专利名称：兔耳风提取物的提取方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种药物提取物的提取方法及新用途，特别涉及兔耳风提取物的提取方法及新用途。
背景技术：
杏香兔耳风(Ainsliaea fragrans Champ.)是菊科兔耳风属植物。杏香兔耳风性味甘、微苦、性凉，归肺、肝经。具有清热补虚，凉血止血，利湿解毒。主治虚劳骨蒸，肺痨咳血，妇女崩漏，湿热黄疸，水肿，痈疽肿毒，瘰疬结核，跌打损伤，毒蛇咬伤。临床上用杏香兔耳风制剂及民间验方配伍治疗宫颈糜烂[3，4]、子宫内膜炎[5]、热疖[6]、鹅口疮[7]。杏香兔耳风作为少常用中药，在许多方面尚属空白，有待进一步开发利用，以期发挥其最大作用。药理实验证明杏香兔耳风对金黄色葡萄球菌，乙型链球菌等有抑制作用，其水煎液(100％)对金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用，其抑菌圈清晰透明，直径有17mm(纸片法)。
目前市售兔耳风制剂的制备工艺方法陈旧，有效成分含量低(总有机酸含量约10％)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种兔耳风提取物，本发明另一个目的在于提供一种兔耳风提取物的提取方法及提取物的新用途。
本发明目的是通过如下技术方案实现的取兔耳风药材，切段或粉碎，按重量份加80℃-100℃的蒸馏水8-12倍量煮提2-4次，每次1.5-2.5小时，过滤，合并滤液，滤液浓缩，用盐酸调pH为1，离心，其上清液上大孔吸附树脂柱吸附，80-95％乙醇洗脱，回收乙醇，合并酸沉物，干燥，得兔耳风提取物。
上述兔耳风提取物经过确定其中化学成分为有机酸类，经含量测定，测得其提取物中总有机酸含量50％以上。
本发明兔耳风提取物的日服用剂量为0.6g-1.2g。
本发明兔耳风提取物的日服用剂量可以为0.9g。
可将上述兔耳风提取物加上药剂学接受的辅料制成临床可接受的剂型，如片剂、胶囊剂、软胶囊剂、分散片、丸剂、颗粒剂、注射液、滴丸剂、口服液体制剂，皮下给药制剂或栓剂等剂型。
本发明通过2种不同动物、2个实验模型通过对兔耳风不同工艺方法提取成分的抗炎活性进行了筛选，并对筛选成分进行了抑制急性非特异性炎症作用的初步药效学试验观察。通过体外抑菌试验，观察兔耳风提取物对引起盆腔感染主要致病菌的体外抑菌和杀菌作用及其强度。
下面实验例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1三种提取方法试验醇提法取兔耳风1Kg，95％乙醇提取2次，合并提取液，回收乙醇，干燥，得乙醇膏，称重。收率约5％。1g提取物相当于生药20g；为F1。
水提醇沉法取兔耳风1Kg，切段或粉碎，加热水10倍量煮提3次，每次2小时，过滤，合并3次滤液，加乙醇使含醇量到70％，静置12小时，过滤，回收乙醇，干燥，得乙醇膏263g。1g提取物相当于生药3.8g；为F2。
本发明的大孔吸附树脂法应用大孔吸附树脂进行兔耳风的有机酸成分的纯化。取兔耳风1Kg，切段或粉碎，加热水10倍量煮提3次，每次2小时，过滤，合并3次滤液，滤液适当浓缩，上树脂柱吸附，95％乙醇解吸附，回收乙醇，干燥，得乙醇膏30g。1g提取物相当于生药33.3g，为F3。
