专利名称：一种丝素蛋白涂层钛网及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属组织工程和医用材料领域，具体涉及一种丝素蛋白涂层钛网及其制备方法和在气管缺损重建中应用。
背景技术：
目前，机体在因炎症、外伤、肿瘤或其他病变导致气管大范围受损、切除较长段气管的情况下，需修复缺损气管。长期以来，气管软骨缺损的修复问题，一直困扰着临床医生。一期端端吻合术仅适合于局部缺损的修复，当缺损长度超过6.0cm时，由于吻合口张力高而易产生吻合口漏等严重并发症。组织工程技术研究的突飞猛给气管重建带来新的希望，但自1994年初步尝试后再无突破性进展，仍处于实验和探索阶段，仍有问题亟待解决。许多学者尝试应用同种异体移植、自体组织移植以及人工材料替代物等方法，效果均不够理想。人工气管完善应用更关键的是如何在人工气管内腔表面引入具有调节气管粘膜细胞生长代谢作用的材料，促进粘膜上皮爬行再生。在众多的生物材料中，胶原被认为是较理想的选择。然而，胶原属于异体动物组织提取物，存在传染病毒等疾病的潜在可能性，且制作过程复杂，而丝素属于天然蛋白，来源丰富，价格适宜。国外学者研究了不同的人体细胞株在丝素蛋白膜上的生长情况，结果表明，丝蛋白和胶原蛋白一样，可以促进细胞的生长。
丝素蛋白是一种天然结构性蛋白，主要由三种简单的氨基酸甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸组成，它们约占蛋白总量的85％。丝素膜在皮肤、口腔及眼睛等部位的生物相容性良好，抗原性不明显，皮下埋植试验表明无明显炎症或占位现象发生。有研究表明由于丝素蛋白中不仅含有相当比例的OH、COOH、NH2等带极性基团的氨基酸残基，使再生丝素蛋白膜的亲水性强；成纤维细胞因其膜表面富含纤维粘连蛋白、组蛋白等，与生物材料表面粘附作用的能力强，再生丝素膜表面所携带的结构信息，显然对成纤维细胞的粘附和增殖具有重要作用。另一方面还含有一定比例的带正电荷的氨基酸残基，这也为成纤维细胞在再生丝素膜表面的粘附和增殖创造了良好条件。
丝素蛋白有良好的生物相容性，无毒，无刺激性，在生物医用领域得到了日益广泛的应用，如医用丝素蛋白皮肤再生膜、隐形眼镜、细胞培养基及人工脑膜的实验研究等等。但迄今为止，国内外尚无丝素蛋白在气管缺损重建方面应用的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种丝素蛋白涂层钛网。本发明的另一目的是提供制备所述钛网的方法。本发明的进一步目的是提供所述钛网在临床气管缺损重建中的应用。
本发明采用医用钛网作为支撑材料，以丝素蛋白为涂层，制成丝素蛋白涂层钛网复合体，所述的丝素蛋白浓度为6-12％(重量/体积)，所述钛网孔隙不封闭。本发明利用丝素的良好生物相容性和促进成纤维细胞和粘膜细胞生长的作用，能加速愈合，减少并发症，又可以长期或永久有效支撑管腔。
本发明丝素蛋白涂层的钛网可用作临床气管缺损修补，能为探讨丝素蛋白在促进气管粘膜修复及临床重建气管缺损、减少重建气管术后并发症的作用提供有意义的参考。
