL/9/00(B2)的G-蛋白的序列分离林NL/3/01(B2)的G-蛋白的序列分离林NL/4/01(B2)的G-蛋白的序列分离林NL/5/01(B2)的G-蛋白的序列分离林NL/1/00的F-基因编码序列分离林UK/1/00的F-基因编码序列分离林NL/2/00的F-基因编码序列分离林NL/13/00的F-基因编码序列分离林NL/14/00的F-基因编码序列分离林FL/3/01的F-基因编码序列分离林FL/4/01的F-基因编码序列分离林FL/8/01的F-基因编码序列分离林UK/1/01的F-基因编码序列分离林UK/7/01的F-基因编码序列分离林FL/10/01的F-基因编码序列分离林NL/6/01的F-基因编码序列分离林NL/8/01的F-基因编码序列分离林NL/10/01的F-基因编码序列分离林NL/14/01的F-基因编码序列分离林NL/20/01的F-基因编码序列分离林NL/25/01的F-基因编码序列分离林NL/26/01的F-基因编码序列分离林NL/28/01的F-基因编码序列分离林NL/30/01的F-基因编码序列分离林BR/2/01的F-基因编码序列分离林BR/3/01的F-基因编码序列SEQIDNO:176分离林NL/2/02的F-基因编码序列SEQIDNO:177分离林NU4/02的F-基因编码序列SEQIDNO:178分离林NL/5/02的F-基因编码序列SEQIDNO:179分离林NL/6/02的F-基因编码序列SEQIDNO:180分离林NL/7/02的F-基因编码序列SEQIDNO:181分离林NL/9/02的F-基因编码序列SEQIDNO:182分离林FL/1/02的F-基因编码序列SEQIDNO:183分离林NL/1/81的F-基因编码序列SEQIDNO:184分离抹NUI/93的F-基因编码序列SEQIDNO:185分离林NL/2/93的F-基因编码序列SEQIDNO:186分离林NL/4/93的F-基因编码序列SEQIDNO:187分离林NL/1/95的F-基因编码序列SEQIDNO:188分离林NL/2/96的F-基因编码序列SEQIDNO:189分离林NL/3/96的F-基因编码序列SEQIDNO:190分离林NL/1/98的F-基因编码序列SEQIDNO:191分离林NL/17/00的F-基因编码序列SEQIDNO:192分离林NL/22/01的F-基因编码序列SEQIDNO:193分离林NL/29/01的F-基因编码序列SEQIDNO:194分离株NL/23/01的F-基因编码序列SEQIDNO:195分离林NL/17/01的F-基因编码序列SEQIDNO:196分离林NL/24/01的F-基因编码序列SEQIDNO:197分离林NL/3/02的F-基因编码序列SEQIDNO:198分离林NL/3/98的F-基因编码序列SEQIDNO:199分离林NL/1/99的F-基因编码序列SEQIDNO:200分离林NL/2/99的F-基因编码序列SEQIDNO:201分离林NL/3/99的F-基因编码序列SEQIDNO:202分离林NL/11/00的F-基因编码序列SEQIDNO:203分离林NL/12/00的F-基因编码序列SEQIDNO:204分离林NL/1/01的F-基因编码序列SEQIDNO:205分离林NL/5/01的F-基因编码序列SEQIDNO:206分离林NL/9/01的F-基因编码序列SEQIDNO:207分离林NL/19/01的F-基因编码序列SEQIDNO:208SEQIDNO:209SEQIDNO:210SEQIDNO:211SEQID隐212SEQIDNO:213SEQIDNO:214SEQIDNO:215SEQIDNO:216SEQIDNO:217SEQIDNO:218SEQIDNO:219SEQIDNO:220SEQIDNO:221SEQIDNO:222SEQIDNO:223SEQIDNO:224SEQIDNO:225SEQIDNO:226SEQIDNO:227SE(JIDNO:228SEQIDNO:229SEQIDNO:230SEQIDNO:231SEQIDNO:232SEQIDNO:233SEQIDNO:234SEQIDNO:235SEQIDNO:236SEQIDNO:237SEQIDNO:238SEQIDNO:239分离林NL/21/01的F-基因编码序列分离林UK/11/01的F-基因编码序列分离林FL/1/01的F-基因编码序列分离林FL/2/01的F-基因编码序列分离林FL/5/01的F-基因编码序列分离林FL/7/01的F-基因编码序列分离林FL/9/01的F-基因编码序列分离林UK/10/01的F-基因编码序列分离林NL/1/02的F-基因编码序列分离林NL/l/94的F-基因编码序列分离林NL/1/96的F-基因编码序列分离林NL/6/97的F-基因编码序列分离林NL/7/00的F-基因编码序列分离抹NL/9/00的F-基因编码序列分离林NL/19/00的F-基因编码序列分离林NL/28/00的F-基因编码序列分离林NL/3/01的F-基因编码序列分离林NL/4/01的F-基因编码序列分离林NL/11/01的F-基因编码序列分离抹NL/15/01的F-基因编码序列分离林NL/18/01的F-基因编码序列分离抹FL/6/01的F-基因编码序列分离林UK/5/01的F-基因编码序列分离林UK/8/01的F-基因编码序列分离林NL/12/02的F-基因编码序列分离林HK/1/02的F-基因编码序列分离株NL/l/00的F-蛋白的序列分离林UK/l/00的F-蛋白的序列分离林NL/2/00的F-蛋白的序列分离林NL/13/00的F-蛋白的序列分离林NL/14/00的F-蛋白的序列分离林FL/3/01的F-蛋白的序列SEQIDNO:240SEQIDNO:241SEQIDNO:242SEQIDNO:243SEQIDNO:244SEQIDNO:245SEQID緣246SEQIDNO:247SEQIDNO:248SEQIDNO:249SEQIDNO:250SEQIDNO:251SEQIDNO:252SEQIDNO:253SEQIDNO:254SEQIDNO:255SEQIDNO:256SEQIDNO:257SEQIDNO:258SEQIDNO:259SEQIDNO:260SEQIDNO:261SEQIDNO:262SEQIDNO:263SEQIDNO:264SEQIDNO:265SEQIDNO:266SEQIDNO:267SEQIDNO:268SEQIDNO:269SEQIDNO:270SEQIDNO:271分离林FL/4/01的F-蛋白的序列分离林FL/8/01的F-蛋白的序列分离株UK/1/01的F-蛋白的序列分离株UK/7/01的F-蛋白的序列分离林FL/10/01的F-蛋白的序列分离林NL/6/01的F-蛋白的序