实验例2杏香兔耳风提取物的化学结构鉴定取1kg杏香兔耳风全草，切碎，用水提取三次，每次1小时，减压浓缩至6升，离心取上清液过1kg大孔树脂。95％乙醇洗脱。浓缩干燥后得到兔耳风提取物30g(即为上述实验例中的F3)。取提取物粉末1g经高速逆流色谱分离，按色谱峰收集，得化合物A1(21mg)，A2(26mg)。
高速逆流色谱分离条件以溶剂系统氯仿∶甲醇∶水＝2∶2∶1分离，检测波长为254nm，流速3ml/min，压力8千克力。
化合物A1淡黄色无定形粉末(甲醇)，经紫外、红外、质谱、核磁共振等波谱技术鉴定化合物A1的化学结构为3，5-二咖啡酰基奎宁酸(3，5-Dicaffeoylquinic acid)。A1分子式为C25H24O12。
化合物A2淡黄色无定形粉末(甲醇)，经紫外、红外、质谱、核磁共振等波谱技术鉴定化合物A2的化学结构为4，5-二咖啡酰基奎宁酸(4，5-Dicaffeoylquinic acid)。A2分子式为C25H24O12。
实验例3杏香兔耳风提取物化学成分性质确定取提取物适量，用甲醇配置成一定浓度的溶液，用带二极管阵列检测器的高效液相检测，其主要色谱峰紫外吸收峰型一致，证明兔耳风提取物为同一类化合物，其中含量较高的2个化合物A1、A2被鉴定为有机酸类，故兔耳风提取物主要成分为有机酸类。
色谱条件Waters高效液相色谱仪(自动进样、600泵、2996紫外二极管阵列检测器)；十八烷基硅胶键合相填充柱；流动相甲醇-水(42∶58)。对照品溶液制备精密称取A2对照品2.04mg，用甲醇定容于2mL容量瓶中，摇匀，即得浓度为1.02mg/mL的对照品储备液。
供试品溶液制备取杏香兔耳风大孔树脂提取物20mg，精密称定，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，超声20分钟，摇匀，过滤，精密吸取续滤液0.8mL，置25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
杏香兔耳风大孔树脂提取物中总有机酸含量测定精密称取三批杏香兔耳风大孔树脂提取物样品，每批2份，每份约20mg，按供试品溶液的制备方法制备后，在328nm处测定吸收度，计算总有机酸含量。结果见下表。
杏香兔耳风大孔树脂提取物样品测定结果
经计算，杏香兔耳风提取物中总有机酸的平均含量为54.11％。
实验例4不同工艺提取兔耳风成分抗炎活性的筛选取WisFar大鼠60只，随机分组，实验组大鼠分别给予实验例1的提取方法所得的F1、F2、和F3，其中F1350mg·kg-1、F21840mg·kg-1、F3210mg·kg-1；阳性药物对照和溶媒对照组大鼠分别给予阿斯匹林100mg·kg-1和同体积蒸馏水，1.0ml·100g-1w容积灌胃给药，12小时(±2小时)1次，连续4次。
末次给药后立即以1％角叉菜0.1ml注射于大鼠右后足跖皮下致炎；自制毛细管放大测量装置测定大鼠致炎足外踝突出处平面以下部位致炎前和致炎后1-5小时的容积，计算大鼠足跖肿胀率(％)和肿胀抑制率(％)。
t检验比较组间足跖肿胀率(％)的显著性差异，方差分析组间方差不齐者，改用t’检验。实验结果见表1。
表1不同工艺提取兔耳风成分对角义菜致大鼠足跖急性炎症(肿胀)反应的影响
注与溶媒对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
实验结果，阳性对照药物阿斯匹林在所试剂量下表现了明显的抗炎活性，药后1-5小时与对照组比较差异有高度显著性(P＜0.01)，作用高峰时间在药后2-3小时。