本发明所述的丝素蛋白涂层钛网通过下述方法和步骤制备1、制备丝素蛋白采用废桑蚕生丝在NaHCO3(0.5wt％)水溶液中脱胶，将脱胶丝溶于9.3mol/L的LiBr水溶液中，搅拌至蚕丝完全溶解。过滤，除去未溶解的蚕丝及杂质，得丝素蛋白盐溶液，用去离子水透析除去溶液中的LiBr，得浓度为4％的丝蛋白，再浓缩，PEG透析，所得丝素蛋白溶液离心去除杂质，留上清液。所得的丝素蛋白浓度为20％，置4℃冰箱保存备用。通过称重法测定丝素蛋白溶液的浓度，可根据需要稀释为6-12％不同浓度的溶液，同时避免引起构象的变化。
2、制备丝素涂层钛网采用医用钛网(市购)制成与实验动物气管相同弧度的、粗细相同的具有一定弹性的类气管环样结构的形状，环氧乙烷熏蒸灭菌后，钛网反复浸蘸于上述低温(4摄氏度)保存的稀释浓度为6-12％的丝素溶液，取出后放入烘箱60度烘干，如此反复6-10次，使其表面均匀涂布有丝素材料，并使钛网孔隙不封闭，以上过程均无菌操作。
3、气管缺损重建动物实验采用清洁级新西兰雄性大白兔25只(由复旦大学动物实验中心提供)，体重2.3-2.5KG，平均2.4KG，兔龄均为3个月，随机分为有丝素蛋白涂层的钛网组(n＝12)、单纯钛网组(n＝12)。正常家兔(n＝1)作为对照。
结果1)有丝素涂层的钛网重建组所有家兔术后均无呼吸困难，术后4周、8周、12周分别取材，均见气管重建处结构理想，丝素钛网表面覆盖生长半透明纤维组织，并且组织内有微血管生长见，且与周围组织无粘连。
气管内窥镜检查，见气管腔内粘膜光滑，管腔无明显狭窄，无疤痕及肉芽组织生长。
气管CT检查或切取重建处气管行CT检查，均未见明显气管狭窄，CT仅有部分气管粘膜极轻微局限性增厚，AIR STRUCTURE影像学重建，重建处气管腔亦显示无狭窄。
组织病理切片检查见缺损重建处粘膜细胞组成与正常气管粘膜无明显差异，主要有纤毛柱状细胞和杯状细胞等组成。
扫描电镜检查，8周时生长良好，纤毛较长、较密，但是方向性仍然稍差且比正常气管粘膜纤毛短及稀疏，12周时恢复正常，与正常气管粘膜纤毛无明显差异。
2)单纯钛网重建组所有家兔术后均不同程度的并发颈部皮下气肿，其中2例并发全身皮下气肿，1例家兔于埋植术后5天及重建术后14天出现腹泻，另外一例家兔在重建术后17天时，出现腹泻，不进食，逐渐消瘦，死亡。另有家兔术后并发颈部皮下肿块，取材时见气管重建处钛网表面疤痕组织。
死亡家兔气管内窥镜检查，见气管腔内感染粘脓栓形成及重建处红色炎性肉芽组织生长，管腔明显狭窄，有疤痕及肉芽组织生长，有明显的分泌物。
气管CT检查见气管腔重度狭窄，甚至完全无腔隙，
组织病理学检查显示大量肉芽组织增生，及少量炎性细胞浸润，粘膜下纤维组织层比丝素涂层的钛网重建组粘膜下纤维组织层厚，纤毛较稀疏。
扫描电镜检查显示与丝素涂层的钛网重建组相比纤毛更稀疏、短、方向性差、自净功能差，表面有少许分泌物附着3)应用SAS6.12统计软件，用cmh卡方，评分方法为修正的ridit评分，并以时间因素分层检验两组重建气管最狭窄处的增生组织的横截面积的差异及相对应处气管的内截面面积的差异；用确切概率法检验两组其他术后并发症(窒息死亡；皮下气肿；颈部感染)的差异。表1是术后并发症“窒息死亡”对比。表2是术后并发颈部感染情况。表3是皮下气肿情况。
表1窒息死亡 未出现窒息 合计丝素涂层的钛网重建组 0 11 11单纯钛网重建组 5 6 11合计 5 17 22确切概率法检验统计学差异有显著性(p＜0.05)。
表2颈部感染 颈部无感染 合计丝素涂层的钛网重建组 0 11 11单纯钛网重建组 2 9 11合计 2 20 22确切概率法检验统计学差异无显著性(p＞0.05)。