列分离林NL/8/01的F-蛋白的序列分离林NL/10/01的F-蛋白的序列分离林NL/14/01的F-蛋白的序列分离林NL/20/01的F-蛋白的序列分离林NL/25/01的F-蛋白的序列分离林NL/26/01的F-蛋白的序列分离株NL/28/01的F-蛋白的序列分离林NL/30/01的F-蛋白的序列分离林BR/2/01的F-蛋白的序列分离株BR/3/01的F-蛋白的序列分离林NL/2/02的F-蛋白的序列分离林NL/4/02的F-蛋白的序列分离株NL/5/02的F-蛋白的序列分离林NL/6/02的F-蛋白的序列分离林NL/7/02的F-蛋白的序列分离株NL/9/02的F-蛋白的序列分离林FL/1/02的F-蛋白的序列分离林NL/1/81的F-蛋白的序列分离林NL/1/93的F-蛋白的序列分离林NL/2/93的F-蛋白的序列分离林NL/4/93的F-蛋白的序列分离林NL/1/95的F-蛋白的序列分离林NL/2/96的F-蛋白的序列分离林NL/3/96的F-蛋白的序列分离林NL/l/98的F-蛋白的序列分离林NL/17/00的F-蛋白的序列SEQIDNO:272SEQIDNO:273SE(JIDNO:274SEQIDNO:275SEQIDNO:276SEQIDNO:277SEQIDNO:278SEQIDNO:279SEQIDNO:280SEQIDNO:281SEQIDNO:282SEQIDNO:283SEQIDNO:284SEQIDNO:285SEQIDNO:286SEQIDNO:287SEQIDNO:288SEQIDNO:289SEQIDNO:2卯SE(JIDNO:291SEQIDNO:292SEQIDNO:293SEQIDNO:294SEQIDNO:295SEQIDNO:296SEQIDNO:297SEQIDNO:298SEQIDNO:299SE(JIDNO:300SEQIDNO:301SEQIDNO:302SEQIDNO:303分离林NL/22/01的F-蛋白的序列分离林NL/29/01的F-蛋白的序列分离林NL/23/01的F-蛋白的序列分离林NL/17/01的F-蛋白的序列分离林NL/24/01的F-蛋白的序列分离林NL/3/02的F-蛋白的序列分离林NL/3/98的F-蛋白的序列分离林NU1/99的F-蛋白的序列分离林NL/2/99的F-蛋白的序列分离株NL/3/99的F-蛋白的序列分离林NL/ll/00的F-蛋白的序列分离林NL/12/00的F-蛋白的序列分离林NL/1/01的F-蛋白的序列分离林NL/5/01的F-蛋白的序列分离林NL/9/01的F-蛋白的序列分离株NL/19/01的F-蛋白的序列分离抹NL/21/01的F-蛋白的序列分离林UK/11/01的F-蛋白的序列分离林FL/1/01的F-蛋白的序列分离林FL/2/01的F-蛋白的序列分离林FL/5/01的F-蛋白的序列分离林FL/7/01的F-蛋白的序列分离林FL/9/01的F-蛋白的序列分离林UK/10/01的F-蛋白的序列分离林NL/1/02的F-蛋白的序列分离林NL/l/94的F-蛋白的序列分离株NL/l/96的F-蛋白的序列分离林NL/6/97的F-蛋白的序列分离林NL/7/00的F-蛋白的序列分离林NL/9/00的F-蛋白的序列分离林NL/19/00的F-蛋白的序列分离林NL/28/00的F-蛋白的序列SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQID緣SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:304分离林NL/3/01的F-蛋白的序列305分离林NL/4/01的F-蛋白的序列306分离抹NL/11/01的F-蛋白的序列307分离林NL/15/01的F-蛋白的序列308分离林NL/18/01的F-蛋白的序列309分离林FL/6/01的F-蛋白的序列310分离株UK/5/01的F-蛋白的序列311分离林UK/8/01的F-蛋白的序列312分离抹NL/12/02的F-蛋白的序列313分离林HK/1/02的F-蛋白的序列314HMPV分离林NL/1/00的F蛋白的序列分离林NL/17/00的F蛋白的序列分离林NL/1/99的F蛋白的序列分离林NL/1/94的F蛋白的序列分离林NL/1/00的F-基因序列分离林NL/17/00的F-基因序列分离林NL/1/99的F-基因序列分离林NL/1/94的F-基因序列分离抹NL/l/00的G蛋白的序列分离林NL/17/00的G蛋白的序列分离林NL/1/99的G蛋白的序列分离林NL/1/94的G蛋白的序列分离林NL/1/00的G-基因序列分离株NL/17/00的G-基因序列分离林NL/1/99的G-基因序列分离林NL/1/94的G-基因序列分离林NL/1/00的L蛋白的序列分离林NL/17/00的L蛋白的序列分离林NL/1/99的L蛋白的序列分离林NL/1/94的L蛋白的序列分离林NL/1/00的L-基因序列分离林NL/17/00的L-基因序列315HMPV316HMPV317HMPV318HMPV319HMPV320HMPV321HMPV322HMPV323HMPV324HMPV325HMPV326HMPV327HMPV328HMPV329HMPV330HMPV331HMPV332HMPV333HMPV334HMPV335HMPVSEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQID緣SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQID戮SEQID緣SEQIDNO:SEQID緣SEQIDNO:SEQID隐SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQID隐SEQIDNO:SEQIDNO:SEQID脆SEQIDNO:336HMPV337HMPV338HMPV339HMPV340HMPV341HMPV342HMPV343HMPV344HMPV345HMPV346HMPV347HMPV348HMPV349HMPV350HMPV351HMPV352HMPV353HMPV354HMPV355HMPV356HMPV357HMPV358HMPV359HMPV360HMPV361HMPV362HMPV363HMPV364HMPV365HMPV366HMPV367HMPV分离林NL/分离林NL/分离林NL/分离林NL/分离林NL/分离抹NL/分离林NL/分离林NL/分离林NL/分离林NL/分离林NL/分离林NL/分离林NL/分离林NL/分离林NL/分离林NL/分离林NL/分离林NL/分离林NL/分离林NL/分离林NL/分离林NL/分离林NL/分离林NL/分离林NL/分离林NL/分离