病毒载体的制作方法

专利名称：病毒载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及与此前已知的毒株相比具有改善的抗肿瘤活性的疱疹病毒株。
背景技术：
已经表明在许多情况下，病毒在生物技术和药物的各种应用中都具有有效性。而每种应用都归功于病毒具有高效进入细胞的独特能力。在这类应用中，该能力继之以病毒基因表达和复制，和/或插入的外源基因的表达。因此，病毒可以运送并在细胞中表达病毒基因或其它基因，所述其它基因为在例如基因治疗或疫苗开发中有效的基因，或者在通过裂解性复制选择性杀伤细胞的过程中或在对诸如肿瘤中运送的基因的作用中有效的基因。
已经表明单纯疱疹病毒(HSV)在肿瘤的溶瘤细胞治疗中有效。用于治疗肿瘤的病毒必须是有缺陷的从而不再具有致病性，即不在非肿瘤细胞中复制也不使之被杀伤，但是仍然能够进入并杀伤肿瘤细胞。对于还可以包括运送增强疗效的基因在内的肿瘤溶瘤细胞治疗而言，已经鉴定了许多HSV突变，这些突变使病毒仍然能够在培养物或在体内活跃分裂的细胞中(如肿瘤中)复制，但是阻止其在正常组织中的大量复制。这些突变包括破坏编码ICP34.5、ICP6和胸苷激酶的基因。其中，具有ICP34.5突变，或者ICP34.5和诸如ICP6同时突变的病毒目前已经显示出有利的安全性特征。已经显示仅缺失神经毒性因子ICP34.5的病毒，能够在许多类型的体外肿瘤细胞中复制，并能够在人为诱导的小鼠脑肿瘤中选择性复制而不累及周围的组织。前期的临床试验也显示出其在人体中的安全性。

发明内容
本发明提供对体内肿瘤细胞的杀灭能力有所改善的病毒。本发明所提供的病毒包括编码ICP34.5的基因的失活突变，且能够运送两个相结合后可以增强疗效的基因。所述病毒包括来自一个或多个以下类型的基因编码前体药物活化酶的基因，该酶能够将无活性或活性极低的前体药物转化为有活性或活性更高的形式。因此用该病毒对肿瘤的治疗伴有前体药物的给予。
编码能够融合细胞的蛋白的基因(即导致合胞体的形成)。其本身就可以由诱导免疫应答的介导而产生抗肿瘤作用。而与前体药物激活相结合后，这种抗肿瘤作用增强。这种融合基因包括修饰过的逆转录病毒被膜糖蛋白，例如来自长臂猿白血病病毒或人内源性逆转录病毒W；来自麻疹病毒的融合F和H蛋白或水泡性口膜炎病毒G蛋白。但其它编码能够导致细胞融合的蛋白的基因也可以使用。
编码免疫调节蛋白的基因。所述免疫调节蛋白促进抗肿瘤免疫应答。这类基因包括免疫调节剂，例如GM-CSF、TNFα、CD40L或其它细胞因子或共刺激分子。所述免疫调节蛋白增强前体药物活化基因和/或能够导致细胞和细胞单独融合的蛋白的作用。因此，本发明的病毒包括编码前体药物活化基因和免疫调节基因，但是不编码能够导致细胞和细胞融合的蛋白基因的病毒，以及编码能够导致细胞和细胞融合的蛋白和免疫调节基因，但是不编码前体药物转化基因的病毒。
因此，本发明提供能够对肿瘤细胞进行溶瘤细胞杀灭的病毒，其中当对患者给药时，可选地与前体药物结合，所述病毒的抗肿瘤特性通过活化的前体药物以及病毒基因组所表达的融合和/或免疫调节蛋白的联合作用，或者通过病毒基因组所表达的融合蛋白和免疫调节蛋白的联合作用而增强。
因此，本发明提供缺少功能性ICP34.5编码基因且包括以下两种或更多种的疱疹病毒(i)编码前体药物转化酶的基因；(ii)编码能够导致细胞和细胞融合的蛋白基因；以及(iii)编码免疫调节蛋白的基因。
优选所述疱疹病毒缺少功能性ICP34.5编码基因且包括(i)编码前体药物转化酶的基因；以及(ii)编码导致细胞和细胞融合的蛋白的基因。
本发明还提供-本发明用在对人或动物体进行治疗的方法中的疱疹病毒。
-本发明的疱疹病毒在治疗癌症的药物的制造中的用途。
-包括作为活性成分的本发明的疱疹病毒和药学可接受的载体或稀释剂的药物组合物。
-对需要治疗的个体进行抗肿瘤治疗的方法，该方法通过给予所述个体有效量的本发明疱疹病毒进行治疗。


图1显示用来构建本发明的病毒的质粒，并阐明质粒的构建方法。所述质粒编码胞嘧啶脱氨酶基因或者长臂猿白血病病毒(GALV)融合糖蛋白或者这两个基因，其侧翼是和ICP34.5编码基因侧翼相接的HSV1序列。所述质粒可以用来同源重组到HSV1基因中，从而用胞嘧啶脱氨酶基因、GALV糖蛋白基因或全部二者取代ICP34.5编码基因。然后将所述质粒用于构建图2中所示的病毒。
图1a显示从pORF Fcy:Fur(Invitrogen)至pRcRSV(Invitrogen)的Fcy:Fur基因。Fcy:Fur基因通过限制性内切酶消化(Nhe I和Nco I(用T4聚合酶钝化))而除去。然后，将该片段连接到用Xba I和Hind III(用T4聚合酶钝化)酶切过的pRcRSV(Invitrogen)上。
图1b显示通过限制性内切酶消化(Pvu II，NruI)RSV Fcy:Fur pA表达盒从pRcRSV到p-34.5的亚克隆。然后将该片段连接到用NotI(用T4聚合酶钝化)酶切过的穿梭载体p-34.5上。p-34.5质粒是基于pSP72(Promega)且在HSV-1 ICP34.5基因的两侧具有两个侧翼区(基于HSV-117+毒株(123462-124958bp，125713-126790bp)Genbank X14112)。