两批次试验，所试临床等效剂量的不同工艺提取兔耳风成分给药后均表现了不同程度的抗炎活性，其中F3在药后1-3小时与对照组比较差异有显著性和高度显著(P＜0.01或0.05)，F2和F1分别在药后2-3小时和药后3小时时与对照组比较差异有显著性或高度显著性(P＜0.01或0.05)。试验结果，兔耳风F3成分试验所用剂量较低，抗炎作用较强且稳定。
实验例5兔耳风提取物F3对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀反应的影响WisFar大鼠40只，随机分组，实验组大鼠分别给予F352.5-210mg·kg-1，阳性药物对照和溶媒对照组大鼠分别给予阿斯匹林100mg·kg-1和同体积蒸馏水，1.0ml·100g-1w容积灌胃给药，12小时(±2小时)1次，连续4次。
同上方法制备模型、量取足容积、计算大鼠足跖肿胀率(％)和肿胀抑制率(％)，t检验比较组间足跖肿胀率(％)的显著性差异。实验结果见表2。
表2兔耳风提取物F3对角叉菜致大鼠足跖急性炎症(肿胀)反应的影响
注与溶媒对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
实验结果，52.5～210mg·kg-1兔耳风提取物F3灌胃给药对角叉菜致大鼠足跖急性炎症反应有不同程度的抑制作用。其中，大剂量组1-3小时、中剂量组1小时、小剂量组1、5小时与溶媒对照组差异有高度显著性或显著性(P＜0.01或0.05)，并表现一定剂量相关性。
实验例6兔耳风提取物F3对二甲苯致小鼠耳廓肿胀反应的影响
26～30g雄性昆明种小鼠50只，随机分组，实验组小鼠分别给予兔耳风提取物F375-300mg·kg-1，阳性药对照和溶媒对照组小鼠分别给予阿斯匹林100mg·kg-1和同体积蒸馏水，0.2ml·10g-1w容积灌胃给药，12小时(±2小时)1次，连续3次。
末次给药后60分钟，以棉球蘸取二甲苯50μl接触试验小鼠右耳双面5秒，15分钟脱颈椎处死小鼠，用直径6mm打孔器将双耳同部位等面积切下，称取左右耳片重量，计算耳廓肿胀率(％)和肿胀抑制率(％)。耳廓肿胀率(％)＝(右耳片重量-左耳片重量)/左耳片重量×100％肿胀抑制率(％)＝(对照组肿胀率-实验组肿胀率)/对照组肿胀率×100％t检验比较耳廓肿胀率(％)组间差异的显著性。实验结果见表3。
表3兔耳风提取物F3对二甲苯致小鼠耳廓急性炎症的抑制作用(x±s)
注与溶媒对照比较**P＜0.01。
实验结果，75～300mg·kg-1兔耳风提取物F3灌胃给药对二甲苯所致小鼠耳廓急性炎症反应有不同程度的抑制作用。其中，300mg·kg-1兔耳风提取物F3组与溶媒对照组差异有高度显著性(P＜0.01)，试验表现了剂量相关性。
实验例7兔耳风提取物抗菌作用的试验观察受试药物兔耳风提取物F3，总有机酸含量53％，室温干燥保存。实验时以蒸馏水溶解，NaHCO3调PH7.4，高压灭菌。设10个对倍稀释浓度。
主要试剂营养肉汤BR生化制剂，北京双旋微生物培养基制品厂生产，批号970910。营养琼脂BR生化制剂，北京双旋微生物培养基制品厂生产，批号981006。
主要仪器电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂生产，型号HH-400。倒置显微镜重庆光学仪器厂生产。