林NL/:分离林NL/分离林NL/1分离林NL/分离林NL/分离林NL/:/99的L-基因序列/94的L-基因序列/00的M2-l蛋白的序列7/00的M2-l蛋白的序列/99的M2-l蛋白的序列/94的M2-l蛋白的序列/00的M2-l基因序列7/00的M2-l基因序列/99的M2-l基因序列/94的M2-l基因序列/00的M2-2蛋白的序列7/00的M2-2蛋白的序列/99的M2-2蛋白的序列/94的M2-2蛋白的序列/00的M2-2基因序列7/00的M2-2基因序列/99的M2-2基因序列/94的M2-2基因序列/00的M2基因序列7/00的M2基因序列/99的M2基因序列/94的M2基因序列/00的M蛋白的序列7/00的M蛋白的序列/99的M蛋白的序列/94的M蛋白的序列/00的M基因序列7/00的M基因序列,99的M基因序列/94的M基因序列/00的N蛋白的序列7/00的N蛋白的序列SEQIDNO:SEQIDNO:SEQID緣SEQIDNO:SEQID緣SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQID隐SEQIDNO:SEQIDNO:SEQIDNO:SEQID隐SEQIDNO:SEQIDNO:368HMPV369HMPV370HMPV371HMPV372HMPV373HMPV374HMPV375HMPV376HMPV377HMPV378HMPV379HMPV380HMPV381HMPV382HMPV383HMPV384HMPV385HMPV386HMPV387HMPV388HMPV389HMPV分离林NL/1/99的N蛋白的序列分离林NL/1/94的N蛋白的序列分离林NL/l/00的N基因序列分离林NL/17/00的N基因序列分离林NL/1/99的N基因序列分离林NL/1/94的N基因序列分离林NL/l/00的P蛋白的序列分离林NL/17/00的P蛋白的序列分离株NL/1/99的P蛋白的序列分离林NL/1/94的P蛋白的序列分离林NL/1/00的P基因序列分离林NL/17/00的P基因序列分离林NL/1/99的P基因序列分离林NL/1/94的P基因序列分离林NL/1/00的SH蛋白的序列分离林NL/17/00的SH蛋白的序列分离株NL/1/99的SH蛋白的序列分离株NL/l/94的SH蛋白的序列分离林NL/1/00的SH基因序列分离林NL/17/00的SH基因序列分离林NL/1/99的SH基因序列分离林NL/1/94的SH基因序列国际申请号PCT/__微生物与说明书'第—页第—行提及的微生物有关的任选页_保藏证明另外的保藏在附页3上证明__保藏机构名称4AmericanTypeCultureCollection保藏机构地址(包括邮编和国家)410801UniversityBlvd.Manassas,VA20110-2209US___保藏日期62001年1月19日_登记号81-2614_B.附加指示7(如果不适用则保持空白)。该信息在单独的附页上继续C.关于做出指示的指定国(如果指示不是所有指定国)D.指示的单独(如果不适用则保持空白)__下面做出的指示将在以后提交给国际局(详细说明指示的一般性质例如"保藏登记号")___E.该页是在提交时与国际申请一起收到的(由接收办公室检查)(授权官员)国际局收到的日期(从申请人)19是__(授权官员)_____PCT/RO/134表(1982年1月)权利要求1.制备间质肺病毒(MPV)的方法，所述方法包括a)向表达异源RNA聚合酶的宿主细胞内引入包含MPV的cDNA的DNA分子，其中所述DNA分子是通过异源RNA聚合酶转录的；和b)分离出由宿主细胞产生的病毒。2.制备间质肺病毒的方法，所述方法包括a)向表达T7RNA聚合酶的宿主细胞内引入包含MPV的cDNA的DNA分子，其中所述DNA分子是通过T7RNA聚合酶转录的；和b)分离出由宿主细胞产生的病毒。3.制备间质肺病毒的方法，所述方法包括(a)向表达poll和polll聚合酶的宿主细胞内引入在正方向上包含MPV的cDNA的DNA分子，其中所述DNA分子是通过poll聚合酶转录的；和(b)分离出由宿主细胞产生的病毒。4.权利要求l、2或3的方法，其中所述方法还包括向表达polI和polII聚合酶的宿主细胞内引入一个或多个与转录调节序列可操纵地连接的编码病毒N、P和L蛋白的DNA分子。5.权利要求l、2或3的方法，其中所述间质肺病毒是哺乳动物间质肺病毒。6.权利要求l、2或3的方法，其中所述间质肺病毒是人间质肺病毒。7.权利要求1、2或3的方法，其中所述宿主细胞还包含编码M2-l的DNA分子。8.权利要求1、2或3的方法，其中所述宿主细胞是BHK细胞系。9.权利要求l、2或3的方法，其中所述宿主细胞是293T细胞。10.权利要求l、2或3的方法，其中所述宿主细胞Vero细胞。11.制备病毒的方法，所述方法包括向宿主细胞内引入一个或多个与转录调节序列可操纵地连接的编码病毒N、P和L蛋白的DNA分子，其中所述N、P和L蛋白来自不是欲拯救的病毒物种的病毒物12.—种分离的哺乳动物间质肺病毒，其中所述哺乳动物间质肺病毒是负链单链RNA病毒，该病毒属于副粘病毒科肺病毒亚科，并且其中所述哺乳动物间质肺病毒在系统发育学上与巴黎CNCM中保藏号为1-2614的病毒分离林的相关程度比其与火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)的相关程度更密切，其中(i)所述病毒的至少一个区域被不同的哺乳动物间质肺病毒分离林的类似区域替换；或者(ii)其中所述病毒的至少一个区域缺失；或者(iii)所述病毒的至少一个区域被不同的哺乳动物间质肺病毒分离林的类似区域替换，并且所述病毒的至少一个区域缺失。13.权利要求12的病毒，其中所述区域的长度为至少3个核苷酸，至少5个核苷酸(nt)，至少10个nt，至少25个nt，至少50个nt,至少75个nt，至少100个nt，至少250个nt，至少500个nt，至少750个nt，至少1kb，至少1.5kb，至少2kb，至少2.5kb，至少3kb，至少4kb，或者至少5kb。14.权利要求12的病毒，其中所述区域是N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2-基因、M2-lORF、M2-2ORF、SH-基因、G-基因、L-基因、前导区、尾随区或非编码区的片段。15.权利要求12的病毒，其中所述区域是N-基因、P-基因、M-基因、F-基因、M2隱基因、M2隱lORF、M2-2ORF、SH-基因、G画基因、L-基因、前导区、尾随区或非编码区。16.权利要求12、13或14的病毒，其中所述病毒是减毒的。17.