病毒载体的制作方法

专利名称：病毒载体的制作方法
本申请要求在2004年11月24日提交的美国申请60/630,963的优先权，其公开内容通过参考并入本文中。
本发明涉及运送在体内有复制能力的病毒用于治疗目的的领域，尤其是可将所述病毒引入患者或宿主内的新方法。
病毒是目前在非人动物和人中广泛使用的对抗疾病的治疗剂。具体而言，利用病毒作为载体用于基因治疗。作为替代，已将细胞裂解型病毒用于靶向和杀死癌或不希望的增殖细胞，这样的治疗也称为“病毒疗法”。因此，在医学处理中直接使用病毒是一个广泛增长的领域，并且正在开发在处理和治疗中涉及病毒的新技术和用途。
病毒是高效进入其宿主细胞并利用该细胞的细胞机器辅助其复制的高度进化的生物学实体。正因如此，它们被预言为理想的基因治疗载体，因为外源/异源基因或编码序列可插入病毒基因组中并进行感染，由此使得外源基因可以被运送至宿主细胞的核中。基因治疗首先被设想用于治疗其中缺陷是遗传性单基因缺陷的遗传疾病，例如重症联合免疫缺陷病(SCID)。不过，目前的基因治疗范围要广泛的多，设想可利用病毒运送针对获得性疾病的基因，所述获得性疾病诸如癌症、心血管疾病、神经退行性病变、炎症甚至传染性疾病。
目前有5类主要的临床可利用病毒载体，它们来源于致癌逆转录病毒(oncoretroviruses)、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)和1型单纯疱疹病毒(HSV-1)。每类载体的特征在于使之适用于特定应用且不适用于其它应用的一组不同性质。
这五种主要类型的病毒载体可依照它们的基因组是整合入宿主DNA中(致癌逆转录病毒和慢病毒)还是主要作为染色体外附加体持续存在于细胞核内(AAVs、腺病毒和疱疹病毒)而分成两组。此区别是各载体对于特定应用的适用性的重要决定因素；非整合性载体，在某些情况下，可在非增殖细胞内介导持续的转基因表达，但是如果需要在分裂细胞中维持稳定的遗传改变，那么当前整合型载体是值得选用的工具。
致癌逆转录病毒载体是开发的第一类病毒载体，迄今为止已广泛用于临床试验中。它们传统上是干细胞离体转导选用的载体。不过，大多数工作集中于慢病毒载体的研发，它们可自然侵入完整的核膜并转导非分裂细胞。慢病毒载体可能是未来许多疾病治疗中的重要载体系统。它们已被证实是递送基因至中枢神经系统的有效工具，其在没有炎症的情况下产生长期的基因表达。
至于“病毒疗法”技术，其中的病毒利用其裂解细胞的能力破坏正在增殖的细胞，诸如癌细胞，病毒不必携带任何外源编码序列或运送任何序列至靶细胞。在这样的策略中使用只靶向于正分裂细胞的病毒可以是非常理想的，使得只有正在增殖的细胞被破坏。在这样的情况下还可在病毒载体中插入核酸序列使得可以通过在系统中添加药物破坏病毒，从而可以更高程度的调控。裂解病毒包括腺病毒。
载体向性(即，宿主细胞靶向)、靶细胞内转基因表达的持续时间和载体的免疫原性是影响具体治疗应用中载体选择的另外因素。可论证地，腺病毒载体在递送其核酸序列至细胞核方面是最有效率的载体类型，并且直接注射腺病毒载体可高效地转导大部分组织。
重组AAV载体(rAAV)是用于在非增殖组织中长期安全的基因转移和表达的最有前景的载体系统之一。AAV在正开发用于基因治疗的病毒中是独特的，因为野生型病毒从未显示出会引起人类疾病。载体颗粒的小尺寸和简单性使其可能系统性地施加高剂量的载体而不会引起急性炎性反应或毒副作用。
载体基因组中适于外源DNA掺入的可利用空间是影响选择适于具体治疗应用的载体的另一标准。
基于简单逆转录病毒诸如Moloney白血病病毒(MoMLV)的基因治疗载体由于其有效整合入靶细胞的基因组中而经常被选择。整合被认为是转导基因长期表达的一个先决条件。
在感染的早期步骤中，逆转录病毒递送它们的核蛋白核心进入靶细胞的细胞质中。在此，病毒基因组发生逆转录，同时核心成熟为前整合复合物。该复合物必须到达核以完成病毒DNA整合进入宿主细胞染色体。对于简单逆转录病毒(致癌逆转录病毒)，此步骤需要在细胞分裂期间核膜解离，这最可能是因为蛋白质/核酸复合物的庞大尺寸阻止了它通过核孔的被动扩散，因为没有明确的定位信号来促进进入核的主动运输。
目前用于人基因治疗的大部分逆转录病毒载体是有复制缺陷的并且必须在包装细胞内产生，它包含已整合的野生型病毒基因组序列并因此提供了组装病毒必需的所有结构元件，但由于包装信号序列(psi)的缺失而不能用壳体包裹它们自身的野生型病毒基因组。
通常，复制缺陷型逆转录病毒载体是以每毫升只有106-7个集落形成单位(cfu)的滴度级从包装细胞产生，它几乎不适于体内转导。
然而，本发明一般地涉及有复制能力的病毒，并且设法处理已经体外产生的病毒的不足以用于治疗的情况。
为了产生足够临床级别引入动物包括人在内的用于治疗的病毒，所述病毒必须依照严格要求生产。为了生产病毒，重组病毒通常最初构建成包含病毒序列以及必要时的治疗基因的质粒。将此质粒在体外转染入细胞，并且收集和纯化由转染细胞产生的病毒，用于治疗的病毒应当具有自我复制能力。在某些情况下，期望制造不能复制的病毒，因此它们必须在包装细胞内产生。本发明不涉及不能自我复制的病毒。
至于临床级别的病毒生产，必须培养昂贵并且技术上要求的大规模哺乳动物细胞培养物。这通常需要持续维持无菌条件、使用具有大表面面积的生物反应器(因为大多数哺乳动物细胞需要粘附于某一表面上，否则它们会凋亡)并且进行长时期的持续灌注和补充培养基(因为大多数哺乳动物细胞平均每24小时只分裂一次，所以放大过程可能花费长时间)。收获后，所述病毒必须用温和但低效的方法进行纯化，尤其是在脂质包裹的病毒诸如逆转录病毒的情况中，它们相当脆弱并且经常需要低速离心或通过体积排阻滤器的切向流过滤以减小体积并浓缩病毒制备物。虽然超速离心沉淀逆转录病毒是可能的，但通常大部分病毒颗粒由于离心而被破坏，导致总产量的显著净损失与稍微更浓缩的小体积制备物相交换。由此可见生产临床级的病毒以用于治疗可以是耗时的、昂贵的、并且最终导致低产量。
因此，需要克服目前病毒治疗方法中采取的漫长培养和纯化步骤所呈现的问题。
本发明设法通过完全去除此步骤来克服体外生产临床级病毒中的有关问题。本发明的发明人由此提出在体内细胞转染中直接应用质粒，以产生重组的有体内复制能力的病毒。本领域技术人员过去从未考虑过这样一种优秀的解决方法。
与当前实践的这种显著变革构成了本发明的基础。具体而言，体内细胞的直接转染应考虑到在所选择的细胞类型、器官或组织内直接生产病毒并允许在低频率转染事件后定位转染靶细胞。此外，若体内产生的病毒粒子结合了靶细胞类型的向性，最初非靶细胞类型可以用所述质粒转染并且其表现为生产细胞。这明显为治疗方法提供了很大的灵活性。
因此本发明旨在在体内细胞转染中利用编码重组且有复制能力的病毒的质粒。一旦细胞已成功地用质粒转染，将发生重组的有复制能力的病毒的表达，并且这将以预期进程导致病毒从所述细胞释放并能转染靶细胞。因此，从单一的初始质粒转染事件开始，很多靶细胞可被转染。在此首次确认了质粒可以这样的方式被应用。如先前所提及的，现有的基因治疗和病毒治疗方法集中于递送病毒自身，而使用编码病毒的质粒则非常简单，并克服了前文所论述的一些问题。
因此，本发明的一方面提供了用于治疗的编码有复制能力的病毒的质粒。