图1c显示长臂猿白血病病毒被截短的被膜(env)(GenbankNC_001885，5552-7555bp)，该基因通过病毒发生细胞株的RT-PCR获得(MLV 144，Rangan et al.，1979)。将所述被膜(GALV env R-)克隆到pcDNA3(Invitrogen)(通过Eco RI和Not I限制性内切酶消化)，检测哺乳动物表达载体与三个克隆的合胞体产生情况。
图1d显示通过采用Not I消化、用T4聚合酶钝化并重新连接使pcDNA3 GALV env R-中的Not-1位点敲除。
图1e显示通过PCR(Promega)，GALV env R-病毒(GenbankNC_001885，5552-7555bp)从pcDNA3(Invitrogen)到pGEM T Easy的亚克隆。
图1f显示通过限制性内切酶消化(Not I)，GALV env R-从pGEM T Easy(Promega)到p-34.5的亚克隆。p-34.5质粒基于pSP72(Promega)且在HSV-1 ICP34.5基因的任一侧具有两个侧翼区(基于HSV-1 17+毒株(123462-124958bp，125713-126790bp)Genbank X14112)。
图1g显示最终的穿梭质粒，该质粒包括ICP34.5侧翼区(基于HSV-117+毒株(123462-124958bp，125713-126790bp)Genbank X14112)，并在CMV启动子和BGH poly A(Invitrogen)控制下表达长臂猿白血病病毒截短的被膜(env)(Genbank NC_001885，5552-7555bp)。
图1h显示通过限制性内切酶消化(Pvu II，NruI)，RSV Fcy:Fur pA表达盒从pRcRSV到p-34.5 GALV(**)的亚克隆。然后将该片段连接到用Nru I酶切过的穿梭质粒p-34.5 GALV上。p-34.5质粒基于pSP72(Promega)，该质粒在HSV-1 ICP34.5基因的任一侧具有两个侧翼区(基于HSV-1 17+毒株(123462-124958bp，125713-126790bp)Genbank X14112)，并在CMV启动子和BGH poly A(Invitrogen)控制下表达长臂猿白血病病毒截短的被膜(env)(Genbank NC_001 885，5552-7555bp)。
图2为本研究中的病毒载体的示意图。从其它方面健康的志愿者的唇疱疹上分离得到HSV-1毒株JS1(Liu et al 2003)。JS1/34.5-/47-具有两处缺失。第一个包括ICP34.5基因的编码区的删除(基于HSV-1毒株17+序列的核苷酸124948-125713)。第二个包括ICP47中280bp的缺失(基于HSV-1毒株17+序列的核苷酸145570-145290)(Liu et al 2003)。JS1/34.5-/GALVenv R-/47-在CMV启动子控制下表达长臂猿白血病病毒的逆转录病毒被膜-R-肽(Genbank NC_001885，5552-7555bp)(Bateman etal 2000，Galanis et al 2001)。JS1/34.5-/RSV/Fcy:Fur/47-在RSV启动子控制下表达酶前体药物活化剂酵母胞嘧啶脱氨酶与尿嘧啶磷酸核糖基转移酶的融合(Invivogen)。JS1/34.5-/GALV/env R-/Fcy:Fur/47-与融合的逆转录病毒被膜和酶前体药物活化剂结合。
图3显示肿瘤细胞通过GALV env R-的融合。斑块表示在用大鼠RG2细胞感染并用结晶紫染色后的JS1/34.5-/47-(A)和JS1/34.5/47-/GALV(B)。
图4显示在存在或不存在5-氟胞嘧啶(5-FC)的情况下，在用对照组病毒、JS1/34.5-/47-、JS1/34.5-/47-/Fcy:Fur或JS1/34.5-/47-/GALV/Fcy:Fur感染48小时后，来自HT1080细胞的上清液的效果。然后将所述上清液加热灭活，并随后加入新鲜的HT1080细胞中保持72小时。右方下侧的两组显示细胞几乎全部死亡，这表明5-氟胞嘧啶已经被含有Fcy:Fur的病毒转化为5-氟尿嘧啶。
图5显示JS1/34.5-/47-、JS1/34.5/47-/GALV、JS1/34.5-/47-/Fcy:Fur病毒对植入大鼠的肿瘤的收缩效应。大鼠9L肿瘤细胞被植入Fischer大鼠的胁腹部并使其生长至肿瘤直径达到大约4-5mm。然后在第7、10、13、17和20天，对五只一组的大鼠用50μl 1×10esp8pfu/ml的前述病毒进行肿瘤内注射。在第9、11、12、14、16、18、19、21、23、24、25和26天通过腹腔途径给予500mg/kg的5-氟胞嘧啶，并测量肿瘤直径。误差线代表标准偏差。
具体实施例方式
