专利名称：在植物中生物安全的瞬时蛋白质表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用瞬时表达在植物中产生重组蛋白的生物安全的方法，其中所述瞬时表达基于农杆菌(Agrobacteria)递送至靶植物内的植物病毒载体。本发明还涉及在靶宿主植物或植物叶中表达目的序列的方法。本发明描述农杆菌属(Agrobacterium)介导的病毒载体递送在整株植物或植物部分中提供目的蛋白质高产量大规模产生的用途。本发明的方法使通过农杆菌属介导递送的瞬时表达限定于所述植物宿主内，同时控制非目的生物的转化。本发明还涉及用于在植物或在植物叶中表达目的序列的生物安全的农杆菌。本发明提供在植物中高产量工业化的蛋白质产生并具有提高的生物安全特点。
背景技术：
目前，植物生物技术依赖于两种在植物中递送和表达外来基因的方法稳定的遗传转化和瞬时表达。后者可以基于农杆菌浸润法或病毒感染建立(综述参见Fischer等，1999，Biotechnol.Appl.Biochem.，30，113-116)。可通过利用在驱动目的基因表达的组成型启动子例如35S启动子控制下的标准表达盒农杆菌浸润植物组织(Vaquero等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，96，11128-11133)或大规模地用病毒载体转染植物实现瞬时表达。通常，农杆菌浸润法并不提供高产量，但在联合转录后基因沉默(PTGS)抑制子如p19或HcPro时，蛋白质表达水平可提高达50倍(Voinnet等，2003，Plant J.，33，549-556)。这仍旧远低于借助病毒表达系统可以达到的生物极限(Marillonnet等，2004，Proc.Natl.Acad.Sci. USA.，101，6852-6857)。在US6,740,526中描述了基于利用农杆菌浸润法在植物组织中瞬时表达重组目的蛋白质的生物反应器。然而，该专利未说明如何提高待表达蛋白质的产量，即该专利并没有优于本领域内其它已知的方法(Vaquero等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci. USA.，96，11128-11133)。一种瞬时表达的更有效方法是使用病毒载体。已证实基于TMV的报告基因(GFP或DsRed)表达可以达到系统的生物产量极限，产生每克新鲜叶生物量几微克的重组蛋白(Marillonnet等，2004，Proc.Natl.Acad.Sci. USA.，101，6852-6857)。该系统的相对产量可以达到TSP的80％，因此极大地方便下游加工并降低其成本。由于病毒诱导关闭宿主蛋白质生物合成，故如此高的相对产量是可能的。
显而易见病毒载体可以提供比农杆菌浸润法中所用的常规载体更高的表达水平(综述参见Porta和Lomonossoff，1996，Mol. Biotechnol.，5，209-221；Yusibov等，1999，Curr.Top.Microbiol.Immunol.240，81-94)并且是功能基因组研究的有力工具(Dalmay等，2000，Plant Cell，12，369-379；Ratcliff等，2001，Plant J.，25，237-245；Escobar等，2003，Plant Cell，15，1507-1523)。本领域众多出版物和专利描述了基于DNA病毒载体和RNA病毒载体的系统(Kumagai等，1994，Proxc.Natl.Acad.Sci.USA.，90，427-430；Mallory等，2002，Nature Biotechnol.20，622-625；Mor等，2003，Biotechnol.Bioeng.，81，430-437；US5316931；US5589367；US5866785；US5491076；US5977438；US5981236；WO02088369；WO02097080；WO9854342)。现存的病毒载体系统就最佳性能而言通常受限于狭窄的宿主范围，并且此类载体即便在其最有利宿主中的表达水平仍远低于系统的生物上限。基于病毒的系统中的一个重要议题是向植物细胞中递送病毒复制子的方法。大规模生产应用最广泛应用的递送方法(在众多植物中同时产生，例如在农田或温室内)是使用RNA病毒载体的感染性拷贝(Kumagai等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，92，1679-1683)。由于重组RNA病毒载体在其复制循环期间丢失异源性插入物的倾向相对高，故这种方法需要体外(in vitro)转录DNA模板，因而效率低且花费高。
虽然更为快捷，但是瞬时途径因病毒的低感染性、不能转染大部分植物体以及基因大小的限制而极其受限。存在描述农杆菌浸润法向植物细胞中递送感染性病毒载体的用途的公开(Liu和Lomonossoff，2002，J.ViroL.Methods，105，343-348)或描述从农杆菌属递送的病毒载体组分中装配出病毒载体的公开(Marillonnet等，2004，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，101，6852-6857)。然而，这些公开并未说明病毒复制子在农杆菌浸润的组织中的每一植物细胞内的效率和同步形成问题，并且载体进一步扩散取决于病毒从细胞至细胞的运动能力和系统运动能力。这种运动需要相对长的时间并且病毒载体通常在感染后大约10-14天后提供该载体的最高可能产量。对于产生强烈干扰植物细胞过程的重组蛋白而言这不可接受，尤其是高度细胞毒性的蛋白质如限制性酶、蛋白酶、非特异性核酸酶、众多药用蛋白质。相反，通过农杆菌浸润法递送的标准载体在农杆菌递送后3-4天内达到载体的可能最高表达水平，然而这种载体提供的产量低得不可接受。因此，我们面临因受组成型启动子驱动以表达目的蛋白质的标准转录性载体低效率所致的问题，尽管这些载体提供了在农杆菌浸润的植物组织中几乎每个细胞内的目的基因表达，并且反之亦然，农杆菌递送的病毒载体能够提供高表达水平，但是几乎不启动复制，因此在大部分细胞中并不提供表达，而只在一小部分(小于农杆菌浸润的所有组织的1％)细胞中提供表达。因此，此类基于病毒的载体需要明显(3-4倍)较长的提供表达的时间，但是系统产率仍低于理论可能达到的产率，尤其是表达细胞毒性蛋白质时。由于病毒载体不在农杆菌浸润的组织中提供同步表达，因此影响产量，尤其细胞毒性基因待表达时，这是在瞬时表达系统中使用病毒载体时的严重缺陷。而且，感染的植物宿主在其大部分组织中不含病毒载体，因而将组织排除于产生方法之外。此外，实现病毒载体在感染植物的最佳可能扩散(和表达水平)需要的时间比标准农杆菌浸润方案长3-4倍。再者，已描述用于瞬时表达的系统中没有一个系统解决了系统生物安全性提高的问题，该问题是涉及利用遗传工程生物工业规模地生产蛋白质中的一个关键要素。
虽然本领域中存在众多公开，包括要求授予专利的技术，但是仍没有以足够高的效率和产量用于商业性高产量生产的基于病毒的大规模生产系统，这主要在于两大主要原因首先，基于植物病毒的瞬时表达系统通常受限于特定宿主，这些宿主可能由于易受环境因素影响而不适于大规模栽培。另外，瞬时表达通常局限在植物宿主的特定部分内，因此将大部分植物生物量排除于产生方法之外，并且因而使重组产物对每单位植物生物量的相对产量水平减至最小至与常规转录启动子在转基因植物中能够实现的水平可比；其次，通过产生在每个细胞内稳定整合病毒复制子前体的转基因植物宿主以放大基于病毒的生产系统的尝试仍没有提供解决办法，尤其因为所述复制子在所述位置中性能低下、待表达目的基因从所述复制子上“泄漏”以及缺乏针对所述载体的高效开关系统(switch system)。通过利用PTGS沉默作用阻遏物作为RNA复制子形成的触发物在基于PVX的载体上实现某些进展(Mallory等，2002，Nature Biotechnol.，20，622-625)，但是因没有提供对触发病毒载体复制的开关(PTGS阻遏物)高效控制的解决办法，该系统的实用价值很低。然而，该系统提供了占总可溶性蛋白质(TSP)3％的GUS基因表达水平，这是该型系统迄今已知的最佳水平，但仍未超过强启动子控制下的常规转基因表达系统。基于植物三联RNA病毒雀麦草花叶病毒(Brome Mosaic Virus，BMV)的另一个可诱导系统(Mori等，2001，Plant J.，27，79-86)产生与标准转录启动子所提供产量可比的极低产量(3-4μg/每克鲜重)的目的蛋白质。
迄今植物表达系统所达到的低表达水平是为什么这些系统难以同其它表达系统如细菌、真菌或昆虫细胞表达系统竞争的一个主要原因。低表达水平导致在植物物质庞大背景下分离和纯化蛋白质的极高下游成本。因此当每单位植物生物量的目的蛋白质产量或目的产物产量提高时，下游加工成本迅速下降。
目前没有这样的大规模植物瞬时表达系统，其产量和效率高到足以在市场上与其它大规模表达系统如细菌、真菌或昆虫细胞表达系统竞争。这种植物表达系统应当尽可能好地符合如下标准(i)高产量，包括在尽可能多的植物组织中和在所述组织尽可能多的细胞内表达目的蛋白质；(ii)为阻止蛋白质表达对植物细胞存活的致死效应，目的蛋白质或目的产物的表达应当在处理的植物或植物组织内的全部细胞中同时开始。
一般，目的蛋白质或目的产物在产生该产物或蛋白质的每个细胞内聚积直至某特定时间点。然而聚积期间，可降低目的蛋白质或目的产物产量或质量的降解过程常常启动。因此，在启动表达后存在一个最适时间点，此时应当收获目的产物或目的蛋白质。最适时间点应当在植物的全部组织或细胞或在所选择田地内的全部植物中同时达到，从而使该方法在整体上高效并有利可图；(iii)该系统应当包括提高的生物安全特点，如用于农杆菌浸润法的农杆菌应当具有至少一个如下特点在开放环境中的低生存率或零生存率、对非靶生物或非靶植物的低感染性或零感染性。
因此，本发明的目的是提供在植物系统中表达蛋白质的方法，该方法可放大至大规模应用，产生高产量的待表达蛋白质，与此同时由于外来DNA转染或转化非靶生物的低概率，因此是生物安全的。
发明概述本发明的目的通过在靶植物或靶植物叶内自目的序列瞬时表达目的蛋白质而产生所述目的蛋白质的方法来实现，其中所述方法包括通过以农杆菌属菌株在互补性因子存在或不存在时浸润所述植物或所述植物叶而转染该植物或该植物叶，所述农杆菌属菌株包含位于T-DNA中的具有编码复制子的序列部分的异源DNA序列，其中编码复制子的所述序列含有(i)对所述复制子的复制子功能必需的衍生自植物病毒的序列，和(ii)待表达的所述目的序列，其中向所述农杆菌属菌株提供了使此农杆菌属菌株在所述互补性因子不存在时对所述T-DNA转染包括所述植物或所述植物叶在内的生物呈缺损的第一遗传修饰。
本发明还提供了多组分的试剂盒(kit of parts)，其包含(i)如上所述的农杆菌属菌株和
(ii)编码能互补如上所定义农杆菌属菌株缺损的互补性因子的植物或其种子。
本发明还提供了多组分的试剂盒，其包含(i)如上所述的农杆菌属菌株和(ii)编码能互补如上所定义农杆菌属菌株缺损的互补性因子的第二农杆菌属菌株。
本发明还提供用于本发明方法的农杆菌属细菌，所述细菌表征为(i)具有使所述细菌在互补性因子不存在时向植物或植物叶的细胞内导入T-DNA所需的功能缺损的第一遗传修饰，(ii)在向其它细菌转移质粒的接合能力上缺损，和(iii)对所述农杆菌属生长所需的必需代谢物呈自养性。
根据自然界中的一般原则，难以同时改进系统中两个或多个冲突的特性，因为改进一个特性将不利地影响另一个特性并且反之亦然。在基于植物的蛋白质表达系统中，难以实现获得待表达蛋白质的高表达水平而同时获得高生物安全性，因为高表达效率倾向使系统的选择性较弱，因此使生物安全性较低。例如，假如为获得高效表达系统而使在感染植物中所用的农杆菌属菌株具有高度感染性，则该农杆菌属菌株很有可能转染非靶植物并将重组的T-DNA向环境中扩散，而这是应当避免的。从另一个角度看，若通过使该农杆菌属菌株具有较低感染性而改进生物安全性，则会削弱在靶植物中的转染效率和表达效率。因此，生物安全性和表达效率就是这种冲突的特性。
如果基于植物的蛋白质表达系统应适于大规模应用-即在众多植物或众多植物叶中同步表达，则对该系统的要求变得更复杂。从一方面看，因为转基因生物向开放环境中逃逸的可能性较高，故生物安全性在大规模应用中更重要。从另一个方面看，在大规模应用中蛋白质高表达效率和高产量对于实现具有经济竞争力的方法是必需的。
本发明首次提供了手段用于创造大规模、高效率和生物安全地产生目的蛋白质的方法。在本发明方法中，目的蛋白质从植物或植物叶中的目的序列上得到瞬时表达。通过瞬时转染所述植物或所述植物叶实现瞬时表达。术语“瞬时转染”意指完成所述异源DNA序列的导入而不选择在植物染色体内稳定整合该异源DNA序列的转染细胞。所述目的序列编码所述目的蛋白质。使用能够向植物细胞中导入外来DNA的所述农杆菌属菌株往所述植物或所述植物叶内导入所述目的序列。该目的序列对衍生所述复制子的所述植物病毒而言是异源的，即本发明的方法不包括向植物或植物叶内转化野生型植物病毒的情况。因所述DNA序列含有异源目的序列，故所述DNA序列是异源的。优选地，所述目的序列不是所述农杆菌属菌株本身的序列。
所述植物或植物叶用所述农杆菌属菌株瞬时转染。应当如此转染该植物或植物叶以至在一个工作步骤中转染该植物的多个细胞和多种组织。这最好通过农杆菌浸润法完成，不过还可以应用允许转染所述植物或所述植物叶的主要部分的其它方法。因此，优选通过所述农杆菌属菌株浸润所述植物或所述植物叶而瞬时转染该植物或该植物叶。鉴于所述浸润法对本系统的效率贡献显著，故该浸润法是本发明的重要组成。系统效率越高，表达所述目的蛋白质的细胞越多并且更好地使表达在多种组织和细胞中同步启动。浸润法允许在一个工作步骤中转化所述植物或所述植物叶中的多个细胞，由此使得在所述植物的多种植物组织和多个部分中启动所述目的蛋白质表达的时间点基本同步。此外，浸润法大幅度地提高转化所述植物或所述植物叶中的大部分细胞的概率。转染和表达不再依赖所述复制子在该植物或在该植物叶中的远距离运动，尽管该复制子远距离运动的能力可能进一步提高总效率。
本发明的方法设计向植物大规模应用，即用于向众多植物平行地实施。在本发明方法中，优选地用所述农杆菌属菌株同时转染至少5株、更优选地至少10株、更优选地至少30株、甚为优选地至少100株并且最优选地至少1000株植物。
如果用整株植物实施本发明的方法，对所述植物的几个部分实施转染(优选地是浸润)，例如转染或浸润大部分的叶。优选地，转染或浸润全部叶。更优选地，转染或浸润植物的全部叶和茎。应当转染或浸润今后收获用来分离目的蛋白质的全部组织。通常无需浸润根，尽管根内的表达和收获可进一步提高系统总效率。整株植物或至少那些在土壤上面的部分可以通过将该植物颠倒地在所述农杆菌属菌株的混悬液中浸泡、施加真空随后快速解除真空进行浸润。这种方法可以放大并且依次或同时应用于多个植物。
若用植物叶实施本发明的方法，可对所述叶的超过一个扇形面实施浸润。优选地，将所述农杆菌属菌株的混悬液向叶喷洒或将叶浸泡其中，随后优选地向叶组织内压入或吸入农杆菌属细胞。优选地，本发明使用的所述植物叶与植物附着。优选地，本发明的方法不在植物组织培养物中实施。
可将浸润法或农杆菌浸润法定义为使用农杆菌混悬液的转染方法，在该方法中使用压力差将农杆菌压入植物组织(细胞间隙)。
备选地，如同递送病毒粒子那样，可通过使用高压喷洒装置向植物喷施农杆菌混合物及磨料而将农杆菌递送植物组织内(Pogue等，2002，Annu.Rev.Phytopathol.，40，45-74)。
向所述农杆菌属菌株提供了使所述农杆菌属菌株在互补性因子不存在时对用所述T-DNA转染生物呈缺损的第一遗传修饰，其中所述互补性因子是本发明中用来提高生物安全性的必需成分。所述生物是不想用所述异源DNA序列转染的生物(“非靶生物”)。非靶生物尤其是植物和微生物如细菌或真菌。当所述互补性因子不存在时，本发明的植物种也是非靶生物。当所述互补性因子不存在时，农杆菌属菌株对感染和转染此类非靶生物呈缺损，优选地不能感染和转染此类非靶生物。
选择所述农杆菌属菌株、所述植物(或所述植物叶)以及所述互补性因子以便允许在所述农杆菌属菌株感染所述植物后转染和/或表达所述目的序列，而不可能发生非靶生物的转染和/或表达。通过所述农杆菌属菌株的遗传修饰使所述农杆菌属菌株对转染非靶生物呈缺损，优选地不能转染非靶生物，如下将该遗传修饰称为所述第一遗传修饰。
所述第一遗传修饰优选地使所述农杆菌属菌株在向所述植物或植物叶的细胞内导入T-DNA的功能上缺损。这可以通过对编码转染靶生物时所需功能的农杆菌基因缺失或破坏而实现。尤其在Ti质粒上编码此类功能，例如在携带向所述植物或植物叶的细胞中待导入所述T-DNA的Ti质粒中。此类基因的实例是农杆菌基因VirE2、GALLS和VirF。
在另一个实施方案中，所述第一遗传修饰使所述农杆菌属菌株具有自养性，其中该农杆菌属菌株的生长依赖外界添加的代谢物。在外界添加的代谢物不存在时，该农杆菌属菌株对用所述T-DNA转染生物呈缺损。
在又一个实施方案中，作为所述第一遗传修饰，将所述农杆菌属菌株转染所述生物时需要的功能置于化学调节的异源启动子控制下。此类基因的实例可以是例如受lac启动子控制的农杆菌基因VirE2、GALLS和VirF。在该实施方案，所述互补性因子是能够调节所述化学调节启动子的小分子化合物。在为lac启动子的情况下，互补性因子可以是IPTG或乳糖。施用于所述植物或所述植物叶的农杆菌混悬液还可以含有所述的小分子化合物如IPTG或乳糖以便能感染所述植物并且优选地向所述植物的细胞中导入所述T-DNA。
在另一个实施方案，所述第一遗传修饰使所述农杆菌属菌株具有条件致死性，并且所述互补性因子是对所述农杆菌属菌株存活时需要的必需代谢物。