—种减毒的hMPV，其中所述病毒包含至少一个基因修饰，所述修饰导致在一个或多个下列氨基酸位置上发生至少一个改变在F蛋白的氨基酸位置99-102上的RQSR;在L蛋白的氨基酸位置456上的Phe;在L蛋白的氨基酸位置749上的Glu;在L蛋白的氨基酸位置1246上的Tyr;在L蛋白的氨基酸位置1094上的Met;和在L蛋白的氨基酸位置746上的Lys。18.权利要求17的减毒的病毒，其中所述基因修饰是缺失、替换或添加。19.权利要求17的减毒的病毒，其中至少一个基因改变是每个密码子发生2或3个核苷酸替换或缺失。20.—种减毒的哺乳动物间质肺病毒，其中所述哺乳动物间质肺病毒基因组中的至少一个开放读框的位置已经被改变。21.权利要求20的减毒的哺乳动物间质肺病毒，其中所述开放读框编码N蛋白；P蛋白；M蛋白；F蛋白；M2蛋白；SH蛋白；G蛋白或L蛋白。22.繁殖病毒的方法，其中所述方法包括将用病毒感染的细胞在低于该细胞的最佳生长温度的温度下培养。23.繁殖病毒的方法，其中所述方法包括(i)在用病毒感染之前，于第一温度下培养细胞；(ii)用病毒感染细胞；和(iii)用病毒感染细胞之后，在第二温度下培养细胞，其中所述第二温度低于所述第一温度。24.繁殖病毒的方法，其中所述方法包括将用病毒感染的细胞在没有血清存在的条件下培养。25.繁殖病毒的方法，其中所述方法包括(i)在用病毒感染之前，在血清存在下培养细胞；(ii)用病毒感染细胞；和(iii)用病毒感染细胞之后，在没有血清存在的条件下培养细胞。26.繁殖病毒的方法，其中所述方法包括在没有血清存在的条件下将用病毒感染的细胞在低于该细胞的最佳生长温度的温度下培养。27.权利要求22、23、24、25或26的方法，其中所述病毒是负链RNA病毒。28.权利要求22、23、24、25或26的方法，其中所述病毒是间质肺病毒。29.权利要求22、23、24、25或26的方法，其中所述病毒是哺乳动物间质肺病毒。30.权利要求22、23、24、25或26的方法，其中所述病毒是人间质肺病毒。31.抑制细胞感染哺乳动物间质肺病毒的方法，所述方法包括将细胞与七氨基酸重复肽接触，其中所述七氨基酸重复肽与哺乳动物间质肺病毒的HR具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或至少99.5%的序列同一性。32.预防、治疗或控制哺乳动物感染哺乳动物间质肺病毒的方法，所述方法包括给哺乳动物施用治疗有效量的七氨基酸重复肽，其中所述七氨基酸重复肽与哺乳动物间质肺病毒的HR具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%或至少99.5%的序列同一性。33.权利要求31或32的方法，其中所述七氨基酸重复肽是HRA、HRB或其组合。34.权利要求31或32的方法，其中所述哺乳动物间质肺病毒是人类间质肺病毒。35.检测样本中哺乳动物间质肺病毒的方法，其中所述方法包括将样本与第一种核酸接触，所述第一种核酸能够在严格杂交条件下与所选择的第二种核酸杂交，其中所述第二种核酸序列是SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21。36.检测样本中哺乳动物间质肺病毒的方法，其中所述方法包括将样本与第一种核酸接触，所述第一种核酸能够在严格杂交条件下与编码一种蛋白的第二种核酸杂交，其中所述蛋白序列是SEQIDNO:322、SEQIDNO:366、SEQIDNO:374、SEQIDNO:358、SEQIDNO314、SEQID綠338、SEQIDNO:346、SEQIDNO:382、SEQIDNO330、SEQID緣325、SEQIDNO:369、SEQIDNO:377、SEQIDNO361、SEQIDNO:317、SEQIDNO:341、SEQIDNO:349、SEQIDNO385、SEQIDNO:333、SEQIDNO:323、SEQIDNO:367、SEQIDNO375、SEQIDNO:359、SEQIDNO:315、SEQIDNO:339、SEQIDNO347、SEQIDNO:383、SEQID緣331、SEQIDNO:324、SEQIDNO368、SEQIDNO:376、SEQIDNO:360、SEQIDNO:316、SEQIDNO340、SEQIDNO:348、SEQIDNO:384或SEQIDNO:332。37.检测样本中哺乳动物间质肺病毒的方法，其中所述方法包括将样本与第一种核酸接触，所述第一种核酸能够在严格杂交条件下与编码一种蛋白的第二种核酸杂交，其中所述蛋白与SEQIDNO:366具有至少90%的序列同一性；与SEQIDNO:374具有至少70%的序列同一性；与SEQIDNO:358具有至少90%的序列同一性；与SEQIDNO:314具有至少82%的序列同一性；与SEQIDNO:338具有至少85%的序列同一性；与SEQIDNO:346具有至少60%的序列同一性；与SEQIDNO:330具有至少85%的序列同一性；与SEQIDNO:322具有至少20%的序列同一性；与SEQIDNO:382具有至少30°/。的序列同一性。38.权利要求36或37的方法，其中所述第一种核酸能够特异性地与hMPV的Al、Bl、A2或B2亚型的基因组杂交。39.权利要求36或37的方法，其中所述第一种核酸的长度是至少12、至少15、至少20或至少25个核苷酸。40.检测样本中哺乳动物间质肺病毒的方法，其中所述方法包括将样本与抗体或其片段接触，所述抗体或其片段能够特异性地识别蛋白或蛋白的片段，其中所述蛋白序列是SEQIDNO:374、SEQIDNO:358、SEQIDNO:314、SEQIDNO:338、SEQIDNO:346、SEQIDNO:330、SEQIDNO:322、SEQIDNO:382、SEQIDNO:366、SEQIDNO:324、SEQIDNO:368、SEQIDNO:376、SEQIDNO:360、SEQIDNO:316、SEQIDNO:340、SEQIDNO:348、SEQIDNO:384、SEQIDNO:332、SEQIDNO:325、SEQDNO:369、SEQIDNO:377、SEQIDNO:361、SEQIDNO:317、SEQIDNO:341、SEQIDNO:349、SEQIDNO:385、SEQIDNO:333、SEQIDNO:323、SEQIIDNO:367、SEQIDNO:375、SEQIDNO:359、SEQIDNO:315、SEQIDNO:339、SEQIDNO:347、SEQIDNO:383或SEQIDNO:331。41.