A.病毒本发明的疱疹病毒能够有效感染肿瘤细胞靶标。在该病毒中编码ICP34.5的基因是失活的。ICP34.5的突变使其具有选择性溶瘤细胞的活性。尽管可以采用任何使ICP34.5无功能的突变，但是Chou et al，1990和Maclean et al，1991中叙述了合适的ICP34.5基因突变。还可以使编码ICP47、ICP6和/或胸苷激酶的基因失活，其他基因也可以，只要这种失活能够显著降低溶瘤细胞效应，或者这种缺失增强病毒的溶瘤细胞或其它有利特性。如果编码ICP47的基因突变，那么它可以以以下方式突变与通常情况下相比，其突变导致附近的US11基因在HSV复制循环的较早时期表达。这类突变在Liu et al，2003中有所叙述。本发明的病毒另外还编码前体药物活化酶、能够导致细胞和细胞融合的蛋白以及免疫调节蛋白中的两个或更多个。
此处所使用的有关疱疹病毒基因的术语是通常用于HSV基因的术语。如果本发明的疱疹病毒来自非HSV疱疹病毒，则所提及的各HSV基因的功能等效物是无活性的。作为HSV基因的功能等效物的非HSV基因和HSV基因执行同样的功能且与HSV基因具有一定程度的序列同源性。功能等效物可以与HSV基因具有至少30％，例如至少40％或至少50％的同源性。同源性可以按以下方法确定。
为上述目的而改变的病毒区域可以是缺失的(完全或部分)，使失去功能的，或被其它序列取代的，尤其是被编码前体药物转化酶的基因、编码能够导致细胞和细胞融合的蛋白的基因或编码免疫调节蛋白的基因取代。
本发明的病毒可以来自单纯疱疹病毒HSV毒株。所述HSV毒株可以是HSV1或HSV2毒株或其衍生物，且优选HSV1。衍生物包括含有来自HSV1和HSV2毒株DNA的型间重组体(inter-type recombinants)。这种型间重组体在本领域已有所叙述，例如在Thompson et al，1998和Meignieret al，1988中。衍生物优选与HSV1或HSV2基因组具有至少70％的序列同源性，更优选至少80％，更优选至少90或95％。更优选，衍生物与HSV1或HSV2基因组具有至少70％的序列同一性，更优选至少80％的同一性，更优选至少90％、95％或98％的同一性。
例如，UWGCG软件包提供了BESTFIT程序，该程序可以用于计算同源性(例如在其默认设置上使用)(Devereux et al.(1984)Nucleic AcidsResearch 12，p387-395)。PILEUP和BLAST算法可以用于计算同源性或序列比对(通常在其默认设置上)，例如在Altschul(1993)J.Mol.Evol.36290-300；Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215403-10中所述的。
执行BLAST分析的软件可以通过National Centre forBiotechnology Information(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法包括首先通过在查询序列中确定长度为W的短字长(当与数据库的序列中具有相同长度的字长比对时，该字长能够匹配或满足某个为正数的阈值分数T)，从而确定打分高的序列对(HSPs)。T被称作相邻字长的打分阈值(Altschul et al.，1990)。这些被命中的初始相邻字长用作发动搜索的种子，以找到含有它们的HSPs。被命中的字长沿每条序列向两个方向延伸，直至所累积的比对分值增加。当累积的比对分值从其达到的最高分值开始以X数量下降时；由于一个或多个打负分的残基比对的积累，而使累积的分值降至零或以下时；或者有一条序列达到终点时，被命中的字长在每个方向上的延伸终止。BLAST算法的参数W，T和X决定了比对的灵敏度和速度。所述BLAST程序所采用的默认状态为长度(W)为11的字长、BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919)、比对(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝4以及对两条链都进行比较。
BLAST算法执行两条序列之间相似性的统计分析；参见例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 905873-5787。由BLAST算法提供的相似性的一个测量值是最小总概率(P(N))，它提供了在两个核苷酸或氨基酸序列之间出现偶然匹配的概率的指标。例如，如果当一个序列与另一个序列比较时，最小总概率小于约1，优选小于约0.1，更优选小于约0.01且最优选小于约0.001，那么第一个序列被认为与第二个序列相似。
衍生物可以具有经核苷酸置换修饰的HSV1或HSV2基因组的序列，所述置换例如从1、2、或3至10、25、50或100个置换。所述HSV1或HSV2基因组可以另外通过一个或多个插入和/或缺失而被修饰，和/或通过在两端或任一端延长而被修饰。
本发明的病毒毒株可以是“非实验室”毒株。这也可以被称为“临床”毒株。本领域技术人员易于区分实验室毒株和非实验室毒株或临床毒株。以下给出了对病毒毒株可能表现的特性的进一步指导。