可以组合以上提及的实施方案。例如，如果所述农杆菌属菌株在向所述植物或植物叶的细胞内导入所述T-DNA时所需的功能缺损，则该菌株额外地可以具有自养性和/或条件致死性以提高系统生物安全性。
所述互补性因子提供由所述第一遗传修饰所缺损的功能。在该互补性因子存在时，所述T-DNA通过所述缺损性农杆菌属菌株转染所述植物或植物叶的细胞得以重新建立。该互补性因子可以是小分子化合物或根据第一遗传修饰可以是聚合分子如蛋白质或编码该蛋白质的核酸。如果所述农杆菌属菌株具有自养性，该互补性因子允许所述农杆菌属菌株生长并具有感染性。如果所述农杆菌属菌株具有缺损性VirE2、GALLS和VirF基因作为所述第一遗传修饰，所述互补性因子分别是VirE2、GALLS和VirF或分别编码VirE2、GALLS和VirF。如果所述农杆菌属菌株受到化学调节的启动子控制，所述互补性因子可以是能够调节、优选地能够诱导该化学调节的启动子的小分子化合物。
必须提供所述互补性因子以便该互补性因子可以执行其功能。如果所述互补性因子是小分子化合物，它可以存在于浸润所述植物或所述植物叶的所述农杆菌属菌株的含水混悬液内。如果所述互补性因子是蛋白质，还可以向这种含水混悬液中添加该互补性因子。然而优选地，作为蛋白质的互补性因子(如VirE2、GALLS或VirF)在DNA中编码并且如此提供以至在实施所述浸润法后该互补性因子即在所述植物或所述植物叶内出现。在一个实施方案中，用能够向所述植物或所述植物叶导入该互补性因子或编码它的DNA的第二农杆菌属菌株浸润该植物或该植物叶。所述第二农杆菌属菌株优选地是不带本发明所述第一遗传修饰和不具有本发明所述异源DNA序列的农杆菌属菌株。当浸润所述植物或植物叶时，可使用作为混合物的本发明所述的农杆菌属菌株和所述的第二农杆菌属菌株。即便这种混合物少量逃逸(优选地所包含的)实施本发明方法的环境，此类农杆菌属菌株的混合物将被迅速稀释以至两种菌株彼此靠近的可能性迅速消失。因此，非靶生物不会同时接触到两种农杆菌属菌株，由此没有向所述非靶生物转化人工核酸或外来核酸(例如所述的异源DNA序列)。
在另一个更优选的实施方案中，所述互补性因子在所述植物或所述植物叶内稳定地表达或瞬时表达，由此优选所述互补性因子的稳定表达。在该实施方案中，向所述植物提供具有编码所述互补性因子的遗传修饰(此后及在权利要求中称此修饰为“第二遗传修饰”)。因为农杆菌属菌株仅仅转化具有所述第二遗传修饰的植物，故可用这种方式实现高生物安全性。所述农杆菌属菌株转化非目的生物或非目的植物的概率极低，因为这些生物缺乏所述的第二遗传修饰。
可用多种方式进一步提高迄今所述方法的生物安全性。编码复制子的所述序列部分可以编码复制子，该复制子在使其于所述植物或所述植物叶中扩散的功能上缺损。所述的功能可以是所述复制子用于远距离运动或细胞至细胞运动的功能，例如分别是病毒外壳蛋白或病毒运动蛋白。优选地，所述复制子至少缺乏远距离运动的能力，由此阻止所述复制子向其它植物的扩散。缺乏远距离运动的能力原则上可能对蛋白质表达效率不利。然而，在本发明的系统中，可通过本发明的其它要素互补这种不利，例如通过浸润所述植物或所述植物叶的主要部分和/或通过改进RNA复制子形成的如下所述方法。
其它进一步改进生物安全性的方法是使用表达致癌抑制活性蛋白质Osa(REF)的农杆菌属菌株转染所述植物以及使用提供virE2基因的第二农杆菌属菌株。另外，所述农杆菌属菌株可以具有用于减少T-DNA向非靶生物转移的经遗传修饰的细胞密度感受或毒力诱导调节系统。
还可以因所述农杆菌属菌株具有使该农杆菌属菌株对于向其它细菌接合转移质粒呈缺损的另一种遗传修饰而提高生本发明方法的生物安全性。通过使农杆菌基因oriT、traG和traF中的至少一个基因功能丧失可完成接合转移。
所述异源DNA序列中的所述序列部分可编码DNA复制子或RNA复制子。优选RNA复制子并且如下描述主要涉及编码RNA复制子的序列部分。
编码复制子的所述序列部分含有对复制子功能必需的序列和从所述复制子上待表达的目的序列。所述的待表达目的序列一般编码目的蛋白质并且可以含有从所述复制子或从RNA复制子的亚基因组RNA上翻译所述目的蛋白质的调节序列。
如果所述复制子是RNA复制子，对该复制子的RNA复制子功能必需的序列(i)对应于所述RNA病毒的序列，尤其是当前者是后者的DNA拷贝(例如cDNA)时。在DNA复制子的例子中，用于复制子功能的所述序列赋予DNA复制子在细胞核内复制的功能；该DNA复制子可使用异源DNA序列或其部分作为模板通过复制自该异源DNA序列形成。在RNA复制子的例子中，用于复制子功能的所述序列赋予RNA复制子在细胞溶胶内复制的功能。用于RNA复制子功能的所述序列一般编码一种或多种参与复制的蛋白质，如依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp复制酶)。用于复制子功能的所述序列还可以是表达复制酶时需要的功能或编码该功能，如亚基因组启动子、转录增强子或翻译增强子。参与植物中RNA病毒细胞至细胞扩散或全身扩散的蛋白质如运动蛋白或外壳蛋白不具备复制子功能，尽管它们可以存在于所述异源DNA序列内。在任何情况下，编码复制子的所述序列部分不编码野生型植物病毒。因为植物RNA病毒是容易得到的复制子功能来源，故用于复制子功能的所述序列优选地从植物RNA病毒序列衍生。在RNA复制子的情况下，“被衍生”意指用于复制子功能的所述序列是所述RNA病毒中相应序列的DNA拷贝并且该DNA拷贝在含于细胞核中的所述异源DNA序列内整合。“被衍生”意指用于复制功能的所述序列不一定是所述RNA病毒中相应RNA序列的精确DNA拷贝，但是可显示如下所述的功能保守性差异。由于所述的差异具有功能保守性，用于复制子功能的所述序列优选地编码能够类似地执行其对所述RNA病毒所执行的复制子功能的蛋白质。
在其中所述复制子是基于烟草花叶病毒属(tobamovirus)如烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)的一个实施方案中，所述复制子含有或编码RdRp。该复制子还可以编码运动蛋白。优选地，该复制子不含或不编码外壳蛋白(CP)。
在另一个优选的实施方案中，通过使用高度稀释的所述农杆菌属菌株的混悬液进一步改进本发明方法的生物安全性。该实施方案不仅降低所述农杆菌属菌株的细胞向环境中扩散的可能性，而且还在使用作为所述植物的病原体的农杆菌感染时，通过减少对所述植物或所述植物叶的接触和应激提高本发明方法的效率。本发明人惊讶地发现本方法的效率在一定范围内随着本发明步骤(a)中所用农杆菌混悬液的浓度降低而升高。在所述植物的细胞内产生的复制子的细胞至细胞运动能力明显随这些农杆菌混悬液的浓度降低而提高。仍然没有确定这种出乎预料现象的原因。推测该现象是因为植物对农杆菌感染的反应并且该反应在农杆菌浓度较低时不发生(或发生程度较低)。
在这个优选的实施方案中，用所述农杆菌属菌株细胞的混悬液浸润所述植物或所述植物叶，所述的混悬液具有农杆菌属细胞的如此浓度，该浓度可通过将600nm OD(光密度)1.0的所述农杆菌属菌株细胞的混悬液稀释至少25倍、优选地至少100倍、更优选地至少250倍和最优选地至少1000得到。这些稀释因此产生在600nm处分别具有如下的计算OD值的农杆菌混悬液至多0.04、优选至多0.01、更优选至多0.004以及最优选至多0.001。
再者，描述了所述复制子是RNA复制子时允许显著提高表达效率的重要实施方案。在该实施方案中，用于复制子功能的所述序列在所述植物RNA病毒的所述序列中的所选择区域(selected localities)处显示出相对所述植物RNA病毒的所述序列的功能保守性差异，所述差异引起与未显示所述差异的RNA复制子相比提高的复制子形成频率。当完整实施本方法时(见如下)，该差异是在植物细胞中提高复制子形成频率的原因。可以在具有该差异的用于复制子功能的序列和不具有该差异的用于复制子功能的序列间通过比较复制子形成频率实验性检测提高的复制子形成频率与所述差异间的因果联系。可如实施例中所描述例如通过计数表达所述目的序列的原生质体实施这种实验性比较。优选地，使用编码易于检测的报告蛋白质如绿色荧光蛋白(GFP)的目的序列达到此目的。进一步如下所述，用不能进行细胞至细胞扩散的复制子开展实验性比较也是优选的。
在所述植物RNA病毒的所述序列的所选择区域上向用于复制子功能的所述序列中导入所述的功能保守性差异。所述所选择区域是在用于植物RNA病毒的复制子功能的所述序列中的这类位点，其引起核内转录的RNA复制子在细胞溶胶中作为功能性复制子出现的概率降低。优选地，此类所选择区域具有高A/T(U)含量，即高A含量和/或高T含量(在RNA水平是高U含量)或具有隐蔽剪接位点，即由核剪接装置识别为剪接位点的序列部分。可如下所示在作为RNA复制子基础的RNA病毒中通过分析该RNA病毒的RNA图谱鉴定所述所选择区域。此外，可通过分析用异源DNA转染后在植物细胞中形成的RNA实验性鉴定所选择区域，其中异源DNA编码了不显示本发明差异的RNA复制子。这种实验分析可通过RT-PCR完成，优选地同时对RT-PCR产物测序。以这种方式可以鉴定出显示破坏RNA复制子的剪接事件的非目的剪接产物。而且，可通过在所述所选择区域内导入所述功能保守性差异鉴定并然后修正引起非目的剪接作用的确切位点。
所述功能保守性差异通过抑制所述所选择区域对所述RNA复制子形成频率的有害效应导致提高的RNA复制子形成频率。所述功能保守性差异可以包括通过降低在编码所述RNA复制子的所述序列中的用于复制子功能的那类序列内的高A/T含量而降低所述RNA复制子中的高A/U含量。可通过至少部分缺失或至少部分替换G/C碱基(如利用遗传密码简并性)降低所述的高A/U含量，前提条件是所述差异具有功能保守性。此外，可以除去在植物RNA病毒来源的所述序列内富含A/U区域侧翼分布的隐蔽剪接位点。可在一个所选择区域或优选地在数个所选择区域内导入此类功能保守性差异。
优选的功能保守性差异包括在所述植物RNA病毒来源的所述序列内富含A/U区域附近或其中插入一个或多个内含子，最优选地是核内含子或者能够形成核内含子的一个或多个序列。可以导入数个内含子并且在本文中提供了导入各种数目内含子的实例。超过一个内含子的效应具有叠加性。此外，内含子插入可以与在其它所选择区域处的其它功能保守性差异组合。
图11显示了用于导入能够形成核内含子的序列的例子，虽然所导入的序列在待表达的目的序列中。在
图11的实例中，当所述异源DNA序列的一部分在发生重组酶催化的翻转后从两个内含子部分形成所述内含子。该原则还适用于所述RNA复制子中的用于复制子功能的序列。在两种不同RNA复制子形成于同一细胞内的实施方案中，所述两种不同复制子间的重组可导致从存在于不同复制子内的两个内含子部分形成一个内含子。此外，还可以通过均不是复制子的两个复制子前体间的重组形成RNA复制子。并且在此情况下，可以从来源于不同复制子前体的两个内含子部分装配出一个内含子。
因为形成所述RNA复制子的前提是转录，故具有编码所述RNA复制子的所述序列部分的所述异源DNA序列有效地连接或可连接转录启动子。转录启动子优选地是组成型启动子以便在农杆菌浸润的全部组织中实现所述目的序列的瞬时表达。组成型启动子的实例在本领域内是已知的。
在本发明的一个实施方案中，编码RNA复制子的所述序列具有一个或多个合起来编码所述RNA复制子的节段，即所述RNA复制子不是由一个连续的DNA编码。取而代之的是，所述RNA复制子由两个或多个节段不连续地编码，由此所述节段均可以在同一个T-DNA中存在，优选地彼此相互连续。然后，所述RNA复制子的形成可能需要所述节段发生重排，例如通过重组。可以通过其它农杆菌属菌株或通过工程化的植物宿主提供用于所述重组的重组酶，因而使瞬时表达限于所述植物宿主内。作为一个例子，用于复制子功能的序列中的一个部分(如编码复制酶的序列的一个部分)可以相对于所述异源DNA序列中其它部分以翻转方向(flippedorientation)在该序列内存在。重组位点可分布在翻转部分的侧翼。由于不能提供所述复制子的功能(例如因为该转录物不编码功能性复制酶)，故该异源DNA的转录物并不是复制子。提供识别重组位点的位点特异性重组酶允许翻转所述节段中的一个节段以至使该复制子得以连续编码。在该实施方案中，重组酶的提供可起到启动复制子形成以及表达目的序列的开关作用(见如下)，并且对高生物安全性作出贡献。
备选地，所述节段中的一个节段可在农杆菌T-DNA中存在而另一个节段可以在植物染色体中整合。随后，RNA复制子的形成需要转录这两个节段并以反式方式剪接这两个转录物以便装配出所述RNA复制子。如PCT/EP03/02986中详述，可使用该实施方案快速分离子代植物或子代细胞中共同编码所述RNA复制子的节段，因此对系统的生物安全性作出贡献。
本发明的方法包括用本发明中所述异源DNA序列(步骤(a))瞬时转染植物或植物叶。术语“瞬时转染”意指导入异源DNA而不选择具有在植物染色体内稳定整合有异源DNA的已转化转基因细胞。瞬时转染通常提供异源DNA序列所编码基因的瞬时复制和/或瞬时表达。本发明中所述的转染引起所述目的序列表达。表达通常在经农杆菌浸润法向所述植物或所述植物叶提供所述异源DNA序列后自发出现。根据需要，可使用多种引起或启动表达的方法。如果用重组酶启动本发明的方法，可瞬时地向所述植物或植物叶提供该重组酶，其中所述的供应可起到所述目的蛋白质表达的开关作用。优选地，可以在植物细胞中稳定编码这样的重组酶并且其表达可受组成型启动子或应激诱导启动子的控制。随后通过诱导所述启动子诱导该重组酶的表达可引起所述目的序列表达。
本发明方法的步骤(b)包括从步骤(a)中已转染优选地已浸润的所述植物或所述植物叶分离所述目的蛋白质。所述目的蛋白质的分离优选地包括匀浆含有表达目的蛋白质的植物或所述植物叶。在作为参考包含于本文并因此引用作为参考的PCT/EP02/09605中描述了多种用于从植物中分离蛋白质的方法。
本发明原则上可以应用于存在感染性DNA病毒或感染性RNA病毒和对于提供瞬时表达的农杆菌浸润法是高效的任何植物。优选的植物是烟草属(Nicotiana)中的种如本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)和普通烟草(Nicotiana tabacum)；除之外优选的植物种是矮牵牛(Petuniahybrida)、芸苔(Brassica campestris)、芥菜型油菜(B.juncea)、水芹(cress)、紫花南芥(arugula)、芥菜(mustard)、草莓菠菜(StrawberrySpinach)、头状藜(Chenopodium capitatum)、莴苣(lettuce)、向日葵(sunflower)和黄瓜(cucumber)。
合适的植物/DNA病毒或植物/RNA病毒配对可以自如下提供的DNA病毒和RNA病毒名单衍生。特别地，由于根据本发明的RNA复制子形成的极高效率，植物病毒的植物物种特异性在实施本发明时很不明显。类似地，本发明可以用于基于任何RNA病毒的RNA复制子。RNA病毒通常在其宿主植物的细胞核外部进化并且将具有使基于该病毒的复制子在此复制子于细胞核内产生时效率低的所选择区域。本发明可应用于所有RNA病毒，尽管在不同植物RNA病毒间改进的水平可能不同。本发明最优选的植物RNA病毒可以基于烟草花叶病毒属，尤其烟草花叶病毒，以及马铃薯X病毒属如马铃薯病毒X。在基于烟草花叶病毒时，通常是外壳蛋白用待表达的所述目的序列替换。也可去除运动蛋白或由待表达目的序列替换之。然而，从烟草花叶病毒衍生的RNA复制子优选地应当编码运动蛋白并且将外壳蛋白用所述目的序列替换。
从其中衍生所述RNA复制子的植物和病毒的优选组合是烟草属中的种和烟草花叶病毒属、烟草属中的种和烟草花叶病毒等。
DNA病毒当中最优选的病毒载体可基于双生病毒(geminiviruses)属制备。在实例15中描述了基于菜豆金黄花叶病毒(Bean Golden MosaicVirus，BGMV)的病毒表达载体。
本发明的主要应用是在植物或植物叶中产生目的蛋白质。如果在植物中实施本发明的方法，不进入人或动物食物链的植物如烟草属中的种为优选。应当将农杆菌浸润后的整株植物或植物部分限制在封闭的环境中，例如温室或专门为提供需要的表达水平所必需的培育时间而设计的室内。
本发明的效率是如此高以至于达到植物表达系统的一个新记录。用本发明可实现的表达水平如此高以至使下游加工(包括分离和纯化目的蛋白质)的费用低到可使本方法与其它大规模表达系统竞争。在现有使用稳定转化植物的表达系统技术中，即便使用基于病毒的载体，表达水平仍然低，因为复制子仅在一小部分的细胞内产生。在植物中扩散的复制子仍不能克服该困难，因为扩散缓慢，特别是要经过长距离。因此，在植物中的表达不能一致地推进并且目的蛋白质的降解在其它蛋白质表达还未发生时就已经在植物的一些部分发生。此外，现有技术中的转染或基于农杆菌浸润法的瞬时表达系统在一个生产系统中既不能提供高表达水平，又不能提供高生物安全性。本发明可以通过对有能力(competent)的植物宿主通过农杆菌介导的递送而一致地启动遍及植物或分离的植物部分(例如叶)的表达。未产生复制子的小部分细胞可迅速地被来自邻近细胞的复制子感染。本发明提供了首个可大规模应用的高产量植物表达系统。本发明还通过使瞬时表达系统限制在专门设计的有能力植物宿主内，因此降低在无能力(非靶)的生物中产生表达的可能性并且提高系统的生物安全性，故具有高生物安全特点。
附图简述
图1描述本发明的一般原则，该原则以增加的生物安全性(A)和基于RNA病毒的复制子形成(B)的可能性升高为基础。
图2(A、B、C)示意性地显示根据本发明修饰的和未修饰的病毒构建体。