表3出现皮下气肿 无皮下气肿 合计丝素涂层的钛网重建组 3 8 11单纯钛网重建组110 11合计 148 22确切概率法检验统计学差异有显著性(p＜0.05＝。
4)使用16排螺旋CT(美国GE公司产)AW4.0 work station进行图像分析，计算家兔重建气管最狭窄处的增生组织的横截面积以及相对应处气管的内截面面积。表4是家兔重建气管最狭窄处的增生组织的横截面积(mm2)。表5是相对应处气管的内截面面积。
表4
结果表明，丝素涂层的钛网重建组家兔重建气管最狭窄处的增生组织的横截面积最小值为1.24mm2，最大值为5.78mm2，平均为3.15±1.58mm2，中位数为3.35。
单纯钛网重建组家兔重建气管最狭窄处的增生组织的横截面积最小值为4.35mm2，最大值为28.56mm2，平均为18.15±7.85mm2，中位数为16.65。
两组数据用cmh卡方，评分方法为修正的ridit评分，并以时间因素分层检验两组重建气管最狭窄处的增生组织的横截面积的差异，统计学差异有显著性(p＜0.05)。
表5
结果表明，丝素涂层的钛网重建组家兔气管重建处的内截面积最小值为26.79mm2，最大值为29.69mm2，平均为28.37±0.86mm2。
单纯钛网重建组家兔气管重建处的内截面积最小值为26.31mm2，最大值为29.46mm2，平均为28.13±1.01mm2。
两组数据以时间因素分层检验两组重建气管处气管的内截面面积的差异，统计学差异无显著性(p＝0.19＞0.05)，而且，时间分层因素检验，统计学差异亦无显著性(p＝0.35＞0.05)。
本发明经动物实验结果显示，丝素可以明显促进成纤维细胞的生长，成纤维细胞紧密附着在丝素表面，方向一致，且呈有极性的生长，本发明实验结果还显示毛细血管和气管粘膜细胞在丝素诱导生成的成纤维细胞表面生长良好，无肉芽组织增生。本发明发现丝素表面生长的成纤维细胞并不是无限制增殖，而是具有一定的极性、层次和厚度，但是在不同部位和不同面积的丝素表面厚度完全不同。
本发明采用医用钛网作为支撑材料，既可以利用丝素的良好生物相容性和促进成纤维细胞和粘膜细胞生长的作用，加速愈合，减少并发症，又可以长期或永久有效支撑管腔。与单纯钛网相比，带有丝素蛋白涂层的钛网用于家兔的气管重建具有更多的优点，由于丝素可以促进成纤维细胞和毛细血管的生长，气管前埋植两周后的钛网表面半透明的纤维组织完全膜闭所有网孔，此时用于气管重建，可以完全封闭气管壁，使其内外不会相通，避免了皮下气肿和局部感染的发生。气管缺损边缘正常气管的粘膜便沿丝素涂层钛网表面的薄层成纤维细胞表面生长，及时快速地完全覆盖支架管腔面，有效地防止了肉芽生长、气管狭窄及由于狭窄导致窒息死亡等并发症的发生。组织学检查显示生长覆盖在材料表面的粘膜生长良好，电镜检查显示其纤毛方向性好，自净功能与正常气管粘膜无异，而且钛网作为支架可以保持一定的弹性、长度和足够的硬度以对抗负压，将丝素蛋白涂层的钛网用于气管重建未发现钛网移位现象，材料表面的成纤维细胞与机体残余气管边缘组织的生长融合良好。
本发明采用丝素蛋白涂层的钛网用于气管重建，解决了在人工气管内腔表面引入具有调节气管粘膜细胞生长代谢作用的材料的问题，可以促进粘膜上皮爬行，避免术后气管再度狭窄，获得了满意的效果，具有理想气管替代物的五个标准是具有高度生物相容性的合成材料；血管适宜在移植物内生长；具上皮组织或适宜于上皮组织生长；有充分的长度以满足不同程度的缺损修复；具有足够硬度以对抗负压。可进一步推广到临床应用于环行较大面积气管组织缺损的重建。
