组织保护性细胞因子受体复合物,用于鉴别组织保护性化合物的测定和其用途的制作方法

专利名称：组织保护性细胞因子受体复合物,用于鉴别组织保护性化合物的测定和其用途的制作方法
本申请要求享有2003年9月30日提交的共同未决的美国专利申请号10/676,694的优先权利益，后者根据35U.S.C.§119(e)要求享有2003年4月25日提交的美国临时专利申请号60/465,891的优先权利益，它们各自的完整内容在这里整体引作参考。
1.导言本发明涉及用于药物筛选/发现的靶向具有至少一个β共有(βc)受体(也称作CD131)和至少一个促红细胞生成素(EPO)受体的组织保护性细胞因子受体复合物的方法，和治疗或预防方法。更具体地，本发明涉及用于鉴别和筛选能调节组织保护性细胞因子受体复合物和组织保护性细胞因子受体复合物配体的相互作用的化合物的方法。本发明的方法还包括，使用能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物，例如通过本发明的筛选方法鉴别出的那些化合物，来治疗或预防疾病或障碍的方法。本发明还包括，使用能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物，例如通过本发明的筛选方法鉴别出的那些化合物，来增强可兴奋组织的功能的方法。
2.发明背景各方面的证据表明，促红细胞生成素作为细胞因子超家族的一个成员，起着重要的生理作用，这通过与促红细胞生成素受体(EPO-R)的相互作用来介导。这些作用包括，生成红细胞、发生有丝分裂、调节平滑肌和神经细胞中的钙流入量和影响中间代谢。
EPO-R是一种68kDa的蛋白，也是1型细胞因子受体家族的一部分。该家族包括白细胞介素(IL)-IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL9、IL11、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、白血病抑制因子(LIF)、睫状神经营养因子(CNTF)、血小板生成素、生长激素和促乳素的受体。由于它们的胞外域的同源性，这些受体聚集在一起。这些受体的保守的胞外域长约200个氨基酸，其含有4个在氨基末端区域的位置上保守的半胱氨酸残基(Cys294，Cys 283，Cys 248，Cys 238)和1个位于跨膜结构域附近的Trp-Ser-X-Trp-Ser基序。这4个半胱氨酸似乎对于受体的维持和结构完整性是至关重要的(Murray，1996，Harpers Biochemistry第24版，pp.524-526，Appilion & Lange，Ltd.；Caravella等，1996，ProteinStruct.Funct.Gen.24394-401；)。
跟1型细胞因子受体家族中的许多受体一样，EPO-R似乎由它的内源配体EPO的相互作用活化。二聚体中的第一个EPO-R以高亲和力结合EPO，而第二个EPO-R再以低亲和力结合到复合物上。EPO-R的二聚体化使与EPO-R结合的Jak2酪氨酸激酶紧密结合，包括它们的转磷酸作用。该活化导致几种蛋白的酪氨酸磷酸化，这随后活化几个不同的途径，例如磷脂酰肌醇(PI)3-激酶途径、Ras/MAP激酶途径和STAT途径。这些途径触发促红细胞生成素介导的生理功能(Kirito等，2002，Blood 99102-110；Livnah等，1999，Science283987-990；Naranda等，2002，Endocrinology 1432293-2302；Remy等，1999，Science 283990-993；和Yoshimura等，1996，TheOncol.1337-339)。
除了形成多聚体外，1型家族的许多成员能将3种不同的信号转导受体组分(gp130、β共有(βc受体)或IL2受体的γ亚基(γc受体))中的一个整合进它们的受体复合物中。例如，GM-CSF的受体复合物由GM-CSF受体、2个βc受体和GM-CSF配体组成。已知EPO-R会与βc受体形成复合物(见Yutaka等，1995，Bioch.Biophys.Res.Com.2081060-1066；Jubinsky等，1997，Blood 901867-1873；D’Andrea等，1998，J.Clin，Invest.1021951-1960)。但是，已经报道，这些复合物不能产生任何生理上相关的作用(Scott等，2000，Blood，961588-1590)。
3.概述本发明涉及用于药物筛选/发现的靶向“组织保护性细胞因子受体复合物”(下面定义的)，和实现体内组织保护或修复的方法，例如预防或治疗各种疾病、障碍和状况的方法，或提高人受试者或其他哺乳动物的可兴奋组织的功能的方法。本发明部分地基于申请人的发现，即EPO受体/βc受体复合物在可兴奋组织的保护中起作用。本文所述的实验证实了，EPO在能表达EPO受体和βc受体两者的野生型细胞中具有保护作用，即减少的细胞凋亡；但是，EPO对缺乏βc受体的细胞没有保护作用。在动物研究中，在野生型小鼠(其能表达2种受体)和βc受体敲除的小鼠(其不表达βc受体)中造成了缺血性脊髓损伤。施用氨甲酰基化的EPO(它是非促红细胞生成的，且不能结合EPO受体二聚体)，会在野生型小鼠中产生提高的恢复。但是，EPO和氨甲酰基化的EPO对βc受体敲除的小鼠的恢复都没有作用。这些结果证明，βc受体的表达对于实现组织保护性作用是必需的。
一方面，本发明涉及包含EPO受体和βc的组织保护性细胞因子受体复合物在无细胞的筛选测定中鉴别能结合组织保护性细胞因子受体复合物的化合物中的用途。在其他方面，本发明涉及包含EPO受体和βc的组织保护性细胞因子受体复合物在基于细胞的筛选测定中鉴别能调节(即增强或抑制)组织保护性细胞因子受体复合物的活性或表现出组织保护活性的化合物中的用途。在其他方面，本发明涉及包含EPO受体和βc的组织保护性细胞因子受体复合物在基于动物的筛选测定中鉴别能表现出依赖于组织保护性细胞因子受体复合物的组织保护活性的化合物中的用途。在另一个具体的方面，通过本发明的筛选方法鉴别出的化合物能调节组织保护性细胞因子受体复合物和其配体的相互作用，并表现出组织保护活性。在其他的实施方案中，本发明提供了治疗或预防疾病、障碍或状况的方法，其包括施用能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物。另一方面，本发明提供了通过施用能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物，来提高可兴奋细胞、组织或器官的功能的方法。
在本发明的筛选方法的某些实施方案中，在有和/或没有组织保护性细胞因子受体复合物(例如但不限于EPO)的配体存在的情况下，使实验化合物接触组织保护性细胞因子受体复合物。这样的测定可以用于鉴别能调节配体和组织保护性细胞因子受体复合物的相互作用的化合物。
无细胞测定可以用于鉴别能结合组织保护性细胞因子受体复合物的化合物。在这样的实施方案中，使组织保护性细胞因子受体复合物或这样的复合物的膜制剂接触实验化合物，并测量结合的指示。该测定可以是直接的结合测定，其中使化合物接触组织保护性细胞因子受体复合物。在竞争性结合测定中，使2种化合物(例如实验化合物和配体，或2种实验化合物)接触组织保护性细胞因子受体复合物，以确定2种化合物中的哪一种具有更大的结合亲和力。该测定可以是替换结合测定，其中使结合到复合物上的第一种化合物接触组织保护性细胞因子受体复合物，并向测定中加入第二种化合物，以确定第二种化合物是否具有替换第一种结合的化合物的能力。在结合测定中，通过标记加入到测定中的化合物和/或标记组织保护性细胞因子受体复合物，可以测量结合。
基于细胞的测定可以用于在有和/或没有组织保护性细胞因子受体复合物的配体存在的情况下，鉴别靶向组织保护性细胞因子受体复合物的化合物。在这样的实施方案中，使能表达组织保护性细胞因子受体复合物的细胞接触实验化合物。为了确定实验化合物是否能调节细胞中的组织保护性细胞因子受体复合物的活性，观察或测量了读数。读数可以是对实验化合物与组织保护性细胞因子受体复合物的结合的简单测量。在某些实施方案中，标记了实验化合物，并通过检测附着到实验化合物上的标记，测量了标记的实验化合物与组织保护性细胞因子受体复合物的结合。在其他的实施方案中，读数是表型变化，例如细胞大小、形状或细胞凋亡的变化。在其他的实施方案中，读数是报告基因的表达或装载到细胞中的或包含在培养基中的指示染料的变化。在这样的实施方案中，在测定中采用的细胞是基因工程改造的，以在活化组织保护性细胞因子受体复合物后表达报告基因产物。在其他的实施方案中，通过细胞的酶促反应确定读数。在这样的实施方案中，在接触实验化合物后，裂解测定中使用的细胞。然后检查细胞裂解物中的活化组织保护性细胞因子受体复合物的指示剂。例如，可以使细胞裂解物暴露于能结合复合物的抗体，该抗体也能附着到锚定有复合物的支持体上。然后可以向测定中加入其他抗体，以检测是否已经活化了组织保护性细胞因子受体复合物。例如，抗-phosphotyrisine抗体可以结合复合物的磷酸化部分和/或EPO/β共有受体复合物的下游组分。在某些实施方案中，使用了能结合复合物的β共有受体部分的磷酸化部分的抗体和/或能结合EPO受体的磷酸化部分的抗体。在某些实施方案中，使能表达组织保护性细胞因子受体复合物的细胞接触能结合β共有受体和/或EPO受体的磷酸化部分的抗体。在某些实施方案中，使分离的组织保护性细胞因子受体复合物接触能结合β共有受体和/或EPO受体的磷酸化部分的抗体。在某些实施方案中，能结合EPO受体的磷酸化部分的抗体是PY-JAK2抗体。由于鉴别出了组织保护性细胞因子受体复合物的下游细胞因子活化靶，所以本发明的筛选方法的读数可以检测下游细胞组分的磷酸化。
下游细胞产物的存在可以用于鉴别靶向组织保护性细胞因子受体复合物的化合物。例如，使化合物接触能表达组织保护性细胞因子受体复合物的细胞后，可以检测细胞是否存在能指示组织保护性细胞因子受体复合物的活化的其他细胞产物，例如核仁素或神经珠蛋白(neuroglobin)。
在本发明的筛选方法的某些实施方案中，细胞是重组工程改造的，以表达至少一种EPO受体或β共有受体。在某些实施方案中，细胞是基因工程改造的，以超表达包含能编码β共有受体多肽或EPO受体多肽的核苷酸序列的核酸。在某些实施方案中，细胞是基因工程改造的，以超表达包含能编码β共有受体多肽的核苷酸序列的核酸和包含能编码EPO受体多肽的核苷酸序列的核酸。通过将核酸可操作地连接到启动子上，可以实现超表达；通过标准转化技术、定向同源重组，以实现内源基因的基因活化，或随机整合和选择具有活化的基因的细胞，可以实现基因工程改造。在某些实施方案中，核苷酸序列源自与细胞相同的物种。在某些实施方案中，细胞能内源地表达β共有受体和/或EPO受体。
在一个实施方案中，本发明提供了用于鉴别能调节β共有受体敲除的细胞中的组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物的方法，包括给第一种细胞施用化合物，随后立即用有害试剂处理细胞，其中第一种细胞能内源地表达组织保护性细胞因子受体复合物，并给第二种细胞施用化合物，随后立即用与第一种细胞相同的有害试剂处理细胞，其中第二种细胞与第一种细胞是相同类型，但是在组织保护性细胞因子受体复合物的表达中有缺陷(即缺乏β共有受体的表达)，从而如果第一种细胞与第二种细胞相比，存在细胞存活率差异，那么该化合物是靶向组织保护性细胞因子受体复合物的化合物。在一个实施方案中，细胞源自β共有受体敲除的动物。
可以在动物模型中进行测定，以鉴别靶向组织保护性细胞因子受体复合物的化合物。在一个实施方案中，本发明提供了用于鉴别能调节哺乳动物中的组织保护活性的化合物的方法，包括在造成损伤后，立即将化合物施用给第一种动物，其中第一种动物能内源地表达组织保护性细胞因子受体复合物，并在造成与第一种动物相同类型的损伤后，立即将化合物施用给第二种动物，其中第二种动物在表达组织保护性细胞因子受体复合物中有缺陷，从而如果第一种动物与第二种动物相比，存在损伤恢复的差异，那么则鉴别出了可以调节组织保护活性的化合物。
能表达可以在本发明的筛选方法中使用的组织保护性细胞因子受体复合物的细胞包括但不限于哺乳动物、昆虫、真核生物、原核生物、真菌或细菌的细胞。在某些实施方案中，使用人细胞，例如但不限于前B细胞、293细胞、293T细胞、HeLa细胞、HepG2细胞、K562细胞或3T3细胞。在其他的实施方案中，使用了小鼠细胞，例如但不限于BaF3细胞。在其他的实施方案中，使用了真菌细胞，例如但不限于来自糖酵母属(Saccharomyces)、裂殖糖酵母属(Schizosaccharomyces)、毕赤氏酵母属(Pichia)和汉逊氏酵母属(Hansenula)的细胞。
根据本发明的另一个方面，提供了治疗或预防人的疾病或障碍的方法，其包括给需要这样的治疗或预防的人施用治疗有效量的能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物。在某些实施方案中，疾病或障碍是属于或影响可兴奋组织的疾病或障碍。
在一个实施方案中，本发明提供了增强人的可兴奋细胞、组织或器官的功能的方法，包括给有所述需要的人施用治疗有效量的能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物，其中所述的增强可兴奋细胞、组织或器官的功能，会增强联想学习或记忆。
在另一个实施方案中，本发明提供了调节人的组织保护性细胞因子受体复合物的活性的方法，包括给需要这样的治疗或预防的人施用能调节所述复合物的活性的化合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了治疗或预防人的疾病或障碍的方法，包含调节人的组织保护性细胞因子受体复合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了增强人的可兴奋细胞、组织或器官的功能的方法，其包括调节人的组织保护性细胞因子受体复合物。
在本发明的用于治疗或预防疾病或障碍、增强可兴奋细胞、组织或器官的功能、或调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的实施方案中，可以通过本文上面所述的用于鉴别具有组织保护性作用或能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物的筛选方法中的任一种，鉴别出施用的化合物。在有关的实施方案中，化合物是对组织保护性细胞因子受体复合物特异性的抗体。在有关的实施方案中，化合物是对组织保护性细胞因子受体复合物配体特异性的抗体。在有关的实施方案中，化合物是小分子、肽或文库中的成员。在有关的实施方案中，化合物能结合组织保护性细胞因子受体复合物。在有关的实施方案中，化合物能增强组织保护性细胞因子受体复合物的活性。在有关的实施方案中，化合物能妨碍组织保护性细胞因子受体复合物的活性。在有关的实施方案中，化合物与EPO结合施用。在某些实施方案中，施用的化合物是EPO。在某些实施方案中，施用的化合物不是EPO。在有关的实施方案中，施用的化合物不是修饰的EPO或EPO突变体。修饰的EPO和突变的EPO化合物的实例包括但不限于在5.4.1.1部分所述的那些。在本发明的某些实施方案中，其中施用的化合物是EPO、修饰的EPO或EPO衍生物，施用的化合物不能结合EPO受体。在本发明的有关实施方案中，其中施用的化合物是EPO、修饰的EPO或EPO衍生物，施用的化合物不能结合EPO受体二聚体。在本发明的用于治疗、预防、增强可兴奋组织的功能和调节组织保护性细胞因子受体复合物的方法的某些实施方案中，施用的化合物不是EPO，即，任意的EPO、修饰的EPO、突变的EPO或其衍生物。
在本发明的用于治疗或预防疾病、障碍或状况，增强可兴奋组织的功能或调节组织保护性细胞因子受体复合物的方法的某些其他实施方案中，施用的化合物不能结合EPO受体。在本发明的用于治疗或预防疾病、障碍或状况，增强可兴奋组织的功能或调节组织保护性细胞因子受体复合物的方法的某些其他实施方案中，施用的化合物不能结合由2个EPO受体组成的二聚体。在本发明的用于治疗或预防疾病、障碍或状况，增强可兴奋组织的功能或调节组织保护性细胞因子受体复合物的方法的某些其他实施方案中，施用的化合物能结合组织保护性细胞因子受体复合物。
在本发明的用于治疗或预防疾病或障碍的实施方案中，疾病或障碍是心境障碍、焦虑障碍、抑郁症、孤独症、注意力不集中的过度反应症、阿尔茨海默病、老化或认知功能障碍。在有关的实施方案中，疾病或障碍的成因是缺氧、癫痫发作病、神经变性病、神经毒素中毒、多发性硬化、低血压、心搏停止、辐射或低血糖。在有关的实施方案中，疾病或障碍是局部缺血或发作。在有关的实施方案中，疾病或障碍是神经变性状况。在有关的实施方案中，神经变性状况是发作、阿尔茨海默病、帕金森病、大脑性麻痹、脑或脊髓创伤、AIDS痴呆、与年龄有关的认知功能丧失、记忆丧失、肌萎缩性侧索硬化症、癫痫发作病、酒精中毒、视网膜缺血、老化、青光眼或神经元丧失。在其他有关的实施方案中，疾病或障碍是神经肌肉病或肌肉状况。在某些实施方案中，神经肌肉病或肌肉状况属于心脏组织。在本发明的用于治疗或预防疾病、障碍或状况，增强可兴奋组织的功能或调节组织保护性细胞因子受体复合物的方法的某些实施方案中，疾病、障碍、状况或可兴奋细胞、组织或器官不是大脑的。在本发明的用于治疗或预防疾病、障碍或状况，增强可兴奋组织的功能或调节组织保护性细胞因子受体复合物的方法的某些实施方案中，疾病、障碍、状况或可兴奋细胞、组织或器官不是中枢神经系统的，包括但不限于肾组织、心组织、内皮组织、视网膜组织、脉管组织、肺组织、胰组织、骨组织、皮肤组织、胚胎组织、胎儿组织、肾组织、横纹肌组织、肝组织、胃肠组织、生殖道组织或内分泌组织。
在本发明的用于增强可兴奋细胞、组织或器官的功能的实施方案中，可兴奋组织是中枢神经系统组织或外周神经系统组织。在某些实施方案中，外周神经系统组织是胎盘组织、视网膜组织或心组织。
在本发明的用于治疗或预防疾病或障碍，增强可兴奋细胞、组织或器官的功能，或调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的实施方案中，施用是经口的、局部的、颅内的、腔内的、吸入、鼻的、肠胃外的、静脉内的、外围地、动脉内的、皮下的、肌内的、腹膜内的、粘膜下的或皮内的施用。在有关的实施方案中，施用是在医学的或手术过程之前。在某些实施方案中，手术程序是肿瘤切除、动脉瘤修复或冠状动脉旁路手术。在本发明的某些实施方案中，医学过程是分娩或生育。
3.1术语如本文所使用的，术语“组织保护活性”是指抑制或延迟细胞、组织或器官的损伤或死亡的作用。组织保护活性可以是针对各种状况、疾病和细胞、器官和/或组织损伤的，例如，在5.5部分所述的那些。组织保护活性可以是对具有组织保护性细胞因子受体复合物的可兴奋组织、细胞和/或器官特异性的，例如但不限于中枢神经系统的组织。
如本文所使用的，术语“组织保护性细胞因子受体复合物”指包含至少一个促红细胞生成素受体和至少一个β共有受体的复合物。组织保护性细胞因子受体复合物可以含有多个促红细胞生成素受体和/或β共有受体，以及在本文5.1.3部分所述的其他种类的受体。
术语“组织保护性细胞因子受体复合物配体”指能结合组织保护性细胞因子受体复合物和通过已知的活化配体活化复合物或抑制活化的任意化合物。“组织保护性细胞因子受体复合物配体”可以是任意种类的化合物，例如但不限于蛋白、肽、小分子、有机分子或无机分子。组织保护性细胞因子受体复合物配体的非限制性的实例包括EPO，包括突变体、化学修饰、或其能结合组织保护性细胞因子受体复合物的片段。组织保护性细胞因子受体复合物配体的另一个实例是对该复合物特异性的抗体。
术语“预防疾病、障碍或状况”指使这样的疾病、障碍或状况延迟发作、阻碍发展、阻碍出现、避免、抑制或消除出现或降低发生率。术语“预防”的使用不是指，接受预防治疗的患者群中的所有患者都不再发展该预防针对的疾病、障碍或状况，而是指，该患者群会表现出疾病、障碍或状况发生率的降低。例如，许多流感疫苗在施用该疫苗的那些人中，对于预防流感不是100％有效的。预防也包括对可兴奋组织的保护。本领域的技术人员能容易地鉴别出能从预防疗法中获益的患者和情形，例如但不限于列入手术计划中的患者，处于遗传疾病、障碍或状况的危险中的患者，处于由环境因素造成的疾病、障碍或状况的危险中的患者，或处于特定疾病、障碍或状况的危险的群体中的一部分人，例如老年人、婴儿或免疫系统较弱的那些人，或具有疾病、障碍或状况的遗传或其他危险因素的那些患者。
在本发明的方法的上下文中，术语“与......结合施用”指在疾病、障碍或状况发作之前、与其同时和/或之后施用化合物。
4.附图简述

图1说明了EPO和氨甲酰基化的EPO之间的竞争测定的结果，该结果证实了氨甲酰基化的EPO不能结合EPO-R。
图2表明βc受体存在于大鼠脑膜中。
图3表明染色显示βc受体存在的大鼠脊髓组织。
图4是染色显示βc受体存在的大鼠脊髓组织的放大图。
图5显示了EPO-R和βc受体的共沉淀。
图6显示了组织保护性受体复合物的潜在构型。
图7显示了在有和没有EPO存在的情况下，从正常的和βc受体敲除的小鼠分离的心肌细胞(cardiomyocyte)的细胞凋亡。
图8显示了使用phosphotyrine(PY)-Jak2抗体，通过聚丙烯酰胺凝胶分离的细胞蛋白的蛋白印迹照片。顶部的凝胶表明，磷酸化的Jak2存在于用5nM和50nM浓度的EPO刺激的细胞中。底部的凝胶显示了进行的对照，其中剥离了膜，并用抗Jak2的抗体再次检测(reprobe)，以确认等量装载。
图9显示了能表达EPO受体的BaF3细胞的配体结合亲和图。对于与EPO受体配体EPO和氨甲酰基化的EPO相接触的能表达BaF3EPO受体的细胞，将以nM为单位的配体浓度(x-轴)相对于结合(cpm)(y-轴)作图。
图10显示了具有EPO受体的UT-7细胞膜的配体结合亲和图。对于与EPO受体配体EPO和氨甲酰基化的EPO相接触的能表达UT-7EPO受体的细胞膜，将以nM为单位的配体浓度(x-轴)相对于结合(cpm)(y-轴)作图。
图11显示了如下柱形图，即，在小鼠中施用对照(载体)、EPO、氨甲酰基化的EPO和脱唾液酸EPO(x-轴)后，11A，通过血细胞比容的百分比体积测得的血细胞比容(y-轴)；11B，测得的以mM浓度计的血红蛋白水平(y-轴)。
图12显示了SDS-PAGE凝胶的照片，103KD核仁素蛋白标有圆圈。
图13显示了BBB运动分数(y-轴)相对于在脊髓损伤后测量的以天表示的时间(x-轴)的图，其中在脊髓损伤后立即给5组小鼠(2组是野生型，3组是βc敲除的)施用了PBS、EPO或氨甲酰基化的EPO。在42天的损伤后时间段期间，施用了氨甲酰基化的EPO的野生型小鼠组表现出比所有其他组提高的运动分数。
图14显示了对于上面图13所述的5组，以曲线下面积(AUC)测得的临床严重性(y-轴)和小鼠组(x-轴)的柱形图。施用了氨甲酰基化的EPO的野生型小鼠组(柱1)表现出比所有其他组(柱2-5)显著增加的临床严重性值(即，更低的严重性)。
5.发明详述本发明涉及使用能介导组织保护性化合物的组织保护活性的异源多聚体受体复合物的方法。本发明提供了用于鉴别这样的组织保护性化合物的筛选方法，和这样的化合物在治疗或预防疾病、障碍或状况中的用途，或这样的化合物在用于增强可兴奋细胞、组织和器官的功能的方法中的用途。本发明还提供了通过施用能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物，例如但不限于通过本发明的筛选方法鉴别出的那些，来治疗或预防疾病、障碍或状况的方法。本发明还提供了通过施用能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物，例如但不限于通过本发明的筛选方法鉴别出的那些，来增强可兴奋细胞、组织或器官的功能的方法。本发明还提供了通过施用能调节或被靶向到组织保护性细胞因子受体复合物的化合物，来调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的方法。
本发明是基于发明人的发现的，即EPO受体能与可兴奋细胞和组织(例如脑、脊髓和心脏)内的βc受体形成复合物。该复合物由复合物内的至少一个EPO-R和至少一个βc受体组成。除了βc受体外，可以使用其他信号转导受体，包括但不限于γc受体和GP130，其他1型细胞因子(包括但不限于GM-CSF、IL-3、IL-5，等)受体的片段和部分，和孤儿受体，包括但不限于ROR1、NR6、HM74，等。本发明的筛选方法可以在用于鉴别能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物的测定中使用这样的组织保护性细胞因子受体复合物。这样的测定包括结合测定，其能鉴别出结合组织保护性细胞因子受体复合物或其配体的化合物。发明人的这一发现，提供了鉴别特别有效的用于治疗和预防疾病、障碍和状况以及增强可兴奋细胞、组织和器官的化合物的方法。
组织保护性细胞因子受体复合物的活化，会导致保护蛋白的生产的上调，所述的保护蛋白包括但不限于核仁素和珠蛋白，例如神经珠蛋白和细胞珠蛋白(组织珠蛋白(histoglobin))。在本文上面所述的本发明的方法的某些实施方案中，测定了组织保护活性，测定鉴别出的化合物的组织保护活性的步骤包括检测细胞中是否存在核仁素。
在本文所述的本发明的方法的某些实施方案中，测定了组织保护活性，测试鉴别出的化合物的组织保护活性的步骤包括检测或测量细胞中的增高水平的神经珠蛋白或细胞珠蛋白活性。因此，用于鉴别具有组织保护活性的化合物的筛选方法可以利用这样的上调蛋白的检测。
在测定中可以使用这样的组织保护性细胞因子受体复合物和下游调节剂，以鉴别组织保护性化合物，包括但不限于小分子和生物制品。使用这些测定鉴别出的化合物可以用于治疗多种中枢和外周神经系统状况以及其他可兴奋细胞、组织和器官的状况。
5.1组织保护性细胞因子受体复合物在本发明的方法中使用的受体复合物包含至少一个EPO受体和至少一个βc受体。可以组合各种类型的天然产生的、修饰的和/或突变的EPO受体和βc受体，以形成各种数目的受体的这种复合物。下面描述了组织保护性细胞因子受体复合物的非限制性的实例。
5.1.1EPO-R哺乳动物的EPO-R可以用于本发明中。已经从小鼠肝(Tojo等，1987，Biochem.Biophys.Res.Comm.148443-48)和人胎儿肝(Jones等，1990，Blood 7631-35；Winkelmann等，1990，Blood7624-30)中分离出了EPO-R cDNA。该人cDNA能编码约55kDa MW的多肽链，且具有约508个氨基酸。本发明还预期已经分离并测序的人EPO-R的其他基因组克隆(Penny和Forget，1991，Genomics11974-80；Noguchi等，1991，Blood 782548-2556)。这些EPO-R的共有结构由信号肽中的约24个氨基酸残基、胞外域中的约226个氨基酸、跨膜结构域中的约23个氨基酸和胞质结构域中的约235个氨基酸组成(D′Andrea和Zon，1990，J.Clin.Invest.，86681-687；Jones等，1990，Blood，7631-35；Penny和Forget，1991，Genomics，11974-80)。成熟的人EPO-R蛋白具有约484个氨基酸。EPO-R可以商业上从BD Biosciences Clonetech(Palo Alto，CA)得到，且具有gene bank登记号M60459和SwissProt登记号P19235。