Act2-拟南芥菜属(Arabidopsis)ACTIN2基因的启动子；RdRP-病毒RNA依赖性RNA聚合酶；MP-病毒运动蛋白；NTR-病毒3′非翻译区；GFP-绿色荧光蛋白；干扰素-人干扰素α2b；hGH-人生长激素；nos-胭脂氨酸合成酶基因的转录终止区。
图3显示用载体pICH16707农杆菌浸润后10天在紫外光下照射的本塞姆氏烟草植物。
图4显示用载体pICH18711农杆菌浸润后4天在紫外光下照射第17(A)、22(B)、28(C)和35(D)日龄的本塞姆氏烟草植物。
图5示意性地显示构建体pICH18722和pICH10745的T-DNA区。Act2-拟南芥菜属ACTIN2基因的启动子；RdRP-病毒RNA依赖性RNA聚合酶；MP-病毒运动蛋白；NTR-病毒3′非翻译区；GFP-绿色荧光蛋白；hGH-人生长激素；nosT-胭脂氨酸合成酶基因的转录终止区；nosP-胭脂氨酸合成酶基因的转录启动子；oscT-章鱼碱合酶基因的转录终止区；NPTII-新霉素磷酸转移酶Il基因的编码序列；TVCV MP-芜菁脉明病毒(turnipvein-clearing virus)运动蛋白。
图6显示载体pICH8543的经转录区域中的内含子预测图谱。在水平轴上给出核苷酸数。垂直轴显示相应序列或序列区域作为编码序列(编码)、作为供体部位(供体)或作为受体部位(受体)的可能性。划圈部分对应于应当在其中导入所述功能保守性差异的所选择区域。
图7显示载体pICH15466的被转录区域即该被转录的区域前半部分中的内含子预测图谱。对划圈区域如本发明所述进行修饰(比较图6A)。
图8显示载体pICH15900的被转录区域即该被转录的区域后半部分中的内含子预测图谱。对划圈区域如本发明所述进行修饰(比较图6B)。
图9显示载体pICH15499的被转录区域中的的内含子预测图谱。划圈区域对应六个插入的植物核内含子。
图10显示在病毒构建体农杆菌浸润本塞姆氏烟草叶和普通烟草叶后的GFP表达。表明了针对每一浸润区域的载体鉴定编号。
A-农杆菌浸润8天后的本塞姆氏烟草；B-农杆菌浸润8天后的普通烟草；C-农杆菌浸润5天后分离的本塞姆氏烟草原生质体。在右图中众多的浅色点表示复制子形成和GFP表达的极高频率。
图11是根据本发明设计的基于RNA病毒的复制子前体的示意图，该前体在非诱导状态产生目的序列(用G表示的GFP)的零表达水平。
P-转录启动子；T-转录终止区；SM-选择标记基因；Act2-拟南芥菜ACTIN2基因的启动子；RdRP-依赖病毒RNA的RNA聚合酶；MP-病毒运动蛋白；NTR-病毒3′非翻译区；
图12使用正链(+链)显示拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)减数分裂特异性基因AtDMC1(GenBank登录号U76670)的内含子预测图谱。编码内含子的区域划圈标记。
图13(A，B)显示在马铃薯病毒X(Potato virus X，PVX)基因组(GenBank登录号AF172259)的正链(+链)中潜在引发问题的区域(划圈标记的)的预测图谱。
图14分别显示对苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus)基因组RNA1(GenBank登录号K02703)和RNA2(GenBank登录号K02702)和RNA3(GenBank登录号L00163)的正链(+链)中潜在引发问题区域(划圈标记)的预测图谱。
图15是构建体pICHVirE2、pICH4300、pICH5202/3和pICH5170中的T-DNA区域的示意图。
图16显示来自转基因植物宿主(本塞姆氏烟草)的反式互补作用对功能性MP(运动蛋白)缺损病毒载体的细胞至细胞运动的影响。上部标记指示植物，底部标记示用于农杆菌浸润法的载体。图左显示如所示处理的植物的代表性叶。图右显示完整的转基因植物。WT野生型植物；pICH10745转基因表达TVCV运动蛋白(MP)的转基因植物；pICH18722用细胞至细胞运动缺损的病毒载体浸润；pICH18711用能够进行细胞至细胞运动的病毒载体浸润。为检测GFP表达在紫外光下显示植物。
图17显示VirE2基因对来自双元载体(binary vector)pICH18711的T-DNA转移效率的影响。VirE2以含有功能性VirE2基因的农杆菌所浸润本塞姆氏烟草的叶；ΔVirE2以VirE2基因功能缺损的农杆菌所浸润本塞姆氏烟草的叶；数字102-107表示在浸润前对农杆菌贮存液的稀释度(对ΔVirE2菌株和VirE2菌株使用相同的OD600贮存液)。箭头指向显示相同的T-DNA转移频率的条件，其对应于102倍稀释的ΔVirE2菌株和107倍稀释的VirE2菌株。
图18显示用含有双元载体pICH18711的ΔVirE2农杆菌菌株浸润的野生型(WT)和转基因(pICHVirE2)植物。该图在浸润后10天摄于紫外光下。将相同的过夜农杆菌培养物10倍稀释用于浸润野生型植物，1000倍稀释用于浸润转基因植物。
图19通过以突变农杆菌(无功能性VirE2基因)和野生型农杆菌(保持VirE2基因功能)共浸润(co-infiltration)野生型植物显示VirE2基因功能的反式互补作用。在紫外光下显示用突变农杆菌和野生型农杆菌的不同组合浸润的本塞姆氏烟草叶。方框内的标记代表具体类型的农杆菌。方框间的加号表示在叶的同一个点上共浸润两种类型的农杆菌。“T-DNA”前的加号或减号分别表示带GFP的T-DNA存在或不存在。功能性VirE2不存在由Δ表示。
图20显示来自缺失acc操纵子的农杆菌的T-DNA转移效率的试验结果。用编码GFP的病毒载体pICH18711转化携带Ti质粒pMP90(对照)或pTiC58Δacc(acc缺失)的农杆菌属菌株GV3101并且使用不同稀释度的过夜培养物浸润植物。该图在接种后7天摄于紫外光下。
图21描述生成农杆菌突变体ΔleuB和ΔpyrE的策略。
图22显示农杆菌属菌株1264(ΔpyrE)在具有或不具有互补作用的不同培养基上的生长动力学。ΔpyrE突变体菌株1264-1-2和1264-1-8仅在含有尿嘧啶的培养基上生长。垂直轴上的值表示OD600。
图23显示农杆菌属菌株1263(ΔleuB)在具有或不具有互补作用的不同培养基上的生长动力学。ΔleuB突变体菌株1263-3-3和1263-3-10依赖亮氨酸而野生型亲本菌株GV3101则不依赖亮氨酸。垂直轴上的值表示OD600。
本发明优选的实施方案通过在植物或在植物叶内表达目的序列产生目的蛋白质的方法，包括通过农杆菌属菌株在互补性因子存在时浸润所述植物或所述植物叶而转染该植物或该植物叶，所述农杆菌属菌株含有位于T-DNA中具有编码RNA复制子的序列部分的异源DNA序列，其中编码复制子的所述序列含有(-)对所述RNA复制子的复制子功能必需的衍生自植物病毒的序列，和(-)所述待表达目的序列，其中向所述农杆菌属菌株提供了使此农杆菌属菌株在所述互补性因子不存在时对用所述T-DNA转染生物呈缺损的第一遗传修饰。
通过在植物或在植物叶表达目的序列而产生目的蛋白质的方法，包括通过农杆菌属菌株在互补性因子存在时转染，优选地通过浸润所述植物或所述植物叶而转染该植物或该植物叶，所述农杆菌属菌株含有位于T-DNA中具有编码RNA复制子的序列部分的异源DNA序列，其中编码复制子的所述序列含有(-)对所述RNA复制子的复制子功能为必需的从植物病毒衍生的序列，和(-)所述待表达目的序列，其中向所述农杆菌属菌株提供了使此农杆菌属菌株在所述互补性因子不存在时对用所述T-DNA转染生物呈缺损的第一遗传修饰，并且其中所述植物或植物叶具有在该植物或植物叶中编码并表达所述互补性因子的第二遗传修饰。
通过在植物或在植物叶中表达目的序列产生目的蛋白质的方法，包括通过用农杆菌属菌株的细胞混悬液在互补性因子存在时浸润所述植物或所述植物叶而转染该植物或该植物叶，所述的混悬液具有这样的细胞浓度，其对应于在600nm处至多0.04、优选至多0.01、更优选至多0.004以及最优选至多0.001的计算的光密度，所述农杆菌属菌株含有位于T-DNA中具有编码RNA复制子的序列部分的异源DNA序列，其中编码复制子的所述序列含有(-)对所述RNA复制子的复制子功能必需的衍生自植物病毒的序列，和(-)所述待表达目的序列，其中向所述农杆菌属菌株提供了使此农杆菌属菌株在所述互补性因子不存在时对用所述T-DNA转染生物呈缺损的第一遗传修饰，并且其中对复制子功能必需的所述序列在所选择区域(selected localities)处表现出与所述植物RNA病毒的功能保守性差异，所述差异导致与未表现所述差异的RNA复制子相比提高的复制子形成频率。
其它优选的实施方案在权利要求书中定义。
发明详述我们开发了高度活性的合成性模板用于利用农杆菌属细菌递送作为DNA前体的RNA病毒载体，其中农杆菌属细菌是一种土壤细菌和有效的载体生物。本文中我们证实可使用这种改进的“农杆菌感染”方法在几乎全部成熟的植物叶内同步地启动瞬时基因扩增和高水平表达，并且可在工业规模上经济地实施这种转染方法。我们还通过改造靶植物宿主生物、农杆菌和/或植物病毒以至可以将生产限制在工程化的“有能力(competent)”的植物宿主内，从而解决生物安全问题，并且限制农杆菌感染并非本生产方法组成的其它植物或微生物的能力。该项技术组合三种生物系统的优点病毒的速度和表达水平/产量、农杆菌属的转染效率和系统递送以及植物的翻译后加工能力和低生产成本。所提出的方法可用于不需要以编码目的产物的异源核酸稳定遗传修饰植物的工业生产方法，并且更安全、更可控及更兼容于目前的工业基础结构。
本发明描述了利用农杆菌属细菌介导性递送病毒复制子或其前体而高产量大规模地产生目的蛋白质的瞬时表达系统。所述复制子能够表达目的序列，所述系统通过使该系统三个关键成分(工程化的植物宿主、农杆菌、复制子)中的至少两个关键成分彼此相互依赖而包含了生物安全特性。
我们惊讶地发现通过使系统中所述关键成分之一的功能部分授予另一个关键成分而产生的相互依赖性可以达到如此程度以至没有负面影响系统效率，同时反而对整个方法提供更好的控制，因此提高了生物安全性。本发明的基本原理示于
图1(A)。可在转基因宿主植物上实施基于病毒复制子前体农杆菌浸润法的大规模蛋白质生产方法，其中所述宿主植物对用于所述农杆菌浸润法的农杆菌和/或者所述复制子在执行其表达所述目的蛋白质时需要的功能上互补。在实施例4中描述了互补RNA复制子的一个实例。在该实施例，整株植物用编码缺少功能性运动蛋白(MP)的RNA复制子的异源DNA序列瞬时转化(图5)。这种复制子不能进行从细胞至细胞的运动，因此在不含有带病毒MP的表达盒(pICH10745，图5)的植物宿主中不能提供高产量。
如果植物或另一种农杆菌菌株以反式方式提供在活化或操纵病毒复制子或瞬时转染时需要的功能，当采用本文中所述用于提高RNA从细胞核释放至细胞溶胶内效率的措施时，发现未负面地影响表达效率。在编码病毒RNA复制子的某些区域内掺入植物内含子或在用于复制子功能的序列内去除或替换隐蔽内含子可显著提高(至少×102倍)所述复制子在宿主植物中的效率。这种效率的提高在至少一个容易测量的参数上体现显示所述载体发生复制的细胞的相对比例，即提高的复制子形成频率。优化RNA复制子形成的启动导致能够在整株植物中基本同步地启动目的序列表达，在相对未修饰载体而言更短的时间内导致大幅提高的目的蛋白质产量。本发明实施例6-14描述了改进所述载体来提高RNA病毒载体从细胞核释放至细胞溶胶内效率的方法。对病毒载体改进的详细描述最近由Marillonnet和同事(2005，Nature Biotechnol.，23，718-723)发表。该改进因允许以有效方式交换RNA复制子、植物宿主和农杆菌间的功能，因此是本发明的一个重要实施方案。令人感兴趣的是这种基于TMV的改进的载体在除烟草外的植物种如矮牵牛、芸苔、芥菜型油菜以及水芹、紫花南芥和芥菜中也有效地发挥作用。表达最好的非茄科(Solanaceae)种是草莓菠菜、头状藜。菊科(Asteraceae)如莴苣(尤其其幼苗)和向日葵以及葫芦科(Cucurbitaceae)如黄瓜表明来自不同植物科的数个种可成功地加以利用，优选地在进一步优化该方法后。
尽管有通过在重组DNA的编码区内掺入内含子以提高核内转基因表达的公开(Mascarenhas等，1990，Plant Mol. Biol.，15，913-920；Bourdon等，2001，EMBO Reports，2，394-398；Rose，AB.，2002，RNA，8，1444-1453；US5,955,330)，现有技术中没有线索表明在病毒RNA复制子前体中掺入内含子将对病毒复制子形成的频率和对目的序列从所述复制子上的表达水平产生任何积极影响。考虑到核mRNA的转录和病毒RNA的复制是在不同的亚细胞区室内发生，这种效果令人惊讶。即便将RNA复制子的cDNA拷贝置于核内，仅该病毒复制子前体的第一代拷贝在核内产生并且随后在细胞质内于不同于细胞核内的条件下扩增。在现有技术中，描述了在克隆野生型病毒cDNA期间使用内含子防止病毒基因在大肠杆菌中“泄漏”表达的细胞毒效应(Johansen，I.E.1996，Proc.Natl.Acad.Sci. USA.，93，12400-12405；Yang等，1998，Arch.Virol.，143，2443-2451；Lopez-Moya和Garcia，2000，Virus Res.，68，99-107)。没有线索表明内含子的包含可以提高复制子从病毒cDNA克隆中形成的频率。
本发明提供显著提高RNA病毒来源的复制子形成频率的方法，所述的复制子通过转录DNA前体衍生并且设计用于表达目的序列。所述方法克服了现存对基于病毒载体的表达系统的限制，如待表达异源序列的大小限制和所述载体的高不稳定性。另外，所述方法提供更好的生物安全特性并且允许设计针对转基因表达的抗泄漏控制(leakage-proof control)(非诱导状态下的零表达水平)，因为这种设计有机地构成所述RNA病毒来源的复制子的设计策略的一部分。通过提供RNA病毒来源的复制子形成的高频率，本文中的所述方法允许在含有编码所述RNA复制子的异源DNA序列的整株植物或植物的部分中如叶内快速启动目的序列表达。通过实施本发明，通过大幅度提高复制子形成的频率可显著改进实际上任何植物RNA病毒来源的复制子的性能，其中所述复制子设计用于通过农杆菌浸润植物或植物叶表达异源目的序列。
属于不同分类组的DNA病毒和RNA病毒适用于构建根据本发明的RNA复制子。如下给出本发明可应用的DNA病毒和RNA病毒名单。引号中的分类单元名称(并且是非斜体)表示该分类名称并不具有ICTV国际病毒分类委员会批准的国际名称。以标准字体给出种(俗名)。显示了未正式划分属或科的病毒DNA病毒环状双链DNA病毒科花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)，属杆状DNA病毒属(Badnavirus)，模式种鸭跖草黄斑驳病毒(commelinayellow mottle virus)，属花椰菜花叶病毒属(Caulimovirus)，模式种花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)，属“大豆退绿斑驳病毒属”(“SbCMV-like viruses”)，模式种大豆退绿斑驳病毒(Soybeanchloroticmottle virus)，属“木薯脉花叶病毒属”(“CsVMV-like viruses”)，模式种木薯脉花叶病毒(Cassava vein mosaicvirus)，属“水稻东格鲁杆状病毒属”(“RTBV-like viruses”)，模式种水稻东格鲁杆状病毒(Rice tungro bacilliformvirus)，属“碧冬茄脉明病毒属”(“Petuniavein clearing-like viruses”)，模式种碧冬茄脉明病毒(Petunia veinclearing virus)；环状单链DNA病毒科双生病毒科(Geminiviridae)，属玉米线条病毒属(Mastrevirus)(双生病毒属亚组I)，模式种玉米线条病毒(maize streak virus)，属甜菜曲顶病毒属(Curtovirus)(双生病毒属亚组Il)，模式种甜菜曲顶病毒(beet curly top virus)，属菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)(双生病毒属亚组III)，模式种菜豆金黄花叶病毒；RNA病毒单链RNA病毒科雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)，属苜蓿花叶病毒属(Alfamovirus)，模式种苜蓿花叶病毒(alfalfa mosaic virus)，属等轴不稳环斑病毒属(llarvirus)，模式种烟草线条病毒(tobacco streakvirus)，属雀麦花叶病毒属(Bromovirus)，模式种雀麦花叶病毒(bromemosaic virus)，属黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)，模式种黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus)；科长线形病毒科(Closteroviridae)，属长线形病毒属(Closterovirus)，模式种甜菜黄化病毒(beet yellows virus)，属莴苣传染性黄化病毒属(Crinivirus)，模式种莴苣传染性黄化病毒(Lettuce infectious yellowsvirus)，科豇豆花叶病毒科(Comoviridae)，属豇豆花叶病毒属(Comovirus)，模式种豇豆花叶病毒(cowpea mosaic