在本文中使用的术语“质粒”表示能在细胞内染色体外存在的核酸结构。它因此能自主存在并组成独立的复制子。它可以是DNA或RNA结构，优选单链或者双链形式的DNA结构。通常，质粒分子是环状核酸分子，其包含编码序列(基因)和下文所进一步描述的调节序列。然而，带缺口的环状核酸分子和线性核酸分子也包括在内。特别优选地是，质粒是环状双链DNA或其带缺口的形式(其中一条链不是连续的环状)。所述DNA可包含病毒cDNA。此外，修饰或不常见的核酸残基(例如，掺入肌苷)可用于质粒中。
“病毒”是能在适当宿主细胞内繁殖的非细胞感染剂。感染性颗粒(病毒粒子)在结构上由蛋白质衣壳以及在某些情况下还有外包膜包绕的核酸(DNA或RNA)核心组成。
应用于细胞转染的质粒编码有复制能力的病毒。根据在本文中使用的意思，短语“编码有复制能力的重组病毒的质粒”指包含病毒(或者DNA病毒或者RNA病毒，如下文所进一步论述)编码序列的质粒，所述序列包含在转染细胞内体内生产病毒所必需的所有序列(诸如编码序列基因和启动子/增强子)，导致产生通过从其所产生细胞中释放而能体内转染细胞的活病毒。因此，所述质粒包含允许产生可体内转染细胞的病毒必需的所有序列，而不需要辅助病毒或包装细胞。有复制能力的病毒可在体内进行高效的转染，因为所述病毒能感染靶细胞。
用于本发明的质粒包含以下事件所需要的病毒核酸序列(i)病毒粒子颗粒的产生、装配和释放，(ii)所述病毒序列(在本文中被称为“病毒基因组”)在所述颗粒内的包装，(iii)所述颗粒进入细胞并建立感染，以及(iv)病毒基因组序列在感染细胞内的复制。
这些序列包括但不限于末端重复序列和包装信号序列，以及编码野生型或异源病毒转录因子、聚合酶和结构衣壳和/或包膜蛋白的序列，其可操作性连接至调节序列，如野生型或异源启动子或增强子。本发明中所用质粒的结构在下文有进一步的详细描述。
任何适当的病毒都可应用于本发明中。所述病毒是如先前所提及的有复制能力的病毒，并因此可原位扩增。合适的病毒包括RNA病毒，诸如逆转录病毒，以及DNA病毒。合适的DNA病毒的实例包括细小病毒、多瘤病毒、腺病毒，较少优选地使用较大的DNA病毒，诸如疱疹病毒，因为它们的基因组跨度有150kb。
优选克隆入质粒的病毒序列小于50kb，通常在4kb(例如，parovins)至约36kb(例如，腺病毒)范围内。适于本发明应用的RNA病毒包括，但不限于逆转录病毒，诸如那些逆转录病毒科的病毒(泡沫病毒(spumaviruses)或泡沫病毒(foamy viruses)、慢病毒和致癌病毒)。慢病毒包括“免疫缺陷病毒”，它包括1型和2型人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。致癌病毒不是必定致癌的，并且包括小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、鼠白血病病毒(MLV)、牛白血病病毒(BLV)以及I型和II型人T细胞白血病病毒(HTLV-I/II)。另外的合适的RNA病毒包括小核糖核酸病毒、鼻病毒、冠状病毒、披膜病毒、肝炎病毒和流感病毒。
当然应理解本发明进一步扩展至修饰病毒，诸如利用来自不同病毒的组分产生具有特殊期望特征的病毒的杂合病毒。所述杂合病毒包括腺病毒-逆转录病毒杂合体和腺病毒-逆转录转座子杂合体，但任一合适的杂合体都可使用。
此外，可以通过对来自许多病毒的各种编码序列和调控序列的重组产生“设计”病毒。
所述病毒通常是重组的，因为它的基因组是重组核酸技术操作的产物并且与野生型基因组不同。因此所述基因组通常将并入异源核酸区域，即，不是在野生型病毒中正常存在的区域，包括已被修饰以改变其功能的天然区域。优选异源区编码治疗性分子，诸如自杀基因(例如，PNP)，或治疗性蛋白质(例如免疫刺激或抗炎细胞因子)或显性-负性(dominant-negative)分子、siRNA、反义分子等。
本发明的质粒因此包含编码有复制能力的病毒的序列。包含所述质粒的元件将随由此所编码病毒的身份而变化。如前文所述的，所述质粒包含以下元件以下各项需要的病毒核酸序列；(i)病毒粒子颗粒的产生、装配和释放，诸如腺病毒的E1B-19KD基因异形体(isoform)，它在感染的晚期阶段帮助关闭宿主细胞蛋白质合成并增强细胞凋亡，由此促进病毒释放；以及结构基因，诸如逆转录病毒的env(包膜蛋白)基因和腺病毒的“晚期”基因L1、L2、L3和L4，它们编码病毒衣壳的结构组分，诸如六邻体、五邻体和纤维单元；(ii)所述病毒序列(在此称为“病毒基因组”)在所述颗粒内的包装，诸如Psi逆转录病毒包装序列；(iii)通过所述颗粒进入细胞和确立感染，诸如腺病毒的E1B-55KD异形体，它编码抑制细胞防御蛋白p53的蛋白质，否则其将抑制DNA复制，停止病毒感染；以及(iv)病毒基因组序列在感染细胞内的复制，诸如腺病毒的“早期”基因E1A，它是病毒复制的主要转录激活物，或者逆转录病毒的编码逆转录酶、蛋白酶和整合酶蛋白质的pol基因。
应当理解质粒因此至少包含为了在受转染细胞内产生有完全复制能力的重组病毒所需要的最小序列。质粒中存在的一些序列可以执行一种以上的功能，即，完成(i)至(iv)中所确定的一种以上的任务。另外还应理解执行上述任务的序列不必一定是编码肽的“基因或编码序列”，还可以是核酸序列内的启动子或增强子区。质粒中所包含的序列包括但不局限于末端重复序列和包装信号序列，以及编码野生型或异源病毒转录因子、聚合酶和结构衣壳和/或包膜蛋白的序列，其具有可操作性连接的调控序列，诸如野生型或异源启动子或增强子。
逆转录病毒基因组相当简单，并且它或它的变体特别优选用于并入本发明所用的质粒中。它只包含3个基因座；gag(编码衣壳和基质蛋白)、pol(编码逆转录酶)和env(编码病毒包膜糖蛋白)。这些结构基因两侧是用于提供病毒粒子RNA转录和聚腺苷化的两个长末端重复(LTR)序列，还包含病毒繁殖所必需的所有其它顺式作用序列，包括包装信号序列。
若期望经质粒转染将重组病毒引入细胞是为了递送治疗性基因至靶细胞，这样的治疗性基因(或编码序列)则包括在质粒内，作为病毒基因组的一部分。然而，在一些实施方案中，将不期望递送任何治疗性基因至靶细胞。取而代之的是，裂解病毒可由所述质粒编码，一旦此病毒在细胞内产生，它通过促进凋亡破坏细胞以释放后代病毒，例如腺病毒就是一种裂解病毒。此策略可用于，例如，处理癌细胞。一旦所述质粒转染进入癌细胞，并且裂解病毒表达，然后癌细胞死亡同时释放后代病毒。这样的病毒被称为“细胞裂解”病毒，其在本发明的范围内。如下文所进一步论述的，这样的病毒可以靶向癌细胞。
作为替代，所述质粒可以包含期望引入靶细胞的治疗性基因或编码序列。这可以是编码任何期望治疗剂的基因，诸如正常宿主蛋白质的非突变形式，诸如胰岛素、生长激素、凝血因子、细胞因子(诸如白介素)，或者作为替代，编码自杀基因的基因，诸如能转化前药的酶、核酶、反义RNA、siRNA(用于基因沉默的小的抑制性RNA)以及基因表达的修饰子/增强子/阻遏子。本领域技术人员应知道适于包含在质粒内的适当基因。治疗性基因/编码序列通常将与启动子可操作性的连接，这使得基因一旦进入细胞就转录。任选地，治疗性基因还与增强子连接。启动子和增强子二者都可以是天然存在于病毒内的，与天然形式基因或编码序列正常相连的，或者可以是由任何适当来源提供的外源性元件。在本发明的一个优选实施方案中，控制治疗性基因表达的启动子和/或增强子序列对该疗法靶向的细胞(靶细胞)具有特异性，由此使得治疗性基因或编码序列只在靶细胞群体中表达。这样的靶向在下文将有进一步的论述。
