光学控制的微流体芯片的制作方法

专利名称：光学控制的微流体芯片的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及微制造的医疗装置。本发明更具体涉及微流体视网膜植入体。
背景与年龄相关的黄斑变性(AMD)是65岁以上的人失明的最普遍的形式。目前对大多数患有AMD的患者尚无有效的治疗方法，AMD这种疾病经常会对光感受器造成永久性的损伤，但是对大部分视网膜神经节细胞(RGC)以及双极细胞和水平细胞之类的次级神经元不会造成破坏。类似地，色素性视网膜炎(RP)之类的其它疾病会导致由于光感受器损失而造成视力减弱以及失明。
人类视觉系统具有通过单独的光感受器转换光的固有能力，使其成为高分辨率影像捕捉系统。全世界的一些研究小组已进行了临床试验以确定，在使用微电极阵列对视皮层的视神经束或细胞进行电刺激时，在受到AMD损伤的个体中是否能够产生光幻视(即光感觉)。这些试验发现，通过用微电极对神经元进行电刺激，失明的个体确实可以识别出水平直线或垂直直线之类的简单图案。尽管这些试验已经证明可以有限恢复视觉，但是仍然存在很大的难题。由于大多数可用的电极的尺寸以及设置上的困难，使用在很长距离上(几个细胞体直径)延伸的不精确的电场刺激使神经元去极化。另外，这些方法经常需要进行过多的刺激，这可能是有害的，会导致被刺激区域发炎和神经胶质增生。
使用电刺激的局限性使得人们需要其它不使用电刺激的方法和更精密模仿的生理刺激。自然刺激法使用极低浓度的生物活性分子，这些分子与神经元受体相结合，产生转换的信号，这是一种被称为突触传递的方法。通常光感受器在黑暗中缓慢地分泌这些生物活性分子。当光感受器感受到光的时候，它们会减少这些分子的分泌。下游的神经元通过改变其极性和产生电信号对这种变化作出应答，所产生的电信号被递送到其它的神经元。特定的神经元对视觉信号作出应答，活化产生精确的信号模式，这些信号模式被传送到大脑进行判读。
因此，本领域需要能够以更为精确和生理相关的方式控制对神经元的刺激的替代方法和装置，它们在黑暗中固定地发生活化，而对光应答时造成活化程度降低。由于能够对与外界刺激相关的一种或一些神经元进行控制，可以更精确地模拟神经元细胞受到刺激和向大脑递送信号，以获得视觉影像或其它信息的自然方式。
发明概述本发明提供了一种能够以更精确和生理相关的受控方式刺激神经元的受光学控制的微流体芯片。该芯片由至少一个单元或像素组成，所述单元或像素在黑暗中固定地释放流体，在感光时对光作出应答而减少流体的释放。所述单独的像素可以被单独地控制，从而将入射光的立体图案转换成神经元刺激的立体图案。每个像素包括外壳、外壳中的孔以及与所述孔相连的包含流体的储存装置。所述孔具有与所述储存装置相连的底部，以及出口，流体通过该出口释放到芯片以外。该孔设计成当像素处于黑暗中的时候，流体可以从储存器连续释放。每个像素还包括光学控制装置，当对光作出应答的时候，该控制装置可减少从所述储存装置释放的流体。
在一优选实施方式中，所述光学控制装置是一个或多个光电二极管。在辐照的时候，所述光电二极管在位于孔底部(即孔与储存装置相连的端部)的电极以及位于芯片顶部的电极之间产生电场，所述位于芯片顶部的电极是所有像素共用的。在特别优选的实施方式中，所述共用电极是透明的。产生于这些电极之间的电场产生了通过所述孔、朝向储存装置的电渗流，该电渗流对通过扩散产生的流体流动产生抵制作用。这使得在对光作出应答的时候，由所述孔流出的流体的扩散减少。因此本发明的作用方式更接近视网膜光感受器，在黑暗中固定地释放流体，在对光作出应答的时候减少流体的释放。另外，各像素可被独立地活化，与正常视觉相类似地对入射光的立体图案作出应答，形成刺激的立体图案。
附图简述通过结合附图阅读以下详述，可以理解本发明及其目的和优点，在附图中

图1显示了根据本发明的光学控制的微流体芯片。
图2显示了根据本发明，与所述孔出口的距离同生物试剂浓度间的关系。
图3显示了根据本发明的非对称性孔的例子。
发明详述本发明提供了一种用来控制流体释放的光学控制的微流体芯片。以下部分将详细描述该芯片的组成、尺寸和制造。
