专利名称：：用于诊断汉他病毒感染的方法和试剂的制作方法
技术领域：
：本发明总地涉及汉他病毒。具体说，本发明涉及衍生自多种汉他病毒血清型的免疫原性试剂，包括免疫原性核衣壳和糖蛋白多肽，用于诊断汉他病毒感染的组合物中。背景汉他病毒(Hantavirus)(布尼亚病毒科(Bunyaviridae):汉他病毒)是脂质包膜的负链RNA病毒。该病毒基因组的RNA分成三部分，由通常分别称为S、M和L的小、中和大的3个基因组片段组成。M节段编码可加工形成称为Gl和G2的两种包膜糖蛋白的前体蛋白。S节段编码称为N的核衣壳蛋白，它能形成病毒的丝状螺旋核衣壳和引发体液应答。基因组的L节段编码RNA-依赖性RNA聚合酶(RDRP)。在世界范围内发现超过20种不同的汉他病毒与特定啮齿类或食虫宿主有关。已经综述了它们传播给人的方式、天然储存库和人感染的临床特征(参见例如，Mertz等，Adv.InternalMed.(1997)42:369-421)。汉他病毒肺综合征(HPS)，也称为汉他病毒心肺综合征(HCPS)是急性发热性疾病，死亡率高达50%。患者出现非特定症状，并快速进展成暴发性肺水肿和心血管虚脱。在北美引起HPS的主要物质是无名(SinNombre)病毒(SNV;也称为四角(FourCorners)病毒和莫尔托-卡尼翁(MuertoCanyon)病毒)。(Song等，Lancet(1994)344:1637;Khan等，J.Med.Virol(1995)46:281-286;Kahn等，Am.J.Med.(1996)100:46-48;Morzunov等，J.Virol(1995)69:1980-1983;Rollin等，J.Med.Virol(1995)46:35-39;疾病控制预防中心，Morbid.Mortal.WeeklyRep.(1993)43:45-48)。在北美至少三种其它汉他病毒与HPS有关，包括纽约病毒(NYV)、污黑小河沟病毒(BlackCreekCanalvirus,BCCV)和牛轭湖病毒(Bayouvirus,BAYV)。世界范围内，更大量的疾病是由引起出血热与肾综合症(HFRS)的欧亚(Eurasian)汉他病毒引起的。HFRS-相关性病毒包括汉坦病毒(Hantaan)(HTNV)、普马拉病毒(Puumala)(PUUV)、首尔病毒(Seoul)(SEOV)和多不拉伐-贝尔格莱德(Dobrava-Belgrade)(DOBV)病毒(Lee等，J.Infect.Dis.(1978)137:298-308;Lee等，J.Infect.Dis.(1982)146:638-644;Lee等，J.Infect.Dis.(1982)146:645-651;Brummer-Korvenkontio等，J.Infect.Dis.(1980)141:131-134)。HTNV和DOBV感染引起的HFRS的临床表现通常最为严重，而与PUUV感染有关的HFRS形式较温和，此HFRS形式是出现在斯堪的纳维亚、芬兰、俄罗斯西部和中欧的流行性肾病(NE)。据报道，HFRS的最严重形式的死亡率高达20。/。。在HFRS相关性汉他病毒中，HTNV、SEOV和DOBV的抗原性相似。HPS相关性病毒也互相紧密相关，并且能与PUUV交叉反应。在病毒N蛋白中抗原交叉反应性最突出。在重组抗原诊断试验中，病毒N抗原相对于病毒糖蛋白是显性的。N抗原的抗体在感染早期出现，在逐渐康复的过程中普遍可检测到。在临床症状发作前，患有急性SNV感染的所有人中都可检测到IgM类型的SNVN抗原的抗体，几乎所有人都有抗N和Gl抗原的IgG抗体(Bharadwaj等，J.Infect.Dis.(2000)182:43-48)。SNVGl抗体不与其它汉他病毒的Gl抗原反应(Jenison等，J.Virol.(1994)68:3000-3006;Hjelle等，J.Gen.Virol.(1994)75:2881-2888)。通过吸入病毒污染的啮齿类唾液、尿和粪便的气溶胶使汉他病毒传播给人。工人仅通过进入有感染啮齿类的房间就可接触汉他病毒感染，这强烈地支持了汉他病毒通过空气传播这一流行的观点。最近流行病学研究证明室内接触及其普遍，这也支持了此观察结果。在阿根廷，也证明了安第斯(Andes)病毒(ANDV)能够进行人对人传播，它可能是智利的两个科群(familycluster)的传播方式。啮齿类咬伤后也可传播病毒，并可能通过摄入污染的食物或水传播病毒。所有种类的汉他病毒似乎主要与特定啮齿类宿主相关。有三大组汉他病毒，它们与啮齿类亚科鼠亚科(Murinae)、田鼠亚科(Arvicolinae)和绵鼠亚科(Sigmodontinae)相关。这些各亚科的啮齿类的系统发育关系大部分是平行的，病毒的系统发育和抗原性关系与各具体库相关。这些汉他病毒组各自含有一个或多个种类或类型，它们是已知的人类病原体。表1中提供了关于各种汉他病毒的信息。表1.<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>处理汉他病毒感染方面有重大进展，但成功的处理需要恰好在疾病的瀕死前阶段诊断出患者。三级护理的进展可降低由汉他病毒感染引起的死亡率。然而，由于感染进展地非常快，这些进展可能只能影响及时作出诊断的患者的预后。适合在乡村条件下快速检测汉他病毒抗体并可在疾病早期施用的方法可提高早期介入的前已尝试几项试验及时地诊断汉他病毒感染。例如，采用各种形式的血清学方法诊断汉他病毒感染，包括珠凝集、用实验室培育的病毒进行的免疫荧光和免疫沉淀试验、血凝抑制、噬斑(plaque)-和细胞灶(focus)-减少中和试验以及ELISA形式(Lee等，J.Infect.Dis.(1978)137:298-308;Lee等，J.Infect.Dis.(1982)146:638-644;Lee等，J.Infect.Dis.(1982)146:645-651;Lundkvist等，Clin.Diagnos.Lab.Immunol.(1995)2:82-86;Chu等，Virology(1994)198:196-204;Elgh等，J.Med.Virol(1995)45:146-150)。也已采用条带免疫印迹试验，以尝试有效诊断汉他病毒感染(参见例如，Hjelle等，J.Clin.Microbiol.(1997)35:600-608;Bharadwaj等，J.Infect.Dis.(2000)182:43-48;Yee等，J.Wildl.Dis.(2003)39:271-277)。然而，现在还没有鉴定多株汉他病毒的通用试验。非常需要具有普遍可用性的准确、有效和快速的试验来检测汉他病毒感染，它们可拯救很多生命。发明概述本发明提供了简单、准确和有效的方法来诊断汉他病毒感染，以及测定存在的汉他病毒类型。该方法能够快速检测(例如在一小时以内)几种汉他病毒，如来自一种以上汉他病毒血清型的汉他病毒引起的汉他病毒感染。如果检测到感染，可给予该个体足够时间的适当治疗，以防止死亡。该方法利用N和/或Gl抗原和/或抗这些抗原的抗体，这些抗原来自至少六种不同的汉他病毒血清型，包括HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV。该试验提供了快速和可靠的诊断测试，适合用于实验室能力相对不复杂的设备。而且，可用该试验筛选野生啮齿类动物的汉他病毒感染，以确定具体啮齿类群体是否感染了该病毒，从而防止实验室工作者、野外工作者以及与野生啮齿类一起工作和遇到野生啮齿类的其他人感染。可用重组技术产生本文所述产物，以提供不含通常存在的其它分子，如其它病毒污染物和有害蛋白的蛋白质制剂。因此，在一个实施方式中，本发明涉及检测生物样品中的汉他病毒抗体的方法。该方法包括(a)将生物样品与至少六种汉他病毒重组抗原相接触，其中所述至少六种汉他病毒重组抗原包括来自汉他病毒血清型汉坦病毒(HTNV)、普马拉病毒(PUUV)、首尔病毒(SEOV)、多不拉伐病毒(DOBV)、无名病毒(SNV)和安第斯病毒(ANDV)的Gl和/或N抗原的组合，其中存在各血清型的至少一种重组抗原，所述接触在允许汉他病毒抗体(存在于生物样品中时)结合于至少一种Gl或N抗原以形成抗体/抗原复合物的条件下进行；和(b)检测是否存在抗体/抗原复合物，从而检测样品中是否存在汉他病毒抗体。