在本文所述的用途中，质粒可不包含、包含一种或更多种(例如，1、2、3、4或5)用于递送至靶细胞的治疗性基因。
本发明中利用的质粒包含允许病毒基因/编码序列发生转录和翻译所必需的序列，以及可能存在的治疗性编码序列。在下文中，这样的序列被描述为“调节性核酸序列”并且包括启动子序列、聚腺苷化信号、转录终止序列、上游调节结构域、复制起点、内部核糖体进入位点(IRES)、增强子，等等，其共同提供细胞内编码序列的复制、转录和翻译。可以使用天然病毒序列。为了复制、翻译和转录编码序列，不必所有这些元件都存在。然而，为了提高靶细胞特异性，可能使用非异源序列指导来自质粒的编码序列表达。例如，可能使用组织特异性启动子和/或增强子或改进质粒内所含基因表达水平的任何其它序列。因此，可提及的有肿瘤相关性启动子和增强子，诸如MUC-1、PSA和酪氨酸酶，以及组织特异性启动子和/或增强子，诸如胰高血糖素基因启动子，其将基因表达限制于肠(gut)的内分泌细胞。
从质粒转染细胞产生的后代病毒可依靠其天然的细胞结合能力(向性)感染靶细胞。更优选的，可以通过修饰负责靶细胞结合和进入的蛋白质的基因/编码序列来增强或改变病毒的向性。这样的再靶向病毒是本领域众所周知的。例如，可改变逆转录病毒的包膜蛋白质以改变向性。由此，负责任何病毒之细胞靶向的衣壳或包膜蛋白质的编码序列可以被修饰，优选通过添加靶向核酸序列加以修饰。靶向核酸序列编码靶向配体，诸如抗体及其衍生物(诸如单链抗体)、抗原、凝集素、糖肽、诸如调蛋白等的肽类激素、受体或受体的配体(诸如结合对生物素和亲合素)。然而，任何靶向结构都可使用。
最初的质粒转染步骤可在任何细胞中发生，它不必是如下所进一步论述的关于病毒治疗的靶细胞。“初始细胞”是被所施加质粒转染的细胞。因此初始转染细胞可以是任何细胞，但优选是靶细胞，或者与靶细胞在同一器官或组织内，以使病毒疗法定向于所需要的区域。因此，初始细胞可以是，例如，质粒转染易于到达的位置，即，在诸如肝脏等器官的表面，其中靶细胞较不易接近，即在肝脏核心。然而优选待转染的初始细胞是靶细胞，或者与其非常接近的。
质粒可以优选结合，例如缀合至将质粒导向至特异类型组织或细胞并因此促进所述特异组织或细胞类型转染的靶向结构或配体。例如，靶向结构可用于特异性地靶向肿瘤细胞。
“靶细胞”是病毒疗法所指向的细胞。细胞可以是纯粹以细胞类型为基础的靶细胞，例如，肝细胞，和/或以位置为基础的靶细胞，例如，腿的平滑肌细胞。靶细胞可以是癌细胞。作为替代，靶细胞可以是患诸如丙型肝炎等感染的细胞、参与炎症过程的细胞、或者需要提供外部提供基因的细胞，诸如糖尿病患者的胰腺细胞可以提供针对胰岛素的功能编码序列。因此，靶细胞可以是期望破坏或期望改变其中指定特性的细胞，通过转移编码序列至该细胞将直接或间接地减少、改善或治疗与该细胞相关的状况。
编码有复制能力的病毒的质粒可用于治疗任何疾病、病况、障碍、感染或炎症。特别是，本发明可用于治疗任何细胞增殖性疾病，诸如癌症；免疫学疾病，诸如SCID；神经细胞紊乱，诸如帕金森病；获得性传染病，诸如丙型肝炎感染和炎症。本领域技术人员应知道可以用基因、特别是基于病毒的疗法治疗的病况和疾病的范围。
此外，本发明可用于免疫接种的目的，例如，质粒编码有复制能力的病毒，并期望产生针对所述病毒的抗体。
除了有复制能力的病毒序列之外，本发明的质粒可以包含质粒骨架。适合的质粒骨架对本领域技术人员是已知的并且在常规教科书中有描述，诸如Sambrook et al.(Molecular Cloning，A laboratory Manual，second edition，Cold Spring Harbor laboratory Press)。质粒骨架优选具有复制起点以允许质粒在细胞培养物中复制。在此上下文中，“细胞培养物”意指其中质粒可增殖和维持的体外细胞培养物，而不是指为治疗意图而对其施用本发明质粒的对象的细胞。通常，细胞培养物是细菌细胞培养物，例如，合适的大肠杆菌菌株，但也可使用包括酵母在内的其它细胞培养物。质粒的复制启点必须是与细胞培养物中的细胞相容的，本领域技术人员应知道如何选择适当的组合。
合适的质粒骨架的例子包括ColE1型质粒，诸如pBR322(可获自，例如TopoGEN，Inc.108Aces Alley Port Orange，FL，USA 32128)，它包含ColE1复制起点；pUC18(GenBank/EMBL登记号L09136)；pUC19(GenBank/EMBL登记号L09137)；包含oriR复制起点的R1质粒(Nordstrm K，Molin S，Light J.Control of replication of bacterialplasmidsgenetics，molecular biology，and physiology of the plasmid R1system.Plasmid.1984 Sep；12(2)71-90.)以及包含pMB1和/或p15A复制起点的质粒。
另一合适质粒骨架的例子是R6K，可获自，例如DSMZ-DeutscheSammlung yon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany。R6K具有α、β和γ三个复制起点以及编码R6K复制所需pi蛋白的pir基因。
依照本发明的质粒可通过将来自合适的有复制能力病毒的序列和来自合适质粒的序列加以组合而构建。作为替代，期望质粒和/或病毒序列可全新合成。
优选的复制起点是在每个细胞内产生高拷贝数目质粒的复制起点，例如，ColE1，以允许在每个宿主细胞内回收大量的质粒，但在一些情况下，低拷贝数复制起点可能是优选的。
质粒骨架还优选包含一个或多个选择标记以便于那些已经用所述质粒转化的细胞的鉴定/选择。适当的选择标记是技术人员公知的。优选的，所述标记是抗生素抗性基因，其赋予针对例如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、博来霉素等的抗性。适当的选择标记的其它例子包括重金属抗性基因和氨基酸生物合成标记物。
质粒可用常规重组核酸技术构建，诸如用限制性内切酶切割期望的核酸片段，并用例如DNA连接酶连接核酸片段。当原本的病毒序列是RNA而希望使用DNA质粒时，能够利用逆转录酶以产生对应于该RNA序列的DNA序列用于载体中。在一些RNA病毒的情况中，可以在质粒构建中使用cDNA序列。质粒构建方法是本领域众所周知的，且可参阅Sambrook，Fritsch and Maniatis，Molecular Cloning，Cold SpringHarbour Laboratory Press。
所述质粒在本发明中直接在体内使用。因此，编码重组的有复制能力的病毒的质粒自身被引入靶生物体内。对上述质粒是“用于治疗”的理解上必须依此解释。其中如本文所述质粒在治疗的背景下产生但不施用于患者的任何方法或用途，例如由于改为施用由所述质粒编码的病毒，这不在本发明的范围内。这样的编码病毒的质粒的递送先前还未设想过，并且胜过先前领域在培养足够滴度病毒用于初始转染事件的繁琐方法。
从另一方面看，本发明提供了编码有复制能力的病毒的质粒，用于在体内生产复制性病毒。
而且，本发明提供了编码有复制能力的病毒的质粒，用于递送治疗性基因至靶细胞/组织/器官。