在实施本发明时有用的EPO-R形式包括人和其他哺乳动物的EPO-R相关分子的天然产生的、合成的和重组的形式。另外，在实施本发明时有用的EPO-R形式包括代表着功能上等同的基因产物的蛋白。这种功能上等同的基因产物包括突变的EPO-R和化学修饰的EPO-R。突变的EPO-R可以含有缺失(包括内部缺失)、添加(包括生成融合蛋白的添加)、或在氨基酸序列内和/或临近氨基酸序列的氨基酸残基的保守取代，但是其会导致“沉默”变化，因为变化会生成功能上等同的EPO-R。在涉及的残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性的类似性的基础上，可以进行氨基酸取代。例如，非极性的(疏水的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；极性中性的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺；带正电荷的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸；和带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。本发明还包括其他已知的EPO-R突变，例如美国专利号5,292,654公开的那些。
另外，本发明的还预期应用只含有胞外域的EPO受体的可溶(截短的)形式，例如Harris等1992，J.Biol.Chem.26715205；Yang&Jones，1993，Blood 821713；和美国专利申请公开号20020031806公开的那些。
5.1.2βc受体一般地，将βc受体鉴定为与人GM-CSF、IL-3和IL-5结合的信号传导受体亚基。除了这些细胞因子外，已经证实了βc受体(例如Swiss登记号P32927或Genebank No.M59941)能在某些情况下结合EPO-R。βc受体的保守区构成了胞外配体-结合区的全部或部分。本发明部分地基于申请人证明EPO-R和βc受体共存于几种可兴奋细胞中，例如脑(见图2)和脊髓(见图3和4)。申请人还发现，EPO-R和βc受体的复合物在导致能表达这些复合物的组织的保护和修复生理过程的机制中起作用(见图13和14)。
在实施本发明时有用的βc受体的形式包括与人和其他哺乳动物的βc受体有关的分子的天然产生的、合成的和重组的形式。另外，在实施本发明时有用的βc受体形式包括代表着功能上等同的基因产物的蛋白。这样的功能上等同的基因产物可以包括突变的βc受体和化学修饰的βc受体。突变的βc受体可以含有缺失(包括内部缺失)、添加(包括生成融合蛋白的添加)、或在氨基酸序列内和/或临近氨基酸序列的氨基酸残基的保守取代，但是其会导致“沉默”变化，生成功能上等同的βc受体。突变的βc受体包括但不限于1374N、FIΔ、ΔGA、H544R、V449、A459D、L445Q、CRD4点突变(I374N、L356P、W358N、Q375P、Y376N、W383R和L399P)，和胞外截短(1GH7)。(见R.J.D′Andrea和T.J.Gonda，2000，Experimental Hematology28231-243；D′Andrea等，1998，J.Clin.Invest.1021951-1960；Jenkins等，1999，J.Biol.Chem.2748669-8677)。
同样预期，其他已知的信号传导受体亚基(包括但不限于γc受体和GP-130)和孤儿受体也可以用于本发明。
5.1.3异源多聚体受体复合物的结构βc受体会与许多以前已知它能结合的受体形成多聚体，即GM-CSF、IL-3和IL-5。例如，GM-CSF的受体复合物由GM-CSF受体、2个βc受体和GM-CSF配体组成。已经知道EPO-R会与βc受体形成复合物。(见Yutaka等，1995，Biochem.Biophy.Res.Com.2081060-1066；Jubinsky等，1997，Blood，901867-1873；D′Andrea等，1998，J.Clin，Invest.1021951-1960.)。类似地，根据本发明，βc受体会与EPO-R形成异源多聚体，以形成组织保护性受体复合物。这是基于免疫沉淀研究的，它证实了βc受体和EPO-R受体会共沉淀(见图5)。
该组织保护性受体复合物包含至少一个EPO-R和至少一个βc受体。优选地，如图6所示，组织保护性受体复合物包含超过一个βc受体。本发明还预期包含超过一个EPO-R的组织保护性受体复合物构型。本发明预期的组织保护性受体复合物的实例包括但不限于EPO-R2/βc受体2、EPO-R/βc受体2和EPO-R/βc受体3。组织保护性受体复合物的最建议的构型是如图6所示的EPO-R/βc受体2。如其中所示的，不受任何具体理论的约束，组织保护性化合物结合组织保护性受体复合物的可能的机理包括，组织保护性化合物首先结合EPO-R，随后2个βc受体结合该复合物。该描述仅仅解释了配体可以结合组织保护性受体复合物的一种方法，且本领域的普通技术人员能合理地预见到发生结合的其他机理——可以在结合配体前形成受体复合物(EPO-R和2个βc受体)，等。
根据常规技术，可以在基因工程改造的宿主细胞中生产出本发明的受体多肽，包括全长受体、受体片段(例如能结合配体的片段)和融合多肽。例如，已经鉴别出了EPO受体的促红细胞生成素结合片段(Barone等，J.Biol.Chem.2724985-4992)。在本发明的筛选方法中，可以使用这些的片段，其也能与βc受体复合。
5.2筛选测定可以在筛选测定中使用组织保护性细胞因子受体复合物，例如但不限于上述的那些，以鉴别具有组织保护活性的化合物。在这些测定中鉴别出的化合物可以调节复合物的活性，例如结合组织保护性细胞因子受体复合物，或调节组织保护性细胞因子受体复合物配体和复合物的相互作用。另外，鉴别出的化合物可以自身具有组织保护活性。
本发明特别适用于筛选化合物，其在众多药物筛选技术中的任一种中使用EPO受体-βc受体复合物。在这样的实验中采用的受体复合物可以是游离于溶液中、固定到固体支持体上、携带在细胞表面上或位于细胞内的。一种药物筛选方法使用稳定地转化了能表达多肽或片段的重组核酸的真核细胞。在竞争性结合测定中，筛选针对这种转化的细胞的药物。无论是活的还是固定的形式，这种细胞都可以用于标准结合测定。人们可以测量例如受体和受试试剂之间的复合物形成，或检测组织保护性细胞因子受体复合物和适当细胞系之间的复合物形成的减少，这是本领域熟知的。例如，见下面的实施例6和7部分。
在上面5.1部分所述的组织保护性细胞因子受体复合物可以类似地用于测定生物学活性的测定中，包括在对用于高通量筛选的多个受体的研究中，作为设计为用于定量测定生物流体中的组织保护性化合物水平的测定的试剂(包括标记的试剂)，作为能优选表达(组成性地或在组织分化或发育的特定阶段或在疾病状态)相应的组织保护性化合物的组织的标记，当然，也可以用于分离相关的配体。
本领域的技术人员熟知进行上述测定的方法。公开了这样的方法的参考文献包括但不限于“Molecular CloningA LaboratoryManual”，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis编，1989，和“Methods inEnzymologyGuide to Molecular Cloning Techniques”，AcademicPress，Berger，S.L.和A.R.Kimmel编，1987。
在某些实施方案中，本文所述的本发明的测定可以用于鉴别能与组织保护性细胞因子受体复合物相互作用的化合物。可以在没有组织保护性细胞因子受体复合物配体存在的情况下，进行这样的测定。相互作用可以是，例如，实验化合物与组织保护性细胞因子受体复合物的结合，或组织保护性细胞因子受体复合物的活性。在这样的实施方案中，使实验化合物接触组织保护性细胞因子受体复合物。鉴别出的化合物是能生成读数的，例如但不限于组织保护性细胞因子受体复合物的活化、报告基因的转录、细胞增殖或组织保护活性。一般地，用对照组进行这样的测定，其中化合物不接触组织保护性细胞因子受体复合物。当有和没有化合物时存在读数差异时，则鉴别出了能与组织保护性细胞因子受体复合物相互作用的化合物。或者，可以在使组织保护性细胞因子受体复合物接触实验化合物之前，测量标准的读数水平，例如但不限于组织保护性细胞因子受体复合物的活性，且在加入化合物之前和之后的读数差异，可以用于鉴别化合物。
在某些其他的实施方案中，本发明的测定可以用于鉴别能调节(即增强或妨碍)组织保护性细胞因子受体复合物配体和组织保护性细胞因子受体复合物之间的相互作用的化合物。可以在有组织保护性细胞因子受体复合物配体，例如EPO或对组织保护性细胞因子受体复合物特异性的抗体存在的情况下，进行这样的测定。在这样的实施方案中，可以检测出在有和没有实验化合物存在的情况下的读数水平的差异。然后，可以将读数水平与没有EPO存在的情况对比。如果有和没有化合物时的读数水平的差异依赖于EPO的存在，则鉴别出了能调节组织保护性细胞因子受体复合物和它的配体之间的相互作用的化合物。例如，如果在有化合物存在的情况下，读数的增加导致了检测出的读数水平的差异，其中该增加依赖于EPO的存在，则鉴别出了组织保护性细胞因子受体复合物和它的配体之间的相互作用的激动剂。或者，如果在有化合物存在的情况下，读数的降低导致了检测出的读数水平的差异，其中该降低依赖于EPO的存在，则鉴别出了组织保护性细胞因子受体复合物和它的配体之间的相互作用的拮抗剂。在读数是负读数的实施方案中，情况相反。例如，当化合物对组织保护性细胞因子受体复合物无作用时，存在读数，而当将具有这种作用的化合物整合进测定中时，则无读数，那么负读数可能意味着已经鉴别出了具有需要的作用的化合物。
能将任意或全部的使用组织保护性细胞因子受体复合物的测定开发成商业化的试剂级或试剂盒形式，作为研究和/或临床产品。
5.2.1无细胞测定本文所述的组织保护性细胞因子受体复合物可以用于无细胞测定中，以鉴别具有组织保护活性的化合物。在无细胞测定的某些实施方案中，组织保护性细胞因子受体复合物可以游离于溶液中或附着到固体支持体上。可以通过多种方式测量组织保护性细胞因子受体复合物的活性。例如，活性可以是化合物的结合组织保护性细胞因子受体复合物的能力，或组织保护性细胞因子受体复合物和化合物的结合亲和力。在某些实施方案中，以含有组织保护性细胞因子受体复合物的分离的膜的形式，将组织保护性细胞因子受体复合物加入结合测定中。
在一个实施方案中，本发明提供了用于鉴别能调节组织保护活性的化合物的方法，包括使实验化合物接触组织保护性细胞因子受体复合物，通过测量组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平，鉴别与在没有实验化合物存在的情况下测量的组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平相比，能增加或降低组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平的实验化合物，并测定鉴别出的实验化合物的组织保护活性。
在直接的结合测定中，在允许实验化合物结合配体或受体的条件下，使配体和/或组织保护性细胞因子受体复合物接触实验化合物。结合可以在溶液中或固体表面上进行。优选地，事先标记实验化合物，以用于检测。可以使用任意的可检测的化合物进行标记，例如但不限于发光剂、荧光剂或放射性同位素或含有它们的基团，或非同位素标记，例如酶或染料。温育足以发生结合的时间段后，使反应暴露于能去除过量的或非特异性地结合的实验化合物的条件和操作下。一般地，这包括用合适的缓冲液进行洗涤。最后，检测结合到实验化合物(例如EPO-实验化合物)上的配体或结合到实验化合物上的组织保护性细胞因子受体复合物的存在。
在竞争结合测定中，测定了实验化合物破坏或增强配体(例如EPO)与组织保护性细胞因子受体复合物结合的能力。可以将标记的配体(例如EPO或氨甲酰基化的EPO)与组织保护性细胞因子受体复合物或其片段混合，并在加入和不加入实验化合物的情况下，将其置于它们之间一般会发生相互作用的条件下。将能结合组织保护性细胞因子受体复合物的标记的配体(例如EPO)的量与在有或没有实验化合物存在的情况下结合的量进行对比。
在优选的实施方案中，为了促进复合物形成和检测，用固定化到固体表面上的一种或多种组分进行结合测定。在各种实施方案中，固体支持体可以是但不限于聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯聚乙烯、玻璃、硝基纤维素、葡聚糖、尼龙、聚丙烯酰胺和琼脂糖。支持体构型可以包括珠子、膜、微粒、反应容器(例如微量滴定板、试管或其他反应容器)的内表面。通过共价的或非共价的附着，可以实现组织保护性细胞因子受体复合物或其他组分的固定化。在一个实施方案中，附着可以是间接的，即通过附着的抗体进行。在另一个实施方案中，组织保护性细胞因子受体复合物和负对照用表位进行标记，例如谷胱甘肽S-转移酶(GST)，从而可以通过可商业上获得的抗体、例如抗-GST(Santa Cruz Biotechnology)来介导向固体表面的附着。
例如，可以使用固定化到固体支持体上的组织保护性细胞因子受体复合物，进行这样的亲和力结合测定。一般地，标记了结合反应的非固定化的组分，在该情况下是配体(例如EPO或氨甲酰基化的EPO)或实验化合物，以使得能够进行检测。可以得到和使用多种标记方法，例如发光剂、发色团、荧光剂或放射性的同位素或含有它们的基团，和非同位素的标记，例如酶或染料。在优选的实施方案中，用荧光团例如异硫氰酸荧光素(FITC，购自Sigma Chemicals，St.Louis)标记了实验化合物。
然后，在允许发生特异性结合的条件下，使标记的实验化合物或配体(例如EPO或氨甲酰基化的EPO)+实验化合物接触固体支持体。已经发生了结合反应后，通过洗涤表面，分离未结合的和非特异性地结合的实验化合物。通过本领域的技术人员已知的多种方式，包括但不限于化学交联、向塑料表面的非特异性粘着、与附着到固相上的抗体的相互作用、附着到结合配偶体(例如生物素)上的配体和附着到固相上的能结合配体的蛋白(例如抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白)之间的相互作用等，可以完成结合配偶体与固相的附着。
优选地，以能表达组织保护性细胞因子受体复合物的完整细胞(见5.2.2部分所述的测定)、或含有组织保护性细胞因子受体复合物的分离的膜的形式，将组织保护性细胞因子受体复合物加入结合测定中。因而，可以在有和没有实验化合物存在的情况下，在培养物中的完整细胞或动物模型中，测定与组织保护性细胞因子受体复合物的直接结合或实验化合物调节配体-组织保护性细胞因子受体复合物(例如EPO-组织保护性细胞因子受体复合物)的能力。可以将标记的配体(例如EPO或氨甲酰基化的EPO)与从这种细胞得到的粗提取物混合，并可以加入实验化合物。分离的膜可以用于鉴别能与组织保护性细胞因子受体复合物相互作用的化合物。例如，在一般的使用分离的膜的实验中，可以基因工程改造细胞以使其表达组织保护性细胞因子受体复合物。可以通过标准技术收获膜，并用于体外结合测定中。标记的配体(例如125I-标记的EPO)会结合到膜上，并测试其特异性的活性；通过与在有过量的未标记的(冷)配体存在的情况下进行的结合测定相比较，以确定特异性的结合。
还可以重组地表达可溶的组织保护性细胞因子受体复合物配体，并将其用于非基于细胞的测定中，以鉴别能结合到组织保护性细胞因子受体复合物配体上的化合物。或者，可以将重组地表达的组织保护性细胞因子受体复合物的配体结合结构域或组织保护性细胞因子受体复合物的片段用非基于细胞的筛选测定中。在另一个替代性的实施方案中，可以将与组织保护性细胞因子受体复合物的一个或多个结合结构域相对应的肽或含有组织保护性细胞因子受体复合物的一个或多个结合结构域的融合蛋白用于非基于细胞的测定系统中，以鉴别能结合组织保护性细胞因子受体复合物的胞质部分的化合物；这样的化合物可以用于调节组织保护性细胞因子受体复合物的信号转导途径。在非基于细胞的测定中，通过本领域的技术人员熟知的方法，将重组地表达的组织保护性细胞因子受体复合物附着到固体基质上，例如试管、微量滴定板孔或柱(见Ausubel等，1998，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY)。然后，测定实验化合物的结合组织保护性细胞因子受体复合物的能力。
或者，可以在溶液中进行结合反应。在该测定中，使标记的组分与它的结合配偶体在溶液中相互作用。如果标记的组分和它的结合配偶体之间的大小差异允许这样的分离，则可以通过使结合反应的产物经过超滤器，它的孔允许未结合的标记的组分通过，但是不允许它的结合配偶体或结合到它的配偶体上的标记的组分通过，从而实现分离。也可以使用能从溶液中捕获标记的组分的结合配偶体的任何试剂，例如抗结合配偶体的抗体、能与事先附着到结合配偶体上的配体相互作用的配体-结合蛋白等，实现分离。
在一个实施方案中，例如，使来自连续的噬菌体展示文库的噬菌体通过含有连接到固相(例如塑料珠)上的纯化的组织保护性细胞因子受体复合物、或其片段或结构域的柱，可以筛选噬菌体文库。通过改变洗涤缓冲液的严格性，可能富集能表达对组织保护性细胞因子受体复合物具有高亲和力的肽的噬菌体。可以克隆从柱分离的噬菌体，并直接测量短肽的亲和力。可以组合超过一种寡核苷酸的序列，以测试结合组织保护性细胞因子受体复合物或它的复合物结合它的配体的更高的亲和力。知道了哪个氨基酸序列能给组织保护性细胞因子受体复合物提供最强的结合，就可以用计算机模型来鉴别组织保护性细胞因子受体复合物和实验化合物之间的分子接触。这使得能够设计能模仿那些接触的非蛋白化合物。这样的化合物可能具有与肽相同的活性，且可以在治疗上使用，从而具有有效和生产成本更低的优点。
在本发明的该方面的另一个具体实施方案中，固体支持体是含有附着到微量滴定盘上的组织保护性细胞因子受体复合物的膜。在允许表达文库成员的条件下，在微量滴定盘中培养实验化合物，例如，能表达文库成员的细胞。收获能结合蛋白(或核酸或衍生物)的文库成员。这样的方法描述在例如Parmley和Smith，1988，Gene73305-318；Fowlkes等，1992，BioTechniques 13422-427；PCT公开号WO 94/18318；和上面引用的文献中。
最后，可以通过本领域已知的任意检测方法，检测残留在固体表面上的标记。例如，如果用荧光团标记了实验化合物，则可以用荧光计检测复合物。
可以使用各种体外测定来鉴别和验证化合物结合组织保护性细胞因子受体复合物、调节组织保护性细胞因子受体复合物和组织保护性细胞因子受体复合物配体的相互作用或调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的能力。
在本发明的另一个实施方案中，可以体外地测定组织保护性细胞因子受体复合物或配体(例如EPO或氨甲酰基化的EPO)和实验化合物之间的相互作用。在有助于结合的条件下，测定了已知的或未知的分子与组织保护性细胞因子受体复合物或其片段的特异性的结合，然后鉴别出了能特异性地结合组织保护性细胞因子受体复合物的分子。以多种方式测量了2个组分。一种方式是，用容易检测的标记来标记一个组分，在使得能够发生结合的条件下，将其与实验组分放在一起，进行分离步骤，该步骤分离结合的标记的组分和未结合的标记的组分，然后测量结合的组分的量。在一个实施方案中，可以使用使得能够发生结合的条件，标记组织保护性细胞因子受体复合物，并加入实验试剂中。使用聚丙烯酰胺凝胶分析，可以测定实验试剂的结合，以对比在有和没有实验试剂存在的情况下形成的复合物。
可以同时地或顺序地进行多个体外测定，以评价化合物对组织保护性细胞因子受体复合物介导的过程的作用。通过测量或检测组织保护性细胞因子受体复合物活性，例如，实验化合物与组织保护性细胞因子受体复合物的结合、细胞增殖、细胞分化和保护性蛋白(例如珠蛋白)的上调，可以进行评价。在优选的实施方案中，以高通量的形式进行本文所述的体外测定(例如在微量滴定板中)。
5.2.2基于细胞的测定可以在培养的细胞中表达组织保护性细胞因子受体复合物，然后将细胞用于筛选受体复合物的配体，包括天然配体以及天然配体的激动剂和拮抗剂。
为了总结基于细胞的测定方案，将能编码受体的cDNA或基因与它的表达所需的其他遗传元件(例如转录启动子)相组合，并将得到的表达载体插入宿主细胞中。可以合成和使用能编码EPO受体或β共有受体的载体，以使用用于本发明方法的目标载体转化或转染宿主细胞。优选地使用稳定的转化体。
使用如下进一步公开的众多可行的筛选系统中的一种，选择和使用了能表达DNA和生成功能受体的细胞。
用于鉴别能调节组织保护性细胞因子受体复合物和其配体的相互作用的化合物的基于细胞的方法的一个实例包含下述的步骤(a)使实验化合物接触配体和能表达组织保护性细胞因子受体复合物的细胞；和(b)测量细胞中的组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平，从而如果在(b)中测得的活性水平不同于在没有实验化合物存在的情况下的组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平，则鉴别出了能调节组织保护性细胞因子受体复合物和它的配体的相互作用的化合物。
用于鉴别能调节组织保护活性的化合物的方法的另一个实例包括，使实验化合物接触重组工程改造以表达EPO受体或β共有受体的细胞，其中所述的细胞转化了包含核苷酸序列的核酸，所述的核苷酸序列(i)可操作地连接到启动子上，且(ii)能编码β共有受体或EPO受体多肽，测量细胞中的组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平，鉴别与在对照细胞中测得的组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平相比，能增加或降低细胞中的组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平的实验化合物，其中所述的对照细胞与接触实验化合物的细胞属于相同的细胞类型，且未转化包含核苷酸序列的核酸，所述的核苷酸序列(i)可操作地连接到启动子上，且(ii)能编码β共有受体或EPO受体多肽，和测定鉴别出的实验化合物的组织保护活性。
或者，基于细胞的测定可以用于鉴别能与组织保护性细胞因子受体复合物相互作用的化合物。例如，可以使实验化合物接触能表达组织保护性细胞因子受体复合物的细胞，并可以测定组织保护性细胞因子受体复合物的活性，如通过结合亲和力、细胞增殖或报告基因转录物的存在所测得的。如果与在没有实验化合物存在的情况下的组织保护性细胞因子受体复合物的活性相比，组织保护性细胞因子受体复合物的活性有所不同，例如增加或降低，则鉴别出了能与组织保护性细胞因子受体复合物相互作用的化合物。
在本文上面所述的本发明的方法的某些实施方案中，其中测量了组织保护性细胞因子受体复合物的活性，这样的活性是通过细胞增殖或细胞分化测量的。
在本文上面所述的本发明的方法的某些实施方案中，其中测量了组织保护性细胞因子受体复合物的活性，这种测量的活性是组织保护性细胞因子受体复合物与组织保护性细胞因子受体复合物配体相互作用的能力。
基于细胞的筛选测定可以用于检测激动剂和拮抗剂配体。激动剂(包括天然配体)和拮抗剂在体外和体内应用中具有巨大潜力。鉴别出的作为受体激动剂的化合物可以用于体外和体内地刺激靶细胞的增殖和发育。例如，激动剂化合物可以用作特定细胞培养基的组分，且可以单独使用，或与其他细胞因子和激素组合使用，以代替在细胞培养中常用的血清。激动剂可以用于在培养物中特异性地促进EPO-反应性细胞(包括但不限于源自神经、心脏和视网膜的细胞)的生长和/或发育。拮抗剂可以用作研究试剂，用于表征配体-受体相互作用的位点。在体内，受体激动剂或拮抗剂可以用于治疗神经、心脏和/或视网膜疾病。许多合适的测定都是本领域已知的。这些测定可以基于靶细胞中的生物反应的检测。
在一个实施方案中，可以在动物模型的完整细胞中，测定配体(例如EPO或氨甲酰基化的EPO)与组织保护性细胞因子受体复合物的结合。可以将标记的配体(例如EPO或氨甲酰基化的EPO)直接施用给有和没有实验化合物的动物。可以在有和没有实验化合物存在的情况下，测量结合到组织保护性细胞因子受体复合物上的配体(例如EPO或氨甲酰基化的EPO)的下游作用，例如，组织保护或细胞增殖。对于这些测定，可以对向其中加入了实验化合物的宿主细胞进行基因工程改造以表达组织保护性细胞因子受体复合物和/或配体(例如EPO或氨甲酰基化的EPO)，这可以是瞬时的、诱导的或组成型的或稳定的。为了本发明的筛选方法的目的，可以使用多种宿主细胞，包括但不限于组织培养细胞、哺乳动物细胞和酵母细胞。哺乳动物细胞例如脑细胞或能表达组织保护性细胞因子受体复合物的其他细胞是实现本发明的测定的优选细胞类型。
5.2.2.1细胞在优选的实施方案中，在本发明的方法中使用的细胞是哺乳动物细胞。在更优选的实施方案中，宿主细胞是人细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是从组织或其他目标生物样品中分离出的原代细胞。本领域的技术人员能够认识到，在本发明的方法中可以使用不同的细胞类型，来筛选或鉴别化合物。使用的细胞类型可以内源地表达EPO受体、β共有受体、EPO受体和β共有受体两者、或无EPO受体或β共有受体。在优选的实施方案中，宿主细胞源自可兴奋组织。在优选的实施方案中，宿主细胞源自可兴奋神经元组织。
作为非限制性的实例，反应性的或可兴奋的细胞可以是神经元的、视网膜的、肌肉的、心脏的、肺的、肝的、肾的、小肠的、肾上腺皮质的、肾上腺髓质的、毛细管内皮的、睾丸的、卵巢的、胰的、骨的、皮肤的或子宫内膜的细胞或组织。而且，反应性的或可兴奋的细胞的非限制性的实例包括感光细胞(杆细胞和和锥细胞)、神经节细胞、双极细胞、水平细胞、无长突细胞、放射状胶质细胞、浦肯野细胞、心肌细胞、起搏细胞、窦房结(sinoatrial node)细胞、窦结细胞(sinus node)、连接组织细胞、房室结细胞、房室束细胞、肝细胞、星形细胞、肝巨嗜细胞、血管系膜(mesangial)细胞、肾上皮细胞、管状间质(tubular interstitial)细胞、杯形细胞、肠腺(隐窝)细胞、肠内分泌细胞、glomerulosa、束状细胞、网状细胞、嗜铬细胞、周细胞、莱迪希氏细胞、支持细胞、精子、Graffianfollicle、原始卵泡细胞、胰岛细胞、α-细胞、β-细胞、γ-细胞、F-细胞、骨原细胞、破骨细胞、成骨细胞、子宫内膜基质细胞、子宫内膜细胞、干细胞和内皮细胞。
适用于表达组织保护性细胞因子受体复合物和转导受体-介导的信号的哺乳动物细胞包括能表达至少一种用于形成功能性组织保护性受体复合物的受体亚基的细胞。这些亚基可以包括I类细胞因子受体的那些。在本发明的某些实施方案中，还优选地使用来自与要表达的受体相同物种的细胞。在优选的实施方案内，细胞的增殖依赖于外源地供给的造血生长因子。在某些优选的实施方案中，该类型的细胞系是人TF-1细胞系(ATCC号CRL-2003)和AML-193细胞系(ATCC号CRL-9589)，它是GM-CSF-依赖性的人白血病细胞系。在一个替代性的实施方案中，可以工程改造合适的宿主细胞，以生产必需的受体亚基或理想的细胞反应所需的其他细胞组分。例如，可以转染鼠细胞系BaF3(Palacios和Steinmetz，1985，Cell 41727-734；Mathey-Prevot等，1986，Mol.Cell.Biol.64133-4135)或幼仓鼠肾(BHK)细胞系，以表达必需的EPO-R和βc受体。后一种方案是有利的，因为可以从任意物种工程改造细胞系来表达受体亚基，由此克服了物种特异性造成的潜在限制。在替代方案中，可以克隆人受体cDNA的物种直向同源物(ortholog)，并用于来自相同物种的细胞系中，例如BaF3细胞系中的小鼠cDNA。因而，可以使依赖于一种造血生长因子(例如GM-CSF)的细胞系工程改造成依赖于组织保护性受体复合物配体的细胞系。
类似地，本领域的普通技术人员能够明白，上面的测定可以在以类似方式转化的其他细胞系中进行。而且，细胞增殖测定可以在已知携带EPO和βc受体两者的细胞中进行。这样的细胞优选地包括神经元细胞系，包括但不限于P-19、PC-12和星形细胞或已知EPO-反应性的其他细胞系，包括但不限于视网膜细胞和心脏细胞。使用本领域的普通技术人员熟知的免疫沉淀方法，可以确认EPO和βc受体两者在这些细胞系中的存在。
可以用于重组地生产组织保护性细胞因子受体复合物或用于本发明的筛选方法中的其他宿主细胞包括但不限于杂交瘤、前B细胞、293细胞、293T细胞、HeLa细胞、HepG2细胞、K562细胞、3T3细胞。在优选的实施方案中，宿主细胞是无限增殖化的细胞系，其源自特定来源，例如组织。在本发明中可以使用的其他宿主细胞包括但不限于酵母细胞、病毒感染的细胞、细菌细胞、昆虫细胞或植物细胞。