实验室和非实验室毒株的关键区分方法是目前普遍使用的实验室毒株已经在培养基中存在了很长时间，在某些情况下已经很多年。所有的HSV实验室毒株最初是从感染个体中分离，因此是来自临床毒株。诸如HSV的病毒培养涉及连续传代的技术。为了培养病毒并使其存活，用病毒感染合适的细胞，病毒在细胞内复制，然后收获病毒；然后使新鲜的细胞再感染，这个过程构成了连续传代的一个循环。在例如HSV的情况下，每一个这样的循环要花费几天的时间。如以上所讨论的，这种连续传代会导致病毒毒株特性的改变，因为发生了对有利于在培养基中生长的选择(例如快速复制)，这不符合对实际应用有用的特性，例如在HSV的情况下保持沿轴突传播的能力，或感染人类细胞的能力。
目前所使用的实验室毒株包括HSV-1毒株F、HSV-1毒株17+以及HSV-1毒株KOS。在本发明中有用的非实验室毒株，与具有相当的修饰的HSV-1毒株F、HSV-1毒株17+以及HSV-1毒株KOS相比，通常具有改善的溶瘤细胞活性。
非实验室毒株是最近才从感染个体中分离的。本发明的非实验室毒株是最近才分离的已经修饰过的毒株，因此编码ICP34.5的基因失活，从而不能表达功能性ICP34.5蛋白，并且包括编码前体药物活化蛋白的基因、编码能够导致细胞融合的蛋白和/或免疫调节蛋白的基因。本发明的病毒将会有一段时间处于培养基中，从而产生所必须的修饰，但是处于培养基中的时间都相当短。临床分离物在修饰之前可以冷冻以保存，或者可以在修饰完成之后再冷冻。本发明的毒株以能够基本保持它们所来源的原始临床分离物的所希望特性的方式制备。
如果亲代病毒毒株被诱变以产生该病毒，则本发明的病毒毒株来自亲代病毒毒株。例如，本发明的病毒可以来自临床分离物JS1。这种JS1-来源的病毒的亲代毒株可以是JS1或其它来自JS1的HSV1毒株。因此本发明的病毒可以是JS1毒株，该毒株缺少功能性ICP34.5编码基因并且包括两个或更多个编码前体药物转化酶基因、编码能够导致细胞和细胞融合的蛋白的基因以及编码免疫调节蛋白基因。此外，这种病毒可以包括任何其它突变，例如此处所提及的突变。
本发明的病毒能够有效感染人类癌细胞靶标。当这种病毒为非实验室或临床毒株时，它是最近从HSV感染个体中所分离的，然后筛选所需的促进复制、感染或杀伤体外和/或体内肿瘤和/或其它细胞的能力(与标准的实验室毒株，例如HSV-1毒株F、KOS和17+相比)。然后对本发明的这种与实验室病毒毒株相比具有改善的特性病毒进行处理，以使其缺少功能性ICP34.5基因并编码两个或更多个下列基因前体药物活化酶的基因，能够导致细胞和细胞融合的蛋白的基因以及编码免疫调节蛋白的基因，其中所述基因处于合适的启动子的控制之下。如果自从来自宿主的未修饰临床亲代毒株被分离后，病毒毒株在培养基中存在了三年或三年以下，那么该病毒毒株就是最近所分离的。更优选，所述毒株在培养基中存在一年或一年以下，例如九个月或更短，六个月或更短，三个月或更短，两个月或更短，一个月或更短，两周或更短或者一周或更短。这种对存在于培养基中的时间的定义是指实际上存在于培养基中的时间。因此，例如通常的做法是使病毒毒株冷冻以使其保存。显然，通过冷冻或以相当的方式保存并不能被认为是将毒株保存在培养基中。因此，毒株被冷冻或以其它方式保存的时间并不包括在上述的存在于培养基中的时间的定义之内。存在于培养基中的时间通常是实际上经历连续传代所花费的时间，即，对能够发生不需要的特性的选择的时间。
优选，自从来自宿主的未修饰临床原代毒株被分离后，非实验室病毒毒株经历1,000或低于1,000个循环的连续传代。更优选，所述毒株经历500个或以下，100个或以下，90个或以下，80个或以下，70个或以下，60个或以下，50个或以下，40个或以下，30个或以下，20个或以下，10个或以下，5个或以下，4个或以下，3个或以下，2个或1个所述循环。
优选，通过标准统计学检验测定，非实验室病毒与具有相当修饰的相关实验室毒株相比，具有更强的执行某些在将来的应用中有用的功能的能力。在用溶瘤病毒治疗肿瘤的情况下，本发明的非实验室病毒毒株优选与具有相当修饰的相关实验室毒株相比，具有更强的感染肿瘤细胞或在肿瘤细胞中复制，杀伤肿瘤细胞或在组织中的细胞间传播的能力。更优选，这种更强的能力是在统计学上具有显著性的更强能力。例如根据本发明，对于所测定的特性而言，本发明的非实验室毒株可以比相关毒株的能力强1.1倍，1.2倍，1.5倍，2倍，5倍，10倍，20倍，50倍或100倍。优选，所述相关毒株选自HSV-1毒株17+、HSV-1(F)和HSV-1 KOS。
对此处所叙述的特性的统计学分析可以通过标准检验，例如t-检验、ANOVA或卡方检验来实现。通常，统计学显著性检测至p＝0.05(5％)，更优选p＝0.01p，p＝0.001，p＝0.0001，p＝0.000001的水平。