所述至少六种汉他病毒重组抗原可以是G1和N抗原的任何组合，只要存在来自至少六种汉他病毒血清型即汉坦病毒(HTNV)、普马拉病毒(PUUV)、首尔病毒(SEOV)、多不拉伐病毒(DOBV)、无名病毒(SNV)和安第斯病毒(ANDV)中的至少一种抗原。在优选实施方式中，这至少六种汉他病毒重组抗原都是N抗原。在其它实施方式中，本发明涉及检测汉他病毒感染的免疫诊断测试试剂盒。该测试试剂盒包括(a)至少六种汉他病毒重组抗原，其中这至少六种汉他病毒重组抗原包括来自汉他病毒血清型汉坦病毒(HTNV)、普马拉病毒(PUUV)、首尔病毒(SEOV)、多不拉伐病毒(DOBV)、无名病毒(SNV)和安第斯病毒(ANDV)的Gl和/或N抗原的组合，其中存在各血清型的至少一种抗原；(b)和进行该免疫诊断测试的说明书。在优选实施方式中，这至少六种汉他病毒重组抗原都是N抗原。在其它实施方式中，本发明涉及检测生物样品中汉他病毒抗原的方法。该方法包括(a)将生物样品与至少六种不同抗体相接触，其中所述抗体各自至少对六种汉他病毒抗原之一特异，其中所述六种汉他病毒抗原包括汉他病毒血清型汉坦病毒(HTNV)、普马拉病毒(PUUV)、首尔病毒(SEOV)、多不拉伐病毒(DOBV)、无名病毒(SNV)和安第斯病毒(ANDV)的Gl和/或N抗原的组合，其中存在对各血清型的至少一种抗原特异的至少一种抗体，其中所述接触在允许汉他病毒抗原(存在于生物样品中时)结合于所述抗体以形成抗体/抗原复合物的条件下进行；和(b)检测是否存在抗体/抗原复合物，从而检测样品中是否存在汉他病毒抗原。在上述方法的某些实施方式中，抗体是单克隆抗体。在又一实施方式中，本发明涉及检测汉他病毒感染的免疫诊断测试试剂盒。该200580019934.9说明书第6/35页测试试剂盒包括(a)至少六种不同的抗体，其中各抗体至少对六种汉他病毒抗原之一特异，这六种汉他病毒抗原包括汉他病毒血清型汉坦病毒(HTNV)、普马拉病毒(PUUV)、首尔病毒(SEOV)、多不拉伐病毒(DOBV)、无名病毒(SNV)和安第斯病毒(ANDV)的Gl和/或N抗原的组合，其中存在对各血清型的至少一种抗原特异的至少一种抗体；和(b)进行所述免疫诊断测试的说明书。在上述免疫诊断测试试剂盒的某些实施方式中，抗体是单克隆抗体。在其它实施方式中，本发明涉及包含至少六种汉他病毒重组抗原的固体支持物，其中这至少六种汉他病毒重组抗原包括汉他病毒血清型汉坦病毒(HTNV)、普马拉病毒(PUUV)、首尔病毒(SEOV)、多不拉伐病毒(DOBV)、无名病毒(SNV)和安第斯病毒(ANDV)的G1和/或N抗原的组合，其中存在各血清型的至少一种抗原。所述固体支持物可以是硝酸纤维素条带。，在某些实施方式中，固体支持物还包含至少一种抗-人免疫球蛋白抗体，所述一种或多种抗体选自抗-人IgM抗体、抗-人IgG抗体和抗-人IgA抗体，其中所述汉他病毒抗原和抗-人免疫球蛋白抗体固定在固体支持物上的分离的(discrete)位置中。在其它实施方式中，固体支持物还包含至少两种内标，其中一种内标确定了采用该固体支持物的免疫试验中阳性结果的检测下限，另一内标确定了采用该固体支持物的免疫试验中的高度阳性结果。在另一实施方式中，本发明涉及检测汉他病毒的免疫诊断测试试剂盒。该测试试剂盒包括(a)如上所述的固体支持物；和(b)进行所述免疫诊断测试的说明书。在其它实施方式中，本发明涉及检测生物样品中是否存在汉他病毒抗体的方法。该方法包括(a)提供生物样品；(b)提供如上所述的固体支持物；(c)将生物样品与固体支持物相接触，接触条件允许汉他病毒抗体(如果存在于生物样品中)与至少一种汉他病毒抗原结合以形成抗体/抗原复合物；和(d)检测是否存在抗体/抗原复合物，从而检测生物样品中是否存在汉他病毒抗体。在某些实施方式中，上述方法还包括(e)去除未结合的汉他病毒抗体；(f)提供能够与抗体/抗原复合物结合的一个或多个部分；和(g)检测是否存在一个或多个部分，从而检测生物样品中是否存在汉他病毒抗体。在某些实施方式中，所述一个或多个部分包括可检测标记的汉他病毒抗原。在这些和其它实施方式中，可检测标记可以是酶。在又一实施方式中，本发明涉及制备基本不含汉他病毒的血液供给品的方法，所述血液供给品包括全血、血小板、血浆或血清。该方法包括(a)用上述方法中的任何一种方法筛选收集的血液样品中的全血、血小板、血浆或血清等份；(b)清除检测到汉他病毒抗原或汉他病毒抗体的任何样品；和(cO混合没有检测到汉他病毒抗原和汉他病毒抗体的样品，以提供基本不含汉他病毒的血液供给品。在任何上述方法中，生物样品可来自人血样品。此外，在任何上述实施方式中，Gl抗原可包含对应于氨基酸序列SEQIDNO:40的氨基酸序列。Gl抗原可以是包含选自下组的氨基酸序列的一种或多种抗原SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46和SEQIDNO:47。此外，N抗原可包含对应于氨基酸序列SEQIDNO:39的氨基酸序列。在其它实施方式中，N抗原可以是包含选自下组的氨基酸序列的一种或多种抗原SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52和SEQIDNO:53。Gl抗原可包含对应于氨基酸序列SEQIDNO:40的氨基酸序列，且N抗原包含对应于氨基酸序列SEQIDNO:39的氨基酸序列。在其它实施方式中，Gl抗原是包含选自下组的氨基酸序列的一种或多种抗原SEQIDNO:14、SEQIDNO:16、SEQIDNO:18、SEQIDNO:20、SEQIDNO:22、SEQIDNO:24、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46和SEQIDNO:47，N抗原是包含选自下组的氨基酸序列的一种或多种抗原SEQIDNO:26、SEQIDNO:28、SEQIDNO:30、SEQIDNO:32、SEQIDNO:34和SEQIDNO:36。在其它实施方式中，至少一种Gl抗原由各汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV递呈，至少一种N抗原由各汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV递呈。在其它实施方式中，至少一种N抗原由各汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV递呈。根据本文公开内容，本领域技术人员不难实施本发明的这些和其它实施方式。附图简要说明图1A和1B(SEQIDNO:1和2)显示了HTNV分离物76-118的全长M节段的代表性核苷酸序列，它编码G1和G2包膜蛋白(图1A)，以及G1蛋白的相应氨基酸序列(图1B)。图2A和2B(SEQIDNO:3和4)显示了PUUV分离物CG1820的全长M节段的代表性核苷酸序列，它编码G1和G2包膜蛋白(图2A)，以及G1蛋白的相应氨基酸序列(图2B)。图3A和3B(SEQIDNO:5和6)显示了SEOV分离物80-39的全长M节段的代表性核苷酸序列，它编码G1和G2包膜蛋白(图3A)，以及G1蛋白的相应氨基酸序歹U(图3B)。图4A和4B(SEQIDNO:7和8)显示了DOBV的全长M节段的代表性核苷酸序列，它编码G1和G2包膜蛋白(图4A),以及G1蛋白的相应氨基酸序列(图4B)。图5A和5B(SEQIDNO:9和10)显示了SNV分离物NMH10的全长M节段的代表性核苷酸序列，它编码G1和G2包膜蛋白(图5A)，以及G1蛋白的相应氨基酸序列(图5B)。图6A和6B(SEQIDNO:11和12)显示了ANDV分离物智利-9717869的全长M节段的代表性核苷酸序列，它编码G1和G2包膜蛋白(图6A)，以及G1蛋白的相应氨基酸序列(图6B)。图7A和7B(SEQIDNO:13和14)显示了用于所述试验的代表性HTNVGl肽的核苷酸序列(图7A)和相应氨基酸序列(图7B)。