如先前所提及的，本发明不需要繁琐的病毒颗粒纯化；取而代之的是，用质粒转化需要所述治疗的对象的细胞。在一个实施方案中，可通过以下来生产质粒用质粒转化合适的细胞，通常是细菌细胞；在利于质粒维持和/或复制的条件下培养细胞，并用标准方法从细胞培养物中纯化质粒。然后可以直接使用所述质粒用于转化需要治疗的对象的细胞。此实施方案优选适于RNA病毒。
在本发明的优选适于DNA病毒的另一实施方案中，病毒序列最初插入合适的载体诸如质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、或酵母人工染色体(YAC)中。然后可通过转化合适的宿主细胞(通常是细菌细胞，但在YAC的情况中是酵母)并培养所述宿主细胞产生期望量的这种载体加病毒序列构建体。然后可从细胞中纯化载体加病毒序列构建体并将病毒序列与部分或整个载体分开，例如，通过限制性酶消化或通过使用重组酶。然后可用标准方法，例如凝胶电泳或层析纯化包含病毒序列的期望的核酸分子。然后可将以此方式获得的包含病毒序列的核酸分子用作本发明的质粒。此质粒可以是线性的或环状的。在一些情况下，线性质粒可以是优选的，例如，当病毒天然作为线性核酸分子存在时，例如，腺病毒。优选的，线性核酸分子的末端可以受到保护，例如，通过在转染入对象之前将它们与重组形式病毒的末端结合蛋白TBP偶联。
在另一些情况下，环状质粒可能是优选的，并且任何线性核酸分子可经过处理环化。在这种实施方案中，最初的构建体优选在插入病毒线性序列的末端包含特异性且独特的限制性内切酶或重组酶识别序列(例如，稀有切割的限制性酶，诸如Pme I，或者CRE重组酶的loxP位点)。
因此在另一方面，本发明提供了生产用于治疗的编码有复制能力的病毒的质粒的方法，所述方法包括(a)在宿主细胞中提供包含编码有复制能力的病毒之核酸的载体；(b)培养所述宿主细胞；和(c)回收所述质粒。
在一个实施方案中，所述方法进一步包括(d)切下编码所述有复制能力的病毒的核酸片段；(e)纯化所述片段。
优选的，用于以上方法中的宿主细胞不是包装细胞(包含已整合的野生型病毒基因组序列并且由此提供装配病毒所必需的全部结构元件，但由于缺失包装信号序列psi而不能用衣壳包裹其自身野生型病毒基因组的细胞)。
目标生物可以是非人动物，诸如哺乳动物、鸟、爬行动物或鱼。优选将所述质粒直接用于哺乳动物体内，诸如伴友动物(狗和猫)、牲畜(诸如牛、马、绵羊和山羊)，或者非人灵长类诸如猴和大猩猩。不过最优选的目标生物是人。
利用任何合适的方法将所述质粒转染入细胞内(如上所讨论的，它们自身可以是或者可以不是靶细胞)。因此，所述质粒可通过，例如脂质体转染、电穿孔或弹道式基因转移方法转染入最初细胞内。此外，诱导转染的化学剂也可与质粒一起体内引入。通常转染剂将包括在包含质粒的组合制备物中或者可同时或顺序施加。
因此，本发明另外的方面提供了包含编码有复制能力的病毒的质粒以及转染剂的配制物。如下文所进一步详细讨论的，作为化学品，当使用弹道式基因转染时转染剂可以是丸状的(例如，钨微球)。转染剂包括适于转染使用的载体。合适的转染剂的实例包括可与DNA混合促进其被哺乳动物细胞摄取的脂类化合物配制物，例如Lipofectin、Lipofectamine、Fugene、DOTAP、DMRIE、DC-Chol。这些是技术人员所公知的，并且许多是商品化的。还可使用聚合物诸如聚乙烯亚胺(PEI)、或者含有多阳离子序列适于与DNA静电偶联形成“聚合复合物(polyplexes)”的肽配体。
在通过电穿孔方法进行转染的情况下(其中组织或器官浸于电解液/质粒溶液中并施加约2000伏的电压，在细胞和核膜上打开大孔，然后质粒可通过)，当然更期望参与起始转染事件的细胞是容易进入的。
颗粒轰击方法(又称为“弹道式基因转移”)也可用于以质粒转染初始细胞，其中利用所谓的“基因枪”将质粒偶联的钨微球高速射入细胞和组织内。这样的技术可以容易地体内使用。
作为替代，可通过生理学上可接受的化学转染剂诸如脂质体转染剂将质粒引入体内，所述转染剂可以是以阳离子或胺为基础的。脂质体转染涉及质粒和脂质体复合物经过胞吞作用进入细胞。由于进入细胞的大部分复合物将在溶酶体内降解，因此通常需要转染众多(即，1千，1万，10万)拷贝的质粒，使得有些逃脱溶酶体降解作用并且即使在没有任何主动运输机制的情况下通过总体流动进入核。其它可使用的化学物包括磷酸钙。
此外，还有一种被称为“流体力学转染(hydrodynamictransfection)”的方法，其中大流体体积的质粒溶液高压递送入脉管系统，气压性损伤和质粒与初始细胞较长的接触时间(因为巨大的流体体积需要较长时间流出)的可能组合导致转染水平相对较高。小鼠内适当的流体力学基因递送方法已由Zhang等人于1997年报道。这包括通过27号针从尾静脉输注质粒溶液。在较大的动物和人中，用于流体力学递送质粒至肝的注射还可(a)通过门静脉注射，在此情况下在输注过程期间或之后即刻通过堵塞肝静脉和下腔静脉瞬时阻断出流，或者(b)通过肝静脉注射(通过下腔静脉)，在此情况下在输注过程期间或之后即刻通过堵塞门静脉、腔静脉和肝动脉瞬时阻断出流，或者(c)通过肝动脉注射(通过股动脉和腹主动脉)，在此情况下在输注过程期间或之后即刻通过堵塞肝静脉和门静脉瞬时阻断出流。尽管流体力学转染在上文是关于肝进行描述的，但技术人员应理解同等方法可用于转染身体的其它器官或部分。
此外可包括在配制物中的适当生理学可接受载体或稀释剂是技术人员所公知的。
有可能通过质粒的直接靶向提高转染率和入核率。通常可以在质粒靶向策略中使用质粒-蛋白质偶联物，例如聚赖氨酸。许多研究组已报道了当含有核定位序列的蛋白质与质粒DNA预结合时质粒转染和表达效率提高(例如，已利用高迁移组(HMG)非组蛋白蛋白和转录因子来促进质粒进入核)。
本发明因此涉及在体内直接使用质粒向细胞递送重组的有复制能力的病毒的编码序列，所述质粒任选地掺入了治疗性基因/编码序列。
本发明因此扩及人或动物患者的治疗方法，包括用编码有复制能力的病毒的质粒在体内转染所述患者的细胞。通常病毒基因组将掺入适于治疗患者所患疾病的治疗基因，但作为替代所述病毒自身可以“治疗”患者，例如其中病毒引起转染细胞裂解并由此破坏实体瘤。优选地患者是人。“治疗”包括患者疾病或其一种或多种症状的部分或全部改善。
一旦质粒转染入细胞并且质粒进入核，细胞的转录和翻译体系应开始质粒内所包含编码序列的转录和翻译。一旦质粒进入核，该细胞受到所述质粒编码的病毒的有效感染，当质粒编码序列被宿主细胞体系翻译和转录时病毒生活周期开始。
由于所述质粒编码的病毒是有复制能力的，在生活周期的适当时间点，重组的有复制能力的病毒将从初始转染细胞中释放。在后代病毒释放期间初始转染细胞是否裂解取决于病毒的特性。若病毒是溶胞性的，诸如腺病毒，那么后代病毒的释放将伴随着细胞的裂解。不过，一些病毒无害地在细胞表面出芽，诸如MLV，因此初始转染细胞将继续存活。
因此，初始转染细胞基本上充当体内病毒产生细胞，然后所述病毒被释放以感染其靶细胞，这样这些靶细胞也变成产病毒的。因此，从利用质粒进行的初始转染事件开始，可实现多重转染事件。