优选的哺乳动物的宿主细胞包括但不限于源自人、猴和啮齿类动物的那些(见，例如，Kriegler M.in“Gene Transfer andExpressionA Laboratory Manual”，New York，Freeman & Co.1990)，例如用SV40转化的猴肾细胞系(COS-7，ATCC登记号CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(293，293-EBNA or 293 cells subcloned for growthin suspension culture，Graham等，1977，J.Gen.Virol.，3659)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC登记号CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.77；4216)；小鼠支持细胞(Mather，1980，Biol.Reprod.23243-251)；小鼠成纤维细胞(NIH-3T3)，猴肾细胞(CVI ATCC登记号CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC登记号CRL-1587)；人子宫颈癌细胞(HELA，ATCC登记号CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC登记号CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC登记号CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC登记号CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；和小鼠乳癌细胞(MMT 060562，ATCC登记号CCL51)。合适的培养的哺乳动物细胞包括COS-1(ATCC号CRL 1650)、BHK(ATCC号CRL 1632)和BHK 570(ATCC号CRL 10314)、293(ATCC号CRL 1573；Graham等，J.Gen.Virol.3659-72，1977)细胞系。其他合适的细胞系是本领域已知的，且可从公共保藏机构得到，例如美国典型培养物保藏中心，Manassas，Va。
其他有用的真核生物宿主-载体系统可以包括酵母和昆虫系统。在酵母中，许多含有组成型的或诱导型的启动子的载体可以用于啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisia)(面包酵母)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)(裂殖酵母)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)和多形汉逊氏酵母(Hansenula polymorpha)(methylotropic酵母)。综述见，Current Protocols in MolecularBiology，Vol.2，1988，Ed.Ausubel等，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience，Ch.13；Grant等，1987，Expression andSecretion Vectors for Yeast，in Methods in Enzymology，Wu &Grossman编，1987，Acad.Press，N.Y.，Vol.153，pp.516-544；Glover，1986，DNA Cloning，Vol.II，IRL Press，Wash.，D.C.，Ch.3；和Bitter，1987，Heterologous Gene Expression in Yeast，Methods in Enzymology，Berger & Kimmel编，Acad.Press，N.Y.，Vol.152，pp.673-684；和Molecular Biology of the YeastSaccharomyces，1982，Strathern等编，Cold Spring Harbor Press，Vols.I和II。
在本发明中还可以使用真菌细胞，包括酵母细胞，尤其是糖酵母属的细胞，例如用于生产受体多肽、受体片段、多肽融合体或复合物，和用于鉴别能调节组织保护性细胞因子活性的化合物的基于细胞的测定。用外源DNA转化酵母细胞和由此生产重组多肽的方法公开在，例如，Kawasaki，美国专利号4,599,311；Kawasaki等，美国专利号4,931,373；Brake，美国专利号4,870,008；Welch等，美国专利号5,037,743；和Murray等，美国专利号4,845,075中。通过选择性标记，通常是抗药性或在没有特定营养物(例如亮氨酸)存在的情况下生长的能力确定的表型来选择转化的细胞。优选的用于酵母的载体系统是Kawasaki等公开的POT1载体系统(美国专利号4,931,373)，其使得能够通过在含有葡萄糖的培养基中的生长来选择转化的细胞。合适的用于酵母的启动子和终止子包括来自糖酵解酶基因(见，例如Kawasaki，美国专利号4,599,311；Kingsman等，美国专利号4,615,974；和Bitter，美国专利号4,977,092)和醇脱氢酶基因的那些。也见美国专利号4,990,446；5,063,154；5,139,936和4,661,454。在本发明中还可以使用其他酵母的转化系统，所述的酵母包括多形汉逊氏酵母、粟酒裂殖糖酵母、乳克鲁维氏酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维氏酵母(Kluyveromycesfragilis)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)、巴斯德毕赤氏酵母、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、季也蒙氏毕赤氏酵母(Pichiaguillermondii)和麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)(见，例如，Gleeson等，1986，J.Gen.Microbiol.1323459-3465，和Cregg，美国专利号4,882,279)。根据McKnight等，美国专利号4,935,349的方法，可以使用曲霉属(Aspergillus)细胞。转化产黄支顶孢(Acremonium chrysogenum)的方法公开在Sumino等，美国专利号5,162,228。转化链孢霉属(Neurospora)的方法公开在Lambowitz，美国专利号4,486,533。
可以使用将目标核酸序列导入宿主细胞的标准方法。通过任意的已知的将多核苷酸导入宿主细胞的方法，包括，例如将多核苷酸包装到病毒中，并用该病毒转导宿主细胞，和通过直接摄入多核苷酸，可以进行转化。使用的转化方法依赖于要转化的宿主。使用Graham & Vander Eb，1978，Virol.52546的磷酸钙沉淀方法，或其各种已知的修改，可以进行通过直接摄入的哺乳动物细胞转化(即，转染)。将重组多核苷酸导入细胞、尤其是哺乳动物细胞中的其他方法，包括葡聚糖-介导的转染、磷酸钙介导的转染、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸被囊化在脂质体中和将多核苷酸直接显微注射进核中。这些方法是本领域的技术人员熟知的。
合适的宿主细胞是可以用外源DNA转化或转染的、在培养基中生长的那些细胞类型，且包括真菌细胞和培养的高等真核细胞。真核细胞，尤其是培养的多细胞生物的细胞，是优选的。操作克隆的DNA分子和将外源DNA导入各种宿主细胞的技术公开在Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989，和Ausubel等，编，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley and Sons，Inc.，NY，1987。
根据常规方法，在含有营养物和选择的宿主细胞生长所需的其他组分的培养基中，培养转化的或转染的宿主细胞。许多合适的培养基，包括确定成分培养基和复合培养基，都是本领域的已知的，且通常包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。根据需要，培养基还可以含有诸如生长因子或血清的组分。
培养的哺乳动物细胞是本发明中优选的宿主。将外源DNA导入哺乳动物宿主细胞中的方法包括磷酸钙-介导的转染(Wigler等，1978，Cell 14725；Corsaro和Pearson，1981，Somatic CellGenetics 7603Graham和Van der Eb，1973，Virology 52456)，电穿孔(Neumann等，1982，EMBO J.1841-845，)，DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel等，编，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley and Sons，Inc.，NY，1987)，和脂质体-介导的转染(Hawley-Nelson等，1993，Focus 1573；Ciccarone等，1993，Focus 1580)。在培养的哺乳动物细胞中生产重组多肽(包括作为本发明的受体复合物的组分的多肽)的方法公开在例如Levinson等，美国专利号4,713,339；Hagen等，美国专利号4,784,950；Palmiter等，美国专利号4,579,821；和Ringold，美国专利号4,656,134。通常，强转录启动子是优选的，例如来自SV-40或巨细胞病毒的启动子(见，例如美国专利号4,956,288)。其他合适的启动子包括来自金属硫蛋白基因的那些启动子(美国专利号4,579,821和4,601,978)和腺病毒主要晚期启动子。生长培养基通常通过例如药物选择或必需营养物缺陷来选择含有外源添加的DNA的细胞，所述必需营养物由表达载体携带的或共转染进宿主细胞的选择标记补偿。
在优选的实施方案中，为高通量筛选制备了含有目标构建体的稳定细胞系。通过导入含有选择标记的构建体，使所述细胞能够在富集培养基中生长1-2天，然后使细胞在选择培养基上生长，可以制备出这种稳定细胞系。重组质粒中的选择标记会赋予对选择的抗性，并使得细胞能够将质粒稳定地整合进它们的染色体中和生长形成转化灶，后者又可以克隆和扩增为细胞系。
药物选择一般用于选择培养的其中已经插入了外源DNA的哺乳动物细胞。这种细胞是通常称作“转染子”。已经在有选择剂存在的情况下培养的、且能将目标基因传递给它们的后代的细胞被称作“稳定的转染子”。可以使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，1977，Cell 11223)，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 482026)，和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，1980，Cell22817)基因可以分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞中。另外，抗-代谢物抗性可以用作选择下述基因的基础dhfr，其能赋予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等，1980，Natl.Acad.Sci.USA 773567；O′Hare等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 781527)；gpt，其能赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan & Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 782072)；neo，其能赋予对氨基糖苷类抗生素G-418的抗性(Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.1501)；和hygro，其能赋予对潮霉素的抗性(Santerre等，1984，Gene 30147)。优选的选择标记是能编码对抗生素新霉素抗性的基因。可以在有新霉素类药物(例如G-418等)存在的情况下，进行选择。选择系统还可以用于提高目标基因的表达水平，该过程称作“扩增”。通过在有低水平的选择剂存在的情况下培养转染子，然后增加选择剂的量，以选择能生产高水平的导入的基因的产物的细胞，来进行扩增。优选的可扩增的选择标记是二氢叶酸还原酶，其能赋予对氨甲蝶呤的抗性。也可以使用其他抗药性基因(例如多药抗性，嘌呤霉素乙酰转移酶)。
在某些实施方案中，BaF3是白细胞介素-3依赖性的前-B细胞系，它具有βc受体，可以被重组EPO-R所转染。然后可以通过对化合物例如zeocin(在2mg/ml)和嘌呤霉素(在2μg/ml)的抗性，选择EPO-R的存在。
5.2.2.2BaF3细胞测定BaF3细胞测定也可以用于鉴别能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物。
例如，可以如下所述进行通过受体复合物信号传导测试BaF3细胞增殖的测定。在96孔板中，8个只含有1∶2系列稀释的生长培养基(RPMI 1640，10％胎牛血清，1mM丙酮酸钠，2mML-谷氨酰胺)，和小分子、生物的或化学的目标化合物。每份稀释液的终体积应当是约100μl。
然后，可以用生长培养基(见上)洗涤BaF3亲本细胞系和转染了EPO-R的BaF3细胞3次，将沉淀重新悬浮于生长培养基中，计数细胞，并在生长培养基中稀释至5,000细胞/100μl。然后，可以将100微升稀释的细胞加入样品的每份稀释液中。然后，在37℃培养箱中温育测定板3-4天。将20μl Alomar blue的等分试样加入每个孔中，并将平板在37℃温育过夜。在544的激发波长和590的发射波长，在荧光平板读数器上阅读平板。
如果化合物表现出组织保护活性，则BaF3细胞在暴露于小分子、生物的或化学的目标化合物时应该增殖。
通过诱变能表达受体复合物的细胞系，并在选择自分泌生长的条件下培养它，也可以鉴别出组织保护性受体复合物的天然配体(见WIPO公开WO 95/21930)。在一般的方法中，诱变了能表达组织保护性受体复合物和必需的其他亚基的BaF3细胞，例如用2-甲基磺酸乙酯(EMS)。然后，在有IL-3存在的情况下，使细胞能够恢复，再转移到缺乏IL-3和IL-4的培养基中。筛选能生产组织保护性受体复合物配体的存活细胞，例如通过将可溶的受体加入培养基中，或通过在野生型BaF3细胞和能表达受体的BaF3细胞上测定条件培养基。
5.2.2.3报告基因测定在本发明的某些实施方案中，将进一步工程改造以使其表达报告基因的细胞用于测定中以鉴别具有组织保护活性的化合物。报告基因连接到对受体-连接的途径是反应性的启动子元件上，且该测定检测报告基因转录的活化。
例如，和本发明的方法一致的报告基因测定可以包括，测试能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物，其中活化的复合物会导致在宿主细胞中生产转录因子。宿主细胞还包含SRE启动子元件，所述启动子元件可操作地连接到其表达由转录激活物调节的萤光素酶报告基因上，从而响应于能活化组织保护性细胞因子受体复合物的化合物的存在，会造成细胞中的萤光素酶基因产物的开启或关闭(即存在或不存在，或以不同的量存在)。
本发明另外还提供了用于鉴别能调节组织保护活性的化合物的方法，包括使实验化合物接触能表达组织保护性细胞因子受体复合物的细胞，其中所述的细胞转化了包含能编码报告基因的核苷酸序列的核酸，所述的报告基因可操作地连接到与组织保护性细胞因子受体复合物活性有关的调节元件上，鉴别与在没有实验化合物存在的情况下测得的报告基因的表达水平相比，能提高或降低报告基因的表达水平的实验化合物，和测定鉴别出的实验化合物的组织保护活性。在本发明的方法的某些实施方案中，调节元件是血清反应元件。本发明另外还提供了鉴别能调节组织保护活性的化合物的方法，包括使实验化合物接触细胞，所述的细胞包含(i)包含报告基因的核酸序列，所述的报告基因可操作地连接到对转录激活物的DNA结合结构域特异性的结合位点上，(ii)第一种融合蛋白，其包含(A)转录激活物的DNA结合结构域，和(B)第一种组织保护性细胞因子受体多肽或其片段，和(iii)第二种融合蛋白，其包含(A)转录激活物的活化结构域和(B)第二种组织保护性细胞因子受体，检测报告基因表达，从而如果与在没有实验化合物存在的情况下测得的报告基因表达相比，在有实验化合物存在的情况下测得的报告基因表达存在差异，则鉴别出了能调节组织保护活性的化合物。
本领域的技术人员熟知的任何报告基因都可以用于报告基因构建体中，以确定化合物对组织保护性细胞因子介导的方法或保护性球蛋白的上调的作用。在这点上，优选的启动子元件是血清反应元件，或SRE(见，例如Shaw等，1989，Cell 56563-572，)。这种报告基因的优选形式是萤光素酶基因(例如，荧光虫萤光素酶，renilla萤光素酶，和叩头虫萤光素酶)(de Wet等，1987，Mol.Cell.Biol.7725，)。使用本领域已知的方法，利用发光检测萤光素酶基因的表达(例如Baumgartner等，1994，J.Biol.Chem.26929094-29101；Schenborn和Goiffin，1993，Promega Notes 4111)。萤光素酶活性测定试剂盒可商业上购自，例如，Promega Corp.，Madison，Wis。这种类型的靶细胞系可以用于筛选化学制剂文库、细胞-条件培养基、真菌液体培养基、土样、水样等。例如，可以在靶细胞上测定细胞-条件培养基样品文库，以鉴别能生产配体的细胞。然后，将阳性细胞用于生产哺乳动物表达载体的cDNA文库，将其分组，转染进宿主细胞中，并表达。然后，测定来自转染的细胞的培养基样品，随后分组，再次转染，继代培养，重新测定阳性细胞，以分离克隆的能编码配体的cDNA。
报告基因的实例包括但不限于荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白(“GFP”)、黄色荧光蛋白、红色荧光蛋白、青色荧光蛋白和蓝色荧光蛋白)，β-半乳糖苷酶(“β-gal”)，β-glucoronidase，β-内酰胺酶，氯霉素乙酰转移酶(“CAT”)，分泌的碱性磷酸酶(“SEAP”)，辣根过氧化物酶(“HRP”)和碱性磷酸酶(“AP”)。或者，报告基因也可以是蛋白标记，例如但不限于myc、His、FLAG或GST，从而无义抑制会生成可以通过ELISA、蛋白印迹或能检测蛋白标记的任何其他免疫实验监控的肽和蛋白。这种方法是本领域的技术人员熟知的。
本发明的筛选方法还包括使用其他报告基因。可以得到报告基因，并通过本领域的技术人员熟知的任意方法，确定该元件的核苷酸序列。可以得到报告基因的核苷酸序列，例如从文献或数据库，例如GenBank得到。或者，可以从合适来源的核酸生成能编码报告基因的多核苷酸。如果不能得到含有能编码特定报告基因的核酸的克隆，但是报告基因的序列是已知的，则可以化学合成编码报告基因的核酸，或通过PCR扩增，从合适的来源(例如cDNA文库，或从能表达报告基因的任意组织或细胞生成的cDNA文库，或从能表达报告基因的任意组织或细胞分离的核酸，优选poly A+RNA)得到编码报告基因的核酸。一旦确定了报告基因的核苷酸序列，就可以使用本领域熟知的操作核苷酸序列的方法，例如重组DNA技术、定位诱变、PCR等(见，例如，描述在Sambrook等，1990，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY和Ausubel等，编，1998，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，NY中的技术，它们二者在这里整体引作参考)，操作报告基因的核苷酸序列，以生成具有不同氨基酸序列的报告基因，例如生成氨基酸取代、缺失和/或插入。
在某些实施方案中，可以在没有组织保护性细胞因子受体复合物配体存在的情况下，进行上述的报告基因测定。在这样的实施方案中，鉴别出的实验化合物是能与组织保护性细胞因子受体复合物相互作用的化合物。在某些其他的实施方案中，可以在有组织保护性细胞因子受体复合物配体(例如EPO)存在的情况下，进行上述的报告基因测定。在这样的实施方案中，可以检测在有和没有实验化合物存在的情况下报告基因的转录水平的差异。然后，可以将转录物水平与没有EPO存在时的水平对比。如果在有和没有化合物时测得的转录物的水平的差异依赖于EPO的存在，则鉴别出了能调节组织保护性细胞因子受体复合物和EPO的相互作用的化合物。例如，如果在有化合物存在时，测得的转录物水平的差异增加，其中该增加依赖于EPO的存在，则鉴别出了EPO和组织保护性细胞因子受体复合物之间的相互作用的激动剂。
5.2.2.4酵母双杂交测定“双杂交”系统可以用于检测啤酒糖酵母中的蛋白-蛋白相互作用(Fields和Song，1989，Nature 340245-246；Fields和Song的美国专利号5,283,173)。因为在酵母中筛选相互作用，所以在模拟哺乳动物细胞的条件的生理条件下，发生在该系统中检测到的分子间蛋白相互作用(Chien等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.889578-9581)。该测定通过2个已经融合到转录激活物的2个功能单位(DNA-结合结构域和活化结构域)上的蛋白结构域的相互作用，利用转录激活物样GAL4的重构(Johnston，1987，Microbiol.Rev.51458-476)。这由于某些转录因子样GAL4的二分(bipartite)性质而是可能的。表征为二分的意味着，DNA-结合和活化功能存在于分开的结构域中，且可以反式发挥作用(Keegan等，1986，Science231699-704)。通过处于含有转录激活物的DNA-结合结构域的结合位点(上游激活序列或UAS)的启动子控制下的报告基因(例如lacZ基因)的活化，可以监控转录激活物的重构。该方法最常用于检测2种已知蛋白之间的相互作用(Fields和Song，1989，Nature340245-246)，或用于从能结合已知蛋白的群体中鉴别相互作用蛋白(Durfee等，1993，Genes Dev.7555-569；Gyuris等，1993，Cell75791-803；Harper等，1993，Cell 75805-816；Vojtek等，1993，Cell 74205-214)。对本文所述的酵母双杂交测定方法和酵母双杂交测定的其他方法的改变，是本领域的技术人员熟知的，且可以用于本发明的筛选方法中。
通过改进的酵母双杂交系统鉴别相互作用蛋白，是基于报告基因表达的检测的，其转录依赖于2种蛋白的相互作用对转录调节剂的重构，每种蛋白融合到一半转录调节剂上。将“饵”(即本发明的组织保护性细胞因子受体复合物或其衍生物或类似物)和“猎物”(要测试与饵的相互作用能力的蛋白)蛋白分别表达为与DNA结合结构域和转录调节结构域的融合蛋白，或反之。
在一个具体的实施方案中，可以将能表达随机肽的重组生物文库用作猎物核酸的来源。
通常，将饵和猎物群体的蛋白提供为融合(嵌合)蛋白(优选地通过嵌合编码序列的重组表达)，其包含与预选序列邻接的每种蛋白。对于一个群体，预选序列是DNA结合结构域。DNA结合结构域可以是任意的DNA结合结构域，只要它能特异性地识别启动子内的DNA序列即可。例如，DNA结合结构域属于转录激活物或抑制剂。对于其他群体，预选序列分别是转录激活物或抑制剂的激活物或抑制剂结构域。单独的调节结构域(不作为与蛋白序列的融合体)和单独的DNA-结合结构域(不作为与蛋白序列的融合体)优选地不存在可检测的相互作用(以避免测定中的假阳性)。测定系统还包括可操作地连接到启动子上的报告基因，所述的启动子含有转录激活物(或抑制剂)的DNA结合结构域的结合位点。因此，在本发明的方法中，组织保护性细胞因子受体复合物融合蛋白与猎物融合蛋白的结合，会导致转录激活物(或抑制剂)的重构，这会活化(或抑制)报告基因的表达。胞内地发生报告基因转录的活化(或抑制)，例如在原核细胞或真核细胞中，优选地在细胞培养物中。
可操作地连接到报告基因核苷酸序列上的启动子可以是核苷酸序列的天然或非天然启动子，且由融合蛋白的DNA结合结构域部分识别的DNA结合位点可以是对该启动子天然的(如果该启动子通常含有这种结合位点的话)或对该启动子非天然的。或者，可以缺失所需基因的转录活化结合位点，并用GAL4结合位点替换(Bartel等，1993，BioTechniques 14920-924，Chasman等，1989，Mol.Cell.Biol.94746-4749)。
在测定中使用的活化结构域和DNA结合结构域可以来自多种转录激活物蛋白，只要这些转录激活物具有分开的结合和转录活化结构域即可。例如，啤酒糖酵母的GAL4蛋白(Ma等，1987，Cell48847-853)、啤酒糖酵母的GCN4蛋白(Hope & Struhl，1986，Cell46885-894)、啤酒糖酵母的ARD1蛋白(Thukral等，1989，Mol.Cell.Biol.92360-2369)和人雌激素受体(Kumar等，1987，Cell51941-951)，具有分开的DNA结合和活化结构域。在融合蛋白中使用的DNA结合结构域和活化结构域无需来自相同的转录激活物。在一个具体的实施方案中，采用了GAL4或LEXA DNA结合结构域。在另一个具体的实施方案中，采用了GAL4或单纯疱疹病毒VP16(Triezenberg等，1988，Genes Dev.2730-742)活化结构域。在一个具体的实施方案中，GAL4的氨基酸1-147(Ma等，1987，Cell48847-853；Ptashne等，1990，Nature 346329-331)是DNA结合结构域，且VP16的氨基酸411-455(Triezenberg等，1988，Genes Dev.2730-742；Cress等，1991，Science 25187-90)包含活化结构域。
在一个具体的实施方案中，通过共转化，将能编码不同的融合蛋白群体的质粒同时导入含有一个或多个报告基因的单一宿主细胞(例如单倍体酵母细胞)中，以进行蛋白-蛋白相互作用测定。或者，优选地，通过接合(例如对于酵母细胞)或细胞融合(例如哺乳动物细胞)，将2个融合蛋白群体导入单一细胞中。在接合型测定中，已经分别转化了结合结构域融合表达构建体(优选质粒)和活化(或抑制剂)结构域融合表达构建体(优选质粒)的相反接合型的单倍体酵母细胞的接合，会将2个构建体送递进相同的二倍体细胞中。通过用HO基因进行转化，可以操作酵母菌株的接合型(Herskowitz和Jensen，1991，Meth.Enzymol.194132-146)。