检测样本中哺乳动物间质肺病毒的方法，其中所述方法包括将样本与抗体或其片段接触，所述抗体或其片段能够特异性地识别蛋白或蛋白的片段，其中所述蛋白或蛋白的片段与SEQIDNO:374具有至少70%的序列同一性；与SEQIDNO:358具有至少90%的序列同一性；与SEQIDNO:314具有至少82%的序列同一性；与SEQIDNO:338具有至少85%的序列同一性；与SEQIDNO:346具有至少60%的序列同一性；与SEQIDNO:330具有至少85/的序列同一性；与SEQIDNO:322具有至少20%的序列同一性；与SEQIDNO:382具有至少30%的序列同一性；与SEQIDNO:366具有至少90%的序列同一性。42.利用血清学诊断哺乳动物中感染MPV的方法，其中所述方法包括通过将下述样本与蛋白或蛋白的片段反应，来检测来自所述哺乳动物的样本中抗体或其片段的存在，所述抗体或其片段能够特异性对抗MPV或其组分，其中所述病毒在系统发育学上与巴黎CNCM中保藏号为1-2614的病毒分离林的相关程度比其与火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)的相关程度更密切，其中所述蛋白或蛋白的片段与SEQIDNO:374具有至少70%的序列同一性；与SEQIDNO:358具有至少卯％的序列同一性；与SEQIDNO:314具有至少82%的序列同一性；与SEQIDNO:338具有至少85%的序列同一性；与SEQIDNO:346具有至少60。/o的序列同一性；与SEQIDNO:330具有至少85%的序列同一性；与SEQIDNO:322具有至少20%的序列同一性；与SEQIDNO:382具有至少30%的序列同一性；与SEQIDNO:366具有至少90%的序列同一性。43.利用血清学诊断哺乳动物中感染MPV的方法，其中所述方法包括通过将下述样本与MPV或其组分反应，来检测来自所述哺乳动物的样本中抗体或其片段的存在，所述抗体或其片段能够特异性对抗MPV或其组分，其中所述病毒在系统发育学上与巴黎CNCM中保藏号为1-2614的病毒分离抹的相关程度比其与火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)的相关程度更密切。44.检测样本中哺乳动物MPV变种Bl的方法，其中所述方法包括将样本与第一种核酸接触，所述第一种核酸能够在严格条件下与编码一种蛋白的第二种核酸杂交，所述蛋白包含(i)与哺乳动物MPV变种Bl的G蛋白(SEQIDNO:324)具有至少66%序列同一性的氨基酸序列；(ii)与哺乳动物MPV变种Bl的N蛋白(SEQIDNO:368)具有至少98.5%序列同一性的氨基酸序列；(iii)与哺乳动物MPV变种Bl的P蛋白(SEQIDNO:376)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(iv)与哺乳动物MPV变种Bl的M蛋白(SEQIDNO:360)相同的氨基酸序列；(v)与哺乳动物MPV变种Bl的F蛋白(SEQIDNO:316)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(vi)与哺乳动物MPV变种Bl的M2-l蛋白(SEQIDNO:340)具有至少98%序列同一性的氨基酸序列；(vii)与哺乳动物MPV变种Bl的M2-2蛋白(SEQIDNO:348)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(viii)与哺乳动物MPV变种Bl的SH蛋白(SEQIDNO:384)具有至少83%序列同一性的氨基酸序列；或(ix)与哺乳动物MPV变种Bl的L蛋白(SEQIDNO:332)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列。45.检测样本中哺乳动物MPV变种Al的方法，其中所述方法包括将样本与第一种核酸接触，所述第一种核酸能够在严格条件下与编码一种蛋白的第二种核酸杂交，所述蛋白包含(i)与哺乳动物MPV变种Al的G蛋白(SEQIDNO:322)具有至少66%序列同一性的氨基酸序列；(ii)与哺乳动物MPV变种Al的N蛋白(SEQIDNO:366)具有至少99.5%序列同一性的氨基酸序列；(iii)与哺乳动物MPV变种Al的P蛋白(SEQIDNO:374)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(iv)与哺乳动物MPV变种Al的M蛋白(SEQIDNO:358)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(v)与哺乳动物MPV变种Al的F蛋白(SEQIDNO:314)具有至少98%序列同一性的氨基酸序列；(vi)与哺乳动物MPV变种Al的M2-l蛋白(SEQIDNO:338)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(vii)与哺乳动物MPV变种Al的M2-2蛋白(SEQIDNO:346)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(viii)与哺乳动物MPV变种Al的SH蛋白(SEQIDNO:382)具有至少84%序列同一性的氨基酸序列；或(ix)与哺乳动物MPV变种Al的L蛋白(SEQIDNO:330)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列。46.检测样本中哺乳动物MPV变种B2的方法，其中所述方法包括将样本与第一种核酸接触，所述第一种核酸能够在严格条件下与编码一种蛋白的第二种核酸杂交，所述蛋白包含(i)与哺乳动物MPV变种B2的G蛋白(SEQIDNO:325)具有至少66%序列同一性的氨基酸序列；(ii)与哺乳动物MPV变种B2的N蛋白(SEQIDNO:369)具有至少97%序列同一性的氨基酸序列；(iii)与哺乳动物MPV变种B2的P蛋白(SEQIDNO:377)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(iv)与哺乳动物MPV变种B2的M蛋白(SEQIDNO:361)相同的氨基酸序列；(v)与哺乳动物MPV变种B2的F蛋白(SEQIDNO:317)具有至少99/序列同一性的氨基酸序列；(vi)与哺乳动物MPV变种B2的M2-l蛋白(SEQIDNO:341)具有至少98%序列同一性的氨基酸序列；(vii)与哺乳动物MPV变种B2的M2-2蛋白(SEQIDNO:349)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(viii)与哺乳动物MPV变种B2的SH蛋白(SEQIDNO:385)具有至少84%序列同一性的氨基酸序列；或(ix)与哺乳动物MPV变种B2的L蛋白(SEQIDNO:333)具有至少99/。序列同一性的氨基酸序列。47.