可以期望利用控制机制以阻止病毒载体的扩散。可使用被动或主动免疫作为质粒介导病毒治疗的随后步骤，这包括对所涉及的患者提供抗体或病毒疫苗。这样的疗法应终止病毒扩散并提供使对非靶细胞的任何风险最小化的安全保障。抗病毒药物，诸如抗逆转录病毒药物AZT(叠氮基-3′-脱氧胸苷)可容易地终止病毒复制和扩散。如果期望，可将另外的“自杀”基因，诸如那些有关治疗已提及的基因，插入病毒基因组中。作为替代，可依赖外源供给的物质如四环素通过使用四环素诱导型启动子制备关键结构性病毒组分的调节核酸序列。其它这样的诱导型启动子包括雷帕霉素/FK 506-结合蛋白诱导型启动子。因此，一旦外源供给的诱导剂撤消，则病毒扩散被阻止。
在本发明特别优选的实施方案中，所述质粒编码(重组的)有复制能力的逆转录病毒。优选掺入靶向某些细胞类型的核酸序列，因为这会降低或消除天然致病性同时提高靶向特异性。特别优选的逆转录病毒构建体论述于作为参考并入本文中的美国专利US 6,410,313中。
在一个优选的实施方案中，本发明因此提供了编码有复制能力的逆转录病毒的质粒，其包含逆转录病毒GAG编码序列；逆转录病毒POL编码序列；逆转录病毒ENV编码序列；逆转录病毒长末端重复(LTR)序列；和任选地一个或多个以下元件；可操作性连接于调节核酸序列的异源编码序列；用于逆转录病毒细胞或组织特异性靶向的一个或多个靶向序列。
如前所述的靶特异性核酸序列可以是组织或细胞类型特异性启动子或增强子序列，诸如调蛋白(heregulin)启动子序列。它通常放置于病毒基因组的5′和/或3′末端。为了使逆转录病毒靶向特异的靶细胞或组织，可修饰逆转录病毒ENV编码序列以使其进一步包含如前所述的靶特异性配体或结合结构。
由于质粒中提供了衣壳化所需的序列，所以形成的病毒是有复制能力的。
所述质粒因此具有至少三个基因gag、pol和env基因，其侧翼是含顺式作用序列诸如Psi的两个长末端重复(LTR)序列，Psi负责高效地用衣壳包裹病毒RNA，以及基因组逆转录所必需的序列诸如tRNA引物结合位点。
gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白质；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)、蛋白酶和整合酶；env基因编码病毒包膜糖蛋白。5′和3′LTR用于启动病毒粒子RNA的转录和聚腺苷酸化。LTR还包含病毒复制所必需的其它顺式作用序列。慢病毒具有另外的基因，包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx(在HIV-1、HIV-2和/或SIV中)。
组织或细胞特异性调节元件(即增强子/启动子)，如果存在的话，优选与5′和/或3′LTR连接，产生嵌合LTR。
在本文所述的质粒中，异源(通常是治疗性的)编码序列优选处于病毒LTR启动子-增强子信号或内部启动子的调控下。因此，期望的序列可在数个位点插入并服从不同的调节区。例如，插入位点可以是病毒增强子/启动子位点(即5′LTR-驱动的基因座位)。作为替代，期望的序列可插入调节远端位点，例如env基因3′的IRES(内部核糖体进入位点)序列。
因此，在一个实施方案中，依照本发明所用的逆转录病毒质粒包含IRES，所述IRES含有用于所期望核酸序列诸如异源序列的插入位点，优选IRES在逆转录病毒载体内env基因的3′端。因此，异源核酸序列，例如，编码异源多肽的异源核酸序列，可以可操作性的与IRES连接。可以可操作性的与IRES联接的核酸序列的例子是自杀基因，诸如PNP和HSV-胸苷激酶，编码反义分子的序列或编码核酶的序列。
病毒gag、pol和env基因或编码序列可来自任何合适的逆转录病毒(例如来源于MLV或慢病毒，即HIV或MoMLV)。在一个替代实施方案中，病毒ENV基因是非逆转录病毒来源的(例如，CMV或VSV)。env基因可来源于任何逆转录病毒。env可以是允许转导人和其它物种细胞的兼嗜性包膜蛋白，或者可以是只能转导小鼠和大鼠细胞的亲嗜性包膜蛋白。
在一个优选的实施方案中，本发明的质粒包含有复制能力的兼嗜性小鼠白血病病毒(MLV)载体构建体的全部序列。更优选的，它包含有复制能力的兼嗜性小鼠白血病病毒(MLV)载体构建体的全部序列，其中用细胞巨化病毒(CMV)启动子置换5’长末端重复(LTR)U3区，并且将脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点(IRES)-治疗性基因表达盒插入在env基因和3’LTR之间。
此外，可以期望通过将包膜蛋白与抗体或用于靶向特定细胞类型的受体的特定配体相连接使重组病毒靶向目标。如上所提及的，可通过插入例如糖脂或蛋白质使逆转录病毒载体具有靶特异性。靶向经常通过使用抗体使逆转录病毒载体靶向特定细胞类型(例如，在某些组织中发现的细胞类型，或者癌细胞类型)上的抗原来实现。本领域技术人员将知道，或无需过度实验就可容易地确定，完成递送逆转录病毒载体至特异靶标的具体方法。在一个实施方案中，env基因来源于非逆转录病毒(例如，CMV或VSV)。逆转录病毒来源的env基因的例子包括，但不局限于Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV)、Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、人免疫缺陷性病毒(HIV)和劳斯肉瘤病毒(RSV)。其它env基因诸如水泡性口炎病毒(VSV)(蛋白G)、细胞巨化病毒包膜(CMV)或流感病毒血细胞凝集素(HA)也可使用。由此，技术人员在设计用于本发明的质粒中可利用来自不同病毒的不同基因来构建杂合载体。类似的靶向方法适于不同的病毒。
可利用细胞或组织特异性调节核酸序列(例如，启动子)在特异性靶细胞群中靶向表达基因序列。适用于本发明的适当哺乳动物和病毒启动子是本领域技术人员所公知的。因此，在一个优选的实施方案中，本发明提供在病毒基因组的5′和/或3′末端具有组织特异性启动子元件的质粒。优选地，组织特异性调节元件/序列是在逆转录病毒基因组LTR的U3区内，包括例如针对癌细胞的细胞或组织特异性启动子和增强子(例如，肿瘤细胞特异性增强子和启动子)，以及诱导型启动子(例如，四环素)。本发明的转录调控序列还可包括天然与异源基因相连的天然转录调控序列。
一旦质粒转染入初始细胞，且后代病毒释放，重组的有复制能力的逆转录病毒就能进一步感染细胞，优选它们的靶细胞。在细胞被病毒感染后，病毒将其核酸注入细胞且遗传物质可整合入靶细胞基因组内。然后转移的遗传物质在宿主细胞内被转录并翻译成蛋白质。质粒中插入的异源(例如，治疗性)编码序列将转移至靶细胞核并可以整合入靶细胞DNA。
一些种类的逆转录病毒只具有感染分裂细胞的能力，因为它们缺少在任意时间转移其遗传物质通过核膜所必需的信号，因此必须等待核膜在有丝分裂期间溶解。C型逆转录病毒，诸如脾坏死病毒(SNV)是所述病毒的例子。因此，这些是用于递送基因至具有细胞增殖紊乱的靶细胞的优选病毒。这样的紊乱包括任何以异常的细胞数目和活跃的细胞分裂为特征的任何病况。因此，这样的病况包括任何类型的癌症，但该细胞群不必是受到转化的、致肿瘤的或恶性的，而是也可包括正常细胞。细胞增殖可以发生在炎症和感染期间，或者在疾病诸如肝硬化期间发生。某些细胞群体诸如皮肤细胞，持续再生并因此可用只转染分裂细胞的逆转录病毒靶向所述细胞群体。