图1-3内窥镜检测结果，其中a丝素涂层钛网重建12周，b单纯钛网重建后肉芽增生，c单纯钛网重建12周时狭窄。
图2是丝素涂层钛网重建处粘膜纤毛，其中a×2000术后4周重建处，b×2000术后8周重建处，c×2000术后12周重建处，已恢复正常。
图3是单纯钛网重建处粘膜纤毛，其中a×2000术后4周重建处，b×2000术后8周重建处，c×2000术后12周重建处。
图4是丝素涂层钛网重建CT检查结果，其中a重建4周，b重建8周，c重建12周，d矢状位重建，eAIR STRUCTURE显示重建处气管腔狭窄(箭头指)。
图5是单纯钛网重建CT检查结果，其中a重建8周窒息，b重建12周狭窄，c冠状位重建，d矢状位重建，eAIR STRUCTURE显示重建处气管腔狭窄(箭头指)。
具体实施例方式
实施例1制备丝素蛋白采用废桑蚕生丝在100℃的NaHCO3(0.5wt％)水溶液中脱胶45分钟，并将脱胶丝溶于9.3mol/L的LiBr水溶液中，在45℃下不断搅拌约2个小时至蚕丝完全溶解。用八层医用纱布过滤，除去未溶解的蚕丝及杂质，得到的丝素蛋白盐溶液，用去离子水透析四天以除去溶液中的LiBr，透析袋的截流分子量为12,000～14,000Da。所制备的丝蛋白浓度为4％左右，进一步对其浓缩，继续用10％的PEG透析一天，透析好的丝素蛋白溶液以6000rpm转速离心15分钟去除杂质，留上层清液。所得的丝素蛋白浓度为20％，作为储存液置4℃冰箱保存备用。通过称重法测定丝素蛋白溶液的浓度，可根据需要可稀释为6-12％不同浓度的溶液。透析好的样品要尽量避免强烈搅拌和震荡以及接触有机溶剂等，以防引起构象的变化，稀释过程中也要尽量避免搅拌过于剧烈。
实施例2制备丝素涂层钛网采用医用钛网(市购)制成与实验动物家兔气管相同弧度的，粗细相同的具有一定弹性的类气管环样结构的形状，环氧乙烷熏蒸灭菌后，钛网反复浸蘸于上述低温保存的稀释浓度为6％的丝素溶液，取出后放入烘箱60度烘干，如此反复6-10次，使其表面均匀涂布有丝素材料，并且保持钛网孔隙不封闭，以上过程均无菌操作。
实施例3采用医用钛网(市购)制成与实验动物家兔气管相同弧度的，粗细相同的具有一定弹性的类气管环样结构的形状，环氧乙烷熏蒸灭菌后，钛网反复浸蘸于上述低温保存的稀释浓度为12％的丝素溶液，取出后放入烘箱60度烘干，如此反复6-8次，使其表面均匀涂布有丝素材料，并且保持钛网孔隙不封闭，以上过程均无菌操作。
实施例4采用医用钛网(市购)制成与实验动物家兔气管相同弧度的，粗细相同的具有一定弹性的类气管环样结构的形状，环氧乙烷熏蒸灭菌后，钛网反复浸蘸于上述低温保存的稀释浓度为10％的丝素溶液，取出后放入烘箱60度烘干，如此反复8次，使其表面均匀涂布有丝素材料，并且保持钛网孔隙不封闭，以上过程均无菌操作。
实施例5动物实验25只清洁级新西兰雄性大白兔(由复旦大学动物实验中心提供)，体重2.3-2.5KG，平均2.4KG，兔龄均为3个月，随机分为丝素蛋白涂层的钛网组(n＝12)、单纯钛网组(n＝12)。正常家兔(n＝1)作为对照。