本发明的病毒感染肿瘤细胞并在肿瘤细胞中复制，随后杀伤肿瘤细胞。因此，这种病毒具有复制的能力。优选，所述病毒具有在肿瘤细胞中选择性复制的能力。这意味着它们在肿瘤细胞复制但不在非肿瘤细胞中复制，或者它们在肿瘤细胞中的复制比在非肿瘤细胞中更有效。例如，当所述病毒被用于治疗中枢神经系统的肿瘤时，该病毒能够在肿瘤细胞中复制而不在周围的神经元细胞中复制。病毒在其中能够复制的细胞是允许细胞。对选择性复制能力的测定可以通过此处所叙述的用于测定复制和肿瘤细胞杀伤能力的试验来实施，并根据需要通过此处所提及的统计学方法来分析。
对于肿瘤细胞而言，病毒毒株的特性可以以任何本领域已知的方式来测定。例如，病毒感染肿瘤细胞的能力可以通过对测定给定百分比的细胞(例如50％或80％的细胞)所需的病毒量的检测来定量。在肿瘤细胞中复制的能力可以通过生长测定法(例如实施例所执行的生长测定法，如通过测定在6，12，24，36，48或72小时或更长时间内病毒在细胞中的生长情况)来检测。
病毒杀伤肿瘤细胞的能力可以通过肉眼粗略定量，或通过计算在给定时间点的时间后残存的活细胞数量和给定细胞类型的MOI更准确地定量。例如，可以在24、48或72小时后进行比较并使用任何已知类型的肿瘤细胞。具体而言，可以使用HT29大肠腺癌、LNCaP.FGC前列腺癌、MDA-MB-231乳腺癌、SK-MEL-28恶性黑色素瘤或U-87 MG成神经胶质星形细胞瘤细胞。可以使用所述细胞类型的任何一种或所述细胞类型的任何组合，也可以使用其它类型的肿瘤细胞。为此，可能需要构建肿瘤细胞类型的标准组。为了计算在给定的时间点残存的活细胞的数目，可以计算不合锥虫蓝的细胞(即活细胞)的数目。还可以通过荧光激活细胞分选术(FACS)或MTT检测实现定量。肿瘤细胞杀伤能力还可以在体内测定，例如通过测定由于特定病毒造成的肿瘤体积的减小。
为了确定本发明病毒的特性，通常需要使用标准实验室相关毒株用来比较。可以使用任何合适的标准实验室相关毒株。在HSV的情况下，优选使用一种或多种HSV1毒株17+、HSV1毒株F或HSV1毒株KOS。相关毒株通常具有与本发明所检测的毒株相当的修饰。因此，所述相关毒株通常具有相当的修饰，例如基因缺失和外源基因的插入。在本发明的病毒的情况下，当ICP34.5编码基因失去功能时，该ICP34.5编码基因在相关毒株中也失去功能。对相关毒株进行的修饰可以与对本发明毒株的修饰相同。这意味着相关毒株中基因的破坏与本发明的毒株中的基因的破坏处于完全相同的位置，例如缺失具有相同的大小且发生在相同的位置。类似的，在本实施方案中，外源基因插入在相同的位置，由相同的启动子驱动等等。但是，产生相同的修饰并不是必需的。重要的是，所述相关基因具有在功能上相当的修饰，例如相同的基因失去功能和/或插入一个或多个相同的外源基因。
B.突变方法可以通过本领域所熟知的一些技术使所涉及的各种基因在功能上失活。例如，可以通过缺失、置换或插入，优选通过缺失使其在功能上失活。缺失可以除去基因的一个或多个部分或整个基因。例如，可以产生导致移码的仅一个核苷酸的缺失。但是，优选产生更大的缺失，例如至少25％，更优选至少50％的全部编码和非编码序列(或者，从绝对项来说，至少10个核苷酸，更优选至少100个核苷酸，最优选至少1000个核苷酸)。特别优选的是，除去整个基因以及部分侧翼序列。当基因的两个或更多个拷贝出现在病毒基因组中时，优选基因的两个拷贝都在功能上失活。
通过本领域技术人员所熟知的同源重组方法对疱疹病毒进行突变。例如，HSV基因组DNA和包括侧翼与同源HSV序列相接的突变序列的载体(优选质粒载体)一起转染。所述突变序列可以包括缺失、插入或置换，所有这些突变都可以通过常规技术来构设。插入序列可以包括选择性标志基因，例如lacZ或绿色荧光蛋白(GFP)基因，所述基因可用于筛选重组病毒，例如，β-半乳糖苷酶活性或荧光。
C.外源基因和启动子本发明的病毒携带两个或更多个编码前体药物活化酶的外源基因、编码能够导致细胞和细胞融合的蛋白的外源基因以及编码免疫调节蛋白的外源基因。优选本发明的病毒包括编码前体药物活化酶的外源基因以及编码融合蛋白的外源基因和编码免疫调节蛋白的外源基因中的一个或二者全部。所述融合蛋白还可以起免疫调节蛋白的作用。
优选，所述前体药物活化蛋白是胞嘧啶脱氨酶。胞嘧啶脱氨酶基因能够将无活性的前体药物5-氟胞嘧啶转化为活性药物5-氟尿嘧啶。能够获得各种胞嘧啶脱氨酶基因，包括细菌来源和酵母来源的。第二个基因，即通常编码第二个酶的基因，可以被用于增强胞嘧啶脱氨酶基因的前体药物转化活性。例如，该第二个基因可以编码尿嘧啶磷酸核糖基转移酶，如在图2中所述的病毒。
可以使用任何合适的编码能够导致细胞和细胞融合的蛋白的融合基因。优选能够导致细胞和细胞融合的蛋白选自修饰过的逆转录病毒被膜糖蛋白，例如来自长臂猿白血病病毒(GALV)或人内源性逆转录病毒W的被膜糖蛋白，来自麻疹病毒的融合F和H蛋白以及水泡性口膜炎病毒G蛋白。更优选，能够导致细胞和细胞融合的蛋白是GALV融合糖蛋白。
免疫调节基因可以是任何编码能够调节免疫应答的蛋白的基因。能够调节免疫应答的蛋白可以是细胞因子，例如GM-CSF、TNF-α、白细胞介素(例如IL12)；趋化因子，例如RNATES或巨噬细胞炎症蛋白(例如MIP-3)；或其它免疫调节分子，例如B7.1、B7.2或CD40L。能够导致细胞和细胞融合的蛋白还能够调节免疫应答。例如，GALV能够调节免疫应答。