检测样本中哺乳动物MPV变种A2的方法，其中所述方法包括将样本与第一种核酸接触，所述第一种核酸能够在严格条件下与编码一种蛋白的第二种核酸杂交，所述蛋白包含(i)与哺乳动物MPV变种A2的G蛋白(SEQIDNO:323)具有至少66%序列同一性的氨基酸序列；(ii)与哺乳动物MPV变种A2的N蛋白(SEQIDNO:367)具有至少99.5%序列同一性的氨基酸序列；(iii)与哺乳动物MPV变种A2的P蛋白(SEQIDNO:375)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(iv)与哺乳动物MPV变种A2的M蛋白(SEQIDNO:359)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(v)与哺乳动物MPV变种A2的F蛋白(SEQIDNO:315)具有至少98%序列同一性的氨基酸序列；(vi)与哺乳动物MPV变种A2的M2-l蛋白(SEQIDNO:339)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(vii)与哺乳动物MPV变种A2的M2-2蛋白(SEQIDNO:347)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(viii)与哺乳动物MPV变种A2的SH蛋白(SEQIDNO:383)具有至少84%序列同一性的氨基酸序列；或(ix)与哺乳动物MPV变种A2的L蛋白(SEQIDNO:331)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列。48.权利要求44、45、46或47中任一项的方法，其中所述第一种核苷酸的长度为至少12、至少15、至少20或至少25个核苷酸。49.检测样本中哺乳动物MPV变种Bl的方法，其中所述方法包括将样本与一种抗体接触，其中所述抗体能够与由下列氨基酸序列组成的蛋白特异性地结合(i)与哺乳动物MPV变种Bl的G蛋白(SEQIDNO:324)具有至少66%序列同一性的氨基酸序列；(ii)与哺乳动物MPV变种Bl的N蛋白(SEQIDNO:368)具有至少98.5%序列同一性的氨基酸序列；(iii)与哺乳动物MPV变种Bl的P蛋白(SEQIDNO:376)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(iv)与哺乳动物MPV变种Bl的M蛋白(SEQIDNO:360)相同的氨基酸序列；(v)与哺乳动物MPV变种Bl的F蛋白(SEQIDNO:316)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(vi)与哺乳动物MPV变种Bl的M2-l蛋白(SEQIDNO:340)具有至少98%序列同一性的氨基酸序列；(vii)与哺乳动物MPV变种Bl的M2-2蛋白(SEQIDNO:348)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(viii)与哺乳动物MPV变种Bl的SH蛋白(SEQIDNO:384)具有至少83%序列同一性的氨基酸序列；或(ix)与哺乳动物MPV变种Bl的L蛋白(SEQIDNO:332)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列。50.检测样本中哺乳动物MPV变种Al的方法，其中所述方法包括将样本与一种抗体接触，其中所述抗体能够与由下列氨基酸序列组成的蛋白特异性地结合(i)与哺乳动物MPV变种Al的G蛋白(SEQIDNO:322)具有至少66%序列同一性的氨基酸序列；(ii)与哺乳动物MPV变种Al的N蛋白(SEQIDNO:366)具有至少99.5%序列同一性的氨基酸序列；(iii)与哺乳动物MPV变种Al的P蛋白(SEQIDNO:374)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(iv)与哺乳动物MPV变种Al的M蛋白(SEQIDNO:358)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(v)与哺乳动物MPV变种Al的F蛋白(SEQIDNO:314)具有至少98%序列同一性的氨基酸序列；(vi)与哺乳动物MPV变种Al的M2-l蛋白(SEQIDNO:338)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(vii)与哺乳动物MPV变种Al的M2-2蛋白(SEQIDNO:346)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(viii)与哺乳动物MPV变种Al的SH蛋白(SEQIDNO:382)具有至少84%序列同一性的氨基酸序列；或(ix)与哺乳动物MPV变种Al的L蛋白(SEQIDNO:330)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列。51.检测样本中哺乳动物MPV变种B2的方法，其中所述方法包括将样本与一种抗体接触，其中所述抗体能够与由下列氨基酸序列组成的蛋白特异性地结合(i)与哺乳动物MPV变种B2的G蛋白(SEQIDNO:325)具有至少66%序列同一性的氨基酸序列；(ii)与哺乳动物MPV变种B2的N蛋白(SEQIDNO:369)具有至少97%序列同一性的氨基酸序列；(iii)与哺乳动物MPV变种B2的P蛋白(SEQIDNO:377)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(iv)与哺乳动物MPV变种B2的M蛋白(SEQIDNO:361)相同的氨基酸序列；(v)与哺乳动物MPV变种B2的F蛋白(SEQIDNO:317)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(vi)与哺乳动物MPV变种B2的M2-l蛋白(SEQIDNO:341)具有至少98%序列同一性的氨基酸序列；(vii)与哺乳动物MPV变种B2的M2-2蛋白(SEQIDNO:349)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(viii)与哺乳动物MPV变种B2的SH蛋白(SEQIDNO:385)具有至少84%序列同一性的氨基酸序列；或(ix)与哺乳动物MPV变种B2的L蛋白(SEQIDNO:333)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列。52.