在优选的实施方案中，使用2种不同类型的宿主细胞(啤酒糖酵母的菌株型a和α)，进行酵母相互作用接合测定。宿主细胞优选地含有至少2个报告基因，每个具有一个或多个DNA-结合结构域(例如转录激活物的)的结合位点。活化结构域和DNA结合结构域都是由2个单独的蛋白群体形成的嵌合蛋白的一部分。一株宿主细胞(例如a菌株)含有核苷酸序列文库与转录激活物(例如GAL4)的DNA-结合结构域的融合体。在这组宿主细胞中表达的杂交蛋白能识别启动子的DNA-结合位点或报告基因构建体的增强子区。第二组酵母宿主细胞(例如，α菌株)含有能编码融合到转录激活物的活化结构域上的DNA序列文库的融合体的核苷酸序列。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了检测一种或多种蛋白-蛋白相互作用的方法，其包括(a)在第一种接合型的第一种酵母细胞群体中重组地表达第一种融合蛋白，所述融合蛋白含有组织保护性细胞因子受体复合物或其片段和DNA结合结构域的序列，其中所述第一种酵母细胞群体含有第一种核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接到由所述的DNA结合结构域识别的一个或多个DNA结合位点驱动的启动子上，从而所述第一种融合蛋白和第二种融合蛋白的相互作用会导致增强的所述第一种核苷酸序列的转录，其中所述第二种融合蛋白包含转录活化结构域；(b)进行负选择，以排除所述第一种群体中的如下酵母细胞，其中增强的所述第一种核苷酸序列的转录发生在没有所述第二种融合蛋白存在的情况下；(c)在与所述第一种接合型不同的第二种接合型的第二种酵母细胞群体中重组地表达许多所述第二种融合蛋白，每个第二种融合蛋白都包含蛋白的片段、衍生物或类似物的序列和转录激活物的活化结构域，其中每个所述第二种融合蛋白的活化结构域都相同；(d)使所述第一种酵母细胞群体与所述第二种酵母细胞群体接合，以形成二倍体酵母细胞的第三群体，其中所述二倍体酵母细胞的第三群体含有第二种核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接到由所述DNA结合结构域识别的DNA结合位点驱动的启动子上，从而所述第一种融合蛋白与所述第二种融合蛋白的相互作用会导致增强的所述第二种核苷酸序列的转录，其中第一种和第二种核苷酸序列可以相同或不同；和(e)检测所述的增强的第一种和/或第二种核苷酸序列的转录，由此检测所述第一种融合蛋白和所述第二种融合蛋白之间的相互作用。
在一个实施方案中，本发明提供了鉴别能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物的方法，所述的方法包括使实验化合物接触修饰的酵母菌株细胞，所述细胞含有(i)能编码报告基因的核苷酸序列，所述的报告基因可操作地连接到组织保护性细胞因子受体复合物-反应性的启动子上，和(ii)表达组织保护性细胞因子受体复合物，并通过测量报告基因的表达水平，来测定组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平，从而如果与在没有化合物存在时报告基因的活性水平相比，在有化合物存在时报告基因的活性水平升高或降低，则鉴别出了能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物。
受体复合物可以用于相互作用截留(trap)测定中(例如，Gyuris等，1993，Cell 75791-803中所述的)，以鉴别能结合已知蛋白的蛋白，鉴别结合相互作用的抑制剂。该系统是修饰的如上所述的双杂交系统，其使用LEU2报告基因作为第一种核苷酸序列，且使用lacZ报告基因作为第二种核苷酸序列，从而可以在缺乏亮氨酸和表达β-半乳糖苷酶的细胞中，选择能导致转录激活物系统重构的蛋白-蛋白相互作用。DNA-结合结构域可以是LexA DNA-结合结构域，而激活物序列可以从B42转录活化结构域得到(Ma和Ptashne，1987，Cell51113-119)。报告基因的启动子含有LexA结合序列，并由功能性转录激活物的重构来活化。该系统的另一个特征是，能编码DNA-结合结构域融合蛋白的基因处于诱导型启动子(例如GAL启动子)的影响下，从而可以在诱导和非诱导条件下进行确认实验。
在一个具体的实施方案中，本发明提供了检测能调节EPO和组织保护性细胞因子受体复合物的相互作用的化合物的方法。包含第一种融合蛋白的第一种酵母细胞群体含有第一种组织保护性细胞因子受体(例如EPO受体)的序列和LexA DNA-结合结构域。第二种酵母细胞群体包含第二种融合蛋白，所述融合蛋白含有与第二种组织保护性细胞因子受体(例如β共有受体)的序列融合的B42转录活化结构域。LEU2报告基因和lacZ报告基因可操作地连接到含有LexA结合序列的启动子上，从而所述第一种融合蛋白和第二种融合蛋白的相互作用，会导致增强的所述报告基因的转录。包含融合蛋白的细胞群体在缺乏亮氨酸的培养基中生长，以进行筛选。该培养基含有EPO，并在有和没有实验化合物的情况下进行测定。当在有实验化合物存在的情况下，转录水平不同时，则鉴别出了能调节EPO和组织保护性细胞因子受体复合物的相互作用的化合物。
还存在其他形式的双杂交方法，例如已经报道了“关联性复制测定(Contingent Replication Assay)”(Nallur等，1993，NucleicAcids Res.213867-3873；Vasavada等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8810686-10690)。在该情况下，2个融合蛋白的相互作用造成的哺乳动物细胞中的转录因子的重构，会导致SV40T抗原转录的活化。该抗原使得活化结构域融合质粒能够复制。使用哺乳动物细胞的双杂交方法的另一个改进是“核质相互作用选择策略(Karyoplasmic Interaction Selection Strategy)”，它也使用转录激活物的重构(Fearon等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA897958-7962)。在该情况下使用的报告基因已经包含了能编码细菌的氯霉素乙酰转移酶的基因、细胞表面抗原CD4的基因和能编码对潮霉素B的抗性的基因。在两个哺乳动物系统中，重构的转录因子是杂交转录激活物，其中DNA-结合结构域来自GAL4，而活化结构域来自VP16。已经描述了转录活化系统，来分离和分类群体内可能的蛋白-蛋白相互作用，并使得能够对比2个群体之间的这种相互作用(见1997年12月18日公开的PCT公开WO 97/47763)。
5.2.3配体/组织保护性细胞因子受体复合物测定在本文所述的无细胞的和基于细胞的筛选方法中，可以将组织保护性细胞因子受体复合物的配体用于测定中，以鉴别能调节组织保护性细胞因子受体复合物和它的配体的相互作用的化合物。
在一个实施方案中，本发明提供了用于鉴别能结合组织保护性细胞因子受体复合物的化合物的方法，其包括，在有利于结合的条件下，使组织保护性细胞因子受体复合物接触(i)附着到第一种标记上的组织保护性细胞因子受体复合物配体和(ii)附着到第二种标记上的等量的实验化合物，从组织保护性细胞因子受体复合物中去除未结合的材料，和检测第一种和第二种标记的水平，其中，如果第二种标记存在则化合物结合到复合物上，且如果与在有利于结合的条件下，在去除未结合的材料后没有实验化合物存在的情况下，使标记的配体接触组织保护性细胞因子受体复合物时的第一种标记的水平相比，第一种标记的水平降低，则鉴别出了能结合组织保护性细胞因子受体复合物的化合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于鉴别能调节组织保护性细胞因子受体复合物配体与组织保护性细胞因子受体复合物的结合的化合物的方法，其包括，在有利于结合的条件下，在有一种或多种实验化合物存在的情况下，使组织保护性细胞因子受体复合物配体接触组织保护性细胞因子受体复合物，并测量结合到组织保护性细胞因子受体复合物上的组织保护性细胞因子受体复合物配体的量，从而，如果在有一种或多种实验化合物存在的情况下测得的结合的组织保护性细胞因子受体复合物配体的量不同于在没有一种或多种实验化合物存在的情况下测得的结合的组织保护性细胞因子受体复合物配体的量，则鉴别出了能调节组织保护性细胞因子受体复合物配体与组织保护性细胞因子受体复合物的结合的化合物。
在本文所述的本发明的方法的某些实施方案中，其中测量了接触组织保护性细胞因子受体复合物配体的组织保护性细胞因子受体复合物的结合，使用组织保护性细胞因子受体复合物配体-特异性的抗体，测量了结合的组织保护性细胞因子受体复合物配体的量。
在本文上面所述的本发明的方法的某些实施方案中，其中测量了接触组织保护性细胞因子受体复合物配体的组织保护性细胞因子受体复合物的结合，组织保护性细胞因子受体复合物配体是标记的，并通过检测附着到组织保护性细胞因子受体复合物配体上的标记，测量了组织保护性细胞因子受体复合物配体与组织保护性细胞因子受体复合物的结合。
在本文上面所述的本发明的方法的某些实施方案中，其中测量了接触组织保护性细胞因子受体复合物配体的组织保护性细胞因子受体复合物的结合，组织保护性细胞因子受体复合物配体是标记的，并通过检测附着到组织保护性细胞因子受体复合物配体上的标记，测量了标记的配体与组织保护性细胞因子受体复合物的结合。在有关的实施方案中，所述标记是荧光的。
在一个实施方案中，本发明提供了用于鉴别能调节组织保护性细胞因子受体复合物和组织保护性细胞因子受体复合物配体之间的相互作用的化合物的方法，其包括，使组织保护性细胞因子受体复合物接触一种或多种实验化合物，和测量组织保护性细胞因子受体复合物活性，从而，如果在有一种或多种实验化合物存在的情况下测得的活性不同于在没有一种或多种实验化合物存在的情况下测得的组织保护性细胞因子受体复合物的活性，则鉴别出了能调节组织保护性细胞因子受体复合物和组织保护性细胞因子受体复合物配体之间的相互作用的化合物。
在本文所述的本发明的方法的某些实施方案中，化合物能结合组织保护性细胞因子受体复合物。在本文上面所述的本发明的方法的某些实施方案中，化合物能结合组织保护性细胞因子受体复合物配体。
5.2.4高通量筛选测定可以以高通量形式使用本文所述的基于细胞的和非基于细胞的测定，以筛选化合物文库，以鉴别能调节组织保护性细胞因子受体复合物活性或调节组织保护性细胞因子受体复合物配体和组织保护性细胞因子受体复合物之间的相互作用的那些化合物。在下面的5.4部分，公开了可以在高通量筛选测定中使用的化合物文库的实例。
使用标记的探针的高通量筛选可以用于鉴别能影响特异性功能位点的形成的化合物。可以在用药物处理的细胞和未处理的细胞或对照细胞之间，对比功能位点的特征，以鉴别药物和药物候选物。而且，当已经将特异性的功能位点与组织保护活性相关联时，可以在药物治疗之前和之后，使用对这种位点特异性的探针来确定该位点的状态，以鉴别能改变功能位点的状态的药物，并因此可以用于细胞、组织或器官保护性的治疗中。在某些实施方案中，药物治疗会使功能位点的状态恢复到在对照样品中观察到的状态。
本发明的筛选测定还包括高通量筛选和测定，以鉴别调节剂组织保护性细胞因子受体复合物活性。根据该实施方案，可以将下面所述的系统制备成试剂盒。为此目的，可以将能表达组织保护性细胞因子受体复合物的细胞或其裂解物包装进多种容器中，例如小瓶、管、微量滴定孔板、瓶子等。可以将其他试剂包含在分开的容器中，并提供给试剂盒；例如阳性对照样品、阴性对照样品、缓冲剂、细胞培养基等。可以首先小规模地(即在试管中)最优化本发明的测定，然后按比例放大成高通量测定。
5.3用于鉴别化合物或在筛选测定中测试鉴别出的化合物的测定5.3.1生物学筛选或测定可以测试鉴别出的对组织保护性细胞因子受体复合物活性有作用的化合物或发现的能调节组织保护性细胞因子复合物和配体之间的相互作用的化合物的组织保护活性，例如，保护细胞、组织或器官。使用体外和体内测定，可以进一步测试保护活性。指示着组织保护活性的体外实验包括，例如，细胞增殖测定、细胞分化测定、或检测由组织保护性细胞因子受体复合物活性上调的蛋白或核酸的存在，例如核仁素、神经珠蛋白和细胞珠蛋白。神经珠蛋白，例如，可以参与促进氧的转运或短期储存。因此，氧的转运或储存测定可以用作鉴别或筛选能调节组织保护性细胞因子活性的化合物的测定。
响应于缺氧或局部缺血会造成神经珠蛋白在中枢神经系统的细胞和组织中表达，并可以提供损伤保护(Sun等2001，PNAS9815306-15311；Schmid等，2003，J.Biol.Chem.2761932-1935)。细胞珠蛋白可以在保护中起类似作用，但是在多种组织中以不同的水平表达(Pesce等，2002，EMBO 31146-1151)。在本发明的一个实施方案中，可以在使鉴别出的实验化合物接触细胞之前和之后，测量细胞中的上调蛋白的水平。在某些实施方案中，与细胞内的组织保护活性相关联的上调蛋白的存在，可以用于确认化合物的组织保护活性。
核仁素可以保护细胞免受损伤。它在细胞中起许多作用，包括调节转录过程、序列特异性的RNA-结合蛋白、胞质分裂、nucleogensis、信号转导、T-细胞诱导的细胞凋亡、染色质重构或复制。它也可以起细胞表面受体DNA/RNA解旋酶、DNA-依赖性的ATP酶、蛋白穿梭、转录因子组分或转录阻抑物的作用(Srivastava和Pollard，1999，FASEB J.，131911-1922；和Ginisty等，1999，J.Cell Sci.，112761-772)。
通过检测与细胞中的蛋白相对应的mRNA水平，可以检测上调蛋白的表达。mRNA可以探针杂交，所述的探针能特异性地结合编码上调蛋白的核酸。杂交可以由例如RNA印迹、DNA印迹、阵列杂交、亲和层析或原位杂交组成。
在另一个实施方案中，可以采用快速和定量的测定系统，来筛选实验化合物的活化组织保护性细胞因子受体复合物的能力。这样的测定，如美国专利号5,763,198所述的，通过使用抗-磷酸酪氨酸抗体和对蛋白底物特异性的抗体，测定蛋白底物的酪氨酸磷酸化状态，可以检测参与信号转导的酪氨酸激酶或磷酸酶活性的调节。这些测定可以在全细胞或无细胞的系统中实现。
在另一个实施方案中，本发明提供了接触能表达组织保护性细胞因子受体复合物的细胞、并裂解细胞来检测组织保护性细胞因子受体复合物是否已经被磷酸化的方法。在有关的实施方案中，用抗-EPO受体抗体沉淀组织保护性细胞因子受体复合物，并用βc受体的抗-磷酸酪氨酸抗体标记了沉淀的复合物。
动物模型系统可以用于证实化合物的组织保护活性或证实通过上述的本发明的筛选方法鉴别出的化合物的安全性和功效。然后，可以使用目标组织损伤、疾病、状况或综合征类型的动物模型，测试在测定中鉴别出的化合物的生物学活性。它们包括被工程改造以含有偶联到功能读数系统上的组织保护性细胞因子受体复合物的动物，例如转基因小鼠。
可以用于测试鉴别出的化合物的细胞或组织保护活性功效的动物模型包括，例如，保护Lewis大鼠免于发作急性实验性变应性脑脊髓炎(EAE)，恢复或保护受脑创伤后小鼠的减少的认知功能(Brines等，2000，PNAS，9710295-10672)，和保护免受诱导的视网膜缺血(Rosenbaum等，1997，Vis.Res.373443-51)。PCT公开号WO02/053580更详细地描述了这样的测定，其在这里整体引作参考。其中所述的体内实验涉及EPO的施用，但是，可以施用已经鉴别为对组织保护性细胞因子受体复合物的活性有作用的实验化合物来代替EPO，以测试组织保护活性。用于确定化合物的组织保护活性的其他测定是本领域的技术人员熟知的。
根据鉴别出的化合物是否是能与组织保护性细胞因子受体复合物相互作用，或调节组织保护性细胞因子受体复合物配体和组织保护性细胞因子受体复合物的相互作用的化合物，可以在有或没有组织保护性细胞因子受体复合物配体存在的情况下，进行用于确定鉴别出的化合物的组织保护活性的测定。
在某些实施方案中，将另外的组织保护性细胞因子受体复合物配体加入测定中，以进一步确认化合物对组织保护性细胞因子受体复合物配体和组织保护性细胞因子受体复合物的相互作用的调节活性。
5.3.2细胞结合测定或者，也可以使用细胞结合测定，所述测定使用上面5.2.2.1部分所公开的细胞。例如，可以用上面讨论的EPO和βc受体转染BaF3细胞。另外，小分子、生物的或化学的目标化合物应当结合到生物学标志上，例如荧光的或放射标记的标志。
在96孔板中，8个只含有1∶2系列稀释的生长培养基(RPMI 1640，10％胎牛血清，1mM丙酮酸钠，2mM L-谷氨酰胺)，和小分子、生物的或化学的目标化合物。每份稀释液的终体积应当是约100μl。
然后，可以用生长培养基(见上)洗涤BaF3亲本细胞系和转染了EPO-R的BaF3细胞3次，将沉淀重新悬浮于生长培养基中，计数细胞，并在生长培养基中稀释至5,000细胞/100μl。然后，可以将100微升稀释的细胞加入样品的每份稀释液中。然后，在37℃培养箱中温育测定板3-4天。然后洗涤细胞，并在荧光平板读数器上阅读平板，或通过其他合适的方法，以检测附着到目标化合物上的生物标志。
类似地，可以用竞争测定来确定化合物是否是组织保护性的。在竞争测定中，已知是组织保护性的化合物，包括但不限于组织保护性细胞因子，例如在美国专利申请号10/188,905和10/185,841中公开的那些，可以结合到合适的生物标志上。
在96孔板中，8个只含有1∶2系列稀释的生长培养基(RPMI 1640，10％胎牛血清，1mM丙酮酸钠，2mM L-谷氨酰胺)，其他孔中含有组织保护性化合物/生物标志、组织保护性化合物/生物标志和过量的小分子、生物的或化学的目标化合物。每份稀释液的终体积应当是约100μl。再次，将BaF3细胞接种到如上所述的平板中，并使其进行温育。经过适当的时间后，洗涤细胞，并在荧光平板读数器上阅读平板，或通过其他合适的方法，以检测生物标志。如果含有组织保护性化合物/生物标志和目标化合物的平板的读数小于只含有组织保护性化合物/生物标志的平板的读数，则目标化合物是组织保护性的。
5.3.3细胞因子和细胞增殖/分化活性本发明的受体复合物有助于在细胞因子、细胞增殖(诱导或抑制)或细胞分化(诱导或抑制)测定中鉴别组织保护性化合物(小分子，蛋白，化学试剂)。迄今为止发现的许多蛋白因子(包括所有已知的细胞因子)都已经在一种或多种因子-依赖性的细胞增殖测定中表现出活性，因而这些测定可以用于方便地确认细胞因子活性。通过细胞系的许多常规因子依赖性的细胞增殖测定的任意一种，可以证实化合物的活性，所述细胞系包括但不限于32D、DA2、DA1G、T10、B9、B9/11、BaF3、MC9/G、M+(preB M+)、2E8、RB5、DA1、123、T1165、HT2、CTLL2、TF-1、Mo7e和CMK。在有或没有实验化合物存在的情况下，培养这些细胞，并通过例如测量氚标记的胸苷的整合，或通过基于3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-联苯溴化四唑(MTT)代谢破坏的比色测定，检测细胞增殖(Mosman，1983，J.Immunol.Meth.6555-63)。除了其他方式外，可以通过化合物或配体与组织保护性细胞因子受体复合物的结合、细胞增殖、细胞分化、具有组织保护作用或组织保护活性的蛋白的上调，来测量组织保护性细胞因子受体复合物的活性。
5.3.4融合蛋白可以将受体胞外域表达为与免疫球蛋白重链恒定区、一般地是Fc片段的融合体，所述片段含有2个恒定区结构域和一个铰链区，但是缺乏可变区。这种融合体一般地分泌成多聚体分子，其中Fc部分由二硫键彼此结合，且2个受体多肽彼此紧密地临近排列。根据本发明，融合体上的受体多肽应当包含至少一个EPO-R胞外域和一个βc受体胞外域。这种类型的融合体可以用于从溶液中纯化同源配体，用作体外测定工具，用于通过特异性地滴定配体来体外地阻断信号，并通过肠胃外地施用它们以结合循环配体，并将其清除出循环而用作体内拮抗剂。为了纯化配体，在能促进受体-配体结合的条件下(一般地，接近生理温度、pH和离子强度)，将组织保护性受体复合物嵌合体加入含有配体的样品(例如细胞-条件培养基或组织提取物)中。然后，使用固定化到固体支持体(例如可溶的树脂珠)上的A蛋白，通过混合，分离嵌合体-配体复合物。然后，使用常规的化学技术，例如盐或pH梯度，来洗脱配体。在替代方案中，利用如上进行的结合和洗脱，可以使嵌合体自己结合到固体支持体上。肠胃外地(例如通过肌内的、皮下的或静脉内的注射)施用具有高结合亲和力的嵌合体。循环分子能结合配体，并通过正常的生理过程从循环中清除。为了用于测定中，可以使嵌合体通过Fc区结合到支持体上，并以ELISA形式使用。
优选的采用配体-结合受体复合物融合蛋白或配体-结合受体复合物片段的测定系统使用可商业上得到的生物传感器装置(BIAcoreTM，Pharmacia Biosensor，Piscataway，N.J.)，其中融合蛋白被固定化到受体芯片的表面上。Karlsson，1991，J.Immunol.Methods145229-240，和Cunningham和Wells，1993，J.Mol.Biol.234554-563公开了该装置的用途。使用胺或巯基化学，使融合蛋白共价地附着到葡聚糖纤维上，后者附着到流动池内的金膜上。使实验样品流过所述池。如果配体存在于样品中，则它会结合到固定化的融合蛋白上，从而造成介质的折射率的变化，后者可以被检测为金膜的表面等离子体共振的变化。该系统使得能够进行结合速率和解离速率的测定，从它可以计算出结合亲和力，并评价结合的化学计量。
配体-结合融合蛋白也可以用于本领域已知的其他测定系统中。这种系统包括用于确定结合亲和力的Scatchard分析(见，Scatchard，1949，Ann.NY Acad.Sci.51660-672)和量热测定(Cunningham等，1991，Science 253545-548；Cunningham等，1991，Science254821-825)。
受体配体-结合融合蛋白也可以用于纯化配体。融合蛋白被固定化到固体支持体上，例如琼脂糖珠、交联的琼脂糖、玻璃、纤维素树脂、基于硅石的树脂、聚苯乙烯、交联的聚丙烯酰胺，或类似的在使用条件下稳定的材料。将多肽连接到固体支持体上的方法是本领域已知的，且包括胺化学、溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧化物活化、巯基活化和酰肼活化。得到的介质通常构造成柱的形式，并使含有配体的流体流经柱一次或多次，以使配体结合到受体多肽上。然后，使用改变的盐浓度或pH来洗脱配体，以破坏配体-受体结合。
5.3.5其他测定本领域的普通技术人员能够认识到，本发明的受体复合物可以用于几个众所周知的测定中，包括但不限于Current Protocols InImmunology，vol.4，Chapter 18，2001，John E.Coligan Ed.JohnWiley and Sons公开的配体-受体测定。
如果化合物表现出组织保护活性，则本领域的普通技术人员能够认识到，它有利于证实使用一种本领域的技术人员已知的神经保护性和组织保护性测定(例如但不限于P-19、PC-12、TF-1和UT-7细胞测定)的结果。另外，与脊髓损伤、缺血性发作、外周神经损伤和心脏和眼睛有关的各种体内模型(例如动物模型)可以有助于进一步表征分离的组织保护性化合物。合适的体外和体内测定公开在美国专利申请号10/188,905和10/185,841中。
5.3.5.1使用βc(-/-)敲除的动物的测定本发明还涉及进行基因工程改造以抑制或“敲除”动物的内源βc受体的表达和/或表达人βc受体(或其突变体)的宿主细胞和动物的用途。这种转基因动物可以用于鉴别神经保护性途径和能活化神经保护性途径的化合物的方法中。
使用定向同源重组，通过灭活或“敲除”靶基因或它的启动子，可以降低内源靶基因的表达(例如见Smithies等，1985，Nature317，230-234；Thomas & Capecchi，1987，Cell 51，503-512；Thompson等，1989，Cell 5，313-321；它们每一个都在这里整体引作参考)。例如，可以使用侧翼连接与内源靶基因同源的DNA(靶基因的编码区或调节区)的突变体、无功能的靶基因(或完全无关的DNA序列)，有或没有选择标记和/或负选择标记，以转染能体内表达靶基因的细胞。通过定向的同源重组，插入DNA构建体，会导致靶基因的灭活。该方案特别适用于修饰ES(胚胎干)细胞，所述ES细胞可以用于生成具有失活的靶基因的动物后代(例如，见Thomas & Capecchi，1987和Thompson，1989，同上)。但是，该方案可以适用于人，前提是使用适当的病毒载体，将重组DNA构建体直接地施用或靶向到所需的体内位点。
一旦已经生成了βc受体(-/-)敲除的动物，则可以使用标准技术，测定重组的βc受体基因的表达。通过DNA印迹分析或PCR技术，可以完成初步筛选，以分析动物组织，以用于测定是否已经发生了内源基因的敲除。使用包括但不限于对从动物得到的组织样品的RNA印迹分析、原位杂交分析和RT-PCR(逆转录酶PCR)的技术，也可以评价转基因动物组织中的转基因的mRNA表达水平。使用对βc受体转基因产物特异性的抗体，也可以免疫细胞化学地评估βc受体基因-表达组织的样品。
在本发明的一个实施方案中，将βc受体(-/-)敲除的动物用于鉴别参与组织保护活性的途径和/或化合物的测定中。例如，可以给正常的和βc受体(-/-)敲除的动物施用已知会造成组织损伤(例如局部缺血)的试剂或力。然后，可以给2种动物施用化合物，并测定化合物的组织保护活性。检测组织保护活性的方法是本领域的普通技术人员熟知的，且这些方法的实例公开在PCT公开号WO02/053580中，其在这里整体引作参考。如果在正常动物中观察到了组织保护活性，但是在施用相同化合物的βc受体(-/-)敲除的动物中没有观察到，则鉴别出了具有依赖于βc受体的组织保护活性的化合物。对鉴别出的βc受体依赖性的组织保护途径的进一步研究，可以由确定化合物是否结合βc受体或其复合物，或鉴别仅仅存在于表现出组织保护活性的动物中的蛋白或mRNA转录物组成。申请人假设可能存在组织保护的第二途径或多余途径，且βc受体(-/-)敲除的动物可以用于研究这种途径。
5.4化合物本发明的筛选和鉴别化合物的方法可以使用许多类型的化合物，包括但不限于小分子、有机分子、无机分子、肽、多肽、肽类似物(包括包含非天然存在的氨基酸(例如D-氨基酸)，氨基酸的磷类似物，例如D-氨基磷酸和D-氨基磷酸，或具有非肽键的氨基酸的肽)、核酸类似物(例如硫代磷酸酯和PNA)。
通过本发明的方法可以测试和鉴别出的化合物包括但不限于从任意商业来源得到的化合物，所述的商业来源包括Aldrich(Milwaukee，WI 53233)，Sigma Chemical(St.Louis，MO)，Fluka Chemie AG(Buchs，瑞士)Fluka Chemical Corp.(Ronkonkoma，NY)，Eastman Chemical Company，Fine Chemicals(Kingsport，TN)，Boehringer Mannheim GmbH(Mannheim，德国)，Takasago(Rockleigh，NJ)，SST Corporation(Clifton，NJ)，Ferro(Zachary，LA 70791)，Riedel-deHaen Aktiengesellschaft(Seelze，德国)，PPG Industries Inc.，Fine Chemicals(Pittsburgh，PA 15272)。使用本发明的方法可以筛选的其他任意种类的天然产物包括微生物、真菌、植物或动物提取物。
多肽或蛋白文库也可以用于本发明的测定中。例如，实验化合物可以是小分子、有机分子、无机分子或肽。根据本发明的方法可以筛选的这样的化合物文库的实例包括但不限于类肽；随机的生物低聚物(biooligomer)；diversomers，例如乙内酰脲，苯二氮_类和二肽；插烯的多肽；非肽的肽模拟物(peptidomimetic)；氨基甲酸酯低聚物；肽酰膦酸酯；肽核酸文库；抗体文库；碳水化合物文库；和小分子文库(小有机或无机分子文库)。这种文库的实例包括但不限于随机的肽文库；(见，例如Lam等，1991，Nature 35482-84；Houghten等，1991，Nature 35484-86)，和由D-和/或L-构型的氨基酸制备的源自组合化学的分子文库，磷酸肽(包括但不限于随机的或部分简并的、定向的磷酸肽文库的成员；见，例如Songyang等，1993，Cell72767-778)，抗体(包括但不限于多克隆的、单克隆的、人源化的、抗-独特型的、嵌合的或单链抗体，和FAb，F(ab′)2和FAb表达文库片段，和其表位-结合片段)，和小有机分子或无机分子。
在本发明的一个实施方案中，肽文库可以用作实验化合物的来源，其可以用于筛选组织保护性细胞因子受体复合物(例如EPO-组织保护性细胞因子受体复合物)相互作用的调节剂。可以筛选多样性文库(例如随机的或组合的肽或非肽文库)中的能特异性地结合组织保护性细胞因子受体复合物的分子。可以使用的许多文库是本领域已知的，例如化学合成文库、重组的(例如噬菌体展示文库)和基于体外翻译的文库。