图8A和8B(SEQIDNO:15和16)显示了用于所述试验的代表性PUUVGl肽的核苷酸序列(图8A)和相应氨基酸序列(图8B)。图9A和9B(SEQIDNO:17和18)显示了用于所述试验的代表性SEOVGl肽的核苷酸序列(图9A)和相应氨基酸序列(图9B)。图10A和IOB(SEQIDNO:19和20)显示了用于所述试验的代表性DOBVGl肽的核苷酸序列(图IOA)和相应氨基酸序列(图IOB)。图UA和IIB(SEQIDNO:21和22)显示了用于所述试验的代表性SNVGl肽的核苷酸序列(图IIA)和相应氨基酸序列(图IIB)。图12A和12B(SEQIDNO:23和24)显示了用于所述试验的代表性ANDVGl肽的核苷酸序列(图12A)和相应氨基酸序列(图12B)。图13A和13B(SEQIDNO:25和26)显示了用于所述试验的分离物76-118的全长HTNVN的代表性核苷酸序列(图13A)和相应氨基酸序列(图13B)。图14A和14B(SEQIDNO:27和28)显示了用于所述试验的分离物CGI820的全长PUUVN的代表性核苷酸序列(图14A)和相应氨基酸序列(图14B)。图15A和15B(SEQIDNO:29和30)显示了用于所述试验的分离物80-39的全长SEOVN的代表性核苷酸序列(图15A)和相应氨基酸序列(图15B)。图16A和16B(SEQIDNO:31和32)显示了用于所述试验的全长DOBVN的代表性核苷酸序列(图16A)和相应氨基酸序列(图16B)。图17A和17B(SEQIDNO:33和34)显示了用于所述试验的分离物NMH10的全长SNVN的代表性核苷酸序列(图17A)和相应氨基酸序列(图17B)。图18A和18B(SEQIDNO:35和36)显示了用于所述试验的分离物智利-9717869的全长ANDVN的代表性核苷酸序列(图18A)和相应氨基酸序列(图18B)。图19A和19B(SEQIDNO:37和38)分别显示了如实施例所述用于SOD与Gl和N抗原的融合物的代表性人SOD核苷酸和氨基酸序列。融合的SOD序列包括图19B的氨基酸l-158(图19A的核苷酸1-489)，它包括C-末端上非SOD序列的五个氨基酸(TRQNK，SEQIDNO:41)，以提供用于克隆的限制性位点。图20(SEQIDNO:42)显示了用于所述试验的代表性SOD/HTNVGl融合物的氨基酸序列。图21(SEQIDNO:43)显示了用于所述试验的代表性SOD/PUUVGl融合物的氨基酸序列。图22(SEQIDNO:44)显示了用于所述试验的代表性SOD/SEOVGl融合物的氨基酸序列。图23(SEQIDNO:45)显示了用于所述试验的代表性SOD/DOBVGl融合物的氨基酸序列。图24(SEQIDNO:46)显示了用于所述试验的代表性SOD/SNVGl融合物的氨基酸序列。图25(SEQIDNO:47)显示了用于所述试验的代表性SOD/ANDVGl融合物的氨基酸序列。图26(SEQIDNO:48)显示了用于所述试验的代表性SOD/HTNVN融合物的氨基酸序列。图27(SEQIDNO:49)显示了用于所述试验的代表性SOD/PUUVN融合物的氨基酸序列。图28(SEQIDNO:50)显示了用于所述试验的代表性SOD/SEOVN融合物的氨基酸序列。图29(SEQIDNO:51)显示了用于所述试验的代表性SOD/DOBVN融合物的氨基酸序列。图30(SEQIDNO:52)显示了用于所述试验的代表性SOD/SNVN融合物的氨基酸序列。图31(SEQIDNO:53)显示了用于所述试验的代表性SOD/ANDVN融合物的氨基酸序列。发明详述除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员已知的病毒学、化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的常规方法。这些技术在文献中有完整的解释。参见例如，《基础病毒学》(FundamentalVirology),第3版，第I和II巻(B.N.Fields和D.M.Knipe编)；《实验免疫学手册》(HandbookofExperimentalImmunology),第I-IV巻(D.M.Weir和CC.Blackwell编，BlackwellScientificPublications);T.E.Creighton，《蛋白质结构和分子特性》(Proteins:StructuresandMolecularProperties)(W.H,FreemanandCompany,1993);A丄.Lehninger，《生物化学》(Biochemistry)(WorthPublishers,Inc.，现有版本)；Sambrook等，《分子克隆实验室手册》(MolecularCloning:ALaboratoryManual)(第2版，1989);《酶学方法》(MethodsInEnzymology)(S,Colowick和N.Kaplan编，AcademicPress,Inc.)。将上述或下述所有发表物、专利和专利申请全文纳入本文作参考。文中使用了下列氨基酸縮写丙氨酸Ala(A)精氨酸Arg(R)天冬酰胺Asn(N)天冬氨酸Asp(D)半胱氨酸Cys(C)谷氨酸Glu(E)组氨酸His(H)亮氨酸Leu(L)脯氨酸Pro(P)苏氨酸Thr(T)酪氨酸Tyr(Y)甲硫氨酸Met(M)谷氨酰胺Gln(Q)甘氨酸Gly(G)异亮氨酸Ue(I)赖氨酸Lys(K)苯丙氨酸Phe(F)丝氨酸Ser(S)色氨酸Trp(W)缬氨酸Val(V)I.定义在本发明的描述中，使用了下列术语，定义如下。必须注意的是，如本说明书中和权利要求书中使用的，单数形式"一"、"一个"、"该"包括复数，除非该内容另有明确说明。因此，例如，提到"G1多肽"包括两种或多种所述多肽的混合物等。术语"多肽"和"蛋白质"指氨基酸残基的聚合物，并不限于产物的最小长度。因此，肽、寡肽、二聚物、多聚物等都包括在该定义中。全长的蛋白质及其片段都包括在该定义中。该术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。另外，为了本发明的目的，"多肽"指包括对天然序列的修饰(例如缺失、添加和取代(通常性质保守))的蛋白质，只要蛋白质保持了所需活性。这些修饰可以是精心设计的，如通过定点诱变，或可以是偶然的，例如通过产生蛋白质的宿主的突变，或由于PCR扩增引起的错误。提到用于本发明的各种汉他病毒多肽时，所用术语"抗原"指天然、重组或合成的N、Gl等多肽，其包括能识别汉他病毒抗体并且衍生自所研究的汉他病毒毒株的各种分离物的一个或多个表位。因此，"汉他病毒抗原"是衍生自任何汉他病毒血清型、毒株和分离物的抗原，分离物包括但不限于鼠亚科、绵鼠亚科和田鼠亚科的各种分离物。例如，SNV抗原衍生自各种无名病毒分离物，如原型新墨西哥SNV分离物、3H226、加利福尼亚分离物、不列颠哥伦比亚分离物等。类似地，SEOV抗原衍生自各种首尔病毒分离物等。用于本发明的其它抗原可衍生自其它HPS-和HFRS-相关性汉他病毒，包括但不限于无名病毒(SNV;也称为四角病毒和莫尔托-卡尼翁病毒)；安第斯病毒(ANDV);纽约病毒(NYV);污黑小河沟病毒(BCCV);牛轭湖病毒(BAYV);汉坦病毒(HTNV)、普马拉病毒(PUUV)、首尔病毒(SEOV)和多不拉伐-贝尔格莱德病毒(DOBV)。这些病毒的基因组序列已知，以下进一步详述用于本发明的几种抗原序列。所研究抗原不需要包括参比分子的全长氨基酸序列，但可仅包括能使多肽与合适的汉他病毒抗体反应的分子。因此，仅需要存在参比分子的一个或几个表位。而且，抗原可包含全长参比分子或参比分子片段与另一种蛋白如另一种汉他病毒抗原和/或不破坏汉他病毒抗原反应性的蛋白的融合蛋白。不难理解，抗原因此可包含参比分子的全长序列、片段、截短和部分序列，以及参比分子的类似物、突变蛋白和前体形式。该术语也指参比序列的缺失、加入和取代，只要抗原保持与汉他病毒抗体反应的能力。在这个方面，具体汉他病毒毒株内不同分离物之间会发生天然变异。因此，该术语旨在包括这种变异，具体说，与参比抗原相比，氨基酸组成的差异不超过约20数量％、更优选不超过约10-15数量％、最优选不超过约5数量％的抗原。