virus)，属蚕豆病毒属(Fabavirus)，模式种蚕豆萎蔫病毒1(broad bean wilt virus1)，属线虫传多面体病毒属(Nepovirus)，模式种烟草环斑病毒(tobaccoringspot virus)；科马铃薯Y病毒科(Potyviridae)，属马铃薯Y病毒属(Potyvirus)，模式种马铃薯病毒Y(potato virus Y)，属黑麦草花叶病毒属(Rymovirus)，模式种黑麦草花叶病毒(ryegrass mosaic virus)，属大麦黄化花叶病毒属(Bymovirus)，模式种大麦黄化花叶病毒(barleyyellow mosaic virus)；科欧防风黄点病毒科(Sequiviridae)，属欧防风黄点病毒属(Sequivirus)，模式种欧防风黄点病毒(parsnip yellow fleck virus)，属水稻矮化病毒属(Waikavirus)，模式种水稻东格鲁球形病毒病毒(rice tungro spherical virus)；科番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)，属香石竹斑驳病毒属(Carmovirus)，模式种香石竹斑驳病毒(carnationmottle virus)，属香石竹环斑病毒属(Dianthovirus)，模式种香石竹环斑病毒(carnation ringspot virus)，属玉米退绿斑驳病毒属(Machlomovirus)，模式种玉米退绿斑驳病毒(maize chlorotic mottlevirus)，属坏死病毒属(Necrovirus)，模式种烟草坏死病毒(tobacconecrosis virus)，属番茄丛矮病毒属(Tombusvirus)，模式种番茄丛矮病毒(tomato bushy stunt virus)，未分类的单链RNA病毒，属线虫病毒属(Capillovirus)，模式种苹果凹茎病毒(apple stem grooving virus)；属香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)，模式种香石竹潜隐病毒(carnation latent virus)；属豌豆耳突花叶病毒(Enamovirus)，模式种豌豆耳突花叶病毒(pea enation mosaic virus)，属真菌传杆状病毒属(Furovirus)，模式种土传小麦花叶病毒(soil-borne wheat mosaic virus)，属大麦病毒属(Hordeivirus)，模式种大麦条纹花叶病毒(barley stripe mosaic virus)，属悬钩子病毒属(Idaeovirus)，模式种悬钩子从矮病毒病毒(raspberry bushy dwarfvirus)；属黄症病毒属(Luteovirus)，模式种大麦黄矮病毒(barley yellowdwarf virus)；属玉米雷亚朵非罗病毒属(Marafivirus)，模式种玉米雷亚朵非罗病毒(maize rayado fino virus)；属马铃薯X病毒属(Potexvirus)，模式种马铃薯病毒X(potato virus X)；属南方菜豆花叶病毒属(Sobemovirus)，模式种南方菜豆花叶病毒(Southern beanmosaic virus)，属纤细病毒属(Tenuivirus)，模式种水稻条叶枯病毒(rice stripe virus)，属烟草花叶病毒属，模式种烟草花叶病毒，属烟草脆裂病毒属(Tobravirus)，模式种烟草脆裂病毒(tobaccorattle virus)，属苹果褪绿叶斑病毒属(Trichovirus)，模式种苹果褪绿叶斑病毒(apple chlorotic leaf spot virus)；属芜菁黄化花叶病毒属(Tymovirus)，模式种芜菁黄化花叶病毒(turnip yellow mosaic virus)；属伞形植物病毒属(Umbravirus)，模式种胡萝卜斑驳病毒(carrot mottle virus)；负股单链RNA病毒目单分子负链RNA病毒目(Mononegavirale)，科弹状病毒科(Rhabdoviridae)，属质型弹状病毒病毒属(Cytorhabdovirus)，模式种莴苣坏死黄化病毒莴病毒(lettuce necroticyellows virus)，属核型弹状病毒属(Nucleorhabdovirus)，模式种马铃薯黄矮病毒(potato yellow dwarf virus)；负股单链RNA病毒科布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，属番茄斑萎病毒属(Tospovirus)，模式种番茄斑萎病毒(tomato spotted wiltvirus)；双链RNA病毒科双组分双链RNA球状真菌病毒科(Partitiviridae)，属α潜隐病毒属(Alphacryptovirus)，模式种白三叶草潜隐病毒1(whiteclover cryptic virus 1)，属β潜隐病毒属(Betacryptovirus)，模式种白三叶草潜隐病毒2(white clover cryptic virus 2)，科呼肠孤病毒科(Reoviridae)，属斐济病毒属(Fijivirus)，模式种斐济病病毒(Fijidisease virus)，属植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)，模式种伤瘤病毒(wound tumor virus)，属水稻病毒属(Oryzavirus)，模式种水稻草丛矮化病毒(rice ragged stunt virus)；未分类的病毒基因组单链RNA，种大蒜病毒A、B、C、D(Garlic viruseA、B、C、D)，种葡萄斑点病毒(grapevine fleck virus)，种玉米白线花叶病毒(maize white line mosaic virus)，种油橄榄潜隐病毒2(olive latentvirus 2)，种Ourmia甜瓜病毒(ourmia melon virus)，种天竺葵环带斑点病毒(Pelargonium zonate spot virus)。
本发明的基本原理示于
图1(A)。可用多种不同方法实施本发明。所述方法可以基于使用不能提供瞬时表达的农杆菌突变体，所述的突变可以反式方式由转基因宿主植物或由第二农杆菌属菌株互补。
本文中通过防止农杆菌感染易感植物以提高系统的生物安全性，因此提高对瞬时表达方法的控制。广泛研究了涉及可成功应用于本发明的向植物宿主转移农杆菌T-DNA的机制。
一种可能的方法是使携带编码病毒复制子的所述异源DNA序列的农杆菌菌株特异地限制在工程化的植物宿主内。质粒pSA的osa基因编码抑制致癌活性蛋白质，该蛋白质可通过抑制在T-DNA转运及进一步整合至植物核DNA时必需的virE2蛋白质而抑制瞬时表达(Lee，L-Y.等，1999，J.Bacteriol.，181，186-196)。然而，这种抑制可通过混合表达osa基因的农杆菌与携带野生型virE2且无osa基因的农杆菌逆转，例如通过反式方式互补突变体表型。可通过产生表达virE2的转基因植物实现类似结果。将T-DNA作为VirD2共价结合于其5′末端的单链中间体转运至植物细胞内，但是virE2仍是该方法的重要成分，因为缺乏virE2的农杆菌突变体不致瘤。可通过接种可表达virE2的转基因植物恢复所述突变体致瘤力(Citovsky，V.等1992，Science，256，1802-1805)。此外，存在完全依赖乙酰丁香酮的农杆菌突变体。在本发明的实施例5中我们描述了一种瞬时表达方法，在其中携带本发明异源DNA序列的农杆菌属菌株的能力依赖于基因工程植物宿主或依赖野生型农杆菌以反式方式互补virE2蛋白质。另外，发根农杆菌(A.rhizogene)GALLS蛋白质可互补VirE2功能(Hodges等，2004，J.Bacteriol.，186，3065-3077)。该系统显著改善对异源DNA扩散的控制，因此提高了系统的生物安全性。如所述的实施例中当用缺乏virE2的农杆菌实施野生型本塞姆氏烟草(N.benthamian)植物的农杆菌浸润后，实际检测不到目的蛋白质(GFP)表达。然而，当对表达virE2的互补性宿主植物实施农杆菌浸润，或当用野生型农杆菌在混合物中与带有这种第一遗传修饰的农杆菌属菌株实施农杆菌浸润时，GFP高效表达。实际上，与反式方式互补的野生型农杆菌或突变农杆菌相比，缺乏virE2的农杆菌递送T-DNA的效率下降大约10,000倍(参见实施例5，
图17)。
设计生物安全性提高的系统的方法不限于以反式方式互补virE2功能。还可以如同virE2那样类似地使用virF基因产生能够通过互补virF缺损的农杆菌用于瞬时表达的植物宿主(Regensburg-Tuink，AJ.和Hooykaas，PJ.1993，Nature，363，69-71)。有趣的是osa蛋白质阻止virE2和virF两种蛋白质的分泌(Chen，L.等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，97，7545-7550)。备选地，可将根癌农杆菌(Agrobacterium tume向ciens)IncP-型或IncN-型接合转移系统导入不同细菌，大肠杆菌菌株，并且所述菌株可在卸甲根癌农杆菌菌株存在时提供T-DNA转移(Pappas，KM.和Winans，SC，2003.Appl. Envir.Microbiol.，696731-6739)。后者表明有可能设计多种具有提高的生物安全性的系统，其中所述系统包含有能力的受体宿主和受限于所述有能力宿主的一种或多种细菌性供体菌株(例如供体菌株和辅助菌株)。这种方法显著地限制对其它生物发生不希望的T-DNA转移的可能。
除了农杆菌向植物细胞内转移T-DNA的能力外，与众多其它细菌类似，农杆菌还可以通过接合作用向细菌细胞传输遗传物质(通常是染色体外的质粒DNA)。这种将质粒DNA(例如双元载体)从工业用农杆菌属菌株转移至其它农杆菌菌株(例如野生型农杆菌)的能力可能破坏对转基因向环境中释放的控制。在多数情况下，这种接合转移仅在携带了具有转基因的T-DNA区域的双元载体与卸甲Ti质粒组合后才可能发生，由于许多双元载体不含有对接合转移必需的结构元件(如代表转移起始位点的oriT)，因此它们仅能通过直接转化而不能通过三亲交配导入农杆菌，其中所述三亲交配基于双元质粒从大肠杆菌接合转移至目的农杆菌菌株。关于不同双元载体的综述，参见Hellens，R.，Mullineaux，Ph.和Klee，H.(2000，TrendPlant Sci.，5，446-451)。然而，即便双元载体不含有oriT，仍有可能在双元载体和原驻卸甲Ti质粒之间发生重组。这种重组可能形成含有具转基因的T-DNA区域的质粒，由此该质粒可以具有在不同细菌间发生接合转移的能力。数个基因参与农杆菌细胞间的接合转移(Cook等，1997，J.Bacteriol.，179，1291-1297；Beck等，1989，J.Bacteriol.，171，5281-5289)。然而，最关键区域(oriT、traG、traF)均位于一个原驻(residential)Ti质粒内(Oger和Farrand，2002，J.Bacteriol.，184，1121-1131；Farrand，Hwang和Cook，1996，J.Bacteriol.，178，4233-4247；Li和Farrand，2000，J.Bacteriol.，182，179-188)。通过同源重组去除上述区域将破坏细菌间接合转移，即便原驻Ti质粒和双元载体间发生同源重组。可按照以上提到的参考文献和本发明实施例16中提供的描述，使用标准分子生物学技术容易地设计出缺乏参与接合转移的所述区域的农杆菌菌株。实施例16显示(还参见图20)参与质粒接合转移的基因缺失不影响从农杆菌至植物细胞的T-DNA转移效率。
用于提高本发明表达系统表达效率的又一个方法是利用限制农杆菌感染的宿主细胞因素和农杆菌因素。在有关农杆菌属介导植物稳定转染的综述(Gelvin，SB.2003，Trends Biotechnol.，2195-98；Gelvin，SB.2003，Microbiol. MoI. Biol.Rev.，67，16-37)中描述了多种这类因素。例如，发现转基因烟草植物中拟南芥菜基因VIPl的过量表达使该植物对农杆菌属的瞬时基因转染和稳定基因转染明显地更易感(Tzfira，T.，Vaidya，M.和Citovsky，V.2002，Proc.Natl.Acad.Sci. USA.，99，10435-10440)。改进植物转染效率的因素可以是农杆菌毒力基因的组成型表达。通常此类基因受控于环境因素或触发vir基因表达的级联，并且可由酚类化合物、糖、改变的pH触发。所述因子可引起VirA蛋白质介导的VirG磷酸化，而这又活化其它vir基因的启动子。在VirG中单氨基酸替换所致的突变可引起其它vir基因不依赖VirA的组成型表达(Hansen，G.，Das，A.和Chilton，MD.1994，Proc.Natl.Acad.Sci. USA.，917603-7607)。在本公开中，使用农杆菌VirG突变株，以GUS报告基因开展的瞬时表达实验检测到在烟草和玉米组织中表达GUS的转化灶数目显著增加。当使用野生型VirG的多重拷贝促进在烟草中瞬时表达的效率时，观察到类似效应，但是在玉米中它们基本无效。作者建议可使用此类VirG突变株转化难以转化的植物种。这意味还可以使用这些VirG突变株开发基于病毒载体的瞬时表达载体系统用于转化通常难以转化的植物种。利用以上所述VirG突变基因是提高瞬时表达效率的有用方法，其中该方法与不同化学因子如酚类化合物(Melchers等，1989，Mol.Microbiol.，3，969-977)、刺激T-DNA转移至植物细胞内的乙酰丁香酮或冠瘿碱(Berthelot等，1998，Phytochemistry，49，1537-1548)组合或彼此独立。
其它可显著提高本发明的瞬时表达系统和方法生物安全性的因素是使用自养性农杆菌菌株，因为此类自养性菌株在开放环境中的存活可能性降低。Dirks和Peeters(US6323396)描述通过X射线处理产生自养性农杆菌菌株。在该专利中描述了数种此类菌株(需要甲硫氨酸或半胱氨酸的菌株或需要组氨酸和腺嘌呤的菌株)。生长需要甲硫氨酸的突变体中的一种突变体在高半胱氨酸甲基转移酶功能上缺损。由于可从数据库获得农杆菌属完整基因组序列，对于任何已充分表征(测序)的农杆菌属菌株，利用基因替换通过同源重组可直接产生此类突变体而不是通过X射线处理得到的预测性较低的结果。例如，根癌农杆菌C58基因组序列(GeneBank登录号NC00305)含有编码5-甲基四氢蝶酰-三谷氨酸-高半胱氨酸甲基转移酶的基因(基因ID1135697)。使用可获得的序列信息，可产生突变的基因形式并将其与侧翼序列共同克隆至含有例如反向选择标记基因sacBR(Berger和Christie，1993，J.Bacteriology，175，1723-1734)的自杀载体内，以便进一步向农杆菌递送并且选择自养性目的突变体(例如在突变的高半胱氨酸甲基转移酶基因的例子中是甲硫氨酸代谢缺损突变体)。使用该方法和公众可获得的不同自养性农杆菌菌株的序列信息可以产生众多其它突变体。Collens和其同事(Biotechnol.Prog.20(2004)，890-896)通过插入性诱变产生自养性农杆菌突变体。此类突变株在腺嘌呤、亮氨酸、半胱氨酸或硫胺素不存在时不能生长。这些突变体中的某些突变体具有降低的T-DNA递送效率，而其它突变体(cys-32)具有甚至比野生型农杆菌更高的向植物细胞递送T-DNA的能力。有可能受影响的农杆菌基因很可能是leuB、thiD以及cysE和cysK。当然，自养性菌株的选择应当基于该菌株适合向植物细胞高效地转移T-DNA。此外，为了更高的生物安全性水平(恢复为野生型的lover频率)，可产生对两种或多种不同的营养添加物呈自养的菌株(例如具有两个或多个突变的基因)。在实施例17中描述了自养性农杆菌菌株(DleuB和DpyrE)的产生。
除了仅当反式互补性因子(例如virE2蛋白质、添加代谢化合物)存在时才能够执行其所需要的功能(如T-DNA转移)和/或能够存活的农杆菌突变株以外，可使用基于针对细菌细胞的积极生物约束(Active BiologicalContainment，ABC)系统的方法。Ronchel和Ramos(2001，Appl. Environ.Microbiol.，67，2649-2656)描述了该系统的一个实例。在这个公开中，作者描述了设计在污染物不存在时通过诱导细胞死亡以便任意控制菌群存活和死亡的ABC系统。该系统以利用杀伤基因如编码穿孔素诱导蛋白的大肠杆菌gef基因为基础。该基因受lacl诱导的启动子的控制。在所述系统中Lacl的表达受依赖环境信号的启动子控制。在众多公开中描述了利用其它杀伤基因设计ABC系统的类似计划(例如Knudsen等(1995)Appl.Environ.Microbiol.61，985-991；Ronchel等(1998)Appl. Environ.Microbiol.64，4904-4911；Torres等(2003)Microbiology149，3595-3601)。Szafranski及其同事(1997，Proc.Natl.Acad.Sci. USA.94，1059-1063)和Kaplan及其同事(1999，Biomol.Eng.，16，135-140)描述了基于链亲和素的约束系统。