检测样本中哺乳动物MPV变种A2的方法，其中所述方法包括将样本与一种抗体接触，其中所述抗体能够与由下列氨基酸序列组成的蛋白特异性地结合(i)与哺乳动物MPV变种A2的G蛋白(SEQIDNO:323)具有至少66%序列同一性的氨基酸序列；(ii)与哺乳动物MPV变种A2的N蛋白(SEQIDNO:367)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(iii)与哺乳动物MPV变种A2的P蛋白(SEQIDNO:375)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(iv)与哺乳动物MPV变种A2的M蛋白(SEQIDNO:359)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(v)与哺乳动物MPV变种A2的F蛋白(SEQIDNO:315)具有至少98%序列同一性的氨基酸序列；(vi)与哺乳动物MPV变种A2的M2-l蛋白(SEQIDNO:339)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列；(vii)与哺乳动物MPV变种A2的M2-2蛋白(SEQIDNO:347)具有至少96%序列同一性的氨基酸序列；(viii)与哺乳动物MPV变种A2的SH蛋白(SEQIDNO:383)具有至少84%序列同一性的氨基酸序列；或(ix)与哺乳动物MPV变种A2的L蛋白(SEQIDNO:331)具有至少99%序列同一性的氨基酸序列。53.检测样本中MPV的方法，所述方法包括将样本与核酸或其片段接触，其中所述核酸是SEQIDNO:378、SEQIDNO:362、SEQIDNO:318、SEQIDNO:342、SEQIDNO:350、SEQIDNO:326、SEQIDNO:334、SEQIDNO:386、SEQIDNO:370、SEQIDNO:379、SEQIDNO:363、SEQIDNO:319、SEQIDNO:343、SEQIDNO:351、SEQIDNO:327、SEQIDNO:335、SEQIDNO:387、SEQIDNO:371、SEQIDNO:380、SEQIDNO:364、SEQIDNO:320、SEQIDNO:344、SEQIDNO:352、SEQIDNO:328、SEQIDNO:336、SEQIDNO:388、SEQIDNO:372、SEQIDNO:381、SEQIDNO:365、SEQIDNO:.321、SEQIDNO:345、SEQIDNO:353、SEQIDNO:329、SEQIDNO:337、SEQIDNO:389、SEQIDNO:373或SEQIDNO:357。54.检测样本中MPV的方法，所述方法包括将样本与核酸或其片段接触，其中所述核酸选自SEQIDNO:84-118;SEQIDNO:154-233;SEQIDNO:318-321;SEQIDNO:326-329;SEQIDNO:334-337;SEQIDNO:342-345;SEQIDNO:350-357;SEQIDNO:362-365;SEQIDNO:370-373;SEQIDNO:378-381;和SEQIDNO:386-389。55.权利要求53或54的方法，其中所述片段的长度为至少10、至少15、至少20、至少25、至少50、至少75、至少100、至少150、至少250、至少500、至少750或至少1000个核苷酸。56.检测样本中哺乳动物间质肺病毒的方法，所述方法包括(i)将样本与细胞接触，所述细胞包含编码报道基因的微复制子；和(ii)检测报道基因的表达。57.权利要求56的方法，其中所述微复制子被包装到在细胞中扩增的哺乳动物间质肺病毒的病毒颗粒内。58.权利要求56的方法，其中所述报道基因的表达在哺乳动物间质肺病毒存下被刺激。59.检测样本中哺乳动物间质肺病毒的方法，其中所述方法包括将样本与第一种核酸和第二种核酸接触，所述第一种核酸和第二种核酸分别能够在严格杂交条件下与第三种核酸杂交，其中所述第三种核酸是SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20和SEQIDNO:21，或其片段。60.检测样本中哺乳动物间质肺病毒的方法，所述方法包括a)将样本与第一种核酸接触，所述第一种核酸能够特异性地与SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21杂交；和b)将mpv核酸的片段从笫一种核酸序列杂交的位点扩增，其中所述片段在其整个长度上与SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21具有至少89%、至少95%、至少98%、至少99%的序列同一性；与SEQIDNO:366具有至少90%的序列同一性；与SEQIDNO:374具有至少70%的序列同一性；与SEQIDNO:358具有至少90%的序列同一性；与SEQIDNO:314具有至少82%的序列同一性；与SEQIDNO:338具有至少85%的序列同一性；与SEQIDNO:346具有至少60%的序列同一性；与SEQIDNO:330具有至少85%的序列同一性；与SEQIDNO:322具有至少20%的序列同一性；或与SEQIDNO:382具有至少30%的序列同一性。61.权利要求60的方法，其中所述片段在其整个长度上与SEQIDNO:366;SEQIDNO:374;SEQIDNO:358;SEQIDNO:314;SEQIDNO:338;SEQIDNO:346;SEQIDNO:330;SEQIDNO:322;或SEQIDNO:382具有至少卯％、95%、98%、99%、99.5%或100%的序列同一性。62.权利要求60的方法，其中所述第一种核酸的长度为至少10、至少12、至少15、至少20或至少25个核苷酸。63.权利要求60的方法，其中所述片段的长度为至少10、至少12、至少15、至少20、至少25、至少50、至少75、至少100、至少150、至少250、至少500或至少1000个核苷酸。64.权利要求60的方法，其中所述第一种核酸包含选自SEQIDNOs:22-83的核酸序列。65.权利要求60的方法，其中(i)将能够与SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20或SEQIDNO:21特异性地杂交的第二种核酸与所述样本接触；(ii)所述第一种和第二种核酸分别能够在严格杂交条件下，在其至少50个核苷酸内，至少100个核苦酸内，至少200个核苷酸内，至少300个核苦酸内，或者至少400个核苦酸内，至少500个核苷酸内，至少1000个核苷酸内，2000个核苦酸内，至少3000个核苷酸内，或者至少4000个核苷酸内，与第三种核酸序列杂交，其中所述第三种核酸序列选自SEQIDNO:18，SEQIDNO:19，SEQIDNO:20，SEQIDNO:21，SEQIDNO:84-118;SEQIDNO:154-233;SEQIDNO:318-321;SEQIDNO:326-329;SEQIDNO:334-337;SEQIDNO:342-345;SEQIDNO:350-357;SEQIDNO:362-365;SEQIDNO:370-373;SEQIDNO:378-381;和SEQIDNO:386-389。