因此，与参比分子的氨基酸序列基本相同，但含有不显著影响抗原的抗体结合能力的少量氨基酸取代的蛋白属于参比多肽的定义。"衍生自"汉他病毒血清型、毒株或分离物的抗原指包含由参比汉他病毒基因组编码的抗原序列的抗原。一般地，所述抗原包括一个或多个表位，通常具有与参比多肽基本同源的氨基酸序列，如下所述。因此，用术语"衍生自"判定分子来源，但不旨在限制制备该分子的方法，可以是(例如)化学合成或重组方法。术语"类似物"和"突变蛋白"指保留了所需活性(如本文所述试验中的免疫反应性)的参比分子的生物活性衍生物。通常，术语"类似物"指具有天然多肽的序列和结构、并与天然分子相比具有一个或多个氨基酸添加、取代(性质通常为保守性)和/或缺失(只要这种修饰不破坏免疫反应性)的化合物，它们与参比分子"基本同源"，如下所述。己知各种分离物之间有许多保守区和可变区，通常，比对两条序列时，衍生自这些区的表位的氨基酸序列具有高度序列同源性，如氨基酸序列同源性大于50%，通常大于60%-70%。术语"突变蛋白"指具有一种或多种肽模拟物("拟肽")的肽。此种类似物或突变蛋白优选至少具有与天然分子相同的免疫反应性。制备多肽类似物和突变蛋白的方法是本领域己知的，以下将进一步描述。术语"类似物"和"突变蛋白"也包括对参比分子进行的有意突变。尤其优选的类似物包括性质上保守的取代物，即在侧链相关的氨基酸类型内发生取代。具体说，氨基酸通常分为四类(l)酸性——天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性——赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性——丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)无电荷极性——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸归为芳族氨基酸。例如，有理由预测单独用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏氨酸，或者用结构上相关的氨基酸对氨基酸进行类似的保守性取代，将不会对其生物活性有显著影响。例如，感兴趣的抗原可包括多达约5-10个保守或非保守氨基酸取代，或甚至多达约15-25个、50个或75个保守或非保守氨基酸取代，或5-75之间任何整数的取代，只要该分子的所需功能仍保持不变。本领域的熟练技术人员参照本领域熟知的Hopp/Woods和Kyte-Doolittle曲线图，不难确定感兴趣的分子中可耐受改变的区域。"片段"指仅由完整全长多肽序列和结构的一部分组成的抗原。片段可包括天然多肽的C末端缺失和N末端缺失，和/或内部缺失。本文图7-12中显示了用于本试验的代表性G1片段。"免疫原性片段"指包含一个或多个表位，从而引发本文所述的一种或多种免疫应答的汉他病毒多肽片段。具体汉他病毒蛋白的"免疫原性片段"通常包括能确定表位的全长分子的至少约5-10个连续氨基酸残基，优选全长分子的至少约15-25个连续氨基酸残基，最优选全长分子的至少约20-50个或更多个连续氨基酸残基，或5个氨基酸-全长序列的任意整数，只要所研究的片段保持引发本文所述免疫应答的能力。如上所述，"N抗原"指衍生自所研究汉他病毒的核衣壳蛋白的抗原。已知各种汉他病毒N蛋白的DNA和相应氨基酸序列。例如，图13-18中分别显示了HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV的代表性N抗原的核苷酸序列和相应氨基酸序列。此外，编码大量分离物的N蛋白的S节段己经保存于GenBank，下面进一步描述。1995年1月5日公开的国际公开号WO95/00648中描述了其它序列。Hjelle等，J.Virol(1994)68:592-596描述了衍生自SNV、希望山(ProspectHill)病毒(PHV)和PUUV的N抗原的氨基酸序列。如上所述，用于本试验的N抗原包括全长或基本全长的蛋白，以及该蛋白的片段、融合物或突变体，其中包含一个或多个表位，以便保持与来自患有所研究具体汉他病毒感染的个体的生物样品中存在的抗体的反应性。例如，用于本文所述试验的N抗原可以是全长SNVN序列与另一种蛋白如另一种汉他病毒抗原的重组融合物，和/或与有助于重组表达的蛋白，如50kDa大肠杆菌(五.co")麦芽糖结合蛋白、或人或酵母超氧化物歧化酶(SOD)蛋白的融合物。用于本试验的N蛋白的代表性免疫反应性片段是43个氨基酸的接近氨基末端的节段，对应的氨基酸序列是N多肽的17-59位(相对于SNVNM10编号)，氨基酸序列为QLVTARQKLKDAERAVELDPDDVNKSTLQSRRAAVSALETKLG(SEQIDNO:39)。此片段包括N蛋白的免疫显性表位，抗此表位的抗体可与PUUV、SEOV和HTNV的N蛋白交叉反应(参见例如，Yamada等，J.Virol.(1995)69:1939-1943和1995年3月2日公开的国际公开号WO95/06250)。因此，此片段以及包含此序列的较大片段可用于本文所述试验。对N蛋白表位的描述也参见Lundkvist等，Clin.Diag.Lab.Immunol.(1995)2:82-86;和Gott等，VirusRes.(1991)19:1-16。如上所述，"Gl抗原"指衍生自所研究汉他病毒的称为Gl的包膜糖蛋白的抗原。各种汉他病毒Gl蛋白的DNA和相应氨基酸序列是已知的。本文图1-6显示了代表性G1区。此外，编码大量分离物的G1蛋白的M节段已经保存于GenBank，下面进一步描述。如上所述，用于本试验的G1抗原包括全长或基本全长的蛋白，以及该蛋白的片段、融合物或突变体，其中包含一个或多个表位，以便保持与来自患有所研究具体汉他病毒感染的个体的生物样品中存在的抗体的反应性。用于本文所述试验的Gl抗原包括所研究Gl抗原与图19所示人超氧化物岐化酶(SOD)序列的融合物，以帮助重组表o&该抗原。本文图7-12中显示了来自许多汉他病毒血清型的Gl蛋白的许多其它代表性免疫反应性片段。Gl蛋白的另一代表性免疫反应性片段是一种31个氨基酸肽，其位于氨基酸59-89(相对于SNVNMH10编号)之间的节段，氨基酸序列为LK正SSCNFDLHVPATTTQKYNQVDWTKKSS(SEQIDNO:40)。这部分Gl蛋白构成了各种SNV分离物的SNV抗体识别的免疫反应性线性表位(Jenison等，J.Virol.(1994)68:3000-3006)。此片段以及包含此序列的较大片段可用于本文所述试验。汉他病毒抗原的"免疫原性"序列指包含具有至少一种汉他病毒表位的氨基酸序列的分子，所述表位使该分子能够与所研究汉他病毒的抗体反应，以及在合适的宿主中刺激抗体的产生。"表位"指抗原上与特定B细胞和/或T细胞反应的位点，使所研究的汉他病毒表位能够与生物样品中汉他病毒抗体反应，并刺激抗体产生。该术语也可与"抗原决定簇"或"抗原决定位点"互换使用。表位可包含3个或多个氨基酸，它们具有独特的空间构象。通常，表位由至少5个这种氨基酸组成，更通常，由至少8-10个或更多个这种氨基酸组成。可用许多本领域熟知的表位作图技术鉴定包含表位的给定多肽的区域。参见例如，《分子生物学方法中的表位作图法》(EpitopeMappingProtocolsinMethodsinMolecularBiology),第66巻(GlennE.Morris编，1996)HumanaPress,新泽西州Totowa。例如，可通过(如)以下方法确定线性表位在固体支持物上同时合成大量肽，使肽对应于蛋白质分子的某部分，在肽仍然连接于支持物时使肽与抗体反应。这种技术是本领域已知的，参见例如美国专利号4,708,871;Geysen等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3998-4002;Geysen等，(1985)Proc.Natl,Acad.Sci.USA82:178-182;Geysen等，(1986)Molec.Immunol.