化学合成文库的实例描述在，Fodor等，1991，Science251767-773；Houghten等，1991，Nature 35484-86；Lam等，1991，Nature 35482-84；Medynski，1994，Bio/Technology 12709-710；Gallop等，1994，J.Medicinal Chemistry 37(9)1233-1251；Ohlmeyer等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9010922-10926；Erb等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9111422-11426；Houghten等，1992，Biotechniques 13412；Jayawickreme等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 911614-1618；Salmon等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9011708-11712；PCT公开号WO 93/20242；和Brenner和Lerner，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA895381-5383。
噬菌体展示文库的实例描述在，Scott & Smith，1990，Science249386-390；Devlin等，1990，Science，249404-406；Christian等，1992，J.Mol.Biol.227711-718；Lenstra，1992，J.Immunol.Meth.152149-157；Kay等，1993，Gene 12859-65；和1994年8月18日公开的PCT公开号WO 94/18318。
作为非肽文库的实例，可以使用苯二氮_类文库(见例如Bunin等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 914708-4712)。也可以使用类肽文库(Simon等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA899367-9371)。Ostresh等(1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9111138-11142)描述了可以使用的文库的另一个实例，其中已经对肽中的酰胺官能团进行了过甲基化(permethylate)，以生成化学转化的组合文库。
通过许多通常已知的方法中的任一种，可以完成筛选文库。见，例如下面的公开了肽文库的筛选的参考文献Parmley & Smith，1989，Adv.Exp.Med.Biol.251215-218；Scott & Smith，1990，Science249386-390；Fowlkes等，1992；BioTechniques 13422-427；Oldenburg等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895393-5397；Yu等，1994，Cell 76933-945；Staudt等，1988，Science241577-580；Bock等，1992，Nature 355564-566；Tuerk等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896988-6992；Ellington等，1992，Nature 355850-852；Ladner等的美国专利号5,096,815，美国专利号5,223,409和美国专利号5,198,346；Rebar & Pabo，1993，Science 263671-673；和PCT公开号WO 94/18318。
在优选的实施方案中，组合文库是小有机分子文库，例如但不限于苯二氮_类、类异戊二烯、噻唑烷酮(thiazolidinones)、metathiazanones、吡咯烷、吗啉代化合物和苯二氮_类。在另一个实施方案中，组合文库包含类肽；随机的生物寡聚物；苯二氮_类；diversomers，例如乙内酰脲、苯二氮_类和二肽；插烯的多肽；非肽的肽模拟物；氨基甲酸酯低聚物；肽酰膦酸酯；肽核酸文库；抗体文库；或碳水化合物文库。组合文库本身是可商业上得到的(见，例如ComGenex，Princeton，New Jersey；Asinex，Moscow，Ru，Tripos，Inc.，St.Louis，Missouri；ChemStar，Ltd，Moscow，俄罗斯；3D Pharmaceuticals，Exton，Pennsylvania；Martek Biosciences，Columbia，Maryland；等)。
在优选的实施方案中，预选文库，从而使文库的化合物更能适合于细胞摄入。例如，基于特定的参数选择化合物，例如但不限于大小、亲脂性、亲水性和氢键，它们能增强进入细胞的化合物的可能性。在另一个实施方案中，通过三维的或四维的计算机计算程序分析化合物。
在一个实施方案中，用于本发明方法的组合化合物文库可以是合成的。在指向建立大量的小有机化合物或文库(将筛选它们的药理学的、生物学的或其他的活性)的合成方法中，有极大的重要性。用于建立巨大的组合文库的合成方法，是在溶液中或在固相(即在固体支持体上)中进行的。固相合成使得进行多步反应和驱动高产率地完成反应更容易，这是因为可以容易地加入过量的试剂，并在每个反应步骤后洗去。固相组合合成也意在改进分离、纯化和筛选。但是，更传统的液相化学能支持比固相化学更多种类的有机反应。
使用这里整体引作参考的Kilcoin等的美国专利号6,190,619所述的装置，可以合成本发明的组合化合物文库。美国专利号6,190,619公开了合成装置，它能容纳许多反应容器，用于平行地合成多种分离的化合物或化合物的组合文库。
在一个实施方案中，可以在溶液中合成组合化合物文库。这里整体引作参考的Boger等的美国专利号6,194,612所公开的方法的特征在于用作液相合成组合文库的模板的化合物。该模板被设计为使反应产物能通过液/液或固/液萃取，容易地从未反应的反应剂中纯化出来。由使用该模板的组合合成生产的化合物优选地是小有机分子。文库中的有些化合物可以模仿非肽或肽的作用。与固相合成组合化合物文库相反，液相合成不需要使用用于监控多步固相合成的单独步骤的专门规程(Egner等，1995，J.Org.Chem.602652；Anderson等，1995，J.Org.Chem.602650；Fitch等，1994，J.Org.Chem.597955；Look等，1994，J.Org.Chem.497588；Metzger等，1993，Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.32894；Youngquist等，1994，RapidCommun.Mass Spect.877；Chu等，1995，J.Am.Chem.Soc.1175419；Brummel等，1994，Science 264399；Stevanovic等，1993，Bioorg.Med.Chem.Lett.3431)。
用于本发明方法的组合化合物文库可以是在固体支持体上合成的。在一个实施方案中，将分裂合成方法，即在合成过程中分离和混合固体支持体的规程用于在固体支持体上合成化合物文库(见例如Lam等，1997，Chem.Rev.9741-448；Ohlmeyer等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9010922-10926和其中引用的参考文献)。最终文库中的每种固体支持体基本上具有一种类型的附着到它的表面上的化合物。本领域的技术人员已知用于在固体支持体上合成组合文库的其他方法，其中一种产物附着到每一种支持体上(见，例如Nefzi等，1997，Chem.Rev.97449-472)。
如本文所使用的，术语“固体支持体”不限于特定种类的固体支持体。相当大量的支持体是可得到的，且是本领域的技术人员已知的。固体支持体包括硅胶、树脂、衍生的塑料膜、玻璃珠、棉花、塑料珠、聚苯乙烯珠、铝凝胶和多糖。基于所需的最终用途和对各种合成规程的适应性，可以选择合适的固体支持体。例如，对于肽合成，固体支持体可以是树脂，例如对甲基二苯甲基胺(pMBHA)树脂(Peptides International，Louisville，KY)，聚苯乙烯(例如从Bachem Inc.，Peninsula Laboratories得到的PAM-树脂，等)，包括氯甲基聚苯乙烯、羟甲基聚苯乙烯和氨甲基聚苯乙烯，聚(二甲替丙烯酰胺)-接枝的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物(例如从Aminotech，加拿大得到的POLYHIPE树脂)，聚酰胺树脂(从PeninsulaLaboratories得到)，与聚乙二醇接枝的聚苯乙烯树脂(例如TENTAGEL或ARGOGEL，Bayer，Tubingen，德国)聚二甲基丙烯酰胺树脂(从Milligen/Biosearch，California得到)，或Sepharose(Pharmacia，瑞典)。
在本发明的一些实施方案中，化合物可以通过接头附着到固体支持体上。接头可以是完整的固体支持体和它的一部分，或者它们可以是非整合的，其在固体支持体上合成或在合成后附着到固体支持体上。接头不仅仅用于提供化合物向固体支持体附着的点，还使得能够根据接头的性质，在不同的条件下，从固体支持体切割下不同组的分子。例如，尤其可以亲电子地切割、亲核地切割、光切割、催促切割、由金属切割、在还原条件下切割或在氧化条件下切割接头。在优选的实施方案中，在高通量筛选化合物之前，从固体支持体切割化合物。
在某些实施方案中，本发明的化合物是细胞因子。可以用于本发明的筛选方法和治疗或预防方法中的细胞因子的实例包括但不限于IL-1α、IL-1β、IL-1β、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-13、IL-12、IL-15、IL-18、TNF-α、脑-衍生的神经营养因子、骨形态发生蛋白-2、β-神经生长因子、睫状神经营养因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子-酸性的、成纤维细胞生长因子-碱性的、粒细胞-集落刺激因子、粒细胞-集落刺激因子、人生长激素、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子、肝细胞生长因子、干扰素-α2a、干扰素-α2b、干扰素-α1b、干扰素-β1a、干扰素-β1b、干扰素-γ、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、角质形成细胞生长因子、神经营养蛋白-3、血小板衍生生长因子-bb、干细胞因子、坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、血管内皮生长因子、瘦素或促乳素。在某些化合物是细胞因子的实施方案中，重组地生产化合物。在某些化合物是细胞因子的实施方案中，化合物是人的。
在本发明的方法的实施方案中，其中化合物是小分子，该小分子可以是对EPO受体特异性的，例如可从Receptron得到的那些(Receptron，Inc.Mountain View，CA)。小分子的其他实例包括Goldberg等(2002，J.Amer.Chem.Soc.124544-555)和Boger和Goldberg(2001，Bioorg.and Org.Chem.9557-562)公开的那些。
5.4.1.1修饰的EPO和EPO突变体在本发明的某些实施方案中，在测定中使用的实验化合物和/或在用于鉴别能调节组织保护性细胞因子受体复合物和其配体的相互作用的化合物的测定中使用的组织保护性细胞因子受体复合物配体是化学修饰的EPO、突变的EPO或其组合。例如，在2003年4月17日公开号为20030072737-A1的美国专利申请号10/188,905，和美国专利申请号10/612,665，它们公开了化学修饰的和/或突变的EPO，并在这里整体引作参考。这种化学修饰的和/或突变的分子可以用于本文所述的本发明的筛选测定中。(也见PCT申请号PCT/US01/49479，美国专利申请号10/188,905，和10/185,841，其在这里整体引作参考)。这些组织保护性细胞因子能保护、维持、增强和/或恢复促红细胞生成素-反应性的哺乳动物细胞、组织和器官的功能和/或生存力，它们包括但不限于神经元的、视网膜的、肌肉的、心脏的、肾的细胞或组织。
可以用于本发明的方法中的化学修饰的EPO分子包括，例如，与天然促红细胞生成素相比，且优选地与天然人促红细胞生成素相比，已经通过至少一个修饰改变了的促红细胞生成素。所述至少一个修饰可以是促红细胞生成素分子的至少一个氨基酸的修饰或促红细胞生成素分子的至少一个碳水化合物的修饰。当然，与天然分子相比，用于本文目的的化学修饰的EPO可以具有许多修饰，例如，该分子的氨基酸部分的多个修饰、该分子的碳水化合物部分的多个修饰、或该分子的氨基酸部分的至少一个修饰和该分子的碳水化合物部分的至少一个修饰。化学修饰的EPO分子保留它的保护、维持、增强或恢复反应性的哺乳动物细胞的功能或生存力的能力，然而与天然分子相比，缺乏了一种或多种与前述的所需特征无关的促红细胞生成素分子性质。在优选的实施方案中，化学修饰的EPO缺乏促红细胞生成素对骨髓的作用，即提高的血细胞比容(红细胞生成)、血管收缩(高血压)、增高的血压、血小板超活化、促凝血活性和提高的血小板生成。更优选地，化学修饰的EPO缺乏红细胞生成；最优选地，化学修饰的EPO缺乏促红细胞生成素对骨髓的所有作用。
作为实例，本发明的化学修饰的EPO可以是脱唾液酸促红细胞生成素(asialoerythropoietin)。在另一个实例中，本发明的化学修饰的EPO可以是已经与一种或多种能修饰天然促红细胞生成素或脱唾液酸促红细胞生成素的氨基酸残基的一个或多个氨基的试剂反应的促红细胞生成素或脱唾液酸促红细胞生成素。在优选的实施方案中，化学修饰的EPO是非促红细胞生成的。
在一个实施方案中，化学修饰的EPO是不具有唾液酸部分的促红细胞生成素。在优选的实施方案中，化学修饰的EPO是脱唾液酸促红细胞生成素，且最优选地，是人脱唾液酸促红细胞生成素。在另一个实施方案中，化学修饰的EPO具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个唾液酸部分。这种部分地脱唾液酸化(desialylated)的促红细胞生成素在本文中称作低唾液酸促红细胞生成素(hyposialoerythropoietin)。它们可以通过天然促红细胞生成素的化学修饰或酶促修饰来制备，或可以通过在根本不能唾液酸化(sialylate)该分子或仅仅能部分地唾液酸化促红细胞生成素的系统中表达来得到。包括本发明的脱唾液酸促红细胞生成素和低唾液酸促红细胞生成素，无论该分子的制备方法如何。
在另一个优选的实施方案中，化学修饰的EPO包含促红细胞生成素分子的至少一个或多个修饰的赖氨酸残基或N-末端氨基修饰，这种修饰例如由赖氨酸ε氨基或N-末端氨基与一种或多种氨基-修饰剂的反应得到的那些修饰。修饰的赖氨酸残基或修饰的N-末端氨基还可以是化学还原的。在一个优选的实施方案中，促红细胞生成素是在一个或多个赖氨酸基团或在N-末端生物素化的、氨甲酰基化的、琥珀酰化的或乙酰化的。在另一个优选的实施方案中，使赖氨酸与醛或还原糖反应，以形成亚胺，然后任选地通过化学还原稳定化所述亚胺，例如通过使用氰基硼氢钠以形成N-烷基化的赖氨酸残基，例如葡萄糖醇基赖氨酸，或者在还原糖的情况下，可以通过Amadori或Heyns重排来稳定化所述亚胺，以形成α-脱氧α-氨基糖，例如α-脱氧-α-果糖基赖氨酸。在另一个优选的实施方案中，赖氨酸或N-末端氨基是氨甲酰基化的，例如，依靠与氰酸根离子的反应，分别用烷基-异氰酸盐、芳基-异氰酸盐或芳基-异硫氰酸盐进行烷基-氨甲酰基化、芳基-氨甲酰基化或芳基-硫代氨甲酰基化，或者通过反应性烷基羧酸或芳基羧酸衍生物对其进行酰化，例如通过与乙酐、琥珀酐或邻苯二甲酸酐的反应。通过与三硝基苯磺酸、优选地与它的一种盐反应，也可以对至少一个赖氨酸基团或N-末端氨基进行三硝基苯基修饰。在另一个实施方案中，可以通过与乙二醛反应，例如与乙二醛、甲基乙二醛或3-脱氧葡糖醛酮反应修饰赖氨酸残基，以形成对应的α-羧基烷基衍生物。
在另一个实施方案中，通过使用亲电子试剂，修饰促红细胞生成素的至少一个酪氨酸残基，例如但不限于通过硝化或碘化修饰，以修饰芳族环位置，可以生成化学修饰的EPO。
如上所述，用于本文目的的组织保护剂可以具有至少一个前述的修饰，但是也可以具有多个上述修饰。作为具有一个对分子的氨基酸部分的修饰和任选的对分子的碳水化合物部分的修饰的化学修饰的EPO的实例，化学修饰的EPO是氨甲酰基促红细胞生成素、氨甲酰基脱唾液酸促红细胞生成素、氨甲酰基低唾液酸促红细胞生成素、乙酰促红细胞生成素、乙酰脱唾液酸促红细胞生成素、乙酰低唾液酸促红细胞生成素、琥珀酰促红细胞生成素、琥珀酰脱唾液酸促红细胞生成素、琥珀酰低唾液酸促红细胞生成素、生物素基促红细胞生成素(biotinylerythropoietin)、生物素基脱唾液酸促红细胞生成素、生物素基低唾液酸促红细胞生成素、碘代促红细胞生成素、碘代脱唾液酸促红细胞生成素、碘代低唾液酸促红细胞生成素、N-ε-羧甲基促红细胞生成素、N-ε-羧甲基促红细胞生成素、N-ε-羧甲基低唾液酸促红细胞生成素和葡萄糖醇基促红细胞生成素、葡萄糖醇基脱唾液酸促红细胞生成素、glucitolylasialohypoerythropoietin。这些化合物仅仅是本发明的修饰的促红细胞生成素的示例。前面的俗名仅仅代表了天然促红细胞生成素分子的修饰，且如前文所述的，氨基的修饰可以是在赖氨酸残基的一个或多个ε氨基或N-末端氨基上，或者，在硝基-或碘代-修饰的促红细胞生成素的情况下，是在一个或多个酪氨酸残基上。本文包括了前面的任意组合。本发明还包括化学修饰的EPO，其包含一种或多种前述的化学修饰。
在本发明的另一个方面，提供了通过施用有效量的任意一种或多种前述的化学修饰的EPO或能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物，例如通过本发明的筛选方法鉴别出的那些化合物，保护、维持、增强或恢复反应性的哺乳动物细胞和它们的关联细胞、组织和器官的功能或生存力的方法。在本方法的一个具体方面，反应性的哺乳动物细胞和它们的关联细胞、组织或器官借助于致密的内皮细胞屏障位于脉管系统的远端。在另一个具体的方面，细胞、组织、器官或其他身体部分是分离自哺乳动物的身体的，例如意在用于移植或再附着的那些。作为非限制性的实例，反应性的细胞或组织可以是神经元的、视网膜的、肌肉的、心脏的、肺的、肝的、肾的、小肠的、肾上腺皮质的、肾上腺髓质、毛细管内皮的、睾丸的、卵巢的、胰的、皮肤的、骨的或子宫内膜的细胞或组织。这些反应性的细胞的实例仅仅是说明性的。在一个具体的实施方案中，反应性的细胞或它的关联细胞、组织或器官不是可兴奋细胞、组织或器官，或不主要包含可兴奋细胞或组织。在另一个具体的实施方案中，可以施用前述的化学修饰的EPO或能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物(例如通过本发明的筛选方法鉴别出的那些化合物)的哺乳动物细胞、组织或器官是已经或即将在至少一种不利于该细胞、组织或器官的生存力的条件下度过一段时间的那些哺乳动物细胞、组织或器官。这种条件可以包括创伤的原位缺氧或代谢功能障碍、手术诱导的原位缺氧或代谢功能障碍或原位毒素暴露；后者可以与化疗或放疗有关。在一个实施方案中，本发明保护免受由心肺旁路术导致的不利状况。
本发明还提供了使用化学修饰的EPO的筛选方法，所述的化学修饰的EPO是i)缺乏唾液酸部分的促红细胞生成素；ii)缺乏N-连接的或缺乏O-连接的碳水化合物的促红细胞生成素；iii)通过用至少一种糖苷酶处理天然促红细胞生成素，得到的具有减少的碳水化合物含量的促红细胞生成素；iv)具有至少一种或多种氧化的碳水化合物的促红细胞生成素；v)包含至少一种或多种氧化的碳水化合物的化学还原的促红细胞生成素；vi)包含至少一个或多个修饰的精氨酸残基的促红细胞生成素；vii)包含促红细胞生成素分子的至少一个或多个修饰的赖氨酸残基或N-末端氨基修饰的促红细胞生成素；viii)包含至少一个修饰的酪氨酸残基的促红细胞生成素；ix)包含至少一个修饰的天冬氨酸或谷氨酸残基的促红细胞生成素；x)包含至少一个修饰的色氨酸残基的促红细胞生成素；xi)具有至少一个去除的氨基的促红细胞生成素；xii)在促红细胞生成素分子中包含至少一个胱氨酸键的至少一个断开的促红细胞生成素；或xiii)截短的促红细胞生成素。
在一个实施方案中，用于本发明的方法中的化学修饰的EPO是脱唾液酸促红细胞生成素或苯基乙二醛-促红细胞生成素。在另一个实施方案中，化学修饰的EPO能穿越内皮细胞屏障。内皮细胞屏障可以选自血-脑屏障、血-眼屏障、血-睾丸屏障、血-卵巢屏障和血-子宫屏障。
本发明还提供了用于本发明的方法的化学修饰的EPO或能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物，例如通过本发明的筛选方法鉴别出的那些化合物，它是促红细胞生成素。在优选的实施方案中，化合物是脱唾液酸促红细胞生成素。在优选的实施方案中，化合物是人脱唾液酸促红细胞生成素。化学修饰的EPO优选地是没有N-连接的碳水化合物的促红细胞生成素。化学修饰的EPO优选地是没有O-连接的碳水化合物的促红细胞生成素。在一个实施方案中，化学修饰的EPO是用至少一种糖苷酶处理的促红细胞生成素。在另一个实施方案中，化学修饰的EPO是高碘酸盐-氧化的促红细胞生成素。优选地用氰基硼氢钠化学还原高碘酸盐-氧化的促红细胞生成素。在一个实施方案中，化学修饰的EPO是在一个或多个精氨酸残基上包含R-乙二醛部分的促红细胞生成素，其中R是芳基或烷基部分。促红细胞生成素优选地是苯基乙二醛-促红细胞生成素。在另一个实施方案中，化学修饰的EPO是促红细胞生成素，其中至少一个精氨酸残基是通过与选自2，3-丁二酮和环己二酮的邻二酮反应修饰的。在另一个实施方案中，本发明的化学修饰的EPO是促红细胞生成素，其中至少一个精氨酸残基与3-脱氧葡糖醛酮反应。在另一个实施方案中，化学修饰的EPO是促红细胞生成素分子，其包含至少一个生物素化的赖氨酸或N-末端氨基。促红细胞生成素分子可以是生物素化的促红细胞生成素。
本发明还提供了化学修饰的EPO，它是葡萄糖醇基赖氨酸促红细胞生成素或果糖基赖氨酸促红细胞生成素。
在一个实施方案中，本发明的方法中的化学修饰的EPO是具有至少一个氨甲酰基化的赖氨酸残基的促红细胞生成素。在另一个实施方案中，氨甲酰基化的促红细胞生成素选自α-N-氨甲酰基促红细胞生成素；N-ε-氨甲酰基促红细胞生成素；α-N-氨甲酰基，N-ε-氨甲酰基促红细胞生成素；α-N-氨甲酰基脱唾液酸促红细胞生成素；N-ε-氨甲酰基脱唾液酸促红细胞生成素；α-N-氨甲酰基，N-ε-氨甲酰基脱唾液酸促红细胞生成素；α-N-氨甲酰基低唾液酸促红细胞生成素；N-ε-氨甲酰基低唾液酸促红细胞生成素；和α-N-氨甲酰基，N-ε-氨甲酰基低唾液酸促红细胞生成素。
在一个实施方案中，本发明的方法中的化学修饰的EPO是促红细胞生成素，其中至少一个赖氨酸残基是酰化的。在另一个实施方案中，所述促红细胞生成素的赖氨酸残基是乙酰化的。在另一个实施方案中，乙酰化的促红细胞生成素选自α-N-乙酰促红细胞生成素；N-ε-乙酰促红细胞生成素；α-N-乙酰，N-ε-乙酰促红细胞生成素；α-N-乙酰脱唾液酸促红细胞生成素；N-ε-乙酰脱唾液酸促红细胞生成素；α-N-乙酰，N-ε-乙酰脱唾液酸促红细胞生成素；α-N-乙酰低唾液酸促红细胞生成素；N-ε-酰低唾液酸促红细胞生成素；和α-N-乙酰，N-ε-乙酰低唾液酸促红细胞生成素。
在一个实施方案中，本发明的化学修饰的EPO是包含琥珀酰化的赖氨酸残基的促红细胞生成素。在一个实施方案中，促红细胞生成素选自α-N-琥珀酰促红细胞生成素；N-ε-琥珀酰促红细胞生成素；α-N-琥珀酰，N-ε-琥珀酰促红细胞生成素；α-N-琥珀酰基脱唾液酸促红细胞生成素；N-ε-琥珀酰脱唾液酸促红细胞生成素；α-N-琥珀酰，N-ε-琥珀酰脱唾液酸促红细胞生成素；α-N-琥珀酰低唾液酸促红细胞生成素；N-ε-琥珀酰低唾液酸促红细胞生成素；和α-N-琥珀酰，N-ε-琥珀酰低唾液酸促红细胞生成素。
在一个实施方案中，本发明的方法中的化学修饰的EPO是具有至少一个被2，4，6-三硝基苯磺酸盐修饰的赖氨酸残基的促红细胞生成素。在本发明的一个方面，该盐是2，4，6-三硝基苯磺酸钠。
在另一个实施方案中，本发明的方法中的化学修饰的EPO是促红细胞生成素，其中至少一个酪氨酸残基是硝化的和/或碘化的。
在另一个实施方案中，本发明的方法中的化学修饰的EPO是促红细胞生成素，其中天冬氨酸和/或谷氨酸残基与碳化二亚胺反应，随后与胺反应。在本发明的一个方面，该胺是甘氨酰胺。
也可以使用突变的EPO分子，例如，组织保护性细胞因子受体复合物配体可以是突变的EPO，其可以重组地生成，包含一个或多个位于SEQ ID NO10的位置11-15之间[SEQ ID NO1]、位于SEQ ID NO10的位置44-51之间[SEQ ID NO2]、位于SEQ ID NO 10的位置100-108之间[SEQ ID NO3]或位于SEQ ID NO 10的位置146-151之间[SEQ IDNO4]的改变的氨基酸残基。
在另一个实施方案中，组织保护性细胞因子受体复合物配体是突变的EPO，其包含一个或多个SEQ ID NO10的下述位置的改变的氨基酸残基7、20、21、29、33、38、42、59、63、67、70、83、96、126、142、143、152、153、155、156或161。