像素所述光学控制的微流体芯片是由一个或多个单元或像素制成的。每个像素包括外壳、该外壳中的孔、包含流体且与所述孔相连的储存装置。每个像素还包括在对光作出应答时，限制通过该孔释放的流体的光学控制装置。每个像素可独立地被光控制，使得入射光的立体图案被转化为立体控制的流体释放的减少。
图1显示了光学控制的微流体芯片100的一个例子。光学控制的微流体芯片100具有两个像素110和120。每个像素包括一个外壳(分别为111和121)，一个储存装置(分别为112和122)，以及一个孔(分别为113和123)。储存装置112和122包含能够通过孔113和123释放的流体，例如神经学活性化合物130。两个储存装置可通过通道140相连。流体的释放速率可通过光电二极管114和124控制。例如在对像素110施加光照115的时候，光电二极管114产生通过孔113、位于共用透明电极150和内部电极117之间的电场116。电场116产生通过孔113进入储存装置112的电渗流118。该电渗流抑制化合物逸散通过孔的正常流动，从而减少了通过孔113逸散的化合物130。与之相反，在此实施例中，像素120不接收光，表现为正常逸散。换言之，光电二极管124未被激活，因此在共用电极150和电极125之间未产生电场；因此未产生通过孔123的电渗流。因此，光活化的像素110释放的神经活性化合物130的量少于黑暗中的像素120。
外壳所述外壳通常是薄膜的形式，通常由两层组成。第一层也被称为隔膜，包括所述孔。第二层包括所述储存装置。所述外壳可以是刚性或柔性的。刚性芯片可以由硅、氮化硅或下列聚合物制成，其中刚性或柔性取决于平均分子量、交联度、以及各股材料之间的物理相互作用，例如氢键、缠绕等。所述外壳由具有生物相容性和非生物降解性的材料制成，优选是柔性的。对于刚性材料，可使用硅或氮化硅。对于可为柔性或刚性的材料，根据分子量和交联度，可使用有机聚合物，例如聚硅氧烷(例如聚(二甲基硅氧烷{PDMS}))、聚酰胺(例如尼龙)、聚酯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、乙烯基聚合物(例如聚乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯和聚氯乙烯)、聚碳酸酯、聚氨酯、乙酸纤维素、聚甲基丙烯酸甲酯、乙烯-乙酸乙烯酯、聚砜、硝基纤维素、以及它们的混合物、衍生物和共聚物。所述外壳可以是透明的、半透明的或不透明的。
为引起电渗流(EOF)，需要壁带电荷。可通过各种方法使壁带电荷，例如使带电的单体与主预聚物共聚，对预聚物进行改性以引入无规或有规间隔的带电基团，使用高能辐射氧化表面进行改性等。另外，可以在表面上涂敷蛋白质之类的带电材料。这些方法是本领域中非常成熟的方法，在本文中无需示例说明。或者可以在介质中使用离子之类的添加剂，以提供具有电荷的表面。
各种基团可提供负电荷或正电荷。羧基、磷酸根、酚基、硼酸根、硅酸等可提供负电荷。胺、脒、肼等可提供正电荷。氧化表面可形成能提供负电荷的羧基或羟基。通常所需的聚合物是具有玻璃化转变温度Tg的聚合物。玻璃化转变温度越低，柔性越高。聚(二甲基硅氧烷)的玻璃化转变温度通常约为146°K。可通过改变聚合物的结构，对其进行官能改性，以增大或减小其“柔软度”。例如，将两个聚硅氧烷链合并成梯状结构，在结构中插入刚性基团，或者添加大体积侧基，都将增大刚度。还可对外壳进行进一步改良，使其在流体界面处具有ζ电势。在另一个例子中，可通过等离子辐射对聚(二甲基硅氧烷)进行官能改性，该处理氧化了其中所含的甲基，释放出碳原子，在其位置留下羟基。这种改性在聚合物材料上有效地形成了结合有羟基官能团的玻璃状表面。
储存装置所述储存装置包含流体，而且与孔相连。可以用与外部储存装置相连的导管或进料管补充所述储存装置中的物料。根据制造方法、成形的容易程度、所需的单元体积和尺寸，该储存装置可以是任何形状的，例如管状、球状、半球状、立方体状、它们的组合等。所述储存装置的容积至少约为1pL，更优选至少约为5pL，而且不大于约500pL，通常不大于约100pL。所述芯片可具有包含不同流体的单个或多个储存装置。当芯片中包含多个储存装置的时候，这些物料可首先进入中部混合储存装置，然后通过所述孔排出。