1)丝素涂层的钛网重建组预置埋植术后7天及重建术后12天，每日两次肌肉注射青霉素10万u/次。术后三天内极少许进食，第五天进食量基本正常，术后体温正常，基本在39.3-39.5℃左右，3例术后出现轻微颈部皮下气肿，该组全部家兔术后无感染并发症出现，一例家兔重建术后14天时，出现腹泻，给予庆大霉素1万单位肌肉注射/天，3天后腹泻停止，但是不进食，逐渐消瘦后死亡，所有家兔术后均无呼吸困难，术后1周内有轻度的喘鸣音，一周后逐渐消失，术后4周、8周、12周分别取材，均可见气管重建处结构理想，丝素钛网表面覆盖生长半透明纤维组织，并且这层薄薄的组织内有微血管生长见，且与周围组织无粘连。
气管内窥镜检查术后4周、8周、12周时检查，可见气管腔内粘膜光滑，管腔无明显狭窄，无疤痕及肉芽组织生长，在4周时粘膜表面有少许分泌物。
家兔麻醉固定后气管CT检查或切取重建处气管行CT检查所有家兔术后4周、8周、12周气管CT检查均未见明显气管狭窄，CT仅有部分气管粘膜极轻微局限性增厚，AIR STRUCTURE影像学重建，重建处气管腔亦显示无狭窄。
组织病理切片检查可见缺损重建处粘膜细胞组成与正常气管粘膜无明显差异，主要有纤毛柱状细胞和杯状细胞等组成，粘膜表面纤毛生长情况术后4周时生长较好，部分区域密度稍稀疏，8周时覆盖良好，12周时基本正常。粘膜下薄层成纤维细胞有序生长，可见未完全吸收的丝素材料生物相容性好，丝素周围成纤维组织生长，偶见少许单核细胞，抗原反应不明显或无明显异物排斥反应。与正常的气管病理切片(HE×400)相比，前者粘膜下多一层薄层纤维组织，且毛细血管丰富。
扫描电镜检查术后4周时纤毛稀疏、较短，方向性差，自净功能差，表面有较多分泌物附着，部分区域裸露无纤毛；8周时生长良好，纤毛较长、较密，但是方向性仍然稍差且比正常气管粘膜纤毛短及稀疏，自净功能较好，表面无明显分泌物；12周时恢复正常，与正常气管粘膜纤毛无明显差异。
2)单纯钛网重建组预置埋植术后7天及重建术后12天，每日两次肌肉注射青霉素10万u/次，术后第三天开始少许进食，第7天进食量基本正常，术后有2例家兔术后第2天至4天耳后体温40.5℃左右，其中1例术后第4天，因为气管内感染粘脓栓形成及重建处肉芽共同导致窒息死亡，另外1例，术后一周颈前部皮下感染形成瘘管，其他家兔术后体温正常，基本在39.3-39.5℃左右。还有4例家兔分别于术后5天、7天、17天、60天各窒息死亡一只。该组所有家兔术后均不同程度的并发颈部皮下气肿，其中2例并发全身皮下气肿，最高达每天自其背部皮下抽出气体约300ml，1例家兔分别于埋植术后5天及重建术后14天再次出现腹泻，予庆大霉素肌肉注射1万单位/天，3天后腹泻停止，并逐渐开始进食，恢复健康，另外一例家兔在重建术后17天时，出现腹泻，给予庆大霉素1万单位/天肌肉注射2天后腹泻停止，但不进食，逐渐消瘦，再经过3天后死亡。另有一例家兔术后并发颈部皮下肿块，约2cm直径，球形有光滑的包膜。取材时可见气管重建处钛网表面疤痕组织。
术后4天时窒息死亡的家兔气管内窥镜检查，可见气管腔内感染粘脓栓形成及重建处红色炎性肉芽组织生长，管腔明显狭窄，另外4例分别于术后5天、7天、17天、60天各窒息死亡的家兔，气管内窥镜检查可见气管腔内明显的不同程度的肉芽组织形成，管腔非常狭窄；术后4周、8周、12周时检查，可见气管腔内粘膜不光滑，管腔有不同程度的狭窄，有疤痕及肉芽组织生长，4周时气管粘膜表面有明显的分泌物。