^1:709-715，将所有文献以全文纳入本文作参考。类似地，通过测定氨基酸空间构象如x-射线晶体衍射和2维核磁共振不难鉴定构象表位。参见例如，《表位作图法》(EpitopeMappingProtocols),上述。也可用标准抗原性和亲水性图鉴定蛋白质的抗原区域，如用(例如)购自OxfordMolecularGroup的Omiga1.0版软件程序计算。此计算机程序采用Hopp/Woods法，Hopp等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1981)78:3824-3828来测定抗原性特征，采用Kyte-Doolittle技术，Kyte等，J.Mol.Biol.(1982)157:105-132作亲水性图。"免疫原性组合物"是包含至少一种免疫原性多肽(如N和/或Gl汉他病毒抗原)的组合物。."基本纯化的"通常指分离物质(化合物、多核苷酸、蛋白质、多肽、多肽组合物)，以使该物质占其存在的样品中的大部分。一般地，样品中基本纯化的组分占该样品的50%、优选80%-85%、更优选90-95%。纯化感兴趣的多核苷酸和多肽的技术是本领域熟知的，包括(例如)离子交换色谱、亲和色谱和根据密度沉降。提到多肽时，"分离的"指所指的分子与它天然存在于其中的整个生物体相分离和分开，或者基本上不存在同一类型的其它生物大分子。"分离的"多核苷酸指全部或部分没有通常在天然条件下与其结合的序列的核酸分子；或者指一种以其天然形式存在但与异源序列结合的序列；或者指从染色体脱离下来的分子。"等效抗原决定簇"指来自汉他病毒的不同分离物或毒株的抗原决定簇，由于序列变异这些抗原决定簇不必相同，但变异发生在所研究汉他病毒序列的等效位置中。通常，在比对两条序列时，等效抗原决定簇的氨基酸序列具有高度序列同源性，如氨基酸序列同源性大于30%、通常大于40%，如大于60%，甚至大于80-90%。"同源性"指两条多核苷酸或两个多肽部分之间的相同性百分数。两个核酸序列或两个多肽序列在确定的分子长度内，当序列显示有至少约50%，优选至少约75%、更佳至少约80-85%、尤其佳至少约卯％、最佳至少约95-98%序列相同性时，彼此"基本上同源"。如本文所述，基本同源也指与特定序列完全相同的序列。通常，"相同性"指两条多核苷酸或多肽序列上核苷酸和核苷酸或者氨基酸和氨基酸准确相对应。通过排列其序列，可比较两个分子(参比序列和与参比序列的相同性％未知的序列)之间的序列信息，计算两条对比序列之间匹配的准确数量，将其除以参比序列的长度，然后乘以100，即可测定相同性百分数。使用易于获得的计算机程序可有助于分析，如ALIGH、Dayhoff、M.O.(A/oso/7Vo&/"Se《we"ce朋c/5Vra"w"、M.O.Dayhoff编辑，5Suppl.，3:353-358，NationalBiomedicalResearchFoundation,Washington,DC),它采用了Sm他和Waterman分析肽用的局部同源性算法(^^va"CMz'打Xpp/.Ma仇，2:482-489，1981)。可从WisconsinSequenceAnalysisPaekage(第8版，从GeneticsComputerGroup,Madison,WI获得)获得测定核苷酸序列相同性的程序，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，这些程序也依赖于Smith和Waterman算法。采用制造者建议的和参照WisconsinSequenceAnalysisPackage所述的默认参数可容易地使用这些程序。例如，可用Smith和Warerman的同源性算法的默认计分表和6个核苷酸位置的间隔罚分(gappenalty)测定核苷酸序列与参比序列的相同性百分数。本发明建立相同性百分数的另一方法是采用版权属于爱丁堡大学、由JohnF.Collins禾卩ShaneS.Sturrok开发、由IntelliGenetics,Inc.(MountainView,CA)发行的MPSRCH程序包。可采用这套程序包中的Sm他-Waterman算法，其中，在计分表中使用默认参数(例如，间隔开放罚分=12，间隔延伸罚分=1，间隔=6)。从这批数据产生的"匹配"值反映出"序列相同性"。计算序列间的同一性百分数或相似性百分数的其它合适的程序通常在本领域中是已知的，例如，另一种排列对比程序是BLAST,也使用默认参数。例如，可使用下述默认参数的BLASTN和BLASTP:基因编码=标准；过滤=无；链=两；截留=60;期望值=10;矩阵-BLOSUM62;描述=50个序列；排序=高分(HIGHSCORE);数据库=无冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBankCDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。不难获得这些程序的详细描述。或者，在同源区域之间形成稳定的双链体条件下进行多核苷酸杂交，接着用单链特异性核酸酶消化，然后测定消化片段的大小，从而测出同源性。在如(为具体的系统所定义的)严格条件下进行的Southern杂交实验中，可鉴别基本同源的DNA序列。确定适当的杂交条件在本领域熟练技术人员所掌握的知识之内。例如，参见Sambrook等，同上；ZW^C7om'"g，同上；A^c/e/d/d外6r/cfec^/o"，同上。本文用于描述核酸分子的"重组"指基因组、cDNA、病毒、半合成或合成来源的多核苷酸，由于其来源或操作的缘故，该多核苷酸与与其天然相关的多核苷酸的全部或部分不相关。用于蛋白质或多肽的术语"重组子"指通过重组多核苷酸表达产生的多肽。通常，克隆感兴趣的基因，然后在转化的生物体中表达(如下所述)。宿主生物体在表达条件下表达外源基因，从而产生蛋白。"抗体"指特异性结合于抗原中存在的感兴趣表位的分子。"特异性结合"指抗体以"锁钥"型相互作用识别表位并与其作用，在抗原和抗体间形成复合物，相反，非特异性结合可以在抗体与(例如)抗体与其反应的测试底物之间发生。因此，抗-汉他病毒Gl抗体是特异性结合于汉他病毒Gl蛋白的表位的分子。本文所用术语"抗体"包括获自多克隆和单克隆制剂的抗体以及杂交(嵌合)抗体分子(参见例如，Winter等，Nature(1991)349:293-299和美国专利号4,816,567);F(ab')2和F(ab)片段；Fv分子(非共价异源二聚体，参见例如，Inbar等，ProcNatlAcadSciUSA(1972)胆:2659-2662;和Ehrlich等，Biochem(1980)1^:4091-40%);单链Fv分子(sFv)(参见例如，Huston等，ProcNatlAcadSciUSA(1988)M:5879-5883);二元和三元抗体片段构建物；小抗体(参见例如，Pack等，Biochem(1992)M:1579-1584;Cumber等，JImmunology(1992)149B:120-126);人源化抗体分子(参见例如，Riechmann等，Nature(1988)m:323-327;Verhoeyan等，Science(1988)212:1534-1536;和1994年9月21日公开的英国专利公开号GB2，276，169);以及获自这些分子的任何功能片段，其中这些片段保持了母抗体分子的免疫结合特性。本文所用术语"单克隆抗体"指含有均一抗体群体的抗体组合物。该术语不限制抗体的种类或来源，也不限制其制备方式。该术语包括完整的免疫球蛋白和片段如Fab、F(ab')2、Fv和其它片段，以及具有母单克隆抗体分子的免疫结合特性的嵌合和人源化的均一抗体群体。本文所用"固体支持物"指可连接大分子，如蛋白质、多肽、肽、多核苷酸的固体表面，如磁珠、乳胶珠、微量滴定板孔、玻璃平板、尼龙、琼脂糖、聚丙烯酰胺、二氧化硅颗粒、硝酸纤维素膜等。"免疫反应性"指所研究的抗原将与来自汉他病毒感染个体的生物样品中存在的抗汉他病毒抗体特异性反应。"免疫复合物"指抗体结合于抗原上的表位时形成的组合。