在不期望增殖事件的情况中，诸如癌症，病毒可递送自杀基因，诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因和大肠杆菌嘌呤核苷酸磷酸化酶(PNP)基因。作为替代，病毒可递送细胞周期的调节因子、抗炎细胞因子诸如白介素、用于识别特定恶性肿瘤相关RNA并将其切割的核酶或者抗血管发生因子。许多合适的治疗性编码序列是本领域技术人员所公知的。应当认为这样的异源编码序列还可通过本文提及的任何病毒运送。
逆转录病毒具有用作病毒DNA产生之模板的RNA基因组。这是通过与RNA基因组一起包装的RNA依赖型DNA聚合酶(逆转录酶)完成的。产生的病毒DNA整合入宿主细胞基因组以提供模板用于经由宿主来源机制的病毒RNA合成。因此，为了产生编码逆转录病毒的DNA质粒，可使用逆转录酶来产生病毒RNA序列的病毒DNA拷贝。这样的DNA序列如果需要可以进行修饰。
在一个特别优选的实施方案中，质粒编码重组的有复制能力的鼠白血病病毒(MLV)，其包含MLV gag编码序列；MLV env编码序列；MLV pol编码序列；包含逆转录病毒基因组5′和3′末端LTR序列的MLV核酸序列；对于在靶细胞中逆转录、包装和整合所必需的顺式作用核酸序列，以及任选地与调节核酸序列可操作性连接的异源编码序列。
基于MLV的基因治疗载体在本领域中已有描述(Logg et al，Journal of Virology，Dec 2002，12738-12791；Logg et al，Journal ofVirology，Aug 2001，6989-6998和Tai et al，Human Gene Therapy14789-802，May 2003)。
现在以以下非限制性的实施例并参考附图对本发明进行进一步的描述，所述附图中


图1是编码有复制能力的MoMLV逆转录病毒的核酸分子的结构示意图；图2是编码有复制能力的逆转录病毒的质粒。有复制能力的逆转录病毒的靶细胞是前列腺癌细胞；图3图3A显示编码有复制能力的逆转录病毒的核酸的一般结构，而图3B显示特定的质粒载体，其指出转基因插入片段的身份与转基因插入片段两端的序列。粗体显示的核苷酸表示env终止密码子的位置。
图4显示质粒pACE-GFP衍生的逆转录病毒载体分别在人结肠直肠癌细胞系WiDr和鼠结肠直肠癌细胞系CT26.WT中以不同剂量接种后的复制曲线。上部组图中的曲线显示在以感染复数(MOI)0.1和0.01(即分别是每10个细胞或每100个细胞有一个感染性纳级载体)起始接种后每三天通过流式细胞仪分析测定的GFP阳性细胞百分数。下部组图显示在接种后指定天数用荧光显微镜获取的感染细胞内GFP表达的代表性图象。
图5显示流体力学注射质粒pACE-GFP(实施例6)后48小时分离的肝脏的GFP荧光经光学成像后的代表性合成图象。左侧显示对照，右侧显示GFP表达。
图6显示如实施例6中所述在第21天(中间图)和第28天(右侧图)分离的肝的GFP荧光经光学成像后的代表性合成图象。左图显示阴性对照。
图7显示pACE-GFP-衍生病毒纳级载体体内复制期间在一系列时间点解剖后对立即收获的分散肿瘤细胞经荧光激活细胞分选(FACS)分析的结果。将每只小鼠最大的肝肿瘤切下，用胶原酶/分散酶(dispase)消化，并立即通过FACS进行分析(每个时间点的n＝4)。曲线图显示了在每个时间点(X轴)肿瘤样品中检测到的GFP阳性细胞百分率(Y轴)。
图8显示对于pACE-GFP-衍生复制病毒整合GFP转基因的PCR分析结果。
实施例实施例1编码逆转录病毒的质粒的构建从质粒pZAP(Soneoka et al，Nucleic Acid Research，23，628-633)(由University of Wisconsin的John A.Young提供)中用NheI切下传染性Moloney MLV前病毒克隆，其中NheI在每个长末端重复(LTR)内切割一次，以消除两侧的大鼠基因组序列，然后再克隆入MLV载体g1ZIN的质粒骨架中以产生质粒pZAP2。用PCR扩增从唯一NsiI位点至终止密码子的env基因区域并与通过重叠延伸PCR(Horton et al，Gene；77，6028 to 6036)扩增自质粒pEMCF的脑心肌炎病毒IRES(Jang et al，J.Virol，62；2636 to 2643，1988)融合，在3′末端引入限制性位点BstBI和NotI。质粒g1ZIN和pEMCF可获自南加州大学的W.French Anderson。
此外还通过PCR扩增了从env终止密码子至3′LTR的3′末端的区域，分别在扩增产物的5′和3′末端引入了NotI和AflIII位点。用三步(three-way)连接将此PCR产物和重叠延伸PCR产物在质粒骨架的的NsiI位点和AflIII位点插入pZAP2中，产生质粒pZAPd。来自质粒pPUR(Clontech)的嘌呤霉素乙酰转移酶基因(pac)、来自质粒pTK-hygro(Clontech)的潮霉素磷酸转移酶基因(hph)和质粒pEGFP(Clontech)的绿色荧光蛋白GFP)cDNA(Cormack et al，Gene 173，33 to38，1996)各自通过PCR扩增并插入pZAPd的BstBI和NotI位点，在与IRES可靠起始密码子相同读码框内，分别生成pZAPdpuro、pZAPd-hygro和pZAPd-GFP。测序验证了PCR产生的所有区域。此外还通过定点诱变产生其中消除IRES-GFP插入片段两侧11-bp重复序列并以MluI位点替换的基于pZAPd-GFP的构建体，并命名为pZAPm-GFP。通过重叠延伸PCR产生其中用来自4070A的兼嗜性包膜替代Moloney MLV亲嗜性包膜的另一构建体，并命名为pAZE-GFP。
实施例2良好制造规范(GMP)级质粒的生产针对临床用途的DNA质粒通常需要以下步骤
-提交关于GMP质粒生产的生物制品主文件供有关管理机构(例如FDA)审阅和批准。
-针对所有的GMP操作设计遵从CFR21(联邦管理法规)和ICH(国际协调委员会)关于活性药物成分之良好制造规范的三联方针的综合标准操作规程(SOP)。
-执行SOP，包括主要计划的确认和关于所有关键设备的确认手续，严格的记录和追踪程序以及对所有引入原材料的全面质量检验(U.S.Pharmacopoiea(USP)或同等级别的成分和试剂)，审核对所有供应商的查账清单，参与GMP过程的所有员工的全面培训程序，等等。
-Per SOP，主细胞库(Master Cell Bank)和制造工作细胞库(Manufacturers Working Cell Bank)的生产(这由以下组成，生成已用目的质粒转化并证实复制该质粒且将其稳定保持的克隆化大肠杆菌细菌储备物；主细胞库是初始储备物，它随后被冷冻保存，而工作细胞库则由来自主库用于实际生产的等分试样组成)。
-GMP生产前专门设计用于放大和法规遵从的的定制纯化方法的工艺优化和开发。
-放大生产工艺包括以逐渐增大的培养规模扩增工作细胞储备物(它已被证实产生所述质粒)，直至达到期望的合成规模。
-对于质粒纯化，离心沉淀细菌，去除上清培养基，用化学物/去垢剂裂解破坏细菌细胞壁，分离并纯化质粒组分，通常通过溶剂分级分离和差速离心，或者更通常是通过树脂吸附并洗脱或柱层析来实施。