备选地，可使用细菌细胞内发挥作用的可诱导系统来控制表达负责特定功能(例如T-DNA转移或代谢物如氨基酸的生物合成等)的基因。实际上，作为从细菌细胞中缺失基因以产生突变株(例如自养性突变体或virE2基因功能缺损的突变体)的替代，可以使所述基因受可调节启动子的控制。通过施加互补性因子可以控制目的基因从这种可调节启动子上的表达，此时互补性因子可以是小分子如四环素和IPTG。可以使用对细菌调节系统例如基于已充分描述的tet和lac阻遏物的不同调节作用来控制农杆菌细胞中目的基因的表达。
除农杆菌属以外，还可以将本发明延伸至设计向植物细胞转移T-DNA的其它微生物。例如，最近已证实为了向多种不同植物介导基因转移可以修饰除农杆菌属以外的共生细菌种(Broothaerts等(2005)Nature，433，629-633)。通过获得卸甲Ti-质粒和双元载体两者，使这些细菌能够用于基因转移。
已知植物RNA病毒(在植物细胞核中扩增的非编码性小RNA-类病毒例外，综述参见Diener，T.O.，1999，Arch.Virol Suppl.，15，203-220；Flores，R.，2001，CR Acad.Sci.III，324，943-952)不在细胞核内出现而在胞浆中出现。因此，RNA病毒序列不适应抵抗核RNA加工作用，原因在于存在可能参与到包括已加工的RNA胞浆内转运的加工步骤中的基序，在所述加工步骤中涉及前mRNA、rRNA和tRNA前体。已经详细研究了加工事件，如5′末端加帽、剪接、生成3′末端、聚腺苷化作用、降解、碱基和糖修饰以及编辑(在质体和线粒体内)。然而对这类事件中众多要素的认识仍不清楚。对核内前mRNA最明显的改变发生在前mRNA剪接期间，即从初级转录物中切去间隔RNA序列(内含子)同时连接外显子的过程。剪接由富含尿苷酸的核内小核糖核蛋白颗粒的复杂结构-剪接体介导。剪接体在两个连续步骤中实施剪接反应第一步-在上游外显子/内含子接界序列的5′剪接位点处切割以形成套索，和第二步-在内含子/下游外显子接界序列的3′剪接位点处切割以及随后连接上游外显子和下游外显子(综述参见Kramer，A.，1996，Annu.Rew.Biochem.，65，367-409；Simpson，GG.和Filipowicz，W.1996，Plant.Mol.Biol.，32，1-41)。在高等植物中分布在内含子序列侧翼的5′和3′剪接位点双核苷酸(5′/GU；AG/3′)高度保守，单个G替换可能消除有关位点处的剪接活性。令人惊讶的是尽管植物和动物之间的剪接位点高度保守，在植物中通常不能剪接或不能正确剪接异源内含子(van Santen，VL.等，1987，Gene，56，253-265；Wiebauer，K.，Herrero，JJ.，Filipowicz，W.1988，Mol. Cel.Biol.，8，2042-2051)。考虑到植物病毒RNA不适应于抵抗核RNA加工装置的进化压力，一旦处于核内环境，这些RNA很有可能受到包括剪接在内的加工。这种情况完全不同于由核内基因编码的RNA转录物所面临的情形，因为这些RNA转录物在进化上已经适应保留其功能性，尽管经历一系列在细胞核内发生的RNA修饰作用。然而，这类修饰作用可能显著地影响病毒RNA复制子形成。重新设计旨在产生异源基因表达载体的植物病毒可能进一步加剧基于RNA病毒的复制子的不稳定性，因为这将增加可相互作用于病毒来源的RNA序列的其它元件，产生不能复制的缺损性RNA。我们的发明通过使表达载体接受修饰解决了这个问题，其中当表达载体作为DNA前体向植物和植物细胞内导入以提供瞬时表达或在植物染色体DNA内稳定整合时，所述修饰显著提高功能性RNA复制子形成的频率。修饰病毒来源的序列可能是提高基于RNA病毒的复制子效率的最佳解决方案。这种修饰可以是直接的(例如在所述RNA病毒来源的序列中)或是间接的(例如在非病毒来源的序列内)，但是所述的间接修饰可以对病毒来源序列产生稳定效果。在本发明中，重点主要在RNA病毒来源的序列内部修饰，因为这些修饰对提高RNA复制子形成的效率是关键。
令人惊讶我们首次寻找证据的尝试是成功的，即潜在导致问题的区域确实存在，并且更为惊讶地是通过找到出人意料的数量级别的改进，我们获得实验性验证。为确定存在隐蔽内含子和RNA剪接位点，使用Netgenell服务器程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)分析衍生自表达载体pICH8543的RNA病毒的序列(实施例1，图2A)，表明存在可能受核RNA加工装置剪接的内含子样区域(见图6中圈定区域)。存在可用来鉴定植物病毒RNA序列中潜在引起问题的区域(所述所选择区域)的众多其它程序，例如外显子/内含子预测程序(http://gene.mit.edu/GENSCAN.html)或剪接信号预测程序(http://125.itba.mi.cnr.it/～webgene/wwwspliceview.html)。
鉴于现存所有程序并不理想且易出错，还可以通过实验确定潜在引起问题的区域。这可以借助RT-PCR(Frohman，MA.，1989，Methods Enzymol.，218，340-356)和适于精确定量不同转录物浓度的更高级形式RT-PCR即所谓实时PCR(Gibson等，1996，Genome Res.，6，995-1001)，优选地随后对PCR扩增产物测序，在核内环境下分析源于受测试DNA载体的转录物而完成。例如通过外显子样序列替换内含子样序列，如用富含G/C(外显子样)区域替换富含A/U(内含子样)区域，本发明中的功能保守性差异显著地改变RNA图谱。植物内含子不同于外显子，通常富含A/U(Csank，C.等，1990，Nucl. Acid Res.，18，5133-5141；Goodall和Filipowicz，1989，Cell，58，473-483)，但是存在例外，例如在单子叶植物中找到了富含G/C的内含子(Goodall和Filipowicz，1989，Cell，58，473-483；Goodall和Filipowicz，1991，EMBO J.，10，2635-2644)。为实施本发明的这个实施方案，富含A/U的区域不仅包括序列中长至少20个核苷酸的具有至少55％和更高A/U含量的延长片段，还包括在一连串仅含A/U的序列中6-19个核苷酸的较短片段(“岛”)。本发明中的A/U含量意指A含量超过U含量或仅富含A，并且本定义包括反之亦然的情形。在实施例6中，我们证实对富含A/U区域的修饰提高表达GFP的细胞数目至少10倍。这在
图10中通过比较用pICH15466(修饰的载体，图2A)和pICH14833(对照载体，图2A)农杆菌浸润的面积得到证实。去除运动蛋白(MP)允许精确计数具有功能性RNA复制子的原代细胞，因为没有发生从最初感染位点至邻近细胞的细胞至细胞的运动。在实施例7中，修饰另一个含有众多隐蔽剪接位点(图6B)并覆盖运动蛋白(MP)亚基因组启动子的富含U的内含子样区域(图8，圈定的区域)。此修饰显著地影响来自病毒载体pICH15900的复制子形成的频率。由于通过原生质体计数实验已经确定了这种修饰(实施例7)，对于两种受测试烟草种-本塞姆氏烟草和普通烟草，这种提高与未修饰的载体pICH14833相比是大约100倍(见
图10，A、B中相应的已浸润面积)。通常，我们通过使用本发明所述方法能够提高RNA复制子形成的频率大约300倍，即具有功能性复制子的细胞比例从大约0.2％(对照载体)提高至超过50％(经修饰的载体)。我们认为这并不是极限，并且达到100％的频率是极有可能的。
如此高的复制子形成效率使得从同一植物细胞内的两个不同RNA复制子表达两个和多个不同基因成为可能，例如利用基于植物RNA病毒的载体共表达不同的基因。对这种共表达而言，关键是在同一时间同一细胞内实现两种或多种复制子的同步释放，因为对病毒载体而言“先到者，先服务”原则的确如此。系统运动和细胞至细胞的运动不起作用，因为不同病毒载体通常在其扩散区域内不重叠或者这种重叠不显著。简单计算显示出本发明所述的技术对于实现在同一植物细胞内从两种复制子上共表达两种目的序列的重要。当非优化的病毒载体具有在0.2％全部细胞中形成功能性复制子的频率时，从两种不同RNA复制子上共表达两种基因的细胞比例是0.2×0.2＝0.04％，而对于具有提高的功能性RNA复制子形成频率(50％或1/2的全体细胞)的构建体，细胞中此比例是0.5×0.5＝0.25或25％，例如高出大约625倍。对于某些性能最好的载体(例如pICH16191，
图10C)，具有功能性复制子的细胞的比例达到大约90％(
图10C，顶部右边)。这意味当使用此种载体从两个独立的复制子表达两个不同目的序列时，共表达可在80％全体细胞中发生。本技术极有可能进一步改进并且可能达到100％共表达。
值得注意的是还可以利用在待从RNA复制子上表达的异源目的序列内的功能保守性差异来提高RNA复制子形成的频率，尤其是与用于复制子功能的序列中的差异组合时，例如可在所述目的序列中导入对所述复制子的形成和加工必需的修饰。
在本发明的另一个实施方案中，通过向用于复制子功能的所述序列中插入核内含子提高复制子形成的频率(实施例8)。内含子在依赖病毒RNA的RNA聚合酶(RdRP)编码区内的掺入(实施例8和12)导致从(
图10A、B)经修饰的载体(图2A、B中的pICH15034、pICH15025、pICH15499)形成复制子的频率显著(至少50倍)升高。图9中显示插入6个拟南芥菜属内含子的载体的RNA图谱。在另一个实施例(实施例11)中，在MP序列中插入内含子提高复制子形成的频率至少100倍。
可使用众多核内含子实施本发明。此类内含子的实例包括但不限于来自如下基因的内含子水稻tpi Actl和salT基因(Rethmeier等，1997，PlantJ.，12，895-899；Xu等，1994，Plant Physiol.，100，459-467；McElroy等，1990，Plant Cell，2，163-171)；玉米Adh1、GapA1、肌动蛋白和Bz1基因(Callis等，1987，Gene Dev.，1，1183-11200；Donath等，1995，Plant Mol. Biol.，28，667-676；Maas等，1991，Plant Mol. Biol.，16，199-207；Sinibaldi和Mettler，在1992年纽约学术出版社WE Cohn，K Moldave编辑的Progress inNucleic Acids Research and Molecular Biology第42卷，第229-257页)、碧冬茄1，5二磷酸核酮糖羧化酶基因SSU301(Dean等，1989，Plant Cell，1，201-208)、拟南芥菜属A1EF1α、UBQ10、UBQ3、PAT1基因(Curie等，1993，Mol. Gen.Genet.228，428-436；Norris等，1993，Plant Mol.Biol.，21，895-906；Rose和Last，1997，Plant J.，11，455-464)和众多其它内含子。合成性内含子还可以用于本发明。最小的可用内含子或它们的部分还可以限于通常在内含子序列侧翼分布的剪接供体部位和剪接受体部位。优选地，内含子应当具有至少50个核苷酸大小、更优选地100至200个核苷酸大小，但是实际上对内含子的大小无限制。但是应当维持构建体大小适合于遗传操作。内含子的来源、其结构和大小应当根据载体特点分别地选择。可用瞬时表达实验测试所选择内含子及相应内含子部分的效率。
如上所述的修饰作用具有累积效应，例如假设使内含子插入和修饰MP亚基因组启动子组合，复制子形成的频率可能提高大约300倍(实施例9)。本文中将用来插入内含子以提高RNA复制子形成频率的优选区域称为所选择区域。此类区域可能含有“内含子样”结构。这可以通过在MP中，实际上在紧接引起问题的区域如MP亚基因组启动子附近插入内含子得到证实(实施例11)。观察到复制子形成的频率提高100倍。向“外显子样”区域内插入内含子未产生如在所述内含子样区域内插入那么明显的影响(实施例10)。
可用不同方法生成具有所赋予功能的转基因植物宿主，其中所赋予功能对植物宿主胜任瞬时表达所述目的序列即胜任互补本发明所述的缺损性农杆菌属菌株是必需的。载体可通过农杆菌属细菌或颗粒携带的Ti质粒载体(US5,591,616；US4,940,838；US5,464,763)或微粒轰击(US05100792；EP 00444882B1；EP 00434616B1)转化入植物细胞。还可以使用其它转化植物的方法如微注射(WO 09209696；WO 09400583A1；EP 175966B1)、电穿孔(EP 00564595B1；EP 00290395B1；WO 08706614A1)或PEG介导的原生质体转化等。选择递送载体的方法可取决于待转化的植物种，例如微粒轰击通常优选地用于转化单子叶植物，而农杆菌介导的转化对双子叶植物通常产生较好结果。
在如下所述的实施例中，我们利用农杆菌属介导的递送使载体(所述异源DNA序列)进入烟草细胞。然而，可以根据适用于稳定或瞬时转化或转染目的植物种的标准技术向植物导入所述载体。用于转化双子叶植物的技术在本领域众所周知，包括基于农杆菌属的技术和不需要农杆菌属的技术。不需要农杆菌属的技术包括直接由原生质体或细胞摄取外源遗传物质。这些技术包括PEG介导或电穿孔介导的摄取、粒子轰击介导的递送以及微注射。这些技术的实例在Paszkowski等，EMBO J.3，2717-2122(1984)，Potrykus等，Mol. Gen.Genet.199，169-177(1985)，Reich等，Biotechnology41001-1004(1986)和Klein等，Nature 327，70-73(1987)中描述。在每一情况下，使用标准技术将转化的细胞再生为整株植物。
因高转染效率和可广泛用于众多不同种属，故农杆菌属介导的转染是转染双子叶植物的优选技术。可通过农杆菌属常规转化的众多作物种包括烟草、番茄、向日葵、棉花、油菜籽、马铃薯、大豆、苜蓿和杨树(EP 0317511(棉花)、EP 0249432(番茄)、WO 87/07299(芸苔(Brassica))、美国专利4,795,855(杨树))。
在本发明实例中，我们使用农杆菌接种法，即一种农杆菌介导递送T-DNA以瞬时表达目的基因的方法(Vaquero等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci. USA.，96，11128-11133)。农杆菌接种法不仅是对小规模至中等规模重组蛋白生产系统极有用的工具，而且作为优化载体的要素允许用构建体的不同突变体迅速得到结果。
为实施农杆菌浸润法，如现有技术中所述(Marillonnet等，2004，Proc.Natl.Acad.Sci. USA.，101，6853-6857)通常制备农杆菌属过夜培养物。过夜培养物通常在600nm波长下达到3-3.5单位光密度(O.D.)并且在实施农杆菌浸润法前稀释3-5倍，产生5-9×109个集落形成单位(Turpen等，1993，J.Virol. Methods，42，227-240)。我们发现稀释102、103和104倍也可以极高效地起作用，尤其在组合了带本文中所述功能保守性差异的用于复制子功能的序列时。令人惊讶的是当提高转化性农杆菌的稀释度时，在已浸润烟草叶中的载体进一步改善其性能，获得更好的GFP产量。例如稀释103倍比稀释102倍产生更好的结果。稀释102倍比稀释10倍得到更好的GFP产量。对此现象的一个可能解释是高度浓缩的农杆菌属混悬液对病毒载体功能例如对细胞至细胞运动产生不利影响，这可能是植物对高浓度病原细菌反应的结果。该现象对大规模工业化蛋白质表达方法有特别价值，因为与现有方法相比，可以使通过农杆菌浸润法产生重组蛋白时需要的农杆菌量减少至少一个数量级。
在实施例13中显示基于病毒RNA的非活性复制子的DNA前体。根据本发明优化所述复制子。此外如果用农杆菌向无能力(non-competent)的植物递送，如不含有提供重组酶稳定掺入基因组DNA的表达盒的植物，该复制子含有防止目的序列表达的结构。功能性RNA复制子的表达和形成可以借助位点特异性重组通过翻转构建体中的一部分而触发。所述的翻转可导致两个内含子形成以及功能性目的序列装配。实施例13中描述的系统不仅显示对病毒载体的优化，而且还显示使用表达技术或药用蛋白质的植物表达系统达到高生物安全性标准的途径。
所述重组酶的转录可以受可诱导启动子或任何其它受调节(例如发育调节的)启动子的控制。可根据诱导条件将可诱导启动子划分为两类受非生物性因子(温度、光线、化学物质)诱导的可诱导启动子和可由生物性因子如病原体或寄生虫侵袭诱导的可诱导启动子。第一类可诱导启动子的实例是热诱导启动子(US05187287)和冷诱导启动子(US05847102)、铜诱导系统(Mett等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.，90，4567-4571)、类固醇诱导系统(Aoyama和Chua，1997，Plant J.，11，605-612；McNellis等，1998，Plant J.，14，247-257；US06063985)、乙醇诱导系统系统(Caddick等，1997，NatureBiotech.，16，177-180；WO 09321334)和四环素诱导系统(Weinmann等，1994，Plant J.，5，559-569)。一个用于植物的化学诱导系统领域中的最新进展是可通过糖皮质激素地塞米松开启并通过四环素关闭的嵌合启动子(Bohner等，1999，Plant J.，19，87-95)。化学诱导系统方面的综述参见Zuo和Chua，(2000，Current Opin.Biotechnol.，11，146-151)和Padidam，M(2003，Curr.Opin.PlantBiol.，6，169-177)。可诱导启动子的其它实例是控制植物的病理相关(PR)基因表达的启动子。可通过使用反应于病原侵袭的植物信号途径中的重要成分-水杨酸或能够触发PR基因表达(US05942662)的其它化合物(苯并-1，2，3-噻二唑或异烟酸)处理植物而诱导这些启动子。