储存装置中的流体可包含生物活性试剂或生物试剂，例如神经调节剂，其包括神经递质、激素、离子、信使分子、核酸、核酸载体、药物等。储存装置可含有生物活性试剂的任意组合和缓冲剂。储存装置中所含的生物活性试剂可包括神经调节剂的任意组合，例如神经递质、激素、离子、信使分子或脂质体。神经调节剂包括例如氨基酸，如谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸；N-甲基-D-天冬氨酸盐(NMDA)，α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑丙酸(AMPA)，使君子氨酸盐、红藻氨酸盐及其类似物；谷氨酸能(gluaminergic)和甘氨酸能试剂(glycinergicagents)；胆碱能试剂，例如乙酰胆碱、环庚二胆碱、它们的类似物等；儿茶酚胺或肾上腺素能药，例如多巴胺、L-多巴胺、降肾上腺素、肾上腺素等，组胺血清素和含血清素试剂；γ-氨基丁酸和GABA能试剂；牛磺酸，去甲新福林，核苷酸，例如三磷酸腺苷，二磷酸腺苷，鸟苷三磷酸，或鸟苷二磷酸，环式核苷酸，信使试剂，例如肽激素，例如脑啡肽，强啡肽，内啡肽，促肾上腺皮质激素ACTH，舒血管肠肽(VIP)等；类固醇激素和活性离子，例如Ca+2，Zn+2，K+等。
很重要的是，神经调节剂包括所有的能够影响神经元上的受体的试剂。这些试剂包括能够改良所述受体的试剂，所述受体包括但不限于谷氨酸盐受体、NMDA-受体、AMPA-受体、甘氨酸受体、多巴胺受体、乙酰胆碱受体和乙酰胆碱受体。所述生物活性试剂可与缓冲剂混合，所述缓冲剂是例如磷酸盐缓冲盐水、HEPES-缓冲盐水、MOPS-缓冲盐水、Dulbecco′s Modified Eagle′s介质，或碳酸氢盐缓冲盐水。可被影响的神经元细胞包括单极细胞、双极细胞、神经节、锥体细胞、神经胶质细胞、星形细胞、运动源、Purkinje细胞、Cajal水平细胞等。
生物试剂包括通道形成分子，例如α-溶血素、短杆菌肽、丙甲菌素等，糖，染料，细胞能量源等。所述生物试剂可以以胶束、脂质体、包含离子通道和/或受体的生物膜制剂等形式存在，所述包含生物试剂的膜可以与细胞膜融合。
孔所述光学控制的微流体芯片具有孔，所述孔使得在黑暗中，流体能够稳定地从所述储存装置中逸散出来。所述孔可具有与芯片表面齐平的开口或凹陷的开口，以便与凹下结构的底部齐平。可在所述孔的附近设置电极，以调节流体的流动。在一实施方式中，可将记录电极置于孔内或孔的附近，使得可以同时对神经元进行电学记录和化学刺激。
图2显示了根据本发明，与像素220的孔113的出口210的距离和生物试剂230浓度C之间的关系。在稳态下，距离半径为r0的孔113的出口210距离r处的生物试剂的浓度C为C＝C1·r0/r，式中C1是出口210处生物试剂的浓度。假定细胞刺激所需的生物试剂浓度为C1＝1mM，距离该孔10微米处的浓度应低于有毒水平C0＝10μM，我们得到所述孔的半径应为r0＝0.1微米。所述储存装置112内的生物试剂的浓度C2＝C1(1+L/r0)，式中L是孔的深度，或包括该孔的膜的厚度。当L＝1微米时，C2＝11mM。与扩散系数D相关的时间常数τ取决于与出口210的距离r，其关系为τ＝r2/D。例如对于谷氨酸盐之类的小蛋白质，D＝10-6厘米2/秒，因此与孔相距1微米以内的浓度会在τ＝10毫秒内变化。这意味着如果细胞位于距离孔1微米以内的位置，其可以以大约100赫兹的频率改变发射率。但是如果细胞与孔相距超过10微米，扩散时间将为1秒，相当于频率为1赫兹，这比正常的视觉慢得多。由于刺激速率关键取决于细胞与孔之间的距离，因此必需采用特殊的技术以确保细胞和孔紧密相邻。例如，可以在与包括活神经元的神经元位点邻近的芯片外表面上提供微型图案。这些微型图案可以引导细胞向着芯片的孔生长。