-终产物应进行QC检验并至少符合以下标准，每一批次都记录有分析证书低水平的残留内毒素(＜1EU/mg质粒)低水平的宿主细胞染色体DNA(＜1％)低水平的RNA低残留蛋白质低残留溶剂主要是共价闭合环状(超螺旋)质粒(＞95％)(在此具体实验中)实施例3经电穿孔的质粒体内转染利用电极阵列的肿瘤电穿孔将B16细胞皮下注射入小鼠(雌性，5-6周龄)侧腹。除非另外指定，注射106个细胞，4天后，生成平均体积75mm3的肿瘤。将质粒DNA(5.5pmol)稀释于50微升K-PBS(30mM NaCl，120mM KCl，3mM Na2HPO4，1.5mM KH2PO4，5mM MgCl2)中并使用27号针的注射器经皮肤注射入肿瘤。用装备0.5cm直径阵列7针电极的电穿孔仪CUY21(Tokiwa Science，Tokyo，Japan)对肿瘤进行脉冲。在针阵列电极中，一个中央针被6个针环绕。电流经过位于正中的针向周围的针传递，或者以相反方向传递。6个方波脉冲以1s-1的频率递送，脉冲时长100ms，电压50V。三个脉冲后进行相反极性的另外三个脉冲。
用于在转基因小鼠生成中产生基因修饰精子的睾丸电穿孔ICR品系和[C57BL/6□DBA/2]F1小鼠购自SLC，Japan。出生后14天的ICR品系小鼠用戊巴比妥钠溶液麻醉，并将睾丸放于解剖显微镜下。将微量吸管插入睾丸网中用于向生精小管中注射。在每个睾丸中注入约6-10μl的DNA/HBS溶液(100-120μg/ml)。用电脉冲发生器(Electrosquare Porator T820，BTX，USA)输送电脉冲。将睾丸保持在一对镊状电极之间，施加四次方形电脉冲，然后再以相反方向施加四次。每个脉冲在30-50V持续50ms。
实施例4用弹道式基因转移进行质粒转染用于DNA疫苗接种的皮肤基因转移用氦驱动的基因枪(Bio-Rad，Hercules，CA)依照制造商提供的方案实施基因枪颗粒介导的DNA疫苗接种。简而言之，通过将25mg的1.6μm金微载体(Bio-Rad，Hercules，CA)和100μl的0.05M亚精胺(Sigma，St，Louis，MO)结合制备DNA包裹的金颗粒。在用涡漩混合的同时顺序加入质粒DNA(50μg)和1.0M CaCl2(100μl)。让该混合物在室温沉淀10分钟。然后将微载体/DNA悬液离心(10,000rpm 5s)并用新鲜无水酒精洗三次，接着重悬于3ml溶于无水酒精的聚乙烯吡咯烷酮(0.1mg/ml；Bio-Rad，Hercules，CA)中。然后将溶液加到管子中使其静置4分钟。轻轻去除乙醇，通过旋转管子使微载体/DNA悬液均匀附着于管子的内表面。然后通过0.4升/分钟的流动氮气吹干管。然后将包被微载体/DNA的干燥管子切成0.5-英寸模块(cartridge)并在4℃贮存于加帽的干燥瓶中。结果，每个模块包含1μg质粒DNA和0.5mg的金。用氦驱动的基因枪(Bio-Rad，Hercules，CA)以400p.s.i的排出压力将DNA包裹的金颗粒(1μg DNA/弹)递送至小鼠的去毛腹部区域。
实施例5流体力学基因转移流体力学转染进入小鼠肝脏在如早前所报道(Zhang et al.，1997)的最优表达条件下通过门静脉或肝静脉(通过下腔静脉)进行肝脏的直接注射。最优条件需要注射溶于含15％甘露醇(Sigma，St.Louis，MO)和肝素(2.5单位/ml；Lypho-Med，Chicago，IL)的1ml生理盐水(0.9％NaCl)中的pDNA(质粒DNA)。对于门静脉注射，通过堵塞肝静脉和下腔静脉来阻断流出。对于肝静脉注射，通过堵塞门静脉、腔静脉和肝动脉来阻断流出。在7-120秒内通过用27号针注射溶于1-3ml Ringer溶液(147mM NaCl，4mM KCl，1.13mM CaCl2)的10-250微克pDNA进行尾静脉的注射。
实施例6.通过流体力学注射入小鼠肝脏的方式进行转染引发的纳级载体传播(TNT)6.1质粒pACE-GFP质粒pACE-GFP包含有复制能力的兼性小鼠白血病病毒(MLV)载体构建体的全序列，其中已经用细胞巨化病毒(CMV)启动子替换了5’长末端重复(LTR)U3区，并且在env基因和3’LTR之间插入脑心肌炎病毒内部核糖体进入位点(IRES)-绿色荧光蛋白(GFP)表达盒。质粒骨架包含大肠杆菌的复制起点和氨苄青霉素抗性基因。下文给出了pACE-GFP的全序列，其中G＝病毒mRNA的转录起始位点(TSS)。这代表Moloney小鼠白血病病毒(MLV)序列的开始。
TSS定为MLV基因组序列的位置1，那么5′长末端重复(LTR)R/U5区＝1至145gag多蛋白序列＝621至2237pol多蛋白序列＝2238至5837加下划线＝兼性MLV 4070A包膜编码序列3’LTR＝7816至8332A＝MLV序列的末端剩余序列包含大肠杆菌复制起点和氨苄青霉素抗性基因的质粒骨架TTTGAAAGACCCCACCCGTAGGTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTCAGGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGAACAGCTGAATATGGGCCAAACAGGATATCTGTGGTAAGCAGTTCCTGCCCCGGCTCAGGGCCAAGAACAGATGGTCCCCAGATGCGGTCCAGCCCTCAGCAGTTTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGGGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCATTTGGGGGCTCGTCCGGGATCGGGAGACCCCTGCCCAGGGACCACCGACCCACCACCGGGAGGTAAGCTGGCCAGCAACTTATCTGTGTCTGTCCGATTGTCTAGTGTCTATGACTGATTTTATGCGCCTGCGTCGGTACTAGTTAGCTAACTAGCTCTGTATCTGGCGGACCCGTGGTGGAACTGACGAGTTCGGAACACCCGGCCGCAACCCTGGGAGACGTCCCAGGGACTTCGGGGGCCGTTTTTGTGGCCCGACCTGAGTCCAAAAATCCCGATCGTTTTGGACTCTTTGGTGCACCCCCCTTAGAGGAGGGATATGTGGTTCTGGTAGGAGACGAGAACCTAAAACAGTTCCCGCCTCCGTCTGAATTTTTGCTTTCGGTTTGGGACCGAAGCCGCGCCGCGCGTCTTGTCTGCTGCAGCATCGTTCTGTGTTGTCTCTGTCTGACTGTGTTTCTGTATTTGTCTGAGAATATGGGCCAGACTGTTACCACTCCCTTAAGTTTGACCTTAGGTCACTGGAAAGA
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6.2体外测试图4显示了在以不同剂量接种后质粒pACE-GFP-来源逆转录病毒载体分别在WiDr人结肠直肠癌细胞系和CT26.WT小鼠结肠直肠癌细胞系中的复制曲线。上方图中曲线显示了以0.1和0.01(即，分别是每10个细胞或每100个细胞一个感染性纳级载体)的感染复数(MOI)初始接种后每三天用流式细胞术分析测定的GFP阳性细胞百分率。下方图显示了在接种后指定天数用荧光显微镜获取的感染细胞内GFP表达的代表性图像。