本发明不限于实施例中所描述的基于TMV的载体，同时还可应用于基于其它植物RNA病毒的复制子。对其它植物病毒RNA序列的分析(实施例14，
图13、14)显出这样的所选择区域，其类似于对TMV和植物核基因的前mRNA序列所描述的所选择区域(
图12)。强烈的证据是可通过使用本发明中描述的方法实际上可通过去除/替换引起问题的区域和/或插入核内含子改进任何植物RNA病毒来源的复制子。
可使用本发明在植物或植物细胞中表达的目的蛋白质、其片段(功能性或非功能性)及其人工衍生物包括但不限于修饰淀粉的酶(淀粉合酶、淀粉磷酸化酶、脱支酶、淀粉分支酶、淀粉分支酶II、颗粒结合的淀粉合酶)、蔗糖磷酸合酶、蔗糖磷酸化酶、多聚半乳糖醛酸酶、聚果聚糖蔗糖酶、腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸酶、环精糊糖基转移酶、果糖基转移酶、糖原合酶、果胶酯酶、抑酶肽、抗生物素蛋白、细菌果聚糖蔗糖酶、大肠杆菌glgA蛋白、MAPK4和直向同源物、氮同化/代谢酶、谷氨酰胺合酶、植物渗透蛋白、2S清蛋白、奇甜蛋白、位点特异性重组酶/整合酶(FLP、Cre、R重组酶、Int、SSVI整合酶R、整合酶phiC31或其活性片段或活性变体)、修饰油的酶(如脂肪酸脱饱和酶、延伸酶等)、异戊烯基转移酶、ScaM5(大豆钙调节蛋白)、鞘翅目型毒素或杀虫活性片段、遍在蛋白缀合酶(E2)融合蛋白、代谢脂类、糖、核酸和多糖的酶、过氧化物歧化酶、蛋白酶的非活性酶原形式、植物蛋白质毒素、产纤维植物中改变纤维的特性、来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的鞘翅目活性毒素(Bt2毒素、杀虫晶体蛋白(ICP)、CrylC毒素、δ内毒素、多肽毒素、前毒素等)、昆虫特异性毒素AaIT、纤维素降解酶、来自Acidothermus Celluloticus的E1纤维素酶、修饰木质素的酶、肉桂醇脱氢酶、海藻糖-6-磷酸合酶、细胞分裂素代谢途径中的酶、HMG-CoA还原酶、大肠杆菌无机焦磷酸酶、种子贮藏蛋白、草生欧文菌(Erwinia herbicola)番茄红素合酶、ACC氧化酶、pTOM36编码的蛋白质、植酸酶、酮水解酶、乙酰乙酰基辅酶A还原酶、PHB(多羟基丁酸酯)合酶、参与合成多羟基链烷酸酯(PHA)的酶、酰基载体蛋白、油菜籽蛋白、EA9、非高等植物八氢番茄红素合酶、pTOM5编码的蛋白质、ETR(乙烯受体)、质体丙酮酸磷酸二激酶、线虫诱导的跨膜孔蛋白、增强植物细胞光合功能或质体功能的特性、1，2二苯乙烯合酶、能够羟化苯酚的酶、儿茶酚双加氧酶、儿茶酚2，3-双加氧酶、氯粘康酸环异构酶、邻氨基苯甲酸合酶、芸苔AGL15蛋白质、果糖1，6-二磷酸酶(FBP酶)、AMVRNA3、PVY复制酶、PLRV复制酶、马铃薯Y病毒属外壳蛋白、CMV外壳蛋白、TMV外壳蛋白、黄症病毒属复制酶、MDMV信使RNA、突变的双生病毒复制酶、加州桂(Umbellularia californica)C120优先的酰基ACP硫酯酶、植物C10或C120优先的酰基ACP硫酯酶、C140优先的酰基ACP硫酯酶(luxD)、植物合酶因子A、植物合酶因子B、D6-脱饱和酶、在脂肪酸生物合成和修饰中例如植物细胞内脂肪酸过氧化物酶体β-氧化作用中具有酶活性的蛋白质、酰基辅酶A氧化酶、3-酮酰基辅酶A硫解酶、脂肪酶、玉米乙酰辅酶A羧化酶等；5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)、膦丝菌素乙酰转移酶(BAR、PAT)、CP4蛋白质、ACC脱氨基酶、具有翻译后切割位点的蛋白质、赋予磺胺抗性的DHPS基因、细菌腈水解酶、2，4-D单加氧酶、乙酰乳酸合酶或乙酰羟酸合酶(ALS、AHAS)、多聚半乳糖醛酸酶、Taq聚合酶、细菌腈水解酶、细菌或噬菌体来源的众多其它包括限制性核酸内切酶、甲基化酶、DNA和RNA连接酶、DNA和RNA聚合酶、逆转录酶、核酸酶(DNA酶和RNA酶)、磷酸酶、转移酶等。
本发明可以用于分子种植及纯化具有商业价值和重要药用性的蛋白质的目的，包括工业酶(纤维素酶、脂肪酶、蛋白酶、植酸酶等)和纤维状蛋白(胶原蛋白、蜘蛛丝蛋白质等)。可使用本发明中描述的方法表达和纯化人和动物有益健康的蛋白质。此类目的蛋白质尤其包括免疫反应蛋白质(单克隆抗体、单链抗体、T细胞受体等)、抗原，包括来源于病原微生物的抗原、集落刺激因子、松弛素、多肽激素，包括促生长素(HGH)和胰岛素原、细胞因子及其受体、干扰素、生长因子和凝固因子、酶活性的溶酶体酶、溶解纤维蛋白的多肽、凝血因子、胰蛋白酶、胰蛋白酶原、a1-抗胰蛋白酶(AAT)、人血清蛋白、葡糖脑苷脂酶、天然霍乱毒素B和保留功能的蛋白质如以上蛋白质的融合蛋白、突变体形式以及合成性衍生物、凝血酶、人胃脂肪酶、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CMF)、丝氨酸蛋白酶阻遏物、溶菌酶、油质蛋白、凝血酶原、α-半乳糖苷酶。
此处完整地引用欧洲专利申请号04016011.1的内容作为参考，本专利申请要求前述专利申请的优先权。
实施例为说明本发明提供如下实施例。可根据需要修改和改动。
实施例1构建基于TMV的RNA载体从俄罗斯莫斯科大学Atabekov教授处得到感染十字花科(crucifer)的烟草花叶病毒属(cr-TMV；Dorokhov等，1994，FEBS Lett.350，5-8)的克隆cDNA和芜菁脉明病毒(TVCV；Lartey等，1994，Arch.Virol.138.287-298)的克隆cDNA。经数个克隆步骤后制得含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的病毒载体。得到的构建体pICH8543(图2A)依次含有来自拟南芥菜属ACTIN2启动子的787个碱基对片段(ACT2，参考An等，1996，GenBank登录号AB026654，第57962至58748碱基对)、TVCV的5′末端(GenBank登录号BRU03387，第1至5455碱基对)、cr-TMV的片段(GenBank登录号Z29370，第5457至5677碱基对，将第5606胸腺嘧啶变成胞嘧啶以除去外壳蛋白CP的起始密码子)、序列“taa teg ata act cgag”、合成性GFP(sGFP)基因、cr-TMV 3′非翻译区(3′NTR；GenBank登录号Z29370，第6078至6312碱基)以及胭脂氨酸合成酶(Nos)终止子。将全部片段克隆在CarbR来源于pBIN19的双元载体pICBV10中的T-DNA左边界(LB)和右边界(RB)之间。将pICH8543转化至农杆菌属菌株GV3101内并浸润入本塞姆氏烟草叶内。浸润后3天出现的GFP荧光灶长大并汇合。令人惊讶的是即便浸润区域内的大多数细胞因病毒复制和运动最终表达GFP，仅有一部分细胞启动病毒复制，这一点通过表达GFP的众多独立转化灶检测。由此可见限制性因子不是DNA向植物细胞的递送，因为用35S启动子控制下的GFP基因浸润本塞姆氏烟草叶导致浸润区域中几乎所有细胞表达GFP(未显示)。
为证实此观察，我们制得MP中含有突变的病毒载体构建体。称作pICH14833的这种构建体类似于pICH8543但是不同之处是在MP基因中缺失位于MP内的EcoRI上游的389碱基对。在附件中将包含该缺失的NcoI至EcoRI片段显示为SEQ ID No.1。将完整的病毒构建体(从ACT2启动子至Nos终止子)克隆至来源于pBIN19的KanR双元载体pICBV49中的T-DNA左边界(LB)和右边界(RB)之间。由于MP中的缺失，从该构建体产生的复制子不能进行从细胞至细胞的运动但是能够在细胞中自主复制。当MP以反式方式例如从组成型启动子如花椰菜花叶病毒35S启动子上提供时，细胞至细胞的运动可恢复。
为制得MP表达构建体，TVCV MP基因通过PCR从克隆的TVCVcDNA(GenBank登录号Z29370，第4802至5628碱基对)中克隆并且亚克隆至双元载体内受35S启动子控制。将得到的构建体pICH10745(未显示)和pICH14833转化至农杆菌属菌株GV3101内并且浸润入本塞姆氏烟草叶中。仅浸润pICH14833导致浸润区域内出现少量表达GFP的细胞。通过计数来自浸润区域的原生质体，我们发现总数500个原生质体中仅有1至3个表达GFP的原生质体(0.2至0.6％)。共浸润pICH14833和pICH10745导致形成来自于初始表达GFP的每个细胞的表达GFP的转化灶。最终，由于细胞至细胞的运动，浸润区域内的大部分细胞表达GFP(
图10A)。
使用如上所述感染十字花科的烟草花叶病毒属(cr-TMV；Dorokhov等，1994，FEBS Lett.350，5-8)的同样的克隆cDNA和从俄罗斯莫斯科大学Atabekov教授处得到的芜菁脉明病毒(TVCV；Lartey等，1994，Arch.Virol.138.287-298)的同样的经克隆cDNA构建数个其它病毒载体。经数个克隆步骤后制得含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的病毒载体。得到的构建体pICH16707(图2C)依次含有来自拟南芥菜属ACTIN2启动子的787个碱基对片段(ACT2，参考An等，1996，GenBank登录号AB026654，第57962至58748碱基对)、TVCV的5′末端(GenBank登录号BRU03387，第1至5455碱基对)、cr-TMV的片段(GenBank登录号Z29370，第5457至5677碱基对，将第5606的胸腺嘧啶变成胞嘧啶以除去外壳蛋白CP起始密码子)、序列“taa tcg ata act cga g”、合成性GFP(sGFP)基因、cr-TMV 3′非翻译区(3′NTR；GenBank登录号Z29370，第6078至6312碱基对)以及胭脂氨酸合成酶(Nos)终止子。将全部片段克隆在来源于pBIN19的KanR双元载体pICBV29中的T-DNA左边界(LB)和右边界(RB)之间。将pICH16707转化至农杆菌属菌株GV3101内。转化的农杆菌属菌株在LB培养基中过夜生长至饱和。将200μl过夜培养生长的农杆菌属细菌用微量离心机以每分钟8000转沉淀3分钟。沉淀在1ml含有10mM MES(pH5.5)、10mM MgSO4的溶液中重悬，得到大约0.7的OD。用不带针头的注射器浸润温室生长的本塞姆氏烟草植物的叶。GFP荧光灶在浸润3天后出现。荧光灶长大并在数天后汇合。
制备OD为0.3-0.4的农杆菌更大体积的浸润溶液(3升)。将完整的本塞姆氏烟草植物连盆以倒置方式浸入溶液中并插入干燥器施加真空1至2分钟，直至足够溶液浸透叶。随后移出植物并固定以便在温室内恢复。浸润后3至4天，浸润区域内荧光点出现，与用注射器手工浸润的区域一样。显示了这种植物浸润后10天的图片(图3)。
RNA病毒如烟草花叶病毒属病毒在胞浆内复制而且从不进入胞核。因此RNA病毒在不暴露于核内的前mRNA加工装置的环境中进化。因此，在核内从人工病毒构建体产生的RNA复制子转录物可能不被RNA加工装置正确识别和加工。此外，来自病毒载体的RNA复制子很大，就基于TMV的复制子而言大约是7000个核苷酸。极少数植物基因具有如此大小并且此类基因中的大多数基因含有利于前mRNA加工、从核内输出和提高已加工转录物稳定性的内含子。因此，我们假设对前mRNA进行将提高精确加工的效率和促进已正确加工的转录产物从核内输出至细胞溶胶内的修饰将会引起启动病毒复制的细胞数目增加。结果证实存在两种方法可用于产生在DNA向胞核递送后能够更高效地启动病毒复制的基于RNA病毒的载体(1)一种方法是除去可能诱导不需要的加工事件(如利用隐蔽剪接部位的备选剪接事件或提前终止事件)的序列特征；(2)第二种方法是添加可增加正确加工的转录产物的量、改善此RNA从核内输出至胞浆内和/或改善转录物稳定性的内含子。
实施例2构建改进的基于TMV的RNA载体为了改进目的序列在浸润的叶中的表达速度，将16个大小范围在91至443个核苷酸的拟南芥菜属内含子添加至载体的第1至16位置内(位置相对GenBank登录号BRU03387的TVCV序列标出)1，第209碱基位置；2，第423碱基位置；3，第828碱基位置；4，第1169碱基位置；5，第1378碱基位置；6，第1622碱基位置；7，第1844碱基位置；8，第2228碱基位置；9，第2589碱基位置；10，第2944碱基位置；11，第3143碱基位置；12，第3381碱基位置；13，第3672碱基位置；14，第3850碱基位置；15，第4299碱基位置；16，第4497碱基位置；17，第5099碱基位置；18，第5287碱基位置；19，第5444碱基位置。将得到的构建体pICH18711(图2C)用于数株不同日龄(播种后17天至35天)本塞姆氏烟草植物的真空浸润法。GFP荧光两天后出现并且在浸润后6天达到最高。显示了浸润后4天的一张图片(图4)。与使用未改进载体pICH16707相比，GFP荧光更快地覆盖整个叶区域(浸润后4至6天)。对改进的病毒载体的详细描述最近已经公开(Marillonnet等，2005，Nature Biotechnol.，23，718-723)。
用本塞姆氏烟草植物的枝(茎和叶)替代整株植物实施真空浸润。留下茎以便通过使茎的基部置于一杯水中恢复。GFP三天后在叶中出现，这表明除整株植物外，植物的部分可用于表达目的基因。
实施例3利用农杆菌属细菌递送的病毒载体实施真空浸润表达药用蛋白质。
在如上所述的改进载体内克隆两种药用目的蛋白质替代GFP。克隆第一种蛋白质即人生长激素(hGH)(序列Genbank登录号NM000515)产生载体pICH17991(图2C)。克隆第二种蛋白质即人干扰素α(序列Genbank登录号V00548)的克隆产生载体pICH19081(图2C)。在此构建体中，干扰素的前17个氨基酸(LLVALLVLSCKSSCSVG)被拟南芥菜属钙网蛋白质外体引导序列(matqrranpsslhlitvfsllvavvsaev)替换。将构建体插入农杆菌属菌株GV3101并用于浸润整株植物。得到了两种蛋白质的高表达水平。对于pICH17991，甚至在蛋白质毒性导致浸润区内细胞死亡时仍得到每克浸润叶组织1mg hGH的高表达水平。
实施例4用缺乏MP的载体浸润整株植物在pICH17811内的MP开始处Avrll位点内产生一个移码(图2C)，形成构建体pICH18722(图5)。移码完全消除MP功能，并且该构建体的浸润导致仅在单个细胞中复制和表达。然而，由于存在内含子，大量细胞仍然表达GFP。
TVCV MP编码序列通过PCR从克隆的TVCV cDNA(GenBank登录号Z29370，第4802至5628碱基位置)扩增并且亚克隆至双元载体内受35S启动子控制，得到质粒pICH10745。pICH18722和pICH10745的共浸润完全恢复细胞至细胞的运动，至少在瞬时表达MP时。在本塞姆氏烟草中稳定地转化pICH10745。用pICH18722浸润表达MP的完整转化体引起与用pICH18711浸润完整野生型植物类似的GFP表达，而浸润野生型植物未引起病毒载体进行细胞至细胞的运动(见
图16)。
实施例5互补突变的农杆菌以提供目的基因的瞬时表达a)通过表达VirE2的转基因植物宿主而反式互补VirE2基因通过PCR从根癌农杆菌C58 T-DNA (GeneBank登录号AE009437，第6368至8038碱基位置)的DNA制品内扩增并克隆入载体pICH10745而替换TVCV MP基因。在根癌农杆菌(GV3101)和缺乏功能性VirE2基因的根癌农杆菌内固定得到的构建体pICHVirE2(
图15)，用于使用50mg/L卡那霉素(Km)为选择剂的农杆菌属介导的本塞姆氏烟草植物叶圆盘转染(Horsh等，1985，Science，227，1229-1231)。将带有MP中移码的构建体pICH18722(图5)转化至VirE2功能缺损的根癌农杆菌菌株内并且在农杆菌浸润实验中与野生型植物和用pICH10745转化的植物一起使用，其中所述缺损因在VirE2基因中的缺失所致。
通过计数每个相同面积的叶表面内表达GFP的细胞数目或(更精确地)通过确定和比较如
图10中所示有能力的宿主和野生型宿主中表达GFP的原生质体数目开展对照载体和修饰的病毒载体启动病毒复制的频率的比较。这类提供瞬时表达的T-DNA递送的相对频率可用于测量本系统相对于没有内建生物安全性特征的系统的生物安全性水平。
众多VirE2功能缺损的其它农杆菌菌株可用于本实验，例如携带VirE2插入突变的菌株(Christie等，1988，J.Bacteriol.170，2659-2667)或携带质粒pSA的菌株，其中质粒pSA具有可抑制VirE2功能的osa基因(Lee，L-Y等，1999，J.Bacteriol.，181，186-196)。此外，获得包括Ti质粒(例如GeneBank登录号NC003065；NC001277)和染色体DNA(例如Gen Bank登录号NC003063；NC003063)在内的农杆菌基因组序列信息允许通过同源重组使功能性基因替换为其突变形式而产生任意类型的突变体。
通过比较不同稀释度的含有VirE2的农杆菌菌株过夜培养物和VirE2缺损的农杆菌菌株过夜培养物测试了VirE2基因对于T-DNA向植物细胞内转移效率的影响。两种农杆菌菌株均在双元载体的T-DNA区域内含有pICH18711病毒载体(图2C)。在