在另一个实施方案中，组织保护性细胞因子受体复合物配体是突变的EPO，其包含具有一个或多个下述改变的SEQ ID NO10的氨基酸序列(已经为每个改变的序列指定了单独的序列标识号)在SEQ IDNO10的残基6处的丙氨酸(SEQ ID NO15)；在SEQ ID NO10的残基7处的丙氨酸(SEQ ID NO16)；在SEQ ID NO10的残基7处的丝氨酸(SEQ ID NO17)；在SEQ ID NO10的残基10处的异亮氨酸(SEQ ID NO18)；在SEQ ID NO10的残基11处的丝氨酸(SEQ IDNO19)；在SEQ ID NO10的残基12处的丙氨酸(SEQ ID NO20)；在SEQ ID NO10的残基13处的丙氨酸(SEQ ID NO21)；在SEQ IDNO10的残基14处的丙氨酸(SEQ ID NO22)；在SEQ ID NO10的残基14处的谷氨酸(SEQ ID NO23)；在SEQ ID NO10的残基14处的谷氨酰胺(SEQ ID NO24)；在SEQ I D NO10的残基15处的丙氨酸(SEQ ID NO25)；在SEQ ID NO10的残基15处的苯丙氨酸(SEQ ID NO26)；在SEQ ID NO10的残基15处的异亮氨酸(SEQID NO27)；在SEQ ID NO10的残基20处的谷氨酸(SEQ ID NO28)；在SEQ ID NO10的残基20处的丙氨酸(SEQ ID NO29)；在SEQ IDNO10的残基21处的丙氨酸(SEQ I D NO30)；在SEQ ID NO10的残基24处的赖氨酸(SEQ ID NO31)；在SEQ ID NO10的残基29处的丝氨酸(SEQ ID NO32)；在SEQ ID NO10的残基29处的酪氨酸(SEQ ID NO33)；在SEQ ID NO10的残基30处的天冬酰胺(SEQ ID NO34)；在SEQ ID NO10的残基32处的苏氨酸(SEQ ID NO35)；在SEQ ID NO10的残基33处的丝氨酸(SEQ ID NO36)；在SEQ ID NO10的残基33处的酪氨酸(SEQ ID NO37)；在SEQ ID NO10的残基38处的赖氨酸(SEQ ID NO38)；在SEQ ID NO10的残基83处的赖氨酸(SEQ ID NO39)；在SEQ ID NO10的残基42处的天冬酰胺(SEQ ID NO40)；在SEQ ID NO10的残基42处的丙氨酸(SEQ ID NO41)；在SEQ ID NO10的残基43处的丙氨酸(SEQ IDNO42)；在SEQ ID NO10的残基44处的异亮氨酸(SEQ ID NO43)；在SEQ ID NO10的残基45处的天冬氨酸(SEQ ID NO44)；在SEQID NO10的残基45处的丙氨酸(SEQ ID NO45)；在SEQ ID NO10的残基46处的丙氨酸(SEQ ID NO46)；在SEQ ID NO10的残基47处的丙氨酸(SEQ ID NO47)；在SEQ ID NO10的残基48处的异亮氨酸(SEQ ID NO48)；在SEQ ID NO10的残基48处的丙氨酸(SEQ ID NO49)；在SEQ ID NO10的残基49处的丙氨酸(SEQ ID NO50)；在SEQ ID NO10的残基49处的丝氨酸(SEQ ID NO51)；在SEQ ID NO10的残基51处的苯丙氨酸(SEQ ID NO52)；在SEQ IDNO10的残基51处的天冬酰胺(SEQ ID NO53)；在SEQ ID NO10的残基52处的丙氨酸(SEQ ID NO54)；在SEQ ID NO10的残基59处的天冬酰胺(SEQ ID NO55)；在SEQ ID NO10的残基62处的苏氨酸(SEQ ID NO56)；在SEQ ID NO10的残基67处的丝氨酸(SEQ ID NO57)；在SEQ ID NO10的残基70处的丙氨酸(SEQ ID NO58)；在SEQ ID NO10的残基96处的精氨酸(SEQ ID NO59)；在SEQ ID NO10的残基97处的丙氨酸(SEQ ID NO60)；在SEQ ID NO10的残基100处的精氨酸(SEQ ID NO61)；在SEQ ID NO10的残基100处的谷氨酸(SEQ ID NO62)；在SEQ ID NO10的残基100处的丙氨酸(SEQ ID NO63)；在SEQ ID NO10的残基100处的苏氨酸(SEQ ID NO64)；在SEQ ID NO10的残基101处的丙氨酸(SEQID NO65)；在SEQ ID NO10的残基101处的异亮氨酸(SEQ ID NO66)；在SEQ ID NO10的残基102处的丙氨酸(SEQ ID NO67)；在SEQ ID NO10的残基103处的丙氨酸(SEQ ID NO68)；在SEQ ID NO10的残基103处的谷氨酸(SEQ ID NO69)；在SEQ ID NO10的残基104处的丙氨酸(SEQ ID NO70)；在SEQ ID NO10的残基104处的异亮氨酸(SEQ ID NO71)；在SEQ ID NO10的残基105处的丙氨酸(SEQ ID NO72)；在SEQ ID NO10的残基106处的丙氨酸(SEQ ID NO73)；在SEQ ID NO10的残基106处的异亮氨酸(SEQ IDNO74)；在SEQ ID NO10的残基107处的丙氨酸(SEQ ID NO75)；在SEQ ID NO10的残基107处的亮氨酸(SEQ ID NO76)；在SEQ IDNO10的残基108处的赖氨酸(SEQ ID NO77)；在SEQ ID NO10的残基108处的丙氨酸(SEQ ID NO78)；在SEQ ID NO10的残基108处的丝氨酸(SEQ ID NO79)；在SEQ ID NO10的残基116处的丙氨酸(SEQ ID NO80)；在SEQ ID NO10的残基126处的丙氨酸(SEQ ID NO81)；在SEQ ID NO10的残基132处的丙氨酸(SEQ IDNO82)；在SEQ ID NO10的残基133处的丙氨酸(SEQ ID NO83)；在SEQ ID NO10的残基134处的丙氨酸(SEQ ID NO84)；在SEQ IDNO10的残基140处的丙氨酸(SEQ ID NO85)；在SEQ ID NO10的残基142处的异亮氨酸(SEQ ID NO86)；在SEQ ID NO10的残基143处的丙氨酸(SEQ ID NO87)；在SEQ ID NO10的残基146处的丙氨酸(SEQ ID NO88)；在SEQ ID NO10的残基147处的赖氨酸(SEQ ID NO89)；在SEQ ID NO10的残基147处的丙氨酸(SEQID NO90)；在SEQ ID NO10的残基148处的酪氨酸(SEQ ID NO91)；在SEQ ID NO10的残基148处的丙氨酸(SEQ ID NO92)；在SEQ IDNO10的残基149处的丙氨酸(SEQ ID NO93)；在SEQ ID NO10的残基150处的丙氨酸(SEQ ID NO94)；在SEQ ID NO10的残基150处的谷氨酸(SEQ ID NO95)；在SEQ ID NO10的残基151处的丙氨酸(SEQ ID NO96)；在SEQ ID NO10的残基152处的丙氨酸(SEQ ID NO97)；在SEQ ID NO10的残基152处的色氨酸(SEQ IDNO98)；在SEQ ID NO10的残基153处的丙氨酸(SEQ ID NO99)；在SEQ ID NO10的残基154处的丙氨酸(SEQ ID NO100)；在SEQID NO10的残基155处的丙氨酸(SEQ ID NO101)；在SEQ ID NO10的残基158处的丙氨酸(SEQ ID NO102)；在SEQ ID NO10的残基160处的丝氨酸(SEQ ID NO103)；在SEQ ID NO10的残基161处的丙氨酸(SEQ ID NO104)；或在SEQ ID NO10的残基162处的丙氨酸(SEQ ID NO105)。在一个实施方案中，组织保护性细胞因子受体复合物配体是突变的EPO，其包含具有一个或多个SEQ ID NO15-105和119的氨基酸残基取代的SEQ ID NO10的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，组织保护性细胞因子受体复合物配体是突变的EPO，其包含缺失SEQ ID NO10的氨基酸残基44-49的SEQ IDNO10的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，组织保护性细胞因子受体复合物配体是突变的EPO，其包含具有至少一种下述变化的SEQ ID NO10的氨基酸序列(已经为每个改变的序列指定了单独的序列标识号)i)在SEQ ID NO10的残基45的天冬氨酸，和在其残基100的谷氨酸(SEQ ID NO106)；ii)在SEQ ID NO10的残基30的天冬酰胺，和在其残基32的苏氨酸(SEQ ID NO107)；iii)在SEQ ID NO10的残基45的天冬氨酸，和在其残基150的谷氨酸(SEQ ID NO108)；iv)在SEQ ID NO10的残基103的谷氨酸，和在其残基108的丝氨酸(SEQ ID NO109)；v)在SEQ ID NO10的残基140的丙氨酸，和在其残基52的丙氨酸(SEQ ID NO110)；vi)在SEQ ID NO10的残基140的丙氨酸，在其残基52的丙氨酸，在其残基45的丙氨酸(SEQ ID NO111)；vii)在SEQ ID NO10的残基97的丙氨酸，和在其残基152的丙氨酸(SEQ ID NO112)；xiii)在SEQ ID NO10的残基97的丙氨酸，在其残基152的丙氨酸，在其残基45的丙氨酸(SEQ ID NO113)；ix)在SEQ ID NO10的残基97的丙氨酸，在其残基152的丙氨酸，在其残基45的丙氨酸，和在其残基52的丙氨酸(SEQ ID NO114)；x)在SEQ ID NO10的残基97的丙氨酸，在其残基152的丙氨酸，在其残基45的丙氨酸，在其残基52的丙氨酸，和在其残基140的丙氨酸(SEQ ID NO115)；xi)在SEQ ID NO10的残基97的丙氨酸，在其残基152的丙氨酸，在其残基45的丙氨酸，在其残基52的丙氨酸，在其残基140的丙氨酸，和在其残基154的丙氨酸，在其残基24的赖氨酸，在其残基38的赖氨酸，在其残基83的赖氨酸，在其残基24的赖氨酸，和在其残基15的丙氨酸(SEQ IDNO116)；xii)在SEQ ID NO10的残基24的赖氨酸，在其残基38的赖氨酸，和在其残基83的赖氨酸(SEQ ID NO117)；或xiii)在SEQ ID NO10的残基24的赖氨酸和在其残基15的丙氨酸(SEQ ID NO118)。在一个实施方案中，组织保护性细胞因子受体复合物配体是突变的EPO，其包含具有至少一个下述的SEQ ID NO106-118氨基酸残基取代的SEQ ID NO10的氨基酸序列。
组织保护性细胞因子受体复合物配体是突变的EPO，且包含具有至少一种下述变化，即取代的SEQ ID NO10的氨基酸序列(已经为列出的每种变化或变化的组合指定了单独的序列标识号)i)在SEQID NO10的残基45的天冬氨酸，和在其残基100的谷氨酸(SEQ IDNO106)；ii)在SEQ ID NO10的残基30的天冬酰胺，和在其残基32的苏氨酸(SEQ ID NO107)；iii)在SEQ ID NO10的残基45的天冬氨酸，和在其残基150的谷氨酸(SEQ ID NO108)；iv)在SEQID NO10的残基103的谷氨酸，和在其残基108的丝氨酸(SEQ ID NO109)；v)在SEQ ID NO10的残基140的丙氨酸，和在其残基52的丙氨酸(SEQ ID NO110)；vi)在SEQ ID NO10的残基140的丙氨酸，在其残基52的丙氨酸，在其残基45的丙氨酸(SEQ ID NO111)；vii)在SEQ ID NO10的残基97的丙氨酸，和在其残基152的丙氨酸(SEQ ID NO112)；xiii)在SEQ ID NO10的残基97的丙氨酸，在其残基152的丙氨酸，在其残基45的丙氨酸(SEQ ID NO113)；ix)在SEQ ID NO10的残基97的丙氨酸，在其残基152的丙氨酸，在其残基45的丙氨酸，和在其残基52的丙氨酸(SEQ ID NO114)；x)在SEQ ID NO10的残基97的丙氨酸，在其残基152的丙氨酸，在其残基45的丙氨酸，在其残基52的丙氨酸，和在其残基140的丙氨酸(SEQ ID NO115)；xi)在SEQ ID NO10的残基97的丙氨酸，在其残基152的丙氨酸，在其残基45的丙氨酸，在其残基52的丙氨酸，在其残基140的丙氨酸，和在其残基154的丙氨酸，在其残基24的赖氨酸，在其残基38的赖氨酸，在其残基83的赖氨酸，在其残基24的赖氨酸，和在其残基15的丙氨酸(SEQ ID NO116)；xii)在SEQ ID NO10的残基24的赖氨酸，在其残基38的赖氨酸，和在其残基83的赖氨酸(SEQ ID NO117)；或xiii)在SEQ ID NO10的残基24的赖氨酸和在其残基15的丙氨酸(SEQ ID NO118)。
根据本发明的另一个方面，组织保护性细胞因子受体复合物配体是突变的EPO，其包含至少一种下述的氨基酸残基取代(已经为列出的每种变化或变化的组合指定了单独的序列标识号)在SEQ ID NO10的残基152的色氨酸(SEQ ID NO98)；在SEQ ID NO10的残基14的丙氨酸和在残基15的丙氨酸(SEQ ID NO119)；在SEQ ID NO10的残基6的丙氨酸(SEQ ID NO15)；在SEQ ID NO10的残基7的丙氨酸(SEQ ID NO16)；在SEQ ID NO10的残基43的丙氨酸(SEQ ID NO42)；在SEQ ID NO10的残基42的丙氨酸(SEQ ID NO41)；在SEQ ID NO10的残基48的丙氨酸(SEQ ID NO49)；在SEQID NO10的残基49的丙氨酸(SEQ ID NO50)；在SEQ ID NO10的残基32的苏氨酸(SEQ ID NO35)；在SEQ ID NO10的残基133的丙氨酸(SEQ ID NO83)；在SEQ ID NO10的残基134的丙氨酸(SEQ ID NO84)；在SEQ ID NO10的残基147的丙氨酸(SEQ ID NO90)；在SEQ ID NO10的残基148的丙氨酸(SEQ ID NO92)；在SEQ ID NO10的残基150的丙氨酸(SEQ ID NO94)；在SEQ ID NO10的残基151的丙氨酸(SEQ ID NO96)；在SEQ ID NO10的残基158的丙氨酸(SEQ ID NO102)；在SEQ ID NO10的残基161的丙氨酸(SEQ ID NO104)；或在SEQ ID NO10的残基162的丙氨酸(SEQ ID NO105)。
5.4.1.2抗体在本发明的某些实施方案中，在上述的筛选测定中测试的化合物是抗体。在设计用于鉴别能调节已知配体与组织保护性受体细胞因子受体复合物的相互作用的化合物的筛选测定中，配体也可以是对组织保护性受体细胞因子受体复合物特异性的抗体。本文描述了生产这种抗体的方法。鉴别出的抗体也可以用于组织保护。鉴别出的抗体也可以用作治疗或预防疾病、障碍或状况的方法中的化合物。
这种抗体可以包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、人源化的或嵌合的抗体、单链抗体、Fab片段、F(ab′)2片段、由Fab表达文库生成的片段、抗-独特型的(抗-Id)抗体和上述任一种的表位-结合片段。可以与例如如上所述的化合物筛选方案组合使用这种抗体，以评价实验化合物对组织保护性受体细胞因子受体复合物的活性或组织保护活性的作用。
为了生产对组织保护性受体细胞因子受体复合物特异性的抗体，可以通过注射组织保护性受体细胞因子受体复合物或其部分，来免疫各种宿主动物。通过本领域已知的算法，可以容易地预测出组织保护性受体细胞因子受体复合物的抗原部分。
宿主动物可以包括但不限于兔子、小鼠和大鼠，仅举几个例子。根据宿主的物种，可以使用各种佐剂来增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂(完全的和不完全的)、矿物质凝胶例如氢氧化铝、表面活性剂例如溶血卵磷脂、多聚醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚和潜在有用的人佐剂，例如BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)。
多克隆抗体是源自用抗原免疫的动物的血清的抗体分子不均质群体，所述的抗原例如组织保护性受体细胞因子受体复合物，或其抗原功能衍生物。为了生产多克隆抗体，可以通过注射补充了也如上所述的佐剂的组织保护性受体细胞因子受体复合物或其部分，来免疫宿主动物，例如上述的那些宿主动物。
通过由培养物中连续的细胞系生产抗体分子的任意技术可以得到单克隆抗体，其是抗特定抗原的抗体的均质群体。这包括但不限于Kohler和Milstein的杂交瘤技术(1975，Nature 256，495-497；和美国专利号4,376,110)，人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等，1983，Immunology Today 472；Cole等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80，2026-2030)，和EBV-杂交瘤技术(Cole等，1985，MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。这种抗体可以属于任意的免疫球蛋白类，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其所有的亚类。可以体外或体内地培养能生产本发明的mAb的杂交瘤。体内生成高滴度的mAbs，使它成为目前优选的生产方法。
另外，可以使用为生产“嵌合抗体”而开发的技术(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.，816851-6855；Neuberger等，1984，Nature 312604-608；Takeda等，1985，Nature，314452-454)，所述技术通过将来自适当抗原特异性的小鼠抗体分子的基因和来自适当生物活性的人抗体分子的基因剪接到一起来实现。嵌合抗体是一种分子，其中不同的部分源自不同的动物物种，例如具有源自鼠mAb的可变区和人免疫球蛋白恒定区的那些(见，例如Cabilly等，美国专利号4,816,567；和Boss等，美国专利号4,816397，它们在这里整体引作参考)。
在本发明的另一个实施方案中，可以在无菌动物中生产单克隆抗体(见PCT国际公开号WO 89/12690，1989年12月12日公开)。根据该发明，可以使用人抗体，且可以通过使用人杂交瘤得到人抗体(Cote等，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.802026-2030)或通过用EBV病毒体外转化人B细胞得到人抗体(Cole等，1985，inMonoclomal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，pp.77-96)。也可以使用为生产“嵌合抗体”而开发的技术(Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.，816851-6855；Neuberger等，1984，Nature 312604-608；Takeda等，1985，Nature，314452-454)，所述技术通过将来自对组织保护性受体细胞因子受体复合物特异性的小鼠抗体分子的基因和来自适当生物活性的人抗体分子的基因剪接到一起；这种抗体在本发明的范围内。
还提供了人源化的抗体(见Winter的美国专利号5,225,539)。免疫球蛋白轻链或重链可变区由“构架”区组成，后者被3个称作互补决定区(CDR)的高变区中断。已经精确地确定了构架区和CDR的范围(见，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，Kabat，E.等，U.S.Department of Health and HumanServices(1983))。简而言之，人源化的抗体是来自非人物种的抗体分子，其具有一个或多个来自非人物种的CDR和来自人免疫球蛋白分子的构架区。已经成功地构建了抗各种抗原的这种CDRS-嫁接的抗体，例如，如Queen等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8610029所述的抗IL-2受体的抗体；如Riechmann等，1988，Nature 332323所述的抗细胞表面受体CAMPATH的抗体；Co等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 882869中的抗乙型肝炎的抗体；以及Tempest等，1991，Bio-Technology 9267中的抗呼吸道合胞病毒的病毒抗原的抗体。人源化的抗体最优选地用于人的治疗用途。
或者，可以使用描述的生产单链抗体的技术(美国专利4,946,778；Bird，1988，Science 242423-426；Huston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883；和Ward等，1989，Nature 334544-546)来生产对组织保护性受体细胞因子受体复合物或其部分特异性的单链抗体。通过氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段，生成单链多肽，形成单链抗体。
通过已知的技术，可以生成能识别特定表位的抗体片段。例如，这种片段包括但不限于F(ab′)2片段，它可以通过对抗体分子的胃蛋白酶消化来生成，和Fab片段，它可以通过还原F(ab′)2片段的二硫键来生成。或者，可以构建Fab表达文库(Huse等，1989，Science，2461275-1281)，以快速地和容易地鉴别出具有所需的特异性的单克隆Fab片段。
依次地，使用本领域的技术人员熟知的技术，可以利用组织保护性受体细胞因子受体复合物的抗体生成能“模仿”组织保护性受体细胞因子受体复合物的抗-独特型抗体(见，例如Greenspan & Bona，1993，FASEB J 7(5)437-444；和Nissinoff，1991，J.Immunol.147(8)2429-2438)。例如，可以使用能结合组织保护性受体细胞因子受体复合物和竞争性地抑制EPO或其他已知配体与组织保护性受体细胞因子受体复合物的结合的抗体，生成能“模仿”组织保护性受体细胞因子受体复合物、并因此结合和中和组织保护性受体细胞因子受体复合物配体的结合结构域的抗-独特型。这种抗-独特型的中和抗-独特型或Fab片段可以用于治疗方案中，以中和天然配体，随后可以施用通过本发明的方法鉴别出的化合物，它能提供比天然配体所提供的保护更优越的组织保护。或者，可以生成能作为组织保护性受体细胞因子受体复合物活性的激动剂起作用的组织保护性受体细胞因子受体复合物的抗体。这种抗体能结合到组织保护性受体细胞因子受体复合物上，并活化受体复合物的信号转导活性。另外，可以作为组织保护性受体细胞因子受体复合物活性的拮抗剂起作用、即能抑制组织保护性受体细胞因子受体复合物的活化的抗体，可以用作用于鉴别能调节组织保护性受体细胞因子受体复合物活性的化合物的测定的阴性对照。在上面的部分中，详细描述了测定这种激动剂和拮抗剂的方法。
5.4.2化合物结构的表征通过本领域的技术人员已知的各种方法，可以确定通过本发明的筛选方法鉴别出的实验化合物的结构。例如，X-射线晶体学可以用于阐明化合物的结构。关于x-射线晶体学的综述，见，例如Blundell等2002，Nat Rev Drug Discov 1(1)45-54。
在某些实施方案中，振动光谱学(例如但不限于红外(IR)光谱学或Raman光谱学)可以用于阐明化合物的结构。改进的Raman分光计描述在Fink等的美国专利号5,786,893中，其在此引作参考。可以以空间分辨的方式测量振动显微术，以通过整合可见光显微镜和分光计来访问单个珠。显微红外分光计描述在Reffner等的美国专利号5,581,085中，其在此整体引作参考。能对样品同时地进行显微红外和显微Raman分析的装置描述在Sostek等的美国专利号5,841,139中，其在此整体引作参考。在该方法的一个实施方案中，化合物是在掺杂了化学修饰的苯乙烯单体的聚苯乙烯珠子上合成的，从而得到的每个珠子在振动(IR或Raman)光谱中具有特征性的吸收线模式，通过包括但不限于Fenniri等，2000，J.Am.Chem.Soc.1238151-8152所述的那些方法。使用本领域的技术人员熟悉的分裂-混合(split-pool)合成方法，制备了化合物文库，从而珠子的光谱模式能鉴别出珠子上的化合物组分之一。通过它们的振动光谱，可以鉴别出已经根据它们的结合组织保护性细胞因子受体复合物的能力分离的珠子。
可以使用质谱法(例如电雾化电离(“ESI”)和基质辅助的激光解吸-电离(“MALDI”)、傅里叶变换离子回旋共振(“FT-ICR”)，来高通量地筛选能结合组织保护性细胞因子受体复合物的化合物，并阐明化合物的结构。
MALDI使用解吸离子的脉冲激光器和飞行时间分析器，且已经用于检测非共价的tRNA氨酰-tRNA合成酶复合物(Gruic-Sovulj等，1997，J.Biol.Chem.27232084-32091)。但是，检测通常需要靶核酸和化合物之间的共价交联，因为非共价结合的复合物会在MALDI过程中解离。
ESI质谱法(“ESI-MS”)已经在研究非共价分子相互作用方面取得了很大效用，因为与MALDI方法不同，ESI-MS产生较少至没有碎裂的分子离子(Xavier等，2000，Trends Biotechnol.18(8)349-356)。ESI-MS已经用于研究由HIV Tat肽和蛋白与TARRNA形成的复合物(Sannes-Lowery等，1997，Anal.Chem.695130-5135)。
傅里叶变换离子回旋共振(“FT-ICR”)质谱法能提供高分辨率的光谱、同位素-分辨的先驱离子选择和精确的质量确定(Xavier等，2000，Trends Biotechnol.18(8)349-356)。FT-ICR已经用于研究氨基糖苷类抗生素和同源和非同源的RNA的相互作用(Hofstadler等，1999，Anal.Chem.713436-3440；Griffey等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9610129-10133)。与本文讨论的所有质谱方法一样，FT-ICR不要求标记组织保护性细胞因子受体复合物或化合物。
质谱法的优点是不但能阐明化合物的结构，而且能确定结合到组织保护性细胞因子受体复合物上的化合物的结构。该信息使得能够发现能特异性地结合组织保护性细胞因子受体复合物的化合物的共有结构。
NMR光谱学方法还可以用于表征与组织保护性细胞因子受体复合物结合的化合物。例如，通过定量检测化学位移(特别是来自使用松弛效应测得的距离的)中的变化，可以检测复合的分子，且基于NMR的方法已经用于鉴别蛋白药物靶的小分子粘合剂(Xavier等，2000，Trends Biotechnol.18(8)349-356)。通过NMR测定结构-活性关系(“SAR”)，是所述的NMR的第一种方法，其中通过靶蛋白的二维1H-15N光谱鉴别出了能结合到临近亚位点(subsite)上的小分子(Shuker等，1996，Science 2741531-1534)。通过使用谱线增宽、传递的NOE和脉冲场梯度扩散测量，监控来自结合的分子的信号(Moore，1999，Curr.Opin.Biotechnol.1054-58)。近来已经描述了使用小分子文库、通过NMR进行引导生成(lead generation)的方法(Fejzo等，1999，Chem.Biol.6755-769)。
可以用于本发明的NMR方法的其他实例包括但不限于一维的、二维的、三维的、四维的NMR方法以及相关光谱学(“COSY”)，和核欧沃豪斯效应(“NOE”)光谱学。这种确定化合物的结构的方法是本领域的技术人员熟知的。
类似于质谱法，NMR的优点是不但能阐明化合物的结构，而且能确定结合到组织保护性细胞因子受体复合物上的化合物的结构。
5.5治疗用途本领域的普通技术人员能够认识到，通过本测定鉴别出的化合物可以作为治疗剂用于治疗或预防各种疾病、障碍和状况。本领域的技术人员还能够认识到，这样的化合物可以用于实现组织保护性细胞因子受体复合物的调节。在本发明的某些实施方案中，可以通过能增强或抑制复合物和复合物配体的相互作用的化合物，来调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性。在这里引作参考的PCT申请号PCT/US01/49479、美国专利申请号10/188,905和10/185,841中，公开了可以用于评价例如通过上述的本发明测定鉴别出的化合物的治疗适应症的体外和体内技术。
前述的通过本发明的方法鉴别出的化合物通常可以用于预防、治疗性治疗或预防性治疗主要具有神经学或精神病学症状的中枢神经系统或外周神经系统的人疾病或障碍，眼病，心血管病，心肺病，呼吸病，肾、泌尿和生殖病，骨病，皮肤病，胃肠病和内分泌和代谢异常。用途的实例包括但不限于保护和修复对于下述各项而言由于创伤导致的损伤和所导致的炎症脑(缺血性发作、钝器伤、蛛网膜下腔出血(subarrachnoid hemorrhage))，脊髓(局部缺血、钝力创伤(blunt force trauma))，外周神经(坐骨神经损伤、糖尿病性神经病变、腕管综合征)，视网膜(黄斑水肿)和心脏(心肌梗死、慢性心力衰竭)。更具体地，这种疾病、障碍和状况包括缺氧状况，它会不利地影响可兴奋组织，例如中枢神经系统组织、外周神经系统组织或心脏组织或视网膜组织(例如，脑、心脏或视网膜/眼)中的可兴奋组织。因此，通过本发明的方法鉴别出的化合物可以用于治疗或预防在许多条件和环境下由缺氧状况导致的对可兴奋组织的损伤。本文下面的表格中提供了这种条件和环境的非限制性的实例。