在本文中，"生物样品"指分离自受检者的组织或体液样品，例如但不限于血液，血浆，血清，粪便排泄物，尿，骨髓，胆汁，脊髓液，淋巴液，脑脊液，皮肤样品，皮肤、呼吸道、肠和泌尿生殖道的分泌物，眼泪，唾液，？L，血细胞，器官，活检组织，以及体外细胞培养组成物的样品，包括但不限于用培养基培养的细胞或组织产生的条件培养基(conditionedmedia),如重组细胞和细胞成分。上面详述的样品不必是直接获自来源的形式。例如，分析前，可在临用前以(例如)加热、离心等处理样品。本文所用术语"标记"和"可检测标记"指能够检测的分子，包括但不限于放射性同位素、荧光剂、半导体纳米晶体、化学发光剂、生色团、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、金溶胶、配体(如生物素、链霉抗生素蛋白或半抗原)等。术语"荧光剂"指能够在可检测范围内发出荧光的物质或其部分。可用于本发明的标记的具体例子包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)、荧光素、FITC、罗丹明、丹酰、伞形酮、二甲基吖啶鑰酯(DMAE)、得克萨斯红、鲁米诺、NADPH和a-e-半乳糖苷酶。II.实施本发明的方式在详细描述本发明之前，应理解本发明并非局限于特定的制剂或加工参数，显然，它们是可以变化的。还应理解本文所用的术语仅用于说明本发明的具体实施例，而并非对其限制。虽然与本文所述内容相似或等效的许多方法和材料可用于实施本发明，但本文描述了优选的材料和方法。本发明基于发现了准确检测汉他病毒感染的新型诊断方法。该方法采用包含免疫显性表位的汉他病毒重组N和G1抗原，和/或这些抗原的抗体，这些抗原来自至少六种不同的汉他病毒血清型，包括HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV。在某些实施方式中，该试验包括(例如)六种重组G1抗原(和/或六种Gl抗原的抗体)(每种抗原来自各上述血清型)和/或六种重组N抗原(每种抗原来自各上述血清型)。在其它实施方式中，该试验可包括(例如)衍生自这六种血清型中任何一种的至少一种重组N抗原(产生能与另外五种血清型的一种或多种交叉反应的抗体)和六种重组Gl抗原，每种抗原来自各上述六种血清型。例如，该试验可包括来自SNV的N抗原(和/或N抗原的抗体)。该试验也包括Gl抗原(和/或Gl抗原的抗体)，优选来自所有六种血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV。或者，该试验可包括来自这六种血清型中任何一种的G1抗原(和/或其抗体)和这六种血清型各自的六种N抗原(和/或其抗体)。在另一实施方式中，该实验可包括(例如)来自这六种血清型中三种的三种G1抗原沐/或其抗体)和来自这六种血清型中另外三种的三种N抗原(和域其抗体)。或者，该实验可包括两种G1抗原(和/或其抗体)和四种N抗原(和/或其抗体)，或者四种Gl抗原(和/或其抗体)和两种N抗原(和/或其抗体)，或者一种Gl抗原(和/或其抗体)和五种N抗原(和/或其抗体)，或者五种Gl抗原(和/或其抗体)和一种N抗原(和/或其抗体)，或者四种Gl抗原(和/或其抗体)和四种N抗原(和/或其抗体)，或者五种Gl抗原(和/或其抗体)和五种N抗原(和/或其抗体)等等。不难理解，可采用重组Gl和N抗原(和/或其抗体)的任何组合，只要代表了六种血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV。本发明试验也可采用衍生自表1所述的多种汉他病毒毒株或后来鉴定的其它毒株的其它汉他病毒抗原。来自六种血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV的汉他病毒N和/或Gl抗原(和/或其抗体)任选地与其它汉他病毒蛋白和/或抗体联用，可诊断多种已知汉他病毒血清型引起的感染。而且，可调整该试验以便可以鉴定引起感染的具体汉他病毒血清型。例如，来自各种HPS-和HFRS-相关性汉他病毒感染者的生物样品与SNVN抗原反应，但不一定与SNVG1抗原反应。因此，能够与SNVN抗原反应但不与SNVG1抗原反应说明感染了汉他病毒但并非SNV，等。不难理解，各种抗原和抗原组合(或这些抗原的抗体)可用于本诊断试验。该方法可用于检测人和啮齿动物群体的汉他病毒感染。该方法可检测血样中的汉他病毒感染，所述血样包括但不限于全血、血清和血浆。因此，可用该方法诊断对象，如人或啮齿类对象的汉他病毒感染，以及检测捐献血样中的汉他病毒污染。可筛选个体捐献样品或集合样品的等份中是否存在汉他病毒，可在混合前清除被汉他病毒污染的样品或集合样品。以此方式，可提供基本没有汉他病毒污染的血液供々厶口S口口口o为了进一步理解本发明，以下更详细地讨论了汉他病毒以及用于本发明组合物和方法的各种汉他病毒抗原和抗体。汉他病毒抗原如上所述，汉他病毒家族的病毒属于布尼亚病毒属，该病毒是有包膜的负链RNA病毒。病毒基因组的RNA分成三部分，由通常分别称为S、M和L的小、中和大3个基因组片段组成。M节段编码一个开放阅读框中的两种包膜糖蛋白，称为G1和G2。S节段编码核衣壳蛋白，称为N，基因组的L节段编码RNA依赖性RNA聚合酶。发现世界上几种不同汉他病毒与特定啮齿类宿主相关(见表1)。如上所述，衍生自至少六种主要汉他病毒血清型HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV的N和/或Gl抗原可用于本发明。经鉴定属于这些血清型的来自许多分离物的N和Gl抗原的序列和编码这些抗原的核酸序列是已知的。本文图1-12中描述了可产生Gl抗原的代表性序列。虽然图中描述的Gl抗原包括N-末端甲硫氨酸，但本文所用G1肽不必包含此甲硫氨酸，尤其是通过合成方法产生时。本文所用Gl抗原可包含全长Gl蛋白或Gl蛋白的免疫原性片段。尤其有用的是至少包含对应于氨基酸59-89(相对于SNVNMH10编号)代表的31个氨基酸序列区域(LKIESSCNFDLHVPATTTQKYNQVDWTKKSS(SEQIDNO:40)的片段。Gl蛋白的这个区域构成了免疫反应性线性表位，在本文图7-12显示的各Gl免疫原性片段中发现了这个区域。在本文感兴趣的六种汉他病毒血清型中此序列不同。因此，应该理解，"对应于"此序列的非-SNV汉他病毒氨基酸序列是属于相同区域的非SNV汉他病毒的氨基酸节段，并显示出与此序列同源，但不必与此序列100%相同。不难通过参照本文图7-12鉴定其它五种汉他病毒血清型中的相应区域。包含对应于SEQIDNO:40所示氨基酸序列的氨基酸序列的免疫原性Gl抗原可包括(例如)31个氨基酸，长达全长G1分子，如31-500个氨基酸，优选31-250个氨基酸，甚至更优选31-150个氨基酸，如31-50...60...70...75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86...90...100...200...300...400...500个氨基酸，长达全长Gl分子，或这些范围内的任意整数个氨基酸。而且，本文所用Gl抗原可缺少所有或一部分跨膜结合结构域和/或包膜C末端中发现的胞质尾。因此，本发明考虑了采用保留跨膜结合结构域和胞质尾的包膜多肽，以及缺少所有或一部分跨膜结合结构域和/或胞质尾的抗原，以及Gl蛋白的相邻部分。用本领域熟知的计算机程序和算法(如Kyte-Doolittle技术，Kyte等，J.Mol.Biol.(1982)157:105-132)不难确定所述结构域的位置。熟知可产生G1抗原的其它序列。例如，G1序列可衍生自各种HTNV序列，如保存在NCBI登录号为NC—005219、AF345636、D25532、D25529、D00377、D00376、AF288645、AF366569、AF035831、Y00386、U38177、U37729、M14627和L08753的序列。G1序列可衍生自各种SNV序列，如保存在NCBI登录号为L37903、L25783、AF030552、AF030551和U02471的序列。Gl序列可衍生自各种ANDV序列，如保存在NCBI登录号为NC—003467和AF291703的序列。