图17中显示比较的结果。从图中显而易见与含有功能性VirE2基因的农杆菌相比，VirE2缺损的农杆菌菌株T-DNA转移效率降低至少10,0000倍。比较在有能力(pICHVIRE2转化的)本塞姆氏烟草植物和野生型本塞姆氏烟草植物的叶中瞬时表达的效率，表明以pICHVIRE2转化的转基因植物以反式方式极其高效地互补了VirE2基因功能(
图18)。通过不同系列稀释度的实验(结果未显示)表明从转基因植物上以反式方式互补VirE2基因功能的效率与使用携带功能性VirE2基因的农杆菌菌株是可比的。
b)通过与表达VirE2的野生型农杆菌菌株混合提供的反式互补作用。
重复前述实施例中的实验，除了通过携带pICH18722的virE2功能缺损菌株与可反式互补virE2功能的根癌农杆菌菌株C58混合而实现virE2功能的互补以外。将两种农杆菌菌株的新鲜接种培养物过夜生长至密度OD6002.5-3.0并且等比例混合用于浸润植物组织。将用于浸润的终混合物稀释50、100、1000和10000倍。在本塞姆氏烟草和普通烟草叶上实施植物组织的浸润。还开展了类似的实验，但是使用携带双元载体pICH18711(具有功能性MP)的AVirE2菌株。在
图19显示实验的结果。显而易见在递送TDNA的效率方面，携带双元载体pICH18711的突变株(T-DNA+、AVirE2)联合野生型菌株(T-DNA-、VirE2)的共浸润不低于通过野生型菌株(T-DNA+、VirE2)直接递送T-DNA。
实施例6除去内含子样序列提高了胞浆中病毒RNA复制子形成的频率我们使用Netgenell服务器程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)分析来自pICH4351中RNA复制子的序列，并且找到几个可能诱导备选剪接事件的内含子样序列特征。这样的一个特征是在RdRP开始处0.6kb富含尿嘧啶的区域(对应于GenBank登录号BRU03387中第827至1462位核苷酸)(图6A)。将pICH14833中的这个区域替换为PCR诱变的序列，该序列因替换54个核苷酸而不同于它的原始序列(附件中作为SEQ ID No.2给出的序列，图7)。替换52个核苷酸以便用多个富含GC的序列替换富含T的序列。全部核苷酸替换均为沉默替换以至不改变RdRP的蛋白质序列。这个诱变的片段还含有为了除去推定的隐蔽剪接供体部位和受体部位分别导入的两个核苷酸替换(在第829和1459位置，坐标相对于GenBank登录号BRU03387)。为测试这些突变的影响，将得到的克隆pICH15466(图2A)连同或不连同pICH10745(反式方式的运动蛋白)通过农杆菌浸润本塞姆氏烟草叶。浸润后8天，在pICH15466浸润的区域内(与pICH14833相比，
图10)观察到表达GFP的细胞数目增加10倍。这表明内含子样序列从病毒复制子中的去除防止了不想要的备选剪接事件并且导致更高效地启动病毒复制。pICH15466和pICH10745的共浸润引起修饰的复制子以类似于未修饰复制子的速度进行细胞至细胞的运动。这表明对RNA序列的修饰不影响病毒载体的细胞至细胞运动。
实施例7在MP亚基因组启动子内除去内含子样序列第二个潜在引起问题的区域对应于MP亚基因组启动子(图6B)。该区域T含量极丰富并且与内含子序列极其相似。因此内含子预测程序在附近序列中预测到众多隐蔽剪接供体部位和受体部位。然而不幸的是，不能轻易修饰该区域而不影响亚基因组启动子功能。我们决定彻底诱变整个区域并以反式方式提供MP以便互补预期的MP表达缺失。由于不从该构建体表达MP，我们还缺失MP序列的大部分，除了含有为驱动目的基因表达所需要的CP亚基因组启动子3 ′序列以外。因此，我们用诱变的297个碱基对片段替换pICH14833(GenBank登录号BRU03387中第4584至5455碱基对)中的383个碱基对片段。得到的构建体pICH15900(图2A)与或不与pICH10745通过农杆菌浸润于本塞姆氏烟草叶中。有趣的是，检测到启动复制的细胞数目与pICH14833浸润的叶面积相比显著增加。通过计数从浸润的叶面积所制备的表达GFP的原生质体，估计由这种修饰引起病毒复制启动的细胞数目与未修饰的pICH14833相比提高80至100倍。将pICH15900与pICH10745(p35S-MP表达盒)实施共浸润并检测到因细胞至细胞运动所致的GFP荧光增加。然而这种增加很有限，因为很多细胞甚至在无细胞至细胞运动时就已经表达GFP。用含有pICH15900的农杆菌属细菌的1000倍稀释混悬液与含有pICH10745农杆菌的未稀释混悬液实施共浸润，产生独立表达GFP的转化灶。荧光灶的亮度和大小与用pICH14833得到的对照灶相同。这表明在pICH15900中的修饰以及以反式方式递送MP没有削弱复制子有关复制水平、目的序列表达和细胞至细胞运动的功能。将相同的构建体(pICH14933和pICH15900，当存在或不存在pICH10745时)共浸润普通烟草叶。pICH15900中的修饰如同这些修饰在本塞姆氏烟草中所表现那样类似地导致启动复制的细胞数目增加(与pICH14833相比)。
实施例8内含子的添加改善胞浆中功能性RNA复制子形成的频率随后我们试验向编码所述复制子的所述序列部分中添加内含子是否可提高启动复制的频率。制得两种构建体pICH15025和pICH15034(图2A)。每种构建体在RdRP的两个不同区域中含有三个不同拟南芥菜内含子。将pICH 15025设计为在RdRP中央含有内含子，pICH15034在RdRP 3′末端、MP亚基因组启动子上游含有内含子。内含子通过PCR从拟南芥菜属基因组DNA中扩增并且使用在内含子/外显子预期接合处重叠的引物通过PCR掺入至病毒序列内。将含有内含子的片段亚克隆入pICH14833中作为产生pICH15025的Ava I HindIII片段(附件中的SEQ ID No.4或者作为产生pICH15034的Pst I Nco I片段(附件中的SEQ ID No.5)。
向本塞姆氏烟草叶内通过农杆菌浸润两个构建体并与pICH14833比较。两种构建体均显著增加启动病毒复制的细胞数目(
图10A)。预计这种增加是相对于pICH14833的50倍的提高。还将两种构建体与表达MP的克隆共浸润，并且发现细胞至细胞的运动与不带内含子的克隆相同。还在普通烟草中测试两种构建体并且观察与在本塞姆氏烟草中相同的改进(
图10B)。
产生第三种克隆pICH15499，该克隆含有全部六个6内含子(图9、2B、10A、10B)。在本塞姆氏烟草和普通烟草中测试此构建体。该构建体比含有三个内含子的每个独立构建体更高效，然而这种改进低于叠加性改进。
实施例9添加内含子和去除内含子样序列提高了胞浆中功能性RNA复制子的形成频率在一个构建体内去除内含子样特征并添加额外的内含子证实这两种修饰均可有益于改进病毒复制的启动。我们在含有诱变的MP亚基因组启动子区域的pICH15900内亚克隆pICH15499的六个内含子。向本塞姆氏烟草叶浸润得到的克隆pICH15860(图2B)并且发现克隆pICH15860比任何亲代克隆更好地发挥作用，使全部原生质体的大约50％至90％表达GFP(
图10)。性能最佳的构建体在RdRP区域和修饰的MP亚基因组启动子区域内含有内含子(pICH16191，
图10C)。与不带任何修饰的克隆相比，这代表了80至300倍的改进。还将该构建体与表达MP的构建体(pICH10745)共浸润并且发现修饰没有削弱细胞至细胞运动或复制。
实施例10添加内含子并不总是提高胞浆中功能性RNA复制子形成的频率我们在RdRP开始处插入两个不同拟南芥菜属启动子，产生克隆pICH15477(图2B)(该区域序列在附件中显示为SEQ ID No.7)。此区域的序列在添加内含子之前已极其类似“外显子样”(例如富含GC且没有隐蔽的剪接位点)。未观察到该构建体对启动病毒复制的改进。因此，添加内含子并不总是导致病毒载体的改进。所选用于插入内含子或诱变的位置似乎是重要参数。例如所有在靠近引起问题的结构如MP亚基因组启动子的区域内插入内含子或替换核苷酸均引起巨大改进，而将内含子插入已呈现“外显子样”的序列内未以显著方式改进病毒复制的启动。
实施例11在MP序列中插入内含子提高病毒复制子形成的频率首先通过限制性酶AvrII消化、补平和再连接在MP中产生一个移码。随后在MP中插入两个内含子。将得到的克隆pICH16422(图2B)浸润入本塞姆氏烟草叶中。检测到含有功能性病毒复制子的细胞数目增高大约100倍。
实施例12在含有MP的载体中插入内含子提高了自主的功能性克隆启动病毒复制的频率将KpnI EcoRI片段从pICH15499亚克隆至pICH8543。得到的克隆16700(图2B)含有在RdRP中带6个内含子的完整病毒载体。将该克隆浸润入本塞姆氏烟草叶中并且高效地启动复制。该克隆还能够在不需要以反式方式提供额外MP时进行从细胞至细胞运动。
实施例13在工程宿主植物中活化农杆菌递送的非活性复制子还可能在转基因植物中用农杆菌浸润含有内含子的病毒载体前体。为了防止意外感染本不用于产生所述目的蛋白质的植物(例如开放环境中的植物)，可产生载体的一部分以反义方向存在的非活性克隆(
图11)。在倒置片段末端掺入重组位点和内含子序列允许通过使用适宜的重组酶使该片段“翻转”至正确方向。重组位点将通过剪接从复制子中完全去除。前复制子中的内含子允许在重组和转录后高效地启动复制。在一个具体实施例中，重组位点位于目的基因内和前复制子下游。这种构型防止在重组前任何的基因表达。可以考虑其它构型，其中重组位点位于前复制子的其它区域例如RdRP内和启动子上游。内含子序列位于重组位点内的优势在于不但允许将重组位点从复制子中完全去除，而且如前所述还可以提高病毒复制的效率。提供重组酶活性的转基因植物宿主可得以设计并在含有非活性病毒载体前体的载体存在时用于农杆菌浸润。所述的病毒载体前体仅在所述工程植物宿主的细胞中才能活化。
实施例14植物病毒RNA序列含有潜在不稳定区域使用Netgenell服务器程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/)对选择的植物RNA病毒和一种充分表征的植物基因(AtDMC1)开展RNA图谱分析。
图12中所示AtDMC1的RNA图谱清楚表明存在先前通过比较cDNA和基因组DNA序列所鉴定的14个内含子(划圈部分)。显而易见如果将两种植物病毒置于植物核内环境中，这两种植物病毒的RNA图谱具有可能引起所述RNA的稳定性问题的区域(见
图13、14)。我们分析了其它几个植物病毒代表的RNA图谱(未显示)，如雀麦草花叶病毒、TMV不同毒株和许多其它病毒。如果将这些病毒作为DNA前体递送至植物细胞内，它们均具有可能削弱基于植物RNA病毒的复制子形成效率的潜在引起问题的区域。
实施例15用双生病毒载体进行整株植物浸润如WO 02077246的实施例10和11所述产生基于菜豆金黄花叶病毒(BGMV)分离株DSMZ PV-0094的表达载体pICH4300、pICH5202/3和pICH5170(
图15)。如实施例5中所述，用构建体pICH5170稳定转化本塞姆氏烟草和普通烟草植物。在VirE2功能缺损的根癌农杆菌和根癌农杆菌C58菌株内固定构建体pICH5202/3和pICH5170。将具有经固定的病毒复制子(pICH5202/3)的菌株用于pICH5170转化的完整烟草植物的农杆菌浸润。转基因植物宿主使在所谓共有区域(CR)内带双生病毒复制起点的携带GFP的DNA复制子复制。对于VirE2功能缺损的农杆菌属菌株，与未转化的根癌农杆菌C58一起开展农杆菌浸润。备选地，将pICHVirE2转化的本塞姆氏烟草植物与pICH5170转化的植物杂交。通过PCR选择含有来自两种构建体的T-DNA区域的F1子代并且与具有功能且携带pICH5202/3的农杆菌属一起用于农杆菌浸润。
将具有固定的病毒复制子(pICH5170)的菌株用于烟草属整株植物的农杆菌浸润。
上述实验的结果表明当使用VirE2功能缺损的菌株而不借助表达VirE2的转基因宿主植物或农杆菌互补所述功能时，在浸润的植物中不出现GFP表达。然而，在其中需要以反式方式互补VirE2功能的实验的表达水平与在根癌农杆菌C58中固定载体的表达水平间未表现显著差异。
实施例16生成细菌质粒接合转移缺损的突变体据描述tra和trb基因参与Ti质粒的接合转移(Farrand等，1996，J.Bacteriol.178，4233-4247；Li等，1999，J.Bacteriol.，181，5033-41)。为了将这些基因从根癌农杆菌菌株C58的Ti质粒中缺失，含有侧翼DNA区域的载体用于转化，由此通过两个连续重组事件导入缺失。用于缺失的载体基于载体pDNR-1r(Clontech)，该载体含有羧苄青霉素抗性作为阳性选择标记以及可引起蔗糖不耐性的sacB基因作为阴性选择标记。
为缺失tra基因(traG、traD、traC、oriT、traA、traF、traB、traH、tralW)，用引物oSM570(5′-gaggatccaacgtttaggagaaccag-3′)和oSM571(5′-ttggtctcacggtatacgcacactgaacatgcg-3′)以及oSM572(5′-ttggtctcaaccggtttccgtttgtctc-3′)和oSM573(5′-acgtctagagatcgcgttccagaccaac-3′)从农杆菌属C58 DNA中PCR扩增大约700碱基对的侧翼区域。连接BsaI消化的PCR片段后产生BstI1071限制性位点且未导入额外核苷酸；通过引物在末端更外侧导入一个BamHI位点和一个XbaI位点。在BamHI和XbaI消化的pDNR-1r载体内连接两个PCR片段。将得到的质粒pICF12721利用电穿孔法用于转化农杆菌属细菌，并且首先在羧苄青霉素上选择，然后在无抗生素，5％蔗糖存在时选择以便反向选择经历两次重组事件并不含载体主链的细胞。
为缺失trb基因(trbB、trbC、trbD、trbE、trbJ)，用引oSM566(5′-ctgaattcaggcaaacgcaccgtgagatg-3′)和oSM567(5′-tcaccatgggtcacgcggcactcctg-3′)以及oSM568(5′-tcaccatggcccaggcccggcgtgaac-3′)和oSM569(5′-acatctagatgccggcatcgaagatgttg-3′)从农杆菌属C58 DNA中PCR扩增大约700碱基对的侧翼区域。连接PCR片段后产生NcoI限制性位点且未导入额外核苷酸；通过引物在末端更外侧导入一个EcoRI位点和一个XbaI位点。在EcoRI和XbaI消化的pDNR-1r载体内连接两个PCR片段。如上所述将得到的质粒pICF12711用于转化农杆菌属细菌。
为测量农杆菌间的接合转移，通过卡那霉素抗性盒替换编码冠瘿碱结合阻遏物的accR基因，构建表现组成型转移的选择性Ti质粒。这可以通过载体pICF12741转化根癌农杆菌菌株C58产生，其中载体pICF12741同样基于载体pDNR-1r并含有使用引物oSM554(5′-gagctagctccgtccttcacctgggc-3′)和oSM555(5′-ttggtctcaccggccgatagccaaaaactgc-3′)以及oSM556(5′-ttggtctcgccggccaaactccggtttgc-3′)和oSM557(5′-atgggcccttcgaacgcaattcctgttgc-3′)从农杆菌属C58 DNA中PCR扩增的两个侧翼区域以及二者之间位于XmaIII位点内的卡那霉素抗性(用引物oSM584(5′-cctcggccgcgaacggcctcac-3′)和oSM585(5′-ctacggccgctgacagctaaaacaattcatcc-3′)从双元载体pICH18711中PCR扩增)。类似Piper和Farrand(1999，Appl Environ Microbiol.，65，2798-2801)所述，将具有抗卡那霉素的Ti质粒的菌株与染色体携带利福平抗性但没有Ti质粒的受体菌株GV3101在硝酸纤维素膜上28℃共同温育2小时。在含利福平和卡那霉素的平板上选择转接合子。对于携带acc缺失和完整tra和trb基因的Ti质粒，发现接合效率为每个输入供体大约3-4×10-4个转接合子。对于tra和trb突变体，接合效率低于检测极限(＜10-7)。
通过含有编码GFP的病毒载体pICH18711的细菌浸润本塞姆氏烟草植物测试这些突变对DNA向植物中转移的影响。使用多种稀释度的细菌以便可以在叶上观察到单个发荧光的点。DNA向植物转移的效率与不带acc、tra或trb缺失的细菌转移的效率可比。
实施例17自养性突变体的产生选择编码参与亮氨酸生物合成的3-异丙基苹果酸脱氢酶的leuB基因和编码参与尿苷生物合成的乳清酸磷酸核糖转移酶的pyrE基因用于产生自养性农杆菌菌株。由于leuB编码序列与位于农杆菌的染色体反义链上假定的蛋白质ATU2792的3′端重叠，因此不能将leuB编码序列完全缺失。因此，选择染色体1的第2792384-2793470碱基位置用于缺失，即通过天然存在在leuB编码序列5′末端的BspH I限制性位点将上游序列775个碱基对与下游序列834个碱基对连接。使用载体pDNR-1r(Clontech)在农杆菌靶基因内部产生缺失。
类似于leuB，pyrE基因的分解代谢性互补是不可能的。农杆菌中存在尿嘧啶磷酸核糖转移酶基因，因此可用较廉价的尿嘧啶替换尿苷补加。此外，可将pyrE缺失作为阳性选择标记使用。该选择利用野生型农杆菌对毒性尿嘧啶类似物5-氟乳清酸易感但pyrE突变体应当具抗性的事实。