在使用通过本发明的方法鉴别出的化合物可以治疗和预防的神经元组织病理学保护的实例中，这种病理学包括由神经元组织降低的氧合导致的那些。使用通过本发明的方法鉴别出的化合物，可以治疗会降低神经元组织对氧的利用度，从而导致应激、损伤和最终导致神经元细胞死亡的所有状况。通常称作缺氧和/或局部缺血的这些状况的成因是或包括但不限于发作、血管闭塞、出生前的或出生后的不供氧、窒息、气哽、几乎淹溺、一氧化碳中毒、烟吸入、创伤(包括手术和放疗)、窒息、癫痫、低血糖、慢性阻塞性肺病、肺气肿、成人呼吸窘迫综合征、低血压休克、脓毒性休克、过敏性休克、胰岛素休克、镰状细胞危象、心搏停止、节律障碍、氮麻醉和由心-肺旁路手术造成的其他神经缺陷。
在一个实施方案中，例如，可以在手术过程或医学过程之前、期间或之后，单独地或作为组合物的一部分施用通过本发明的方法、使用本发明的测定鉴别出的化合物，来预防由损伤或组织损伤危险导致的损伤或组织损伤。例如，手术过程可以包括肿瘤切除或动脉瘤修复，医学过程例如化疗和自然过程例如分娩或生育。使用通过本发明的方法鉴别出的化合物可以治疗的由低血糖造成的或导致的其他病理学包括胰岛素过量，也称作医源性的血胰岛素过多症、胰岛素瘤、生长激素缺乏、hypocortisolism、药过量和某些肿瘤。
由可兴奋神经元组织损伤导致的其他病理学包括癫痫发作病，例如癫痫、痉挛或慢性癫痫发作病。其他可治疗的状况和疾病包括但不限于下述疾病，例如发作、多发性硬化、低血压、心搏停止、阿尔茨海默病、帕金森病、大脑性麻痹、脑或脊髓创伤、AIDS痴呆、与年龄有关的认知功能丧失、记忆丧失、肌萎缩性侧索硬化症、癫痫发作病、酒精中毒、视网膜缺血、由青光眼导致的视神经损伤和神经元丧失。
通过本发明的方法鉴别出的特定化合物可以用于治疗或预防由疾病、状况或各种创伤导致的炎症，例如物理地或化学地诱导的炎症。这种创伤可以包括脉管炎、慢性支气管炎、胰腺炎、骨髓炎、类风湿性关节炎、肾小球肾炎、视神经炎、颞动脉炎、脑炎、脑膜炎、横贯性脊髓炎、皮肌炎、多肌炎、坏死性筋膜炎、肝炎和坏死性小肠结肠炎。
通过本发明的方法鉴别出的化合物可以用于治疗或预防视网膜组织的状况和损伤。这种障碍包括但不限于视网膜缺血、黄斑变性、视网膜脱离、色素性视网膜炎、动脉硬化性视网膜病、高血压性视网膜病、视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、低血压和糖尿病性视网膜病。
在另一个实施方案中，通过本发明的方法和本发明的原理鉴别出的化合物可以用于预防或治疗由对可兴奋组织的辐射损伤导致的损伤。通过本发明的方法鉴别出的化合物的另一个应用是治疗神经毒素中毒，例如软骨藻酸有壳的水生动物中毒山黧豆中毒和Guam病，肌萎缩性侧索硬化症和帕金森病。
如上所述，本发明还涉及通过外周施用如上所述的组织保护性细胞因子，用于增强哺乳动物的可兴奋组织功能的通过本发明的方法鉴别出的化合物。使用该方法可以治疗多种疾病和状况，而且，在没有任何状况或疾病存在的情况下，该方法可以用于增强认知功能。下面更详细地描述了本发明的这些用途，且所述用途包括增强人和非人哺乳动物的学习和训练。
使用通过本发明的方法鉴别出的化合物可以治疗或预防的状况和疾病涉及中枢神经系统，包括但不限于心境障碍、焦虑障碍、抑郁症、孤独症、注意力不集中的过度反应症和认知功能障碍。这些状况可以从增强神经元功能中获益。根据本发明的教导可以治疗的其他障碍包括睡眠破坏，例如，睡眠性呼吸暂停和与旅行有关的障碍；蛛网膜下和动脉瘤流血、低血压休克、震伤、脓毒性休克、过敏性休克和各种脑炎和脑膜炎后遗症，例如，与结缔组织疾病有关的大脑炎，例如狼疮。其他应用包括预防或保护免受神经毒素中毒，例如软骨藻酸有壳的水生动物中毒、山黧豆中毒和Guam疾病，肌萎缩性侧索硬化症、帕金森病；栓塞或缺血性损伤的手术后治疗；全脑辐射；镰状细胞危象；和惊厥。
使用通过本发明的方法鉴别出的化合物可以治疗或预防的另一组状况包括遗传性或获得性的线粒体功能障碍，它是多种神经性疾病(典型特征是神经元损伤和死亡)的原因。例如，Leigh病(亚急性坏死性脑病)的特征在于由于神经元脱落和肌病引起的渐进性视觉丧失和脑病。在这些情况中，有缺陷的线粒体代谢不能供给足够高能量的底物来促进可兴奋细胞的代谢。促红细胞生成素受体活性调节剂能最优化多种线粒体疾病的衰竭功能。如上所述，缺氧状况不利地影响可兴奋组织。可兴奋组织包括但不限于中枢神经系统组织、外周神经系统组织和心脏组织。除了上述的状况外，通过本发明的方法鉴别出的化合物可以用于治疗吸入中毒(例如一氧化碳和烟吸入)、严重哮喘、成人呼吸窘迫综合征和气哽和几乎淹溺。会造成缺氧状况或通过其他方式诱导可兴奋组织损伤的其他状况包括低血糖，它可能发生在不适当的胰岛素给药中，或与能生成胰岛素的肿瘤有关(胰岛素瘤)。
使用通过本发明的方法鉴别出的化合物，可以治疗被认为是源自可兴奋组织损伤的各种神经心理学障碍。其中涉及神经元损伤的、且本发明可以治疗或预防的慢性障碍包括，与中枢神经系统和/或外周神经系统有关的障碍，包括与年龄有关的认知功能丧失和老年性痴呆、慢性癫痫发作病、阿尔茨海默病、帕金森病、痴呆、记忆丧失、肌萎缩性侧索硬化症、多发性硬化、结节性硬化症、Wilson氏病、大脑的和渐进性核上麻痹、Guam病、Lewy body痴呆、朊病毒病(例如，海绵状脑病，例如Creutzfeldt-Jakob病)、亨廷顿舞蹈病、强直性肌营养不良，Freidrich氏共济失调和其他共济失调，以及Gilles de la Tourette氏综合征、癫痫发作病例如癫痫和慢性癫痫发作病、发作、脑或脊髓创伤、AIDS痴呆、酒精中毒、孤独症、视网膜缺血、青光眼、自主功能障碍例如高血压和睡眠障碍，和神经精神病学障碍，其包括但不限于精神分裂症、精神分裂症情感障碍、注意缺损障碍、心境恶劣障碍、严重的抑郁性障碍、躁狂症、强迫性神经失调、心理物质应用障碍、焦虑、惊恐性障碍以及单相和双相情感障碍。其他的神经精神病和神经变性病包括，例如，AmericanPsychiatric Association′s Diagnostic and Statistical manualof Mental Disorders(DSM)中列出的那些，它的最新版本在这里整体引作参考。
在另一个实施方案中，包含促红细胞生成素的重组的嵌合毒素分子可以用于治疗性地送递毒素，以治疗或预防增殖障碍，例如癌症，或病毒障碍，例如亚急性硬化性全脑炎。
下表列出了关于前述的组织保护性细胞因子可以治疗的各种状况和疾病的其他示例性的、非限制性的适应症。

如上所述，这些疾病、障碍或状况仅仅说明了通过本发明的方法鉴别出的化合物提供的优点范围。因此，本发明通常提供了机械创伤或人疾病引起的预防、治疗性或预防性治疗。预期了CNS和/或外周神经系统的疾病、障碍或状况的预防或治疗性或预防性治疗。提供了具有精神病学组分的疾病、障碍或状况的预防或治疗性或预防性治疗。提供了包括但不限于具有下述组分的那些疾病、障碍或状况的预防或治疗性或预防性治疗眼的、心血管的、心肺的、呼吸的、肾的、泌尿的、生殖的、胃肠的、内分泌的或代谢的组分。
在一个实施方案中，可以全身地施用包含能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物的这种药物组合物，以保护或增强靶细胞、组织或器官。这种施用可以是肠胃外地、通过吸入、或跨粘膜地，例如经口地、经鼻地、直肠地、阴道内地、舌下地，粘膜下地或经皮地使用。优选地，肠胃外地施用，例如通过静脉内的或腹膜内的注射，且也包括但不限于动脉内的、肌内的、皮内的和皮下的施用。
在考虑本领域的普通技术人员已知的几个因素的基础上，技术人员能容易地确定化合物的优选的有效剂量或量的选择。这些因素包括促红细胞生成素和/或通过本发明的方法鉴别出的化合物的具体形式，和药物代谢动力学参数，例如生物利用率、代谢、半衰期等，它们应当已经在一般开发过程中建立起来，一般地，用于得到药物化合物的政府批准。考虑剂量时的其他因素包括要治疗的状况或疾病、或在正常个体中达到的益处、患者的体重、施用途径、施用是急性的还是慢性的、伴随疗法和已知会影响施用的药物的功效的其他因素。因而，应当根据操作人员的判断和每位患者的情况，例如根据个体患者的状况和免疫状态，和根据标准临床技术，来决定精确剂量。
参考下面的用于解释本发明的非限制性的实施例，可以更好地理解本发明。提出下面的实施例，是为了更充分地解释本发明的优选实施方案。但是，无论如何不应将它们理解成是限制本发明的宽范围。
6.实施例6.1实施例1竞争性EPO生物测定进行下述的竞争性结合测定，以确定氨甲酰基化的EPO是否结合到EPO-R上。使用能表达EPO-R的UT-7细胞，以确定氨甲酰基化的EPO是否能竞争性地抑制rhEPO与EPO-R的结合。由于rhEPO与EPO-R的结合，细胞表现出增殖。增殖的抑制指示着竞争性结合。
方法为了竞争性结合测定的目的，从DSMZ(Braunschweig，德国，ACC137)得到了红白血病UT-7细胞(Komatsu，N.等，1991，CancerRes.，51341-8)。如Leveque等(1996，Hematol Oncol 14137-46)所述，进行48小时的氨甲酰基化的EPO和rhEPO的测定。使用WST-1减少(Roche #1 644 807)，来定量活细胞。测定的信噪比是8-15，且从使用至少6个药物浓度的浓度反应曲线，通过4个参数拟合，确定了氨甲酰基化的EPO和rhEPO的半数最大有效浓度。在该具体测定中，用rhEPO进行测定，然后分开地用氨甲酰基化的EPO进行测定，然后用rhEPO和氨甲酰基化的EPO两者进行测定。
结果表明，当施用rhEPO时，以及当将氨甲酰基化的EPO和rhEPO二者整合于测定中时，细胞增殖分别增加了0.6-倍和1.7-倍。证实了单独的氨甲酰基化的EPO对细胞增殖无作用，即使当以高浓度使用时亦然。
图1显示了x-轴上的实验化合物(rhEPO和氨甲酰基化的EPO)的浓度相对于y-轴上的细胞增殖的图。图1清楚地表明，氨甲酰基化的EPO的存在，没有影响rhEPO的刺激测定中的UT-7细胞增殖的能力，因为氨甲酰基化的EPO和rhEPO两者的竞争测定没有表现出细胞增殖的减少。
这些结果表明，氨甲酰基化的EPO不能结合存在于UT-7细胞上的经典的EPO-R二聚体复合物。
6.2实施例2大鼠脑膜的蛋白印迹已经显示大鼠脑细胞对EPO是反应性的。分离了大鼠脑细胞的膜蛋白，以确定这些EPO反应性的细胞是否能表达βc受体或与IL-3特异性的受体组分结合的βc受体。
方法使用下述规程，分离了大鼠膜蛋白。在含有蛋白酶抑制剂(25μg/ml亮抑蛋白酶肽(5mg/ml原液)、10μg/ml Aprotin(1mg/ml原液)、1mM PMSF(100mM原液)20X的PBS中，匀浆大鼠脑。然后，在3,800rpm、4℃，离心匀浆的组织5分钟。然后，收集上清液，并在14,000rpm、4℃，再离心30分钟。然后，在含有蛋白酶抑制剂和1％Triton X-100的PBS中，匀浆离心得到的沉淀。然后，在14,000rpm、4℃，再离心匀浆物30分钟。得到的上清液含有膜蛋白。
然后，通过凝胶电泳分离膜蛋白。在4℃，用1X酪蛋白(Vector10X Casein Soln.，Cat#SP-5020)，封闭膜蛋白过夜。使用载体抗生物素蛋白/生物素封闭试剂盒(目录号SP-2001)，生成了抗生物素蛋白和生物素封闭。通过加入2滴抗生物素蛋白/10ml 1X PBS-0.1％Tween-20/1X酪蛋白20分钟，简单地冲洗该封闭，然后用1X PBS-0.1％Tween-20/1X酪蛋白洗涤该封闭10分钟，生成了抗生物素蛋白封闭。通过加入2滴生物素/10ml 1X PBS-0.1％Tween-20/1X酪蛋白20分钟，简单地冲洗该封闭，然后用1X PBS-0.1％Tween-20/1X酪蛋白洗涤该封闭10分钟，以类似方式生成了生物素封闭。在室温温育第一抗体(共有β单位K-17(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)，稀度1∶200)1小时。然后，用1X PBS-0.1％Tween-20/1X酪蛋白洗涤所述封闭4次、10分钟。在室温，以1∶1000稀度(60ml 1X PBS-0.1％Tween-20/1X酪蛋白中1滴)，用VECTASTAINABC试剂盒(过氧化物酶兔IgG，目录号PK-4001)进行1小时的第二次温育。然后，用1X PBS-0.1％Tween-20洗涤所述封闭3次、10分钟。在洗涤过程中，在1X PBS-0.1％Tween-20中制备AB试剂将试剂盒的2滴试剂A加入10ml 1X PBS-0.1％Tween-20中，混匀，加入2滴试剂B，混匀，并在室温温育30分钟，以使复合物形成。然后，在室温温育膜30分钟，然后用1X PBS-0.1％Tween-20洗涤所述膜3次、10分钟。在即将加入印迹之前，用载体过氧化物酶底物试剂盒DAB在蒸馏水中制备了底物溶液(将2滴缓冲剂原液加入10ml蒸馏水中，混合，加入4滴DAB原液，混合，加入2滴过氧化氢溶液，混合)。然后，在室温温育含有底物的印迹10分钟，或直到颜色显示。然后，用2遍蒸馏水洗涤印迹。还使用IL-3特异性的亚基的第一抗体(T-20，Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)，重复了该过程。
结果表明，在大鼠脑细胞膜中鉴别出了βc受体和对IL-3特异性的βc受体。
图2显示了分离的膜蛋白的聚丙烯酰胺凝胶照片。第一块凝胶显示了与βc受体对应的130KD蛋白。第二块凝胶显示了与对IL-3受体蛋白特异性的βc受体形式对应的70KD蛋白。结果清楚地证实了βc受体(在130kD的条带)存在于促红细胞生成素-反应性的细胞(脑)中。该发现暗示着，组织保护性细胞因子受体复合物可以在脑细胞膜中形成，这是因为EPO受体和βc受体都存在于膜中。
6.3实施例3大鼠脊髓中的βc受体的免疫组织化学为了测试βc受体的存在，对大鼠脊髓切片进行了染色。
方法取出大鼠的脊髓，并固定在石蜡中。然后，将包埋的组织进行切片(6um)。然后，使用抗-βc受体抗体(K-17，Santa CruzBiotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)，对脊髓切片进行染色。
图3显示了使用抗βc受体抗体，对βc受体染色的切片脊髓的照片。染色表示βc受体存在于脊髓中。
图4显示了切片脊髓的染色区域的放大照片，证实了抗-βc受体抗体的反应性。
该发现表明组织保护性细胞因子受体复合物存在于脊髓组织中，这是因为βc受体和EPO受体都存在于这些组织中。
6.4实施例4EPO-R和βc受体的共沉淀为了确定EPO受体和βc受体是否在细胞中彼此结合，使用受体抗体来共沉淀来自能表达二种受体的细胞的复合物。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳，从P-19细胞分离了膜蛋白，并进行了蛋白印迹，以对EPO受体和βc受体染色。
方法根据Jubinsky等，1997，(Blood 901867-1873)所述的规程，进行了来自P-19细胞、神经样胚胎癌细胞的EPO-R和βc受体的免疫沉淀反应。使用对如上面6.3部分所述的受体特异性的抗体。然后在聚丙烯酰胺凝胶上进行免疫沉淀反应，并通过蛋白印迹转移，且使用对EPO受体和βc受体特异性的抗体进行染色。
图5说明了与EPO-R和βc受体抗体共免疫沉淀的样品的蛋白印迹。泳道1显示了在蛋白印迹没有EPO存在的情况下，EPO-R与βc受体抗体(顶部)和EPO-R抗体(底部)的免疫沉淀反应的结果。在凝胶上可以清楚地看到代表着βc受体的条带(指向合适条带的箭标，顶部)。在用βc受体抗体染色的顶部凝胶上的箭标指示着EPO受体迁移的位置，如果它存在于样品中的话。泳道2显示了在蛋白印迹有EPO存在的情况下，EPO-R与βc受体抗体(顶部)和EPO-R抗体(底部)的免疫沉淀反应的结果。泳道3显示了反向免疫沉淀反应，条带(底部)指示着EPO-R存在于使用βc受体抗体免疫沉淀的样品中。在被EPO-R抗体染色的底部凝胶上的第一个箭标指向约103kD的条带，它被鉴别为核仁素(见下面的实施例10)。在被EPO-R抗体染色的底部凝胶上的第二个箭标指向约68kD的条带，它被鉴别为EPO受体(见下面的实施例10)。
结果表明，EPO-R和βc受体会在表达2种受体的细胞中形成复合物。最后，无论EPO自身是否存在，都形成了复合物(对比泳道1和泳道2)，表明EPO不是形成组织保护性细胞因子受体复合物所必需的。
6.5实施例5有和没有βc受体的心肌细胞的细胞凋亡在来自正常小鼠的野生型心肌细胞和来自βc链敲除的(-/-)小鼠的心肌细胞中，诱导了心肌细胞的细胞凋亡，以确定βc受体是否在EPO对细胞的保护活性(预防或延迟细胞凋亡)中起作用。
方法如(Fiordaliso等，2001，Diabetes 502363-2375)所述，从野生型C57BL/6-129Sv或品系匹配的共有β链敲除的βc(-/-)小鼠(Robb等，1995，P.N.A.S.U.S.A.929565-9569)分离了心肌细胞。在有或没有促红细胞生成素(100ng/ml)存在的情况下，通过在星形孢菌素(Sigma，0.1μM)中温育，诱导了细胞凋亡性细胞死亡。野生型细胞和βc(-/-)心肌细胞用作其中没有诱导细胞凋亡的对照(图7的柱1和2)。在野生型和βc(-/-)心肌细胞中诱导了细胞凋亡(图7的柱3和4)，在有EPO或氨甲酰基化的EPO存在的情况下，在野生型心肌细胞中诱导了细胞凋亡(图7的柱5和6)，以及在有EPO存在的情况下，在βc(-/-)心肌细胞中诱导了细胞凋亡(图7的柱7)。
在温育16小时后，固定细胞，并加工，以使用TUNEL(RocheDiagnostics)原位检测断裂的DNA。
图7显示了结果，它显示了在有和没有EPO存在的情况下，从正常的和βc受体敲除的小鼠分离的心肌细胞的百分比细胞凋亡(y-轴)(柱3-7)。在有EPO存在的情况下诱导细胞凋亡的βc(-/-)心肌细胞的百分比细胞凋亡(柱7)，与在没有EPO存在的情况下的野生型和βc(-/-)心肌细胞的百分比细胞凋亡(见柱3和4)没有显著差异。
该结果表明，EPO的组织保护活性依赖于这些细胞中βc受体的存在。
6.6实施例6下游激酶通过EPO受体活化为了确定不同浓度的EPO和氨甲酰基化的EPO是否能在表达EPO受体的细胞中诱导下游激酶活性，在有EPO和氨甲酰基化的EPO存在的情况下，检测了能表达EPO受体的细胞中活化的激酶，磷酸化的Jak2的存在。
方法用不同浓度的EPO或氨甲酰基化的EPO，刺激BaF/3/EPOR细胞10分钟。使用能识别酪氨酸-磷酸化的Jak2(PY-Jak2)的抗体，通过细胞裂解物的蛋白印迹，分析了Jak2的活化。剥离膜，并用抗Jak2的抗体再次检测，以确认等量装载。
图8显示了聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的和使用PY-Jak2抗体染色的细胞蛋白的蛋白印迹。顶部表明，磷酸化的Jak2存在于用5nM和50nM浓度的EPO刺激的细胞中。
该结果表明，氨甲酰基化的EPO不能在表达EPO受体的细胞中诱导经典的EPO受体同源二聚体的下游活化。这表明，氨甲酰基化的EPO不能结合经典的EPO受体同源二聚体。
6.7实施例7BAF3/EPOR细胞-结合测定为了确定能表达EPO受体的细胞是否结合EPO和氨甲酰基化的EPO，使BaF3细胞接触每种配体，并在竞争性结合测定中测量了结合亲和力。
方法在室温，将0.1nM 125-I EPO和分级剂量的未标记的EPO和氨甲酰基化的EPO分别在106孔内的PBS中温育30分钟。在滤器上洗涤膜，并在γ计数器中计数膜结合的125-I EPO。将受体结合的放射性配体的分数绘制成结合的125-I EPO相对于分级剂量的未标记的配体的图。
图9显示了能表达EPO受体的BaF3细胞的配体结合亲和力的图。绘制了以nM计的配体浓度(x-轴)相对于对接触EPO受体配体EPO和氨甲酰基化的EPO的能表达BaF3 EPO受体的细胞的结合(cpm)(y-轴)的图。
BaF-3/EPO-R细胞以约1nM的亲和力结合EPO，但是未检测到氨甲酰基化的EPO结合。该结果表明，氨甲酰基化的EPO不能竞争性地抑制EPO与能表达EPO受体的细胞的结合。
6.8实施例8UT-7膜测定为了确定能表达经典的EPO受体二聚体的细胞是否结合EPO和氨甲酰基化的EPO，使UT-7细胞膜接触每种配体，并在竞争性结合测定中测量了结合亲和力。
方法在室温，在200ul PBS中，将100微克UT-7膜分别与0.1nM125IEPO和分级剂量的未标记的EPO和氨甲酰基化的EPO温育30分钟。在滤器上洗涤膜，并在γ计数器中计数膜结合的125I EPO。将受体结合的放射性配体分数绘制成结合的125I EPO相对于分级剂量的未标记的配体的图。UT-7膜以0.1-0.5nM的亲和力结合EPO。相反地，未检测到氨甲酰基化的EPO结合。
图10显示了具有EPO受体的UT-7细胞膜的配体结合亲和力的图。绘制了以nM计的配体浓度(x-轴)相对于对接触EPO受体配体EPO和氨甲酰基化的EPO的能表达UT-7EPO受体的细胞膜的结合(cpm)(y-轴)的图。
该结果表明，氨甲酰基化的EPO不能竞争性地抑制EPO与能表达2种经典的EPO受体二聚体的细胞的结合。
6.9实施例9血细胞比容和血红蛋白浓度给小鼠施用EPO和修饰的EPO，以确定氨甲酰基化的EPO或脱唾液酸EPO是否具有与EPO相同的促红细胞生成能力，即提高的血细胞比容和提高的血红蛋白。
方法给小鼠每周静脉内地注射5次50μg/kg EPO、氨甲酰基化的EPO和脱唾液酸EPO，持续4周。使用在异荧烷(isoflurane)麻醉下从眼眶后丛抽取的血液(＜50μl)，通过血红蛋白计确定血清血红蛋白浓度和血细胞比容。
图11显示了如下柱形图，即，在小鼠中施用对照(载体)、EPO、氨甲酰基化的EPO和脱唾液酸EPO(x-轴)后，11A，通过血细胞比容的百分比体积测得的血细胞比容水平(y-轴)；11B，以mM浓度计的血红蛋白水平(y-轴)。
结果表明，给小鼠施用的氨甲酰基化的EPO和脱唾液酸EPO不能诱导施用了EPO的小鼠所表现出的提高的血细胞比容和血红蛋白。这暗示着，与EPO相比，氨甲酰基化的EPO和脱唾液酸EPO在体内不同地与细胞相互作用。综合上述结合测定的实验结果，这些结果确认了氨甲酰基化的EPO和脱唾液酸EPO不能结合EPO受体，并因而不能影响EPO的促红细胞生成活性。
6.10实施例10检测核仁素的存在进一步分析了使用蛋白印迹和上面实施例4所述的βc受体抗体的沉淀。更具体地，进一步分析了与图5中的泳道1(顶部)所示的103KD条带相对应的蛋白，以确定已经在样品中沉淀出的另一种蛋白的特征。
方法使P19细胞在完全培养基中生长至70％汇合。用10ng/ml EPO或盐水(C)处理它们15分钟，然后通过在烧瓶上轻敲来使其脱附，在700rpm离心7分钟，并重新悬浮到裂解缓冲液中(含有蛋白酶抑制剂，2mM CaCl2，1％Triton和1％NP40的TBS)，至终浓度1mg蛋白/ml。CaCl2存在于裂解缓冲液中，并避免其冷冻或漩涡，以维持蛋白相互作用。在120000rpm离心10分钟去除碎片后，将裂解物在室温与A蛋白琼脂糖(Pharmacia，10μL排出的凝胶/ml)一起温育1小时，以除去非特异性的结合。
然后，将上清液与事先偶联了抗体的A蛋白琼脂糖(10μL凝胶/ml)一起温育1小时，并用裂解缓冲液洗涤3次。使用抗β共有链的抗体(K17，Santa Cruz Biotechnologies)或1∶200最终稀度的抗EPO-R的2种抗体的混合物(M20和h194，Santa CruzBiotechnologies)，并在4℃温育过夜。然后，用低去污剂裂解缓冲液(同上，只是0.5％Triton和无NP40)洗涤A蛋白琼脂糖珠5次，并通过加入30μL 2x Laemmli样品缓冲液(含有5％β-巯基乙醇)，解离结合的蛋白，并在10％SDS-PAGE上运行。
从考马斯蓝染色的凝胶切离103kD条带，在25mM碳酸氢铵/40％乙醇中脱色几小时，并用递增百分比的乙腈洗涤。在30℃，用在25mM碳酸氢铵/10％乙腈溶液中的浓度为12ng/ml的胰蛋白酶(Promega，Madison WI)凝胶内-消化蛋白过夜。使用a-氰基-4-羟基肉桂酸(Bruker Daltonics Billerica，MA)作为基质，在BrukerReflexIIITM基质辅助的激光解吸/电离(MALDI)质谱仪上，进行肽质量指纹分析(PMF)。用1000-3000Da的7种标准肽的混合物，从外部校正质谱。对得到的数据进行数据库(NCBInr)搜索，其中使用程序Mascot(http//ww.matrixscience.com)和Profound(http//prowl.rockefeller.edu/)，这允许最多1个错过的胰蛋白酶切割和±0.2Da的质量公差。使用质谱法来确定核仁素的特征。
该结果表明，响应于施用EPO，能表达EPO受体和能形成组织保护性细胞因子受体复合物的βc受体的P19细胞会生成核仁素。图12显示了SDS-PAGE凝胶的照片，其中103KD核仁素蛋白标有圆圈。
6.11实施例11βc受体敲除的小鼠的脊髓损伤在βc链敲除的(-/-)小鼠和正常的(野生型)小鼠中诱导了脊髓损伤，以进一步研究上述的来自βc敲除的小鼠的心肌细胞的结果，并进一步确定βc受体是否在脊髓损伤后的EPO保护活性中起作用。
方法使用Farooque(2000，Acta Neuropathol(Berl)10013-22)的改进方案，在小鼠中进行了脊髓损伤。该技术生成了动物模型，它用于使用EPO和氨甲酰基化的EPO来测试损伤的可兴奋细胞、组织和器官。具体地，使用了8-16周龄的C57/b16(野生型)或βc受体敲除的(无效(null))小鼠。通过PCR分析从尾巴得到的DNA，确认了每只动物的无效。在5组小鼠(每组含有4-9只小鼠)中造成了脊髓损伤，2组野生型小鼠和3组无效小鼠。在脊髓损伤过程中，用异荧烷麻醉动物，并维持正常的核心温度。在T3进行了椎板切除术，并以15克力将2mm不锈钢棒施加到硬脑膜上4分钟，然后移开。
损伤后，立即将单剂的氨甲酰基化的EPO施用给第一组无效小鼠，将单剂的EPO施用给第二组无效小鼠，将PBS作为对照施用给第三组无效小鼠，将单剂的氨甲酰基化的EPO施用给第一组野生型小鼠，并将单剂的PBS施用给第二组野生型小鼠。
然后，使用Basso等(1995，J.Neurotrauma 121-21)的评分系统，评价动物42天。Basso，Beattie，Bresnahan(BBB)等级是用于测试正常地上运动的21-点等级，它通常用于测量脊髓损伤后的功能恢复。BBB分数能非常敏感地用于检测细微的运动缺陷，并且也能评价脊髓损伤后的恢复程度。对于所有组的动物，用BBB运动分数相对于损伤后天数作图。然后，测量BBB相对于损伤后天数的图中的曲线下面积(AUC)，计算临床严重性。分析小鼠组之间的临床严重性值的统计学差异，并生成显示了每组的临床严重性值的条形图。
结果证实了心肌细胞中的那些，并表明EPO的组织保护活性依赖于动物中βc受体的存在。结果显示在图13中，它显示了BBB运动分数(y-轴)对损伤后天数(x-轴)的关系图。贯穿在损伤后的42天时间段期间，施用了氨甲酰基化的EPO的野生型组小鼠表现出比所有其他组提高的运动分数。结果显示在图14中，它显示了以曲线下面积(AUC)测得的临床严重性(y-轴)和小鼠组(x-轴)。施用了氨甲酰基化的EPO的野生型组小鼠(柱1)表现出比所有其他组(柱2-5)显著提高的临床严重性值(即，更低的严重性)。施用了EPO的无效小鼠组(柱5)表现出比所有其他组非常高的死亡率。该结果表明，βc受体是实现EPO在治疗损伤中的治疗性益处所必需的。
本发明的范围不限于所述的具体实施方案，所述实施方案仅仅用于解释本发明的各个方面，且功能上等同的方法和组分都在本发明的范围内。实际上，除了本文列出的和描述的那些外，本领域的技术人员从前面的描述和附图，能够明白本发明的各种改进。这种改进也在所附权利要求的范围内。
本文引用的所有文献都在这里整体引作参考，用于所有目的。
序列表<110>The Kenneth Warren Institute，Inc.