Gl序列可衍生自各种SEOV序列，如保存在NCBI登录号为AF458104、AB027521、AF288654、AF288652、AF288650和S47716的序列。Gl序列可衍生自各种PUUV序列，如保存在NCBI登录号为NC—005223、AY526218、U14136、U22418、L08754、L08755、X61034、X55129和M29979的序列。Gl序列可衍生自各种DOBV序列，如保存在NCBI登录号为NC_005234、AJ4腿6、AY168578、AY168577和L33685的序列。本文图13-18中描述了可产生N抗原的代表性序列。如上G1抗原所述，N抗原可以或可以不包含N末端甲硫氨酸。本文所用N抗原可包含全长N蛋白或N蛋白的免疫原性片段。尤其有用的是至少包含对应于N多肽17-59位(相对于SNVNMH10编号)的43个氨基酸序列区域(QLVTARQKLKDAERAVELDPDDVNKSTLQSRRAAVSALETKLG(SEQIDNO:39)的片段。N蛋白的此区域包含免疫显性表位，抗此表位的抗体能与PUUV、SEOV和HTNV的N蛋白交叉反应。在六种感兴趣的汉他病毒血清型中此序列不相同。因此，应理解，"对应于"此序列的非-SNV汉他病毒的氨基酸序列是属于相同区域的非SNV汉他病毒的氨基酸节段，并显示出与此序列同源，但不必与此序列100%相同。不难通过参照本文图13-18鉴定其它五种汉他病毒血清型中的相应区域。包含对应于SEQIDNO:39所示氨基酸序列的氨基酸序列的免疫原性N抗原可包括(例如)43个氨基酸，长达全长N分子，如43-350个氨基酸，优选43-300个氨基酸，更优选43-200个氨基酸，甚至更优选43-100个氨基酸，如43-60...70...80...90...100...200...300...400，长达全长N分子，或这些范围内的任意整数个氨基酸。熟知可产生N抗原的其它序列。例如，N序列可衍生自多种HTNV序列，如保存在NCBI登录号为AB127998、AB027101、AB027523、AB027097、D25533、AF288646、AF288644、AF427324、AF427323、AF427322、AF427320、AF427319、AF427318、AF366568、AY017064、AF32謡、AF321094、AF288296、U37768和M14626的序列。N序列可衍生自多种SNV序列，如保存在NCBI登录号为NC—005216、L37904、L25784、L33816、L33683和U02474的序列。N序列可衍生自多种ANDV序列，如保存在NCBI登录号为NC—003466、AF325966、AF0044660和AF291702的序列。N序列可衍生自多种SEOV序列，如保存在NCBI登录号为NC—005236、AF488708、AF488707、AY273791、AB027522、AF329390、AF288655、AF288653、AF288643、AF406965、AY006465的序列。N序列可衍生自多种PUUV序列，如保存在NCBI登录号为NC—005224、AY526219、AJ314601、AJ314600、AJ314599、AJ314598、AJ314597、AF442613、AF367071、AF367070、AF367068、AF367067、AF367066、AF367065、AF367064、AJ277030、AJ277076、AJ277075、AJ277034、AJ277033、AJ277032、AJ277031、AJ238791、AJ238790、AJ238789、AJ238788、X61035、AB010731、AB010730、U14137、AF294652、U22423、L08804、L11347和M32750的序列。N序列可衍生自多种DOBV序列，如保存在NCBI登录号为NC—005233、AJ616854、AJ410619、AJ410615、AJ131673、AJ131672、AJ269550、AJ269549、A扁9775、AJ009773、AY168576和L41916的序列。重组N和G1抗原可以是单独产物，或是多种N和G1抗原、与或不与来自这六种血清型中一种或多种的其它汉他病毒抗原，以及衍生自除HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV以外的血清型的抗原的融合物。例如，融合物可包含来自上述六种血清型的G1抗原。此融合物可单独使用或与第二种融合物联用，第二种融合物包含来自这六种血清型中一种或多种的一个或多个N抗原。相似地，融合物可包含来自上述六种血清型的N抗原，此融合物可单独使用或与第二种融合物联用，第二种融合物包含来自这六种血清型中一种或多种的一种或多种G1抗原。或者，可以一种融合物或多种融合物提供所有N和Gl抗原。不难理解，本发明融合蛋白可取多种形式，只要存在来自HTNV、PUUV、SEOV、DOBV、SNV和ANDV的N禾口/或G1抗原。如果产生了融合物，那么不需要以天然病毒中发现的相同顺序组织多肽。因此，例如，可将G1多肽融合于N多肽的N末端或C末端等。其它可能的融合蛋白包括人或酵母超氧化物岐化酶(SOD)蛋白或SOD蛋白片段与汉他病毒Gl和/或N多肽的融合物。表达为人SOD融合抗原的重组蛋白的例子参见Barr等，FaccZne(1987)1:卯隱101;Pichuantes等，ProteinsStruct,Fuct.Genet.(1989)6:324-327;Pichuantes等，J.Biol.Chem.(1990)23:13890-13898。可用标准技术获得用于本发明的抗原。例如，可用本领域熟知的重组方法方便地产生汉他病毒抗原。参见例如，1995年1月5日公开的国际公开号WO95/00648;1995年3月2日公开的国际公开号WO95/06240;和Hjelle等，J.Virol(1994)68:592-596，其中描述了用重组方法产生汉他病毒抗原。可根据汉他病毒基因组的已知序列设计寡核苷酸探针，用探针检测编码本发明所用抗原的汉他病毒基因组的基因组或cDNA文库。然后，可用标准技术进一步分离基因，和(如果需要)用限制性酶在全长序列的所需部分上突变基因。相似地，可用己知技术，如酚抽提从感染组织中直接分离汉他病毒基因(参见例如，1995年1月5日公开的国际公开号WO95/00648)，可进一步操作序列以产生任何所需变化。参见例如，Sambrook等，同上，其中描述了用于获得和分离DNA的技术。最后，可用合成方法根据已知序列产生编码汉他病毒抗原的基因。可用所需具体氨基酸序列的合适密码子设计核苷酸序列。通常选择将要表达该序列的宿主的优选密码子。通常通过以下方法组装完整序列使标准方法制备的寡核苷酸重叠，组装成完整的编码序列。参见例如，Edge,Nature(1981)292:756;Nambair等，Science(1984)223:1299;Jay等，J.Biol.Chem.(1984)259:6311。多核苷酸可包含天然存在的或可包含天然情况下不存在的人工序列的多种多肽的编码序列。如果需要，可用标准分子生物学技术连接这些多核苷酸形成融合蛋白的编码序列。一旦制备或分离了编码序列后，可将此序列克隆入任何合适的载体或复制子中。本领域技术人员已知许多克隆载体，选择合适的克隆载体只是选择的问题。合适载体包括但不限于与合适控制元件连接时能够复制的质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体或病毒。然后，将编码序列置于合适的控制元件的控制下，合适的控制元件取决于用于表达的系统。因此，可将编码序列置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)和(任选)操纵子的控制下，以便通过合适的转化子将感兴趣的DNA序列转录成RNA。编码序列可以或可以不含有在后续翻译后加工中可被宿主去除的信号肽或前导序列。参见例如，美国专利号4,431,739;4,425,437;4,338,397。