在不同数据库中对pyrE起始密码子的解读不同(第394734-395534碱基位置，登录号NP_531105和第394836-395534碱基位置，登录号Q8U198)。但是在第394836碱基位置之前与其它pyrE序列不存在同源性。不过，设计了两种缺失变体(缺失始于染色体1的第394760或394849位置并且均在第395531位置处终止)。将含有缺失的片段克隆至载体pDNR-1r的EcoRI-BamH I位点，产生载体pICF1263(ΔleuB第2792384-2793470碱基位置)、pICF1264(ΔpyrE第394760-395531碱基位置)和pICF1265(ΔpyrE第394848-395531碱基位置)(见图21)。
农杆菌属菌株GV3101用质粒pICF1263-3(ΔleuB第2792384-2793470碱基位置)、pICF1264-1(ΔpyrE第394760-395531碱基位置)和pICF1265-10(ΔpyrE第394848-395531碱基位置)转化。在含有羧苄青霉素的培养基上选择两天后得到少量的转化体(6-10cfu/μg)。通过依次在液体LB+利福平和LB+利福平+蔗糖内生长所选择的克隆分离共整合体。通过PCR分析从LB+利福平+蔗糖培养物中分离的农杆菌属DNA而确认靶基因中含有目的缺失的农杆菌突变体。
在补加或不补加30mg/l和150mg/l亮氨酸的LB丰富培养基和M9极限培养基中生长突变株1263-3-3和1263-3-10以及野生型亲代菌株GV3101。在LB培养基中突变体和野生型菌株的生长无差异，而在M9培养基中仅野生型菌株能够生长。当向M9培养基补加亮氨酸，野生型和突变株均能生长。图22和23中显示了在含有和不含有补充物的培养基上不同突变株的生长。随亮氨酸浓度升高生长率增高。将农杆菌属突变体1263-3-3用GFP质粒pICH18711转化以分析该突变体在本塞姆氏烟草中的感染效率。
附件SEQ ID No.1 (pICH14833的Ncol-EcoRI片段)
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SEQ ID No.6(pICH15477的节段)gttttagttttattgcaacaacaacaacaaattacaataacaacaaacaaaatacaaacaacaacaacatggcacaatttcaacaaacaattgacatgcaaactctccaagccgctgcgggacgcaacagcttggtgaatgatttggcatctcgtcgcgtttacgataatgcagtcgaggagctgaatgctcgttccagacgtcccaaggtaaaacaacatttcattcacatatatgaatacttttgtcattgagtacgaagaagacacttactacttgttgatgaaagtttccgcctttatacttatctatatcattttcatcatttcaaactagtatgaaattaggtgatgtttatatgatatcatggaacattaatctatagggaaactgttttgagttagttttgtataatatttttccctgtttgatgttaggttcatttctccaaggcagtgtctacggaacagacactgattgcaacaaacgcatatccggagttcgagatttcctttactcatacgcaatccgctgtgcactccttggccggaggccttcggtcacttgagttggagtatctcatgatgcaagttccgttcggctctctgacctacgacatcggcggaaacttctccgcgcacctcttcaaaggtaattttctttctctactcaattttctccaagatccaatatttgaagactgatctatagttaaaattaatctctactccattcttgttacctcaggtcgcgattacgttcactgctgcatgc
权利要求
1.通过在植物或在植物叶中表达目的序列产生目的蛋白质的方法，包括a)以农杆菌属(Agrobacterium)菌株在互补性因子存在或不存在时转染所述植物或所述植物叶，所述农杆菌属菌株含有位于T-DNA中的具有编码复制子的序列部分的异源DNA序列，其中编码复制子的所述序列含有(i)对所述复制子的复制子功能必需的衍生自植物病毒的序列，和(ii)待表达的所述目的序列，b)任选地从步骤a)中浸润的所述植物或所述植物叶分离所述目的蛋白质，其中向所述农杆菌属菌株提供了使该农杆菌属菌株在所述互补性因子不存在时对用所述T-DNA转染生物呈缺损的第一遗传修饰。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一遗传修饰使所述农杆菌属菌株在向所述植物或植物叶的细胞内导入所述T-DNA所需的功能呈缺损。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述互补性因子提供了以所述T-DNA通过所述农杆菌属菌株转染所述植物或所述植物叶的细胞所需的功能。
4.根据权利要求3所述的方法，其中以所述T-DNA转染所述植物或所述植物叶的细胞所需的所述功能由选自VirE2、GALLS和VirF的基因或蛋白质提供。
5.根据权利要求1至4所述的方法，其中作为所述第一遗传修饰，将所述农杆菌属菌株转染所述生物所需的功能置于受化学调节的异源启动子控制下，并且所述互补性因子是能够调节所述化学调节的启动子的小分子化合物。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述互补性因子由第二农杆菌属菌株向所述植物或所述植物叶提供。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中向所述植物提供第二遗传修饰，该第二遗传修饰是所述的互补性因子或编码该互补性因子。
8. 根据权利要求2至8中任一项所述的方法，其中所述农杆菌属菌株具有自养性并且在该农杆菌属菌株自养生长所需的必需代谢物存在下向所述植物或所述植物叶提供所述农杆菌属菌株。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一遗传修饰使所述农杆菌属菌株具有自养性，并且所述互补性因子是所述农杆菌属菌株自养生长所需的必需代谢物。
10.根据权利要求2至7中任一项所述的方法，其中所述农杆菌属菌株是条件致死的并且在该农杆菌属菌株存活所需的代谢物存在时生长和/或向所述植物或所述植物叶提供所述农杆菌属菌株。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一遗传修饰使所述农杆菌属菌株是条件致死的，并且所述互补性因子是所述农杆菌属菌株存活所需的必需代谢物。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述农杆菌属菌株具有使该农杆菌属菌株对从所述农杆菌属的接合质粒转移或向所述农杆菌属的接合质粒转移呈缺损的进一步的遗传修饰。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述对接合转移的缺损由如下基因中至少一种基因的功能缺乏所致oriT、traG和traF。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中编码复制子的所述序列部分编码功能缺损的复制子，其中所述功能是所述复制子于所述植物内或于所述植物叶内扩散所需的功能。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述序列部分编码功能缺损的复制子，其中所述功能是所述复制子进行远距离运动或细胞至细胞运动所需的功能。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述复制子扩散所需的所述功能通过在所述植物或所述植物叶内从不同于所述异源DNA序列的核酸序列表达该功能而向该植物或该植物叶提供。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述农杆菌属菌株表达致癌抑制活性蛋白质Osa。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述农杆菌属菌株具有用于减少T-DNA向非靶生物转移的经遗传修饰的细胞密度感受或毒力诱导调节系统。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述互补性因子在所述植物或所述植物叶内通过反式剪接两种RNA序列提供，由此所述两种RNA序列中的至多一种序列由所述农杆菌属菌株编码。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述复制子是DNA复制子。
21.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述复制子是RNA复制子并且编码该RNA复制子的所述序列部分有效地连接至转录启动子。
22.根据权利要求21所述的方法，其中对复制子功能必需的所述序列在所选择区域处表现出与所述植物RNA病毒的功能保守性差异，所述差异导致与未显示所述差异的RNA复制子相比提高的复制子形成频率。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述的功能保守性差异包含除去分布在富含A/U区域侧翼的隐蔽剪接位点。
24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述的功能保守性差异包含在复制子功能必需的所述序列的富含A/U区域附近或内部插入一个或多个核内含子或一个或多个能够形成核内含子的序列。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述复制子对所述植物或所述植物叶内的细胞至细胞运动呈缺损。
26.根据权利要求21至25中任一项所述的方法，其中所述植物病毒是烟草花叶病毒属，优选地是烟草花叶病毒。
27.根据权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述的农杆菌属菌株是根癌农杆菌(A.Tumefaceiens)或发根农杆菌(A.rhizogenes)或工程化为含有农杆菌属来源的有功能的T-DNA转移遗传装置的其它微生物。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述遗传修饰在细菌染色体和/或质粒染色体上实施。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述植物或所述植物叶在步骤(a)中用所述农杆菌属菌株的混悬液浸润，所述混悬液具有所述农杆菌属菌株的如此细胞浓度，该细胞浓度对应于在600nm处至多0.04、优选地至多0.01、更优选地至多0.004以及最优选地至多0.001的计算光密度，其中所述计算光密度通过将600nm处OD1.0的农杆菌混悬液分别稀释至少25倍、优选地至少100倍、更优选地至少250倍和最优选地至少1000倍进行定义。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述植物或所述植物叶属于如下种中的一个种本塞姆氏烟草(Nicotiana benthamiana)、普通烟草(Nicotiana tabacum)、矮牵牛(Petunia hybrida)、芸苔(Brassicacampestris)、芥菜型油菜(B.Juncea)、水芹、紫花南芥、芥菜、草莓菠菜、头状藜(Chenopodium capitatum)、莴苣、向日葵和黄瓜。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述的转染通过浸润所述植物或所述植物叶实施。
32.通过在植物或在植物叶中表达目的序列产生目的蛋白质的方法，包括(a)以农杆菌属菌株在互补性因子存在或不存在时转染所述植物或所述植物叶，所述农杆菌属菌株含有位于T-DNA中的具有编码复制子的序列部分的异源DNA序列，其中编码RNA复制子的所述序列含有(i)对所述RNA复制子的复制子功能必需的衍生自植物病毒的序列，和(ii)待表达的所述目的序列，(b)任选地从步骤(a)中浸润的所述植物或所述植物叶分离所述目的蛋白质，其中向所述农杆菌属菌株提供了使该农杆菌属菌株在所述互补性因子不存在时对用所述T-DNA转染生物呈缺损的第一遗传修饰，并且其中对复制子功能必需的所述序列在所选择区域处表现与所述植物RNA病毒的功能保守性差异，所述差异导致与不显示所述差异的RNA复制子相比提高的复制子形成频率。
33.通过在植物或在植物叶中表达目的序列产生目的蛋白质的方法，包括(a)以农杆菌属菌株在互补性因子存在或不存在时转染所述植物或所述植物叶，所述农杆菌属菌株含有位于T-DNA中的具有编码复制子的序列部分的异源DNA序列，其中编码RNA复制子的所述序列含有(i)对所述RNA复制子的复制子功能必需的衍生自植物病毒的序列，和(ii)待表达的所述目的序列，(b)任选地从步骤(a)中浸润的所述植物或所述植物叶分离所述目的蛋白质，其中向所述农杆菌属菌株提供了使该农杆菌属菌株在所述互补性因子不存在时对用所述T-DNA转染生物呈缺损的第一遗传修饰，并且其中对复制子功能必需的所述序列含有一个或多个核内含子。
34.通过在植物或在植物叶中表达目的序列产生目的蛋白质的方法，包括(a)以农杆菌属菌株在互补性因子存在或不存在时转染所述植物或所述植物叶，所述农杆菌属菌株含有位于T-DNA中的具有编码复制子的序列部分的异源DNA序列，其中编码RNA复制子的所述序列含有(i)对所述RNA复制子的复制子功能必需的衍生自植物病毒的序列，和(ii)待表达的所述目的序列，(b)任选地从步骤(a)中浸润的所述植物或所述植物叶分离所述目的蛋白质，其中向所述农杆菌属菌株提供了使该农杆菌属菌株在所述互补性因子不存在时向所述植物或植物叶的细胞内导入所述T-DNA所需的功能呈缺损的第一遗传修饰，并且其中所述农杆菌属菌株具有使该农杆菌属菌株对于向其它细菌接合转移质粒DNA呈缺损的进一步的遗传修饰。
35.通过在植物或在植物叶中表达目的序列产生目的蛋白质的方法，包括(a)以农杆菌属菌株在互补性因子存在或不存在时转染所述植物或所述植物叶，所述农杆菌属菌株含有位于T-DNA中的具有编码复制子的序列部分的异源DNA序列，其中编码RNA复制子的所述序列含有(i)对所述RNA复制子的复制子功能必需的衍生自植物病毒的序列，和(ii)待表达的所述目的序列，(b)任选地从步骤(a)中浸润的所述植物或所述植物叶分离所述目的蛋白质，其中向所述农杆菌属菌株提供了使该农杆菌属菌株在所述互补性因子不存在时向所述植物或植物叶的细胞内导入所述T-DNA所需的功能呈缺损的第一遗传修饰，并且其中所述农杆菌属菌株对其自养生长所需的必需代谢物呈自养。
36.通过在植物或在植物叶中表达目的序列产生目的蛋白质的方法，包括(a)以农杆菌属菌株在互补性因子存在或不存在时转染所述植物或所述植物叶，所述农杆菌属菌株含有位于T-DNA中的具有编码复制子的序列部分的异源DNA序列，其中编码RNA复制子的所述序列含有(i)对所述RNA复制子的复制子功能必需的衍生自植物病毒的序列，和(ii)待表达的所述目的序列，(b)任选地从步骤(a)中浸润的所述植物或所述植物叶分离所述目的蛋白质，其中向所述农杆菌属菌株提供了使该农杆菌属菌株在所述互补性因子不存在时向所述植物或植物叶的细胞内导入所述T-DNA所需的功能呈缺损的第一遗传修饰，所述农杆菌属菌株对其自养生长所需的必需代谢物呈自养，并且对复制子功能必需的所述序列含有一个或多个核内含子。
37.多组分的试剂盒，其包含(i)如权利要求1中定义的农杆菌属菌株和(ii)编码能互补权利要求1中所定义的农杆菌属菌株的缺损的互补性因子的植物或其种子。
38.多组分的试剂盒，其包含(i)如权利要求1中定义的农杆菌属菌株和(ii)编码能互补权利要求1中所定义的农杆菌属菌株的缺损的互补性因子的第二农杆菌属菌株。
39.农杆菌属的细菌，其特征在于(i)具有使所述细菌在互补性因子不存在时向植物或植物叶的细胞内导入T-DNA所需的功能呈缺损的第一遗传修饰，(ii)向其它细菌转移质粒的接合能力呈缺损，(iii)是自养的。
40.权利要求39的细菌，其中所述农杆菌属菌株含有位于T-DNA中的具有编码复制子的序列部分的异源DNA序列，其中编码复制子的所述序列含有(i)对植物中所述复制子的复制子功能必需的衍生自植物病毒的序列，和(ii)在应用所述细菌的植物中待表达的目的序列。
全文摘要
通过在植物或植物叶中自目的序列表达目的蛋白质而产生该目的蛋白质的方法，包括a)通过以农杆菌属菌株在互补性因子存在时浸润所述植物或所述植物叶而转染该植物或该植物叶，所述农杆菌属菌株含有位于T－DNA中的具有编码复制子的序列部分的异源DNA序列，其中编码复制子的所述序列含有对所述复制子的复制子功能必需的衍生自植物病毒的序列和待自所述复制子表达的所述目的序列，b)任选地从步骤a)中浸润的所述植物或所述植物叶分离所述目的蛋白质，其中向所述农杆菌属菌株提供了使该农杆菌属菌株在所述互补性因子不存在时对用所述T－DNA转染生物呈缺损的第一遗传修饰。
文档编号A01H5/12GK1981042SQ200580022815
公开日2007年6月13日 申请日期2005年7月7日 优先权日2004年7月7日
发明者S·马里约内, C·恩格勒, S·米尔鲍尔, S·赫茨, S·维尔纳, V·克利姆克, Y·格莱巴 申请人:爱康遗传股份公司