表4细菌菌株
以上菌株保存于-20℃条件下。
试验菌液的配制以上细菌分别以营养肉汤培养基37℃18小时增菌培养，相同培养基10-3稀释为试验菌液。
最小抑菌浓度(MIC)的测定灭菌兔耳风提取物(总有机酸)26.5mg/ml(原料50mg/ml)浓度起始，营养肉汤培养基倍比稀释药液至10个浓度，每孔1ml加入24孔细胞培养板，每稀释度药液设2个复孔，分别加入以上试验菌液50μl，并设各菌液不加药物的对照孔，37℃培养18小时，肉眼和倒置显微镜下观察有无细菌生长。以无细菌生长的的药物最高稀释度为最小抑菌浓度(MIC)。
最小杀菌浓度(MBC)的测定以上观察无细菌生长培养物50μl接种于普通琼脂平板培养基，37℃培养18小时，计数菌落。以菌落数少于5个(2复孔平均值)的药物最高稀释度为药物对该细菌的最低杀菌浓度(MBC)。实验结果见表5。
表5 兔耳风提取物F3的体外抗菌作用稀释度·浓度(mg/ml)
注1.“+”为液体培养基有细菌生长，琼脂平板培养基生长为菌苔；2.表中所示药物浓度为总有机酸浓度。
实验结果，本实验3种8株细菌对照孔均有细菌生长，琼脂平板培养基生长为菌苔。兔耳风提取物对所试8株细菌君表现了不同程度的抗菌作用。在本实验所试菌株条件下，兔耳风提取物的抑菌作用强度排序为金黄色葡萄球菌＞葡萄球菌＞大肠埃希氏菌。
以上实验结果表明，兔儿风提取物对与临床盆腔感染有关的金黄色葡萄球菌、葡萄球菌、大肠埃希氏菌等具有较强的抑菌活性。
实施例1兔耳风提取物的制备取兔耳风药材1000kg，切段或粉碎，加80℃的蒸馏水8倍量煮提2次，每次1.5小时，过滤，合并滤液，滤液浓缩，用盐酸调pH为1，离心，其上清液上D101大孔吸附树脂柱吸附，80％乙醇洗脱，回收乙醇，合并酸沉物，干燥，得兔耳风提取物25kg。
实施例2兔耳风提取物的制备取兔耳风药材1000kg，切段或粉碎，加100℃的蒸馏水10倍量煮提3次，每次2小时，过滤，合并滤液，滤液浓缩，用盐酸调pH为1，离心，其上清液上D101大孔吸附树脂柱吸附，90％乙醇洗脱，回收乙醇，合并酸沉物，干燥，得兔耳风提取物30kg。
实施例3兔耳风提取物的制备取兔耳风药材1000kg，切段或粉碎，加90℃的蒸馏水12倍量煮提4次，每次2.5小时，过滤，合并滤液，滤液浓缩用盐酸调pH为1，离心，其上清液上D101大孔吸附树脂柱吸附，95％乙醇洗脱，回收乙醇，合并酸沉物，干燥，得兔耳风提取物23kg。
实施例4颗粒剂的制备取兔耳风提取物100g，加常规辅料制成颗粒剂，每袋重10g，急慢性宫颈炎病的患者服用，每次1袋，每日3次。
实施例5胶囊的制备取兔耳风提取物300g，加常规辅料制成胶囊，每粒重0.4g，急慢性宫颈炎病的患者服用，每次2粒，每日3次。
实施例6片剂的制备取兔耳风提取物300g，加常规辅料制成片剂，每片重0.3g，急慢性宫颈炎病的患者服用，每次2片，每日3次。
实施例7口服溶液的制备取兔耳风提取物100g，加常规辅料制成口服溶液，每瓶10毫升，急慢性宫颈炎病的患者服用，每次一瓶，每日3次。
实施例8缓释片的制备取兔耳风提取物300g，加常规辅料制成缓释片，每片1g，急慢性宫颈炎病的患者服用，每次1片，每日1次。
实施例9滴丸的制备取兔耳风提取物100g，加常规辅料制成滴丸，每粒0.025g，急慢性宫颈炎病的患者服用，每次100粒，每日3次。