66.权利要求60的方法，其中所述方法还包括检测扩增的片段。67.诊断哺乳动物感染MPV的方法，所述方法包括通过将样本与能够特异性地识别选自F、L、N、M、P、M2、G和SH的MPV蛋白的抗体接触来确定所述哺乳动物的样本中MPV或其组分的存在。68.诊断人感染MPV的方法，所述方法包括通过将样本与能够特异性地识别选自F、L、N、M、P、M2、G和SH的hMPV蛋白的抗体接触来确定人的样本中MPV或其组分的存在。69.—种用于检测MPV的试剂盒，其中所述病毒在系统发育学上与巴黎CNCM中保藏号为1-2614的病毒分离林的相关程度比其与火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)的相关程度更密切，所述试剂盒在一个或多个容器中包含蛋白，所述蛋白与SEQIDNO:366具有至少90%的序列同一性；与SEQIDNO:374具有至少70%的序列同一性；与SEQIDNO:358具有至少90%的序列同一性；与SEQIDNO:314具有至少82%的序列同一性；与SEQIDNO:338具有至少85%的序列同一性；与SEQIDNO:346具有至少60%的序列同一性；与SEQIDNO:330具有至少85%的序列同一性；与SEQIDNO:322具有至少20%的序列同一性；与SEQIDNO:382具有至少30。/o的序列同一性。70.权利要求69的试剂盒，其中所述药盒还包括用于检测所述蛋白的工具。71.—种用于检测MPV的试剂盒，其中所述病毒在系统发育学上与巴黎CNCM中保藏号为1-2614的病毒分离林的相关程度比其与火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)的相关程度更密切，所述试剂盒在一个或多个容器中包含抗体，其中所述抗体与一种蛋白特异性地结合，所述蛋白与SEQIDNO:366具有至少90%的序列同一性；与SEQIDNO:374具有至少70%的序列同一性；与SEQIDNO:358具有至少90%的序列同一性；与SEQIDNO:314具有至少82%的序列同一性；与SEQIDNO:338具有至少85%的序列同一性；与SEQIDNO:346具有至少60%的序列同一性；与SEQIDNO:330具有至少85%的序列同一性；与SEQIDNO:322具有至少20%的序列同一性；与SEQIDNO:382具有至少30%的序列同一性。72.权利要求71的试剂盒，其中所述药盒还包括用于检测所述抗体的工具。73.—种用于检测MPV的试剂盒，其中所述病毒在系统发育学上与巴黎CNCM中保藏号为1-2614的病毒分离林的相关程度比其与火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)的相关程度更密切，所述试剂盒在一个或多个容器中包含核酸或其片段，其中所述核酸编码一种蛋白，所述蛋白与SEQIDNO:366具有至少90%的序列同一性；与SEQIDNO:374具有至少70%的序列同一性；与SEQIDNO:358具有至少卯％的序列同一性；与SEQIDNO:314具有至少82°/。的序列同一性；与SEQIDNO:338具有至少85%的序列同一性；与SEQIDNO:346具有至少60%的序列同一性；与SEQIDNO:330具有至少85%的序列同一性；与SEQIDNO:322具有至少20%的序列同一性；与SEQIDNO:382具有至少30%的序列同一性。74.—种用于检测MPV的试剂盒，其中所述病毒在系统发育学上与巴黎CNCM中保藏号为1-2614的病毒分离林的相关程度比其与火鸡鼻气管炎病毒(TRTV)的相关程度更密切，所述试剂盒包含一种或多种核酸或其片段，其中所述核酸与选自下列的核酸具有至少卯％、至少95%、至少98%或至少99.5%的序列同一性SEQIDNO:378、SEQIDNO:362、SEQIDNO:318、SEQIDNO:342、SEQIDNO350、SEQIDNO:326、SEQIDNO:334、SEQIDNO:386、SEQIDNO370、SEQIDNO:379、SEQIDNO:363、SEQIDNO:319、SE(JIDNO343、SEQIDNO:351、SEQIDNO:327、SEQIDNO:335、SEQIDNO387、SEQIDNO:371、SEQIDNO:380、SEQIDNO:364、SE(JIDNO320、SEQIDNO:344、SEQID綠352、SEQIDNO:328、SEQIDNO336、SEQIDNO:388、SEQIDNO:372、SEQIDNO:381、SE(JIDNO365、SEQID綠321、SE(JIDNO:345、SEQIDNO:353、SEQIDNO329、SEQIDNO:337、SEQIDNO:389、SEQIDNO:373、SEQIDNO357、SEQIDNO:314和SEQIDNOs:22-83。75.权利要求73或74的试剂盒，其中所述试剂盒还包括用于检测核酸或其片段的工具。76.权利要求73的试剂盒，其中所迷片段的长度为至少10、至少15、至少20或至少25个核苷酸。全文摘要本发明提供了一种分离的哺乳动物负链RNA病毒，间质肺病毒(MPV)，该病毒属于副粘病毒科肺病毒亚科。本发明还提供了在系统发育学上鉴定为对应于或相关于间质肺病毒属的分离的哺乳动物负链RNA病毒，及其组分。具体而言，本发明提供了哺乳动物MPV，及其亚组和变种。本发明涉及哺乳动物间质肺病毒，特别是人间质肺病毒的不同分离株的基因组核苷酸序列。本发明涉及哺乳动物间质肺病毒不同分离株的序列信息用于诊断和治疗方法的用途。本发明涉及编码间质肺病毒基因组的核苷酸序列，或其部分，所述间质肺病毒包括哺乳动物和禽类间质肺病毒。本发明还包括由所述核苷酸序列编码的嵌合或重组病毒。本发明还涉及含有一个或多个非天然或异源序列的嵌合及重组哺乳动物MPV。本发明还涉及含有哺乳动物或禽类间质肺病毒的疫苗制剂，包括所述病毒的重组和嵌合形式。本发明的疫苗制剂包括多价疫苗，包括二价及三价疫苗制剂。本发明还提供了繁殖病毒的方法。文档编号A61K39/155GK101410519SQ200480017850公开日2009年4月15日申请日期2004年4月23日优先权日2003年4月25日发明者A·D·M·E·奥斯特豪斯,A·哈勒,B·G·范登霍根,R·A·M·福希耶,R·唐申请人:免疫医疗疫苗公司;维洛诺瓦蒂夫公司