<120>组织保护性细胞因子受体复合物，用于鉴别组织保护性化合物的测定和其用途<130>10165-028-228<140>
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>27
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>28Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Glu Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
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<223>人工序列描述突变蛋白
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>34Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
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<210>35<211>193<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工序列描述突变蛋白<400>35Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 l0 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu Thr Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>36Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Ser Ser Leu Asn Glu
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<220>
<223>人工序列描述突变蛋白<400>37Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Tyr Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile145 150 155 160
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>38Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Lys Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>40Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Asn Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>41Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45
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<213>人工的<220>
<223>人工序列描述突变蛋白<400>42Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Ala Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>43Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Ile Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>44Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
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180 185 190Arg<210>45<211>193<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工序列描述突变蛋白<400>45Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Ala Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>46Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
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<211>193<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工序列描述突变蛋白<400>47Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Ala Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>48Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Ile Tyr Ala Trp Lys Arg
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>49
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>50Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Ala Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
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<210>52<211>193<212>PRT<213>人工的<220>
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<223>人工序列描述突变蛋白
<400> 54Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Ala Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile145 150 155 160Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
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<210>57<211>193<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工序列描述突变蛋白<400>57Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Ser Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>58Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
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<220>
<223>人工序列描述突变蛋白<400>59Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Arg Lys Ala Val Ser Gly115 120 125Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile145 150 155 160
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>63Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45
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<213>人工的<220>
<223>人工序列描述突变蛋白<400>64Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Thr Gly115 120 125Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>65Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>67Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110
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<211>193<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工序列描述突变蛋白<400>69Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125Leu Glu Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>70Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>71
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<223>人工序列描述突变蛋白
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>78Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
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<210>79<211>193<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工序列描述突变蛋白<400>79Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>80Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
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<220>
<223>人工序列描述突变蛋白<400>81Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ala Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile145 150 155 160
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>82Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>83Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ala145 150 155 160Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu165 170 175Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp180 185 190
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>84Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>85Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45
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<213>人工的<220>
<223>人工序列描述突变蛋白<400>86Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>87Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>88Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile145 150 155 160Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ala Asn Phe Leu165 170 175Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180 185 190Arg<210>89<211>193<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工序列描述突变蛋白<400>89Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>90Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
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<211>193<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工序列描述突变蛋白<400>91Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>92Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>93
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>94Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
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<210>96<211>193<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工序列描述突变蛋白<400>96Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>97Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60
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<223>人工序列描述突变蛋白
<400>98Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile145 150 155 160Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>99Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>100Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
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<210>101<211>193<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工序列描述突变蛋白<400>101Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile145 150 155 160Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu165 170 175Arg Gly Lys Leu Lys Ala Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp180 185 190Arg<210>102<211>193<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工序列描述突变蛋白<400>102Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
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<220>
<223>人工序列描述突变蛋白<400>103Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile145 150 155 160
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>104Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>105Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile145 150 155 160Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu165 170 175Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Ala Thr Gly Asp180 185 190
Arg<210>106<211>192<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工序列描述突变蛋白<400>106Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn50 55 60Ile Thr Val Pro Asp Thr Asp Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met65 70 75 80Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu85 90 95Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln100 105 110Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Glu Gly Leu
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>107Met Gly Val His Glu Cys Pro Ale Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Asn Glu Thr Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile145 150 155 160Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu165 170 175Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp180 185 190Arg<210>108<211>193<212>PRT<213>人工的<220>
<223>人工序列描述突变蛋白
<400>108Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Asp Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile145 150 155 160Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
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<223>人工序列描述突变蛋白<400>109Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu1 5 10 15Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu20 25 30Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu35 40 45Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu50 55 60Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg65 70 75 80Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu85 90 95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser100 105 110Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly115 120 125Leu Glu Ser Leu Thr Thr Ser Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu130 135 140Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile145 150 155 160Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu165 170 175Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp180 185 190Arg<210>110<211>193<212>PRT<213>人工的<220>
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权利要求
1.用于鉴别能调节组织保护活性的化合物的方法，其包括(a)使实验化合物接触组织保护性细胞因子受体复合物；(b)测量组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平；(c)鉴别与在没有实验化合物存在的情况下测得的组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平相比，能提高或降低组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平的实验化合物；和(d)测定鉴别出的实验化合物的组织保护活性。
2.如权利要求1的方法，其中通过测量实验化合物与组织保护性细胞因子受体复合物的结合，来测量组织保护性细胞因子受体复合物活性。
3.如权利要求2的方法，其中标记了所述实验化合物，并通过检测附着到所述实验化合物上的标记，测量了标记的实验化合物与组织保护性细胞因子受体复合物的结合。
4.如权利要求2的方法，其中通过测量实验化合物与组织保护性细胞因子受体复合物的结合，来测量组织保护性细胞因子受体复合物活性。
5.用于鉴别能调节组织保护活性的化合物的方法，其包括(a)使实验化合物接触能表达组织保护性细胞因子受体复合物的细胞；和(b)测量细胞中的组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平；(c)鉴别与在没有实验化合物存在的情况下测得的组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平相比，能提高或降低组织保护性细胞因子受体复合物活性的实验化合物；和(d)测定鉴别出的实验化合物的组织保护活性。
6.如权利要求5的方法，其中通过细胞增殖测定测量组织保护性细胞因子受体复合物活性。
7.如权利要求5的方法，其中重组工程改造所述细胞以表达至少一种EPO或β共有受体。
8.如权利要求7的方法，其中所述细胞能内源地表达EPO受体，并转化了包含核苷酸序列的核酸，所述的核苷酸序列(i)可操作地连接到启动子上，且(ii)能编码β共有受体多肽。
9.如权利要求7的方法，其中所述细胞能内源地表达β共有受体，并转化了包含核苷酸序列的核酸，所述的核苷酸序列(i)可操作地连接到启动于上，且(ii)能编码EPO受体多肽。
10.如权利要求8或9的方法，其中核苷酸序列源自与细胞相同的物种。
11.用于鉴别能调节组织保护活性的化合物的方法，其包括(a)使实验化合物接触重组工程改造以表达EPO受体的细胞，其中所述的细胞转化了包含核苷酸序列的核酸，所述的核苷酸序列(i)可操作地连接到启动子上，且(ii)能编码β共有受体多肽；(b)测量细胞中的组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平；(c)鉴别与在对照细胞中测得的组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平相比，能增加或降低细胞中的组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平的实验化合物，其中对照细胞是与步骤(a)的细胞相同的细胞类型，且未转化包含核苷酸序列的核酸，所述的核苷酸序列(i)可操作地连接到启动子上，且(ii)能编码β共有受体多肽；和(d)测定鉴别出的实验化合物的组织保护活性。
12.用于鉴别能调节组织保护活性的化合物的方法，其包括(a)使实验化合物接触能表达β共有受体的重组细胞，其中所述的细胞转化了包含核苷酸序列的核酸，所述的核苷酸序列(i)可操作地连接到启动子上，且(ii)能编码EPO受体多肽；(b)测量细胞中的组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平；(c)鉴别与在对照细胞中测得的组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平相比，能增加或降低细胞中的组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平的实验化合物，其中对照细胞是与步骤(a)的细胞相同的细胞类型，且未转化包含核苷酸序列的核酸，所述的核苷酸序列(i)可操作地连接到启动子上，且(ii)能编码β共有受体多肽；和(d)测定鉴别出的实验化合物的组织保护活性。
13.用于鉴别能调节组织保护活性的化合物的方法，其包括(a)使实验化合物接触能表达组织保护性细胞因子受体复合物的细胞，其中所述的细胞转化了包含核苷酸序列的核酸，所述的核苷酸序列能编码可操作地连接到与组织保护性细胞因子受体复合物活性有关的调节元件上的报告基因；(b)鉴别与在没有实验化合物存在的情况下测得的报告基因的表达水平相比，能提高或降低报告基因的表达水平的实验化合物，和(c)测定鉴别出的实验化合物的组织保护活性。
14.如权利要求13的方法，其中所述的调节元件是血清反应元件。
15.鉴别能调节组织保护活性的化合物的方法，其包括(a)使实验化合物接触细胞，该细胞包含(i)包含报告基因的核酸序列，所述的报告基因可操作地连接到对转录激活物的DNA结合结构域特异性的结合位点上；(ii)第一种融合蛋白，其包含(A)转录激活物的DNA结合结构域，和(B)第一种组织保护性细胞因子受体多肽或其片段；和(iii)第二种融合蛋白，其包含(A)转录激活物的活化结构域，和(B)第二种组织保护性细胞因子受体，(b)检测报告基因表达，从而，如果(b)中的报告基因表达不同于在没有实验化合物存在的情况下测得的报告基因表达，则鉴别出了能调节组织保护活性的化合物。
16.如权利要求5、11、12、13或15中的任一项的方法，其中所述的细胞是原核细胞。
17.如权利要求5、11、12、13或15中的任一项的方法，其中所述的细胞是真核细胞。
18.如权利要求17的方法，其中所述的真核生物细胞是人细胞。
19.如权利要求5、11、12、13或15中的任一项的方法，其中所述的细胞能内源地表达至少一种组织保护性细胞因子受体复合物的受体。
20.如权利要求5、11、12、13或15中的任一项的方法，其中所述的细胞是BaF3细胞。
21.鉴别能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物的方法，所述的方法包括(a)使实验化合物接触修饰的酵母菌株细胞，所述细胞含有(i)能编码报告基因的核苷酸序列，所述的报告基因可操作地连接到组织保护性细胞因子受体复合物-反应性的启动子上，和(ii)表达组织保护性细胞因子受体复合物；和(b)通过测量报告基因的表达水平，来测定组织保护性细胞因子受体复合物的活性水平，从而，如果与在没有化合物存在时报告基因的活性水平相比，在有化合物存在时报告基因的活性水平升高或降低，则鉴别出了能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物。
22.用于鉴别能结合组织保护性细胞因子受体复合物的化合物的方法，其包括(a)在有利于结合的条件下，使组织保护性细胞因子受体复合物接触(i)附着到第一种标记上的组织保护性细胞因子受体复合物配体和(ii)附着到第二种标记上的等量的实验化合物；(b)从组织保护性细胞因子受体复合物中去除未结合的材料；和(c)检测第一种和第二种标记的水平，其中，如果第二种标记存在，则化合物结合到复合物上，且如果与在有利于结合的条件下，在去除未结合的材料后没有实验化合物存在的情况下，使标记的配体接触组织保护性细胞因子受体复合物时的第一种标记的水平相比，第一种标记的水平降低，则鉴别出了能结合组织保护性细胞因子受体复合物的化合物。
23.用于鉴别能调节组织保护性细胞因子受体复合物配体与组织保护性细胞因子受体复合物的结合的化合物的方法，其包括(a)在有利于结合的条件下，在有一种或多种实验化合物存在的情况下，使组织保护性细胞因子受体复合物配体接触组织保护性细胞因子受体复合物；和(b)测量结合到组织保护性细胞因子受体复合物上的组织保护性细胞因子受体复合物配体的量；从而，如果在(b)中测得的结合的组织保护性细胞因子受体复合物配体的量不同于在没有一种或多种实验化合物存在的情况下测得的结合的组织保护性细胞因子受体复合物配体的量，则鉴别出了能调节组织保护性细胞因子受体复合物配体与组织保护性细胞因子受体复合物的结合的化合物。
24.如权利要求23的方法，其中使用组织保护性细胞因子受体复合物配体-特异性的抗体测量结合的组织保护性细胞因子受体复合物配体的量。
25.如权利要求23的方法，其中标记了组织保护性细胞因子受体复合物配体，并通过检测附着到组织保护性细胞因子受体复合物配体上的标记，来测量组织保护性细胞因子受体复合物配体与组织保护性细胞因子受体复合物的结合。
26.如权利要求23的方法，其中标记了组织保护性细胞因子受体复合物配体，并通过检测附着到组织保护性细胞因子受体复合物配体上的标记，来测量标记的配体与组织保护性细胞因子受体复合物的结合。
27.如权利要求24的方法，其中所述的标记是荧光的。
28.用于鉴别能调节组织保护性细胞因子受体复合物和组织保护性细胞因子受体复合物配体之间的相互作用的化合物的方法，其包括(a)使组织保护性细胞因子受体复合物接触一种或多种实验化合物；和(b)测量组织保护性细胞因子受体复合物活性，从而，如果在(b)中测得的活性不同于在没有一种或多种实验化合物存在的情况下测得的组织保护性细胞因子受体复合物活性，则鉴别出了能调节组织保护性细胞因子受体复合物和组织保护性细胞因子受体复合物配体之间的相互作用的化合物。
29.如权利要求1、5、11、12或28中的任一项的方法，其中通过细胞增殖或细胞分化测量组织保护性细胞因子受体复合物活性。
30.如权利要求1、5、11、12或28中的任一项的方法，其中测量的组织保护性细胞因子受体复合物活性是组织保护性细胞因子受体复合物与组织保护性细胞因子受体复合物配体相互作用的能力。
31.如权利要求1、5、11、12、13、22或28中的任一项的方法，其中测定鉴别出的化合物的组织保护活性的步骤包括检测细胞中核仁素的存在。
32.如权利要求1、5、11、12、13、22或28中的任一项的方法，其中测定鉴别出的化合物的组织保护活性的步骤包括检测或测量细胞中的高水平的神经珠蛋白或细胞珠蛋白的活性。
33.如权利要求1、22、23或28中的任一项的方法，其中所述的组织保护性细胞因子受体复合物是在溶液中的。
34.如权利要求1、22、23或28中的任一项的方法，其中所述的组织保护性细胞因子受体复合物是在细胞中的。
35.如权利要求23或28的方法，其中所述的化合物会抑制组织保护性细胞因子受体复合物配体与组织保护性细胞因子受体复合物的结合。
36.如权利要求23或28的方法，其中所述的化合物会增强组织保护性细胞因子受体复合物配体与组织保护性细胞因子受体复合物的结合。
37.如权利要求1、22、23或28中的任一项的方法，其中在步骤(a)中接触的组织保护性细胞因子受体复合物是在细胞表面上的。
38.如权利要求1、22、23或28中的任一项的方法，其中所述的组织保护性细胞因子受体复合物是在分离的细胞膜上的。
39.如权利要求1、22、23或28中的任一项的方法，其中所述的组织保护性细胞因子受体复合物是固定化到固体表面上的。
40.如权利要求39的方法，其中所述的固体表面是微量滴定盘。
41.如权利要求39的方法，其中所述的固体表面是芯片。
42.用于鉴别能结合组织保护性细胞因子受体复合物的化合物的方法，其包含(a)使实验化合物接触配体-结合组织保护性受体复合物片段，所述片段包含至少一个EPO受体胞外域和至少一个β共有受体胞外域，其融合到附着到固体支持体上的Fc片段上；和(b)从固体支持体去除未结合的实验化合物；(c)鉴别附着到组织保护性细胞因子受体复合物片段上的化合物，从而，将结合到固体支持体上的化合物鉴别为能结合组织保护性细胞因子受体复合物的化合物。
43.如权利要求1、5、11、12、13、15、16、22、23、28或42中的任一项的方法，其中所述的实验化合物是对组织保护性细胞因子受体复合物特异性的抗体。
44.如权利要求16、22、23、28或42中的任一项的方法，其中所述的实验化合物是对组织保护性细胞因子受体复合物配体特异性的抗体。
45.如权利要求1、5、11、12、13、15、16、22、23、28或42中的任一项的方法，其中所述的实验化合物是小分子。
46.如权利要求1、5、11、12、13、15、16、22、23、28或42中的任一项的方法，其中所述的实验化合物是肽。
47.如权利要求1、5、11、12、13、15、16、22、23、28或42中的任一项的方法，其中所述的实验化合物是文库中的成员。
48.如权利要求16、22、23、28或42中的任一项的方法，其中所述的组织保护性细胞因子受体复合物配体是EPO。
49.如权利要求1、5、11、12、13、28或42中的任一项的方法，其中所述的化合物能结合组织保护性细胞因子受体复合物。
50.如权利要求16、23、28或42中的任一项的方法，其中所述的化合物能结合组织保护性细胞因子受体复合物配体。
51.用于鉴别能调节哺乳动物的组织保护活性的化合物的方法，其包括(a)在造成损伤后，立即将化合物施用给第一种动物，其中第一种动物能内源地表达组织保护性细胞因子受体复合物；和(b)在造成与步骤(a)相同的损伤后，立即将化合物施用给第二种动物，其中第二种动物在表达组织保护性细胞因子受体复合物中有缺陷；从而，如果步骤(a)的动物与步骤(b)的动物相比，存在损伤恢复的差异，则鉴别出了能调节组织保护活性的化合物。
52.治疗或预防人的疾病或障碍的方法，其包括将治疗有效量的能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物施用给需要这样的治疗或预防的人，条件是所述的化合物不是EPO。
53.如权利要求52的方法，其中所述的疾病或障碍是可兴奋组织的疾病或障碍，或能影响可兴奋组织的疾病或障碍。
54.增强人的可兴奋细胞、组织或器官的功能的方法，其包括将治疗有效量的能调节组织保护性细胞因子受体复合物的活性的化合物施用给有所述需要的人，其中所述的增强可兴奋细胞、组织或器官的功能，会导致增强联想学习或记忆，条件是所述的化合物不是EPO。
55.调节人的组织保护性细胞因子受体复合物的活性的方法，其包括将能调节所述复合物的活性的化合物施用给需要这样的治疗或预防的人，条件是所述的化合物不是EPO。
56.治疗或预防人的疾病或障碍的方法，其包括调节人的组织保护性细胞因子受体复合物。
57.增强人的可兴奋细胞、组织或器官的功能的方法，其包括调节人的组织保护性细胞因子受体复合物。
58.如权利要求52、53、54或55中的任一项的方法，其中所述的化合物是通过如权利要求1-5、11-15、21-23、28和42中的任一项的方法鉴别出的。
59.如权利要求52、53、54或55中的任一项的方法，其中所述的化合物是对组织保护性细胞因子受体复合物特异性的抗体。
60.如权利要求52、53、54或55中的任一项的方法，其中所述的化合物是对组织保护性细胞因子受体复合物配体特异性的抗体。
61.如权利要求52、53、54或55中的任一项的方法，其中所述的化合物是小分子、肽或文库中的成员。
62.如权利要求52、53、54或55中的任一项的方法，其中所述的化合物能结合组织保护性细胞因子受体复合物。
63.如权利要求52、53、54或55中的任一项的方法，其中所述的化合物能增强组织保护性细胞因子受体复合物的活性。
64.如权利要求52、53、54或55中的任一项的方法，其中所述的化合物能妨碍组织保护性细胞因子受体复合物的活性。
65.如权利要求52、53、54或55中的任一项的方法，其中将所述的化合物与EPO结合施用。
66.如权利要求52、53或56中的任一项的方法，其中所述的疾病或障碍是心境障碍、焦虑障碍、抑郁症、孤独症、注意力不集中的过度反应症、阿尔茨海默病、老化或认知功能障碍。
67.如权利要求52、53或56中的任一项的方法，其中所述的疾病或障碍是由缺氧、癫痫发作病、神经变性病、神经毒素中毒、多发性硬化、低血压、心搏停止、辐射或低血糖造成的。
68.如权利要求52、53或56中的任一项的方法，其中所述的疾病或障碍是局部缺血或发作。
69.如权利要求52、53或56中的任一项的方法，其中所述的疾病或障碍是神经变性状况。
70.如权利要求69的方法，其中神经变性状况是发作、阿尔茨海默病、帕金森病、大脑性麻痹、脑或脊髓创伤、AIDS痴呆、与年龄有关的认知功能丧失、记忆丧失、肌萎缩性侧索硬化症、癫痫发作病、酒精中毒、老化或神经元丧失。
71.如权利要求52、53或56中的任一项的方法，其中所述的疾病或障碍是神经肌肉或肌肉状况。
72.如权利要求71的方法，其中神经肌肉或肌肉状况是心脏组织的。
73.如权利要求52、53或56中的任一项的方法，其中所述的疾病或障碍是心脏的。
74.如权利要求73的方法，其中所述的疾病或障碍是充血性心力衰竭、冠状动脉病、局部缺血、心肌梗死、心绞痛、先天性心脏病、prinzmetal心绞痛、心脏破裂、脉管炎、心律失常、快速性-缓慢性心律失常、室上的、心室的、传导异常、心肌炎、肺源性心脏病或钝伤和穿透伤。
75.如权利要求52、53或56中的任一项的方法，其中所述的疾病或障碍是眼的。
76.如权利要求73的方法，其中所述的疾病或障碍是视神经炎、钝伤和穿透伤、感染、肉样瘤、镰刀形细胞病、视网膜脱离、颞动脉炎、视网膜缺血、黄斑变性、色素性视网膜炎、动脉硬化性视网膜病、高血压性视网膜病、视网膜动脉阻塞、视网膜静脉阻塞、低血压、糖尿病性视网膜病或黄斑水肿。
77.如权利要求54或57的方法，其中所述的可兴奋组织是中枢神经系统组织或外周神经系统组织。
78.如权利要求77的方法，其中所述的外周神经系统组织是胎盘组织、视网膜组织或心脏组织。
79.如权利要求52、53、54或55中的任一项的方法，其中施用是经口的、局部的、颅内的、腔内的、吸入、肠胃外的、静脉内的、外围地、动脉内的、皮下的、肌内的、腹膜内的、粘膜下的或皮内的施用。
80.如权利要求52、53、54或55中的任一项的方法，其中所述的施用是在医学的、手术的或自然的过程之前。
81.如权利要求80的方法，其中所述的手术程序是肿瘤切除、动脉瘤修复或冠状动脉旁路程序。
82.如权利要求80的方法，其中所述的医学过程是化疗。
83.如权利要求80的方法，其中所述的自然的过程是分娩或生育。
全文摘要
本发明涉及使用能介导组织保护活性的异源多聚体受体复合物鉴别具有组织保护活性的化合物的方法。该复合物由复合物中的至少一个EPO－R和至少一个β
文档编号A61K39/00GK1812806SQ200480017705
公开日2006年8月2日 申请日期2004年4月26日 优先权日2003年4月25日
发明者M·布赖恩斯, A·切拉米, P·赫兹, F·费奥尔达利索, M·弗拉特利, M·莱斯特, M·尼尔森, T·萨格尔, L·O·彼得森, J·格尔韦恩, T·科尔曼 申请人:肯尼思 S.沃伦协会有限公司