在我们的实施方式中，出口210处的分子扩散漂移速率v＝D-grad(C)/C＝D/r0＝1毫米/秒。在此速率下，当施加在深1微米的孔上的电势U＝0.7伏的时候，可获得电渗流。在生理性介质中，该孔的电阻约为5MOhm，相当于每个孔的电功率p＝U2/R＝0.1微瓦。当像素尺寸为20微米时，3毫米的芯片上的像素总数为18,000，总功率为1.8毫瓦。这种功率耗散相当于芯片表面上的温度升高0.26℃，这远低于可接收的1℃的极限。为防止发生可逆的电化学反应，电流应为两相的，而且电荷平衡。施加相反极性的电脉冲会以相反的方向产生电渗流，平均来讲，这种电渗流将完全抵消流动的效果。为避免这种情况，本发明的孔可以是非对称性的。图3A和图3B显示了根据本发明的两种非对称孔。在图3A中，具有外壳302的像素300包括孔304，该孔304出口处306的宽度大于该孔304与储存装置308相连处的宽度。在图3B中，具有外壳312的像素310包括孔314，该孔开始在出口316时较宽，接着变窄，然后在进入储存装置318的位置再次变宽。具体来说，图3B在朝向储存装置的方向上的流体动力学阻力较低，使得在施加两相脉冲的时候，沿朝向储存装置方向上的流动比相反方向上的流动更快。
光学控制装置光学控制装置对光作出应答，减小了通过所述孔中的出口从储存装置逸散出的流体。在一优选实施方式中，所述光学控制装置是一种或多种光电二极管。在辐照的时候，该光电二极管传导电流，从而在电极之间形成电场，产生从孔的出口流向孔的底部的电渗流。电极和连接导线由任何导电材料形成，例如金属或金属氧化物，如铂、钯、铱、氧化铱、氮化钛、银、氯化银、铬、锡、铟、氧化铟锡、氧化锌、金或铝。所述芯片可包括单个电极对，或包括多个电极或电极对。
可以将光电二极管镀敷在任何便利的位置，以提供用于电渗流的电源，具体来说是将光电二极管镀敷在透明性材料处，使得(例如来自眼睛的)光照射光电二极管并产生电流。所述光电二极管可形成于所述孔的相对侧的端口，或者位于其它的位置。
尺寸单个像素的表面积通常约为2-50微米2，更优选约为5-25微米2，在特殊的环境下可使用更大或更小的表面积。对于视网膜应用，表面积通常不超过15微米2，更优选不超过10微米2，表面积通常至少约为2微米2。具有多个像素的芯片的表面积通常约为10-500微米2，更优选不大于约200微米2。孔间隔通常至少约2微米，更优选至少约5微米，通常不大于约50微米，更优选不大于约25微米。面积越大，越需要对芯片形状进行处理，使其适应特殊的表面，以提供所需的相互作用，以及将从芯片逸散的试剂限制在局部区域。所述芯片通常可以是圆形、椭圆形、矩形、管状或其它形式，边缘可以是圆化的。孔的直径通常为0.01-10微米，更优选0.05-2微米。
形成芯片的层的厚度通常至少约为1微米，且不大于约2毫米，通常不小于10微米且不大于约0.2毫米，当使用粘合层的时候，其厚度在此范围的下端。这种层厚提供了机械稳定性，而且植入芯片(特别是植入视网膜外层或视网膜下区域)的时候便于操作，或者是当芯片中的物料用尽、或不再需要芯片的时候，芯片便于取出。对植入物应进行形状处理，以适合将要植入的区域。例如，对于视网膜，芯片必需足够小，从而能够舒适地安置在视网膜区域、视网膜外层或视网膜下。尽管可以制造更大和更小的芯片，但是通常芯片的厚度约为20-500微米，更优选约为50-300微米。
制造可采用微型制造方法很容易地制造所述芯片。可以很容易地将标准硅处理技术加以改造，以适用于制造本文所述的芯片。可采用低压化学气相沉积在取向的硅晶片上生长氮化硅。结合光刻在光敏聚合物中形成结构，然后通过等离子蚀刻在氮化硅中刻划出结构图案，在晶片的一个面上形成孔，在另一个面上形成蚀刻剂掩蔽层。使用氢氧化四甲基铵(TMAH)之类的各向异性蚀刻剂除去晶面上的硅，剩下未受影响的氮化硅。这形成了位于所述孔之下、暴露着所述氮化硅膜的通孔开口(连接通道)，从而完成了该过程。
所述导管或通孔向作为生物试剂储存装置的微流体通道开放。所述微流体通道通过标准PDMS压印法制得，密封在晶片上。可以用稳定的密封材料将这种微流体通道很容易地密封在晶片上。在酸(例如HCl)清洗和等离子处理之后，所述具有通道的PDMS压印制品被结合在氮化硅表面，形成不可逆的结合。所得的通道可作为通用缓冲剂储存装置，用来处理废产物和递送生物试剂。所形成的孔的尺寸可小于神经元的长度，以确保仅刺激单个细胞。