因此本发明的病毒可以用于将基因运送至体内细胞，在那里它们将被表达。
通过任何合适的方法，例如HSV毒株与例如携带侧翼与HSV序列相接的基因的质粒载体的同源重组，可以将前体药物活化基因，编码能够导致细胞和细胞融合的蛋白的基因和/或编码免疫调节蛋白的基因插入到病毒基因组中。所述基因可以插入到HSV基因组中的相同位点，例如以使取代ICP34.5编码基因，或者插入不同的位点。所述基因可以在各自独立的启动子的控制下表达，例如CMV启动子和RSV启动子，或在同一个启动子控制下表达。当所述基因在同一个启动子控制下表达时，这些基因可以被内核糖体进入位点(IRES)隔开。所述基因还可以表达为翻译融合物，这样融合的蛋白保持了独立基因的活性(即前体药物活化和细胞与细胞融合，前体药物活化和免疫调节活性，或细胞与细胞融合和免疫调节活性)，从而在表达之后融合蛋白被蛋白酶以相对融合蛋白顺式或反式切割。在一个优选的实施方案中，所述的两个蛋白或三个蛋白中的两个分别在RSV或CMV启动子的控制下表达，所述启动子互相之间处于背对背的位置并插入HSV基因组中以取代编码ICP34.5的基因。这种病毒在图2中有所叙述。但是只要保持溶瘤细胞特性，所述基因也可以在任何位置插入病毒基因组。
插入基因的被转录序列优选与允许所述基因在肿瘤细胞中表达的控制序列有效连接。术语“有效连接”指毗邻，其中所述组分间的关系允许它们以预期的方式起作用。控制序列与编码序列“有效连接”的方式使得能够实现编码序列在与控制序列相容的条件下表达。
控制序列通常包括允许与其有效连接的基因表达的启动子和用来终止转录的信号。所述启动子选自在哺乳动物中有功能的启动子，优选人类肿瘤细胞。所述启动子可以来自真核基因的启动子序列。例如，所述启动子可以来自外源基因将要在其中表达的细胞的基因组，优选哺乳动物肿瘤细胞，更优选人类肿瘤细胞。对于真核启动子而言，它们可以是以普遍存在的方式(例如β-肌动蛋白，微管蛋白的启动子)，或者以肿瘤特异性方式起作用的启动子。所述启动子还可以是响应特异性刺激的启动子，例如结合类固醇激素受体的启动子。也可以使用病毒启动子，例如Moloney鼠白血病病毒长末端重复(MMLVLTR)启动子，或其它逆转录病毒启动子例如来自Rous肉瘤病毒(RSV)、人或小鼠巨细胞病毒(CMV)IE启动子或疱疹病毒基因的启动子，包括驱动潜在的伴随转录本表达的启动子。
应用本领域技术人员已知的常规克隆技术(参见，例如Sambrook etal.，1989，Molecular Cloning-A laboratory manual；Cold SpringHarbor Press)，可以构建包括前体药物转化酶编码基因、编码能够促进细胞与细胞融合的蛋白的基因和/或免疫调节基因以及控制序列的表达盒和其它合适的构建体。
启动子具有可诱导性也是有利的，这样能够在肿瘤细胞的生存期内对所述基因的表达水平进行调控。可诱导性是指使用该启动子所实现的表达水平能够被调控。例如，本发明的病毒可以进一步包括在强启动子控制下(例如CMV IE启动子)编码四环素(tet)抑制子/VP 16转录激活因子融合蛋白的外源基因，而前体药物转化、细胞与细胞融合或免疫调节或其它基因可以处于响应前述的四环素抑制子VP 16转录激活因子融合蛋白的启动子控制之下(Gossen and Bujard，1992，Gossen et al，1995)。因此，在该实例中，所述基因的表达将取决于是否存在四环素。
本发明的病毒编码多种外源基因。本发明的病毒可以包括一个或多个其它基因，例如1个、2个至3个、4个或5个其它基因。所述其它基因可以是前体药物转化基因、融合基因和/或免疫调节基因的更多拷贝。所述其它基因可以编码一种或多种不同的前体药物转化基因，一种或多种不同的融合基因和/或一种或多种不同的免疫调节基因。所述其它基因可以编码其它旨在增强疗效的基因。
可以将一个以上的基因和相关联的控制序列，在病毒基因组的单个位点或多个位点导入特定的HSV毒株中。或者，可以使用彼此方向相反且各自驱动一个基因表达的成对启动子(相同或不同的启动子)。
D.治疗用途本发明的病毒可以用在治疗人或动物体的方法中。具体而言，本发明的病毒可以用在癌症治疗的方法中。优选，本发明的病毒用在癌症的溶瘤细胞治疗中。本发明的病毒可以用在哺乳动物，优选人，的任何实体瘤的治疗中。例如，本发明的病毒可以给予患有前列腺、乳房、肺、肝脏、肾脏细胞、子宫内膜、膀胱、结肠、子宫颈的癌症；腺癌；黑色素瘤；淋巴瘤；神经胶质瘤；肉瘤例如软组织和骨肉瘤；或头颈部癌的受试者。
E.给药本发明的病毒可以用于需要治疗的患者，优选人类患者。需要治疗的患者是患有癌症的个体，优选患有实体瘤的个体。治疗的目标是为了改善患者的病情。通常采用本发明病毒的治疗能够减轻癌症的症状。根据本发明治疗癌症的方法包括对患有癌症的患者给予本发明治疗有效量的病毒。本发明溶瘤病毒对患有肿瘤的个体的给药，通常能够杀伤肿瘤细胞，因此减小肿瘤的体积和/或阻止恶性细胞从肿瘤的扩散。