6.3结肠直肠癌向肝脏转移的小鼠模型的建立为了证明使用流体力学转染作为递送质粒至体内肿瘤用于起始复制性病毒传播的方法，通过脾内注射肿瘤细胞来建立结肠直肠癌向肝脏转移的小鼠模型。小鼠结肠腺癌细胞系CT26，最初来源于Balb/c小鼠，可获自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(Manassas，VA，USA)，在含5％CO2的潮湿空气中保持于含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的RPMI 1640培养基中。为了建立肿瘤，在经异氟烷麻醉并进行左肋骨下切开后，将配制于200μl PBS中的CT26肿瘤细胞(5×10e4个细胞)通过30号针注射入6周龄的雌性Balb/c小鼠的脾。止血5分钟后，进行脾切除并用创缘夹闭合切口。
当然，其它合适的细胞系也可应用于适当宿主(适于来自相同株系和物种之肿瘤的有免疫能力的同源宿主，或适于来源于异源株系或异种物种之肿瘤的无胸腺免疫缺陷宿主)的此类型肿瘤模型中。
6.4体内转染肿瘤接种两周后，将30μg pACE-GFP质粒与TransIT-QR(QuickRecovery)流体力学递送溶液(Mirus Bio Corp.，Madison，WI，USA)混合，每只小鼠每克体重总体积为0.1ml(例如，对于体重20g的小鼠，每只小鼠总体积为2.0ml)。在如前所报道(Zhang et al.，1997)的基因表达最优条件下进行此质粒DNA溶液的流体力学注射，要求总体积通过置于尾静脉的27号针在4至7秒内以恒定速率输注。
转染引发病毒复制后GFP表达的分析在施用质粒后的多个时间点，在无菌条件下切下肝脏并用Xenogen-IVIS冷CCD光学成像系统(Xenogen IVIS，Alameda，CA，USA)显现肿瘤中的GFP荧光。用Living成像软件(Living Image Software)(Xenogen)和IGOR-PRO成像分析软件(Wave Metrics，Lake Oswego，OR，USA)生成由所分离器官的灰度背景摄影图像和发射荧光的颜色重叠图像组成的合成图像。
图5显示在上述右图有关pACE-GFP的条件下流体力学注射质粒pACE-GFP后48小时来自分离肝脏的GFP荧光经光学成像后的代表性合成图像。有趣的是，流体力学注射似乎导致了相较于正常肝实质而言多病灶CT26肿瘤的优先转染(显现为包埋于暗色正常肝组织背景中的白色区)，可能是由于新形成的肿瘤新脉管系统中存在较大的并且更易“泄漏的”缝隙。作为介质对照，还平行进行了未添加质粒DNA的TransIT-QR溶液的流体力学注射；此转染显示出没有可检测到的GFP荧光信号(左图，对照)。右边的色标显示在每秒每cm2的荧光信号光通量的相对强度。
图6显示来自第21天和第28天所分离肝脏的GFP荧光光学成像后的代表性合成图像，在此时间点来自转染质粒的GFP直接表达应完全受到抑制；因此，所有的GFP荧光应来自正复制的逆转录病毒纳级载体(中间和右侧图，分别是第21天和第28天的ACE-GFP)。可以观察到，随着时间增加在很多肿瘤团块中由于复制病毒载体传播GFP转基因所造成的GFP扩散增加。右侧色标显示每秒每cm2荧光信号光通量的相对强度，它比前图中的高10倍；这表明相比较于初始质粒转染，不只是区域，而且GFP转基因表达的总强度也随时间增加。作为介质对照，如上进行流体力学注射未添加质粒DNA的单独TransIT-QR溶液后所分离肝脏的光学成像；仍然没有可检测到的GFP荧光信号(左图，对照)。
图7显示在体内pACE-GFP来源病毒纳级载体复制期间一系列时间点解剖后立即收获的分散肿瘤细胞的荧光活化细胞分选仪(FACS)的分析结果。切下每只小鼠最大的肝肿瘤，用胶原酶/分散酶消化，然后立即用FACS分析(每个时间点的n＝4)。曲线图显示，在每个时间点(X轴)检测到的肿瘤样品中GFP阳性细胞的百分率(Y轴)。同样，结果证明了GFP转基因随时间增加通过复制病毒在肿瘤实体中被有效传播。
图8显示pACE-GFP-来源的复制病毒整合GFP转基因的PCR分析结果。对于GFP转基因的特异性引物，其序列正常不存在于小鼠基因组中，用于PCR扩增分离自小鼠肝脏的CT26肿瘤或荷瘤小鼠中各种正常组织(如所标记)的基因组DNA。未转导的肿瘤也作为阴性对照(标记为“肿瘤(阴性)”进行扩增。上图显示直接从以不同拷贝数(如所示)与基因组DNA混合的pACE-GFP质粒来PCR扩增GFP序列的标准曲线。下图显示用另一套特异性引物作为内部对照扩增内源小鼠β-肌动蛋白基因序列(500bp带)，以确认基因组DNA样品和PCR流程的完整性。结果显示只在来自于正发生pACE-GFP-来源病毒复制的肿瘤基因组DNA中可扩增到GFP特异性的强而可靠(robust)的信号(700bp带)；相比之下，初始质粒DNA转染自身只是短暂性的并且从未导致如此高水平的整合入基因组DNA中。
权利要求
1.用于治疗的编码有复制能力的病毒的质粒。
2.根据权利要求1的质粒，其用于治疗细胞增殖性疾病、免疫学疾病、神经紊乱、获得性感染和/或炎症。
3.根据权利要求2的质粒，其中所述疾病选自癌症、SCID、帕金森病、丙型肝炎感染和/或糖尿病。
4.根据权利要求1至3中任一项的质粒，其中所述有复制能力的病毒是逆转录病毒。
5.根据权利要求4的质粒，其中所述有复制能力的逆转录病毒包含逆转录病毒GAG编码序列；逆转录病毒POL编码序列；逆转录病毒ENV编码序列；逆转录病毒长末端重复(LTR)序列；和任选地以下元件的一种或多种与调控核酸序列可操作性连接的异源编码序列；用于逆转录病毒的细胞或组织特异性靶向的一个或多个靶向序列。
6.根据权利要求1至5中任一项的质粒，其中所述质粒包含治疗性基因和/或编码序列。
7.根据权利要求6的质粒，其中所述治疗性基因和/或编码序列可操作性连接至对所述治疗所靶向的细胞具有特异性的启动子和/或增强子。
8.根据权利要求1至5中任一项的质粒，其中所述有复制能力的病毒是裂解病毒。
9.根据权利要求8的质粒，其中所述裂解病毒是腺病毒。
10.根据权利要求1至9中任一项的质粒，其中所述病毒的向性被增强或改变。
11.根据权利要求1至10中任一项的质粒，其中用于将所述质粒递送至需要治疗的对象的方法是流体力学转染。
12.一种包含根据权利要求1至9中任一项的质粒以及转染剂的配制物。
13.一种生产用于治疗的编码有复制能力的病毒的质粒的方法，所述方法包括(a)在宿主细胞中提供包含核酸的载体，所述核酸编码有复制能力的病毒；(b)培养所述宿主细胞；和(c)回收所述质粒。
14.一种治疗人或动物患者的方法，其包括用编码有复制能力的病毒的质粒对所述患者的细胞进行的体内转染。
15.根据权利要求14的方法，其中所述病毒基因组中并入适于治疗患者所患病况的治疗性基因或编码序列。
16.根据权利要求15的方法，其中所述病况选自包含以下的组细胞增殖性疾病、免疫学疾病、神经紊乱、获得性感染和炎症。
全文摘要
本发明提供编码有复制能力的病毒的质粒，其用于治疗的用途，更具体地用于治疗细胞增殖性疾病、免疫学疾病、神经紊乱、获得性感染和炎症的用途，以及包含这种质粒与转染剂的配制物。
文档编号A61K48/00GK101065492SQ200580040285
公开日2007年10月31日 申请日期2005年11月23日 优先权日2004年11月24日
发明者笠原典之 申请人:纳诺非科特有限公司