实施例10兔耳风提取物的应用取实施例1-3中的兔耳风提取物，急慢性宫颈炎病的患者服用，每次0.3g，每日3次。
权利要求
1.一种兔耳风提取物，其特征在于该提取物由如下方法制成取兔耳风药材，切段或粉碎，按重量份加80℃-100℃的蒸馏水8-12倍量煮提2-4次，每次1.5-2.5小时，过滤，合并滤液，滤液浓缩，用盐酸调pH为1，离心，其上清液上大孔吸附树脂柱吸附，80-95％乙醇洗脱，回收乙醇，合并酸沉物，干燥，得兔耳风提取物。
2.如权利要求1所述的兔耳风提取物，其特征在于该提取物中总有机酸含量50％以上。
3.如权利要求1或2所述的兔耳风提取物，其特征在于该提取物制成临床上或药学上接受的片剂、胶囊剂、软胶囊剂、分散片、丸剂、颗粒剂、注射液、滴丸剂、口服液体制剂，皮下给药制剂或栓剂等剂型。
4.如权利要求3所述的兔耳风提取物的制备方法，其特征在于该方法为取兔耳风药材，切段或粉碎，按重量份加80℃-100℃的蒸馏水8-12倍量煮提2-4次，每次1.5-2.5小时，过滤，合并滤液，滤液浓缩，用盐酸调pH为1，离心，其上清液上大孔吸附树脂柱吸附，80-95％乙醇洗脱，回收乙醇，合并酸沉物，干燥，得兔耳风提取物。
5.如权利要求4所述的兔耳风提取物的制备方法，其特征在于该方法为取兔耳风药材，切段或粉碎，按重量份加80℃-100℃的蒸馏水8倍量煮提2次，每次1.5小时，过滤，合并滤液，滤液浓缩，用盐酸调pH为1，离心，其上清液上D101大孔吸附树脂柱吸附，80％乙醇洗脱，回收乙醇，合并酸沉物，干燥，得兔耳风提取物。
6.如权利要求4所述的兔耳风提取物的制备方法，其特征在于该方法为取兔耳风药材，切段或粉碎，按重量份加80℃的蒸馏水10倍量煮提3次，每次2小时，过滤，合并滤液，滤液浓缩，用盐酸调pH为1，离心，其上清液上D101大孔吸附树脂柱吸附，90％乙醇洗脱，回收乙醇，合并酸沉物，干燥，得兔耳风提取物。
7.如权利要求4所述的兔耳风提取物的制备方法，其特征在于该方法为取兔耳风药材，切段或粉碎，按重量份加100℃的蒸馏水12倍量煮提4次，每次2.5小时，过滤，合并滤液，滤液浓缩用盐酸调pH为1，离心，其上清液上D101大孔吸附树脂柱吸附，95％乙醇洗脱，回收乙醇，合并酸沉物，干燥，得兔耳风提取物。
8.如权利要求4所述的兔耳风提取物的制备方法，其特征在于该方法为取兔耳风药材，切段或粉碎，按重量份加90℃的蒸馏水12倍量煮提4次，每次2.5小时，过滤，合并滤液，滤液浓缩用盐酸调pH为1，离心，其上清液上D101大孔吸附树脂柱吸附，95％乙醇洗脱，回收乙醇，合并酸沉物，干燥，得兔耳风提取物。
9.如权利要求1或2所述的兔耳风提取物在制备治疗急慢性宫颈炎的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于其中的治疗急慢性宫颈炎是指抑制急性非特异性炎症、抑制金黄色葡萄球菌、葡萄球菌或大肠埃希氏菌。
全文摘要
本发明公开一种兔耳风提取物，该提取物主要是由如下步骤制成的取兔耳风药材，粉碎，加蒸馏水煮提，过滤，滤液浓缩，用盐酸调pH值，离心，其上清液上大孔吸附树脂柱吸附，乙醇洗脱，合并酸沉物，干燥，得兔耳风提取物。同时本发明公开了该提取物及其制剂在制备治疗急慢性宫颈炎的药物中的应用。
文档编号A61K9/16GK1899337SQ200510087008
公开日2007年1月24日 申请日期2005年7月22日 优先权日2005年7月22日
发明者陈正道 申请人:陈正道