一种给药治疗的方法包括将所述病毒与药学上可接受的载体或稀释剂相结合，从而产生药物组合物。合适的载体和稀释剂包括等渗的生理盐水，例如磷酸盐缓冲生理盐水。
治疗可以按照直接向靶组织注射所述病毒组合物来实施。所述靶组织可以是肿瘤或供应肿瘤的血管。在HSV的情况下，所给予的病毒量的范围从104到1010pfu，优选从105到108pfu，更优选约106到109pfu。通常1-4ml，例如2到3ml的主要包括所述病毒和药学上可接受的合适载体或稀释剂的药物组合物可以用来直接注射到个体的肿瘤中。而对于某些溶瘤治疗应用而言，也可以采用高达10ml的较大剂量，这取决于肿瘤的类型、肿瘤的体积以及注射的位置。同样，也可以采用低于1ml的较小剂量。
所述给药路线和剂量仅作为指导目的，因为本领域技术人员能够容易地确定最佳给药路线和剂量。所述剂量可以根据各种参数来确定，尤其是根据肿瘤的位置、肿瘤的体积和要治疗的患者的年龄、体重和病情以及给药路线。所述病毒也可以全身给药或通过注射到供应肿瘤的血管给药。给药的最佳路线取决于肿瘤的位置和体积。
以下实施例用于说明本发明。
在旨在产生具有增强的溶瘤和抗肿瘤潜力的ICP34.5缺失的HSV的工作中，我们已经从HSV1毒株JS1中删除了CIP47和ICP34.5，并插入了编码前体药物活化基因(胞嘧啶脱氨酶/尿嘧啶磷酸核糖基转移酶融合基因)和/或编码GALV融合糖蛋白的基因。
实施例1病毒构建(参见图1和2)所使用的病毒基于临床或“非实验室”HSV1毒株，JS1。ICP34.5和ICP47从毒株JS1中完全缺失。该病毒在Liu et al，2003中有所叙述。然后将GALV env R-(Bateman et al 2000，Galanis et al 2001)和/或胞嘧啶脱氨酶/尿嘧啶磷酸核糖基转移酶融合基因(Fcy:Fur；Invitrogen)分别插入到处于CMV和RSV启动子控制下的ICP34.5编码基因的位置。
图1a-1h示出了用来构建所述病毒的质粒的分步构建过程步骤1(图1a)用NcoI和NheI将Fcy::Fur基因从pORF Fcy::Fur中切除，并在用HindIII和XbaI消化后插入到pRCRSV中；步骤2(图1b)将来自PRcRSV Fcy::Fur的RSV启动子/Fcy::Fur/BGHpA表达盒插入到ICP34.5侧翼区(Lui et al 2003)，从而产生p-34.5 Fcy::Fur；步骤3(图1c)通过PCR从含有整合的前病毒的细胞扩增GALV envR-，并克隆到pcDNA3的NotI和EcoRI位点之间，从而产生pcDNA3 kGALVenv R-；步骤4(图1d-1e)通过处理除去不需要的限制性内切酶酶切位点；步骤4(图1g)将CMV启动子/GALV R-/BGHpA表达盒克隆到ICP34.5侧翼区，从而产生p-34.5 CMV GALV env R-；步骤5(图1h)为了产生能够插入取代ICP34.5并包括GALV env R-和Fcy::Fur基因的质粒，将来自pRcRSV Fcy::Fur的RSV启动子/Fcy::Fur/pA表达盒切下并插入到p-34.5 CMV GALV env R-中，从而产生p-34.5 GALV FCY。
通过同源重组，将质粒p-34.5 Fcy::Fur、p-34.5 CMV GALV env R-和p-34.5 GALV FCY插入到病毒毒株JS1/34.5-/47-CMV GFP(Lui et al2003)，从而用ICP34.5取代GFP序列。选出重组的不表达GFP的斑块，产生出三种病毒(JS1/34.5-/47-/Fcy::Fur，JS1/34.5-/47-/GALV和JS1/34.5-/47-/Fcy::Fur)。以上所述显示在图2中。
实施例2表达GALV env R-的病毒介导细胞与细胞的融合与不表达GALV蛋白的相同病毒相比，仅表达GALV的病毒(i)导致包括HT1080、Fadu和U87MG在内的许多人类肿瘤的体外细胞系发生由GAVL蛋白的表达所介导的细胞与细胞融合，(ii)在小鼠模型(Fadu和HT1080)中产生增强的体内抗肿瘤活性。
图3中示出了细胞与细胞的融合。用JS1/34.5-/47-或者JS1/34.5-/47-/GALV感染大鼠RG2神经胶质瘤细胞，并观察到了对斑块形态学的影响。可以看到，表达GALV的病毒产生的斑块显著增大，并伴有易于观察到的合胞体(syncitial(细胞与细胞融合))效应。
实施例3表达Fcy::Fur的病毒显示出胞嘧啶脱氨酶活性含有胞嘧啶脱氨酶/尿嘧啶磷酸核糖基转移酶融合基因的病毒显示，其指导5-氟胞嘧啶在体外向5-氟尿嘧啶的转化，因此产生5-氟尿嘧啶介导的细胞杀伤作用。这在图4中有所显示，其中在存在或不存在5-氟胞嘧啶的情况下用所述三种病毒感染HT1080细胞。来自这些细胞的上清液加热处理以灭活其中存在的病毒。然后将上清液用来覆盖新的细胞。如果5-氟胞嘧啶已经被转化为有毒性的5-氟尿嘧啶，那么这些新的细胞随后就会被杀灭。从图4中可以看出，当用来感染原始HT1080细胞的病毒包括Fcy::Fur基因时，则用所得到的上清液覆盖的细胞就会被杀灭，这证实了Fcy::Fur基因的生物学活性。