如果存在，信号序列可以是与感兴趣的汉他病毒多肽相连的天然前导物。例如，如果表达的汉他病毒多肽是Gl抗原，那么可包括所有或一部分天然Gl前导序列。或者，可存在异源信号序列，其可提高分泌效率。本领域已知许多代表性前导序列，包括但不限于酵母a-因子前导物、TPA信号肽、Ig信号肽等。本领域熟知这些和其它前导序列的序列。除了控制序列以外，可能想要加入调控序列，以相对于宿主细胞生长调节该序列的表达。本领域技术人员已知调控序列，例子包括响应于化学或物理刺激，包括在调控化合物存在下开放或关闭基因表达的序列。载体中也可存在其它类型的调控元件。例如，本文中可用增强子元件提高构建物的表达水平。例子包括SV40早期基因增强子(Dijkema等，(1985)EMBOJ.4:761)，衍生自劳氏肉瘤病毒的长末端重复(LTR)的增强子/启动子(Gorman等，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA79:6777)和衍生自人CMV的元件(Boshart等，(1985)Cell41:521)，如CMV内含子A序列中所含元件(美国专利号5,688,688)。表达盒还可包括用于在合适的宿主细胞中自发复制的复制起点、一个或多个可选择标记、一个或多个限制性位点、可能是高拷贝数和强效的启动子。构建一表达载体，使具体编码序列位于带有合适调控序列的载体中，编码序列相对于控制序列的定位和方向应使编码序列能在控制序列的"控制"下转录(即结合于DNA分子的控制序列的RNA聚合酶转录编码序列)。可能需要修饰编码感兴趣分子的序列以达到此目的。例如，在一些情况下，可能需要修饰该序列，使其可以合适方向连接于控制序列；即维持阅读框。可在插入载体前将控制序列和其它调控序列连接于编码序列。或者，可将编码序列直接克隆入已经含有控制序列和合适的限制性位点的表达载体。'如上所述，也可能需要产生感兴趣多肽的突变体或类似物。用于本发明组合物的汉他病毒多肽的突变体或类似物可通过以下方法制备缺失编码感兴趣分子的序列的一部分、插入序列、和/或取代序列中的一个或多个核苷酸。本领域技术人员熟知用于修饰核苷酸序列的技术，如定点诱变等。参见例如，Sambrook等，同上；Kunkel，T.A.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82:448;Geisselsoder等，(1987)BioTechniques5:786;Zoller禾口Smith(1983)MethodsEnzymol.100:468;Dalbie-McFarland等，(1982)Proc,Natl.Acad.Sci,USA79:6409。为了帮助重组表达，可将感兴趣分子表达为融合蛋白，如与(如)50kDa大肠杆菌麦芽糖结合蛋白的融合物、与人或酵母超氧化物岐化酶(SOD)或其片段的融合物，或表达为泛素融合蛋白。可在本领域熟知的多种系统中表达该分子，包括昆虫、哺乳动物、细菌、病毒和酵母表达系统。例如，昆虫细胞表达系统如杆状病毒系统是本领域技术人员已知的，参见例如，Summers和Smith,得克萨斯农业实验站公报(TexasAgriculturalExperimentStationBulletin)1555期(1987)。杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒的形式购自Invitrogen，加利福尼亚州圣地亚哥("MaxBac"试剂盒)等。相似地，本领域熟知细菌和哺乳动物细胞表达系统，参见例如，Sambrook等，同上。酵母表达系统也是本领域已知的，参见例如，《酵母遗传工程》(YeastGeneticEngineering)(Barr等编，1989)Butterworths，London。也己知与上述系统一起使用的许多合适宿主细胞。例如，本领域已知哺乳动物细胞系，包括获自美国典型培养物保藏中心的永生化细胞系，例如但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人胚肾细胞、人肝细胞癌细胞(如HepG2)、Madin-Darby牛肾("MDBK")细胞等。相似地，细菌宿主如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌CBfl"7/w^Z^7/力和链球菌0^"印tococcws^p.)可与本发明构建物一起使用。用于本发明的酵母宿主包括但不限于酿酒酵母(5"acc/^raw^cejcerev^/ae)，白假丝酵母(Ca"力'cfa、麦芽糖假丝酵母(03"<&/<3wa/tosa)、多形汉逊酵母(7/a似e"w/a/o/ymor;Aa)、脆弱克鲁维酵母菌(i^/M，yverom;;cM々ag//^)、乳糖克鲁维酵母菌(A7z^veram;^w/ac他)、尸/c/z/ag"/〃en.mow&7、巴斯德毕赤酵母(尸/c/n'apaWor&)、粟酒裂殖酵母OSc/zizo犯cc/wTomyc^/om6e)和解脂耶氏酵母(7amw/a/^/,'cfl)等。与杆状病毒表达载体一起使用的昆虫细胞包括但不限于埃及伊蛟04ecfesaegy/")、苜蓿夜蛾(y4Mfogn3//iacahybr打fca)、桑蚕(5o附&3;:)c附orf)、黑腹果虫黾(Z>050_p/2//a附e/a"ogaWer)、草i也贪夜蛾(Spo(io/^era/ragz》erafa)和粉纹夜蛾(7Hc/zo;/,'am〕等。可用本领域熟知的各种基因递送技术将包含感兴趣核苷酸序列的核酸分子稳定地整合到宿主细胞基因组中或维持在合适宿主细胞中的稳定附加型(episomal)元件上。参见例如，美国专利号5,399,346。根据所选的表达系统和宿主，通过在能够表达蛋白质的条件下培养用上述表达载体转化的宿主细胞，产生该分子。然后从宿主细胞中分离表达蛋白并纯化。如果表达系统将蛋白质分泌到生长培养基中，可直接从培养基中纯化产物。如果没有分泌，可从细胞裂解物中分离产物。本领域技术人员能够选择合适的培养条件和回收方法。本文将汉他病毒抗原用作诊断物，以检测生物样品中是否存在抗病毒的反应性抗体。而且，可用该抗原测定是哪种汉他病毒类型产生了感染。也可用该抗原产生用于诊断的抗体。汉他病毒抗体可用汉他病毒抗原产生汉他病毒-特异性多克隆和单克隆抗体。汉他病毒-特异性多克隆和单克隆抗体能特异性结合汉他病毒抗原。可通过将汉他病毒抗原给予哺乳动物如小鼠、兔、山羊或马产生多克隆抗体。收集免疫动物的血清，通过(例如)以下方法从血浆中纯化抗体用硫酸铵沉淀、然后进行层析(优选亲和层析)。本领域已知产生和加工多克隆抗血清的技术。也不难产生抗蛋白质上存在的汉他病毒-特异性表位的单克隆抗体。来自用汉他病毒抗原免疫的哺乳动物如小鼠(参见例如，Kohler和Milstein,Nature(1975)256:495-497)或兔(参见例如，全文纳入本文作参考的美国专利号5675,063)的正常B细胞可与(例如)HAT-敏感性小鼠骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤。可用RIA或ELISA鉴定产生汉他病毒-特异性抗体的杂交瘤，并通过在半固体琼脂中克隆或有限稀释来分离。用另一轮筛选来分离产生汉他病毒-特异性抗体的克隆。可能需要提供嵌合抗体。可由小鼠单克隆抗体分子形成人和非人氨基酸序列组成的嵌合抗体，以降低它们在人体中的免疫原性(Winter等，(1991)Nature349:293;Lobuglio等，(1989)Proc.Nat.Acad,Sci.USA86:4220;Shaw等，(1987)JImmunol.138:4534;和Brown等，(1987)CancerRes.47:3577;Riechmann等，(1988)Nature332:323;Verhoeyen等，(1988)Science239:1534;和Jones等，(1986)Nature321:522;1992年12月23日公开的EP公开号519,596;和i994年9月21日公开的英国专利发明者S·H·恩古耶,S·皮谢安特斯申请人:诺华疫苗和诊断公司