在以下文献中描述了用于微型制造或纳米制造的方法美国专利第5,776,748号，第5,900,160号；第6,060,121号；和第6,180,239号；Marzolin等人的“Patterning of a Polysiloxane Precursor to Silicate Glasses by MicrocontactPrinting”，Thin Solid Films 1998，315，9-12；Qin等人的“Microfabrication，Microstructures and Microsystems”，InMicrosystem Technology in Chemistry andLife Sciences，第194卷，Manz，A和Becker，H主编，Springer-Velag，Berlin，1998，1-20；以及Xia等人的“Unconventional Methods for Fabricating and PatterningNanostructures”，Chem Rev 991823-48(1999)。上文和下文中的所有专利都全文参考结合入本文中。电极和其它元件可使用本领域已知的技术形成，例如溅射和受控气相沉积法，然后进行化学蚀刻等。
植入所述芯片的方法可将本文所述的芯片植入眼中视网膜附近、视网膜下或视网膜外层。对该区域实施麻醉之后，可采用标准3-口睫状环玻璃体切除术(3-port pars planavitrectomy)，通过巩膜切除术插入视网膜外植入体。对于视网膜下植入体，在斑区形成位于视网膜下的气泡，进行视网膜切开术，将植入体插入视网膜下的空间。在其它的区域可以采用类似的步骤，插入与神经元结构相连的植入体。
本文所述的所有参考文献都全文参考结合入本文。与该文献有关的相关部分对本领域技术人员是显而易见的。通过阅读本文所述的内容可以分辨本申请与这些参考文献之间的不同。
权利要求
1.一种光学控制的微流体芯片，该芯片具有外壳，所述外壳具有包含流体的贮存装置，所述储存装置与孔相连，所述流体能够通过所述孔从所述储存装置中逸散出来，所述芯片包括光学控制装置，该装置用来减少所述流体的逸散，从所述储存装置逸散出的所述流体的量与所述光学控制装置接收到的光的量成反比。
2.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述光学控制装置包括一个或多个光电二极管。
3.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述光学控制装置产生两相和电荷平衡的电流。
4.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述孔是不对称的。
5.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述孔的直径约为0.01-10微米。
6.如权利要求1所述的芯片，其特征在于，所述孔的直径约为0.05-2微米。
全文摘要
提供了一种光学控制的微流体芯片，用以控制向神经元位点的流体输送。所述芯片由至少一个单元或像素制成，每个单元或像素在黑暗中固定地逸散流体，在对光作出应答的时候，流体的逸散会减少。单独的像素能够被单独地控制，从而将入射光的立体图案转换为神经元刺激的立体图案。每个像素包括外壳，该外壳中的孔，以及与所述孔相连的包含流体的储存装置。所述孔设计成使得当所述像素处于黑暗中的时候，流体能够通过所述孔、从所述储存装置连续地逸散出来。每个像素还包括光学控制装置，在对光作出应答的时候，该光学控制装置将减少流体通过所述孔从所述储存装置的逸散。
文档编号A61K9/22GK1976684SQ200580019932
公开日2007年6月6日 申请日期2005年6月20日 优先权日2004年6月23日
发明者D·V·帕兰克, H·A·菲什曼 申请人:利兰·斯坦福青年大学托管委员会