实施例4GALV env R-和Fcy::Fur的表达与5-氟胞嘧啶的表达相结合，与单独使用其中一种基因相比，在体内产生增强的抗肿瘤活性。
图5显示三种病毒(JS1/34.5-/47-/GALV，JS1/34.5/47-/Fcy::Fur和JS1/34.5-/47-/GALV/Fcy::Fur)，以及“空载体”对照(JS1/34.5-/47-)对缩小植入大鼠胁腹部肿瘤的作用。所述病毒与5-氟胞嘧啶结合给药。从图5中可以看出，每种病毒都引起被注射的肿瘤缩小。但是，与空载体对照相比，仅运送GALV env R-或Fcy::Fur的肿瘤缩小作用有所改善，而GALV env R-和Fcy::Fur相结合的运送更进一步改善对肿瘤的缩小作用，在这种情况下所有肿瘤都被治愈。因此可以得出结论，与所述方法单独使用相比，前体药物活化基因和融合糖蛋白的共运送产生对肿瘤治疗的改善。
保藏信息HSV1毒株JS1于2001年1月2日保藏于欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)，CAMR，Sailsbury，Wiltshire SP4 OJG，United Kingdom，临时保藏号为01010209。
参考文献Chou et al.1990，Science 2501262-1266Maclean et al.1991，J.Gen.Virol.72631-639Gossen M&Bujard H，1992，PNAS 895547-5551Gossen M et al.1995，Science 2681766-1769Thompson et al.1998，Virus Genes 1(3)；275-286Meignier et al.1988，Infect.Dis.159；602-614Liu et al et al 2003，Gene Therapy 10；292-303Bateman et al 2000，Cancer Research 60；1492-1497Galanis et al 2001，Human Gene Therapy 12；811-82权利要求
1.一种缺少功能性ICP34.5编码基因且包括以下两种或更多种的疱疹病毒(i)编码前体药物转化酶的基因；(ii)编码能够导致细胞与细胞融合的蛋白的基因；以及(iii)编码免疫调节蛋白的基因。
2.根据权利要求1的疱疹病毒，其中包括(i)编码前体药物转化酶的基因；以及(ii)编码能够导致细胞与细胞融合的蛋白的基因。
3.根据权利要求1或2的病毒，其中所述前体药物转化酶是胞嘧啶脱氨基酶。
4.根据前述任一项权利要求的病毒，其中所述能够导致细胞与细胞融合的蛋白是长臂猿白血病病毒融合糖蛋白。
5.根据权利要求1的疱疹病毒，其中包括(i)编码免疫调节蛋白的基因；以及(ii)编码能够导致细胞与细胞融合的蛋白的基因。
6.根据权利要求1的疱疹病毒，其中包括(i)编码前体药物转化酶的基因；以及(ii)编码免疫调节蛋白的基因。
7.根据权利要求5或6的病毒，其中所述免疫调节蛋白是GM-CSF、TNFα或CD40L。
8.根据前述任一项权利要求的病毒，其中包括一种或多种另外的能够增强所述病毒的抗肿瘤疗效的基因。
9.根据前述任一项权利要求的病毒，其中进一步缺少编码ICP47的功能基因。
10.根据前述任一项权利要求的病毒，其中进一步缺少编码ICP6的功能基因、糖蛋白H和/或胸苷激酶。
11.根据前述任一项权利要求的病毒，其中进一步缺少编码能够抑制树突细胞功能的功能蛋白的基因。
12.根据权利要求11的病毒，其中所述编码能够抑制树突细胞功能的功能蛋白的基因是UL43或vhs。
13.根据前述任一项权利要求的病毒，其中所述病毒是单纯疱疹病毒1或2的毒株。
14.根据前述任一项权利要求的病毒，其中所述病毒是非实验室病毒毒株。
15.根据前述任一项权利要求的病毒，其中所述病毒来自保藏在欧洲动物细胞保藏中心(ECACC)中临时保藏号为01010209的HSV1 JSI。
16.根据前述任一项权利要求的病毒，用于治疗人或动物体的方法中。
17.根据前述任一项权利要求的病毒在制造治疗癌症的药物中的用途。
18.根据权利要求17的病毒的用途，其中所述药物用于直接的肿瘤内注射。
19.一种药物组合物，其中包括根据权利要求1至15任一项的病毒作为活性成分以及药学上可接受的载体或稀释剂。
20.一种对需要治疗的个体中的肿瘤进行治疗的方法，所述方法通过给予所述个体有效量的根据权利要求1至15任一项的病毒。
全文摘要
本发明提供一种疱疹病毒，所述病毒缺少功能性ICP34.5编码基因但包括以下两个或更多个基因(i)编码前体药物转化酶的基因；(ii)编码能够导致细胞与细胞融合的蛋白的基因；以及(iii)编码免疫调节蛋白的基因。
文档编号C12N15/869GK1829523SQ200480021565
公开日2006年9月6日 申请日期2004年7月26日 优先权日2003年7月25日
发明者R·S·科芬, G·R·辛普森 申请人:拜奥维克斯有限公司