术后包括窒息死亡的家兔CT检查可见气管腔重度狭窄，甚至完全无腔隙，术后4周、8周、12周气管CT检查均可见不同程度的气管狭窄，AIR STRUCTURE重建亦显示重建处气管腔狭窄。
气管内增生组织组织病理学切片检查术后窒息死亡的5只家兔，可见大量肉芽组织增生，及少量炎性细胞浸润；重建术后缺损重建处有纤维疤痕组织增生，其他细胞组成与正常气管粘膜无明显差异，主要有纤毛柱状细胞和杯状细胞等组成，粘膜表面纤毛生长情况术后4周时疤痕组织表面纤毛生长差，密度稀疏；8周时疤痕组织表面纤毛生长稍好，但是差于丝素涂层的钛网重建组；12周时可见粘膜下纤维组织层比丝素涂层的钛网重建组粘膜下纤维组织层厚外，纤毛也较稀疏。
扫描电镜检查家兔管腔面可见气管粘膜纤毛生长情况术后4周时与丝素涂层的钛网重建组相比纤毛更稀疏、短、方向性差、自净功能差，表面有少许分泌物附着；8周时生长稍好，纤毛稍长、稍密，但是仍然差于丝素涂层的钛网重建组，部分区域尚未完全纤毛覆盖，并且方向性欠佳；12周时仍未完全恢复正常，与正常气管粘膜、丝素涂层的钛网重建组相比有一定的差异，方向性没有后两组好，纤毛短于后两组。
权利要求
1.一种丝素蛋白涂层钛网，其特征是采用医用钛网作支撑材料，以丝素蛋白为涂层，制成丝素蛋白涂层钛网复合体，所述的丝素蛋白重量/体积浓度为6-12％，所述钛网孔隙不封闭。
2.按权利要求1所述的丝素蛋白涂层钛网，其特征是所述的丝素蛋白重量/体积浓度为10％。
3.按权利要求1所述的丝素蛋白涂层钛网，其特征是所述的钛网为气管环样结构形状。
4.权利要求1所述的丝素蛋白涂层钛网的制备方法，其特征是通过下述方法和步骤1)制备丝素蛋白采用废桑蚕生丝在NaHCO3 0.5wt％水溶液中脱胶，将脱胶丝溶于9.3mol/L的LiBr水溶液，搅拌至蚕丝溶解。过滤，除去未溶解的蚕丝及杂质，得丝素蛋白盐溶液，去离子水透析除去溶液中的LiBr，再浓缩，PEG透析，离心，留上清液，得浓度为20％丝素蛋白，置4℃冰箱保存备用，称重法测定丝素蛋白溶液浓度，根据需要稀释为6-12％不同浓度的溶液，避免引起构象的变化。2)制备丝素涂层钛网采用医用钛网制成与气管相同弧度的、粗细相同的具有一定弹性的类气管环样结构的形状，环氧乙烷熏蒸灭菌后，钛网反复浸蘸于上述低温保存的稀释浓度为6-12％的丝素溶液，取出放入烘箱60度烘干，反复6-10次，使其表面均匀涂布有丝素材料，并使钛网孔隙不封闭。3)气管缺损重建动物实验采用清洁级新西兰雄性大白兔25只，随机分组为有丝素蛋白涂层的钛网组、单纯钛网组和正常对照组。
5.权利要求1所述的丝素蛋白涂层钛网在制备气管缺损重建中的应用。
全文摘要
本发明属组织工程和医用材料领域，具体涉及一种丝素蛋白涂层钛网及其制备方法和在气管缺损重建中应用。本发明采用医用钛网作为支撑材料，以丝素蛋白为涂层，制成丝素蛋白涂层钛网复合体。本发明利用丝素的良好生物相容性和促进成纤维细胞和粘膜细胞生长的作用，能加速愈合，减少并发症，又可以长期或永久有效支撑管腔。本发明丝素蛋白涂层的钛网可用作临床气管缺损修补，能为探讨丝素蛋白在促进气管粘膜修复及临床重建气管缺损、减少重建气管术后并发症的作用提供有意义的参考。
文档编号A61F2/04GK1739809SQ20051002746
公开日2006年3月1日 申请日期2005年7月1日 优先权日2005年7月1日
发明者赵霞, 倪玉苏, 周梁, 严文洪, 邵正中, 陈新, 曹正兵 申请人:复旦大学附属华山医院, 复旦大学