专利名称：用于筛选阿尔茨海默病治疗剂的pet和磁共振的制作方法
技术领域：
本发明通常涉及神经变性紊乱动物模型用于确定脑功能损伤的临床前指标的用途以及用于鉴定病症缓解性治疗剂(disease-modifying therapy)的用途。
背景技术：
阿尔茨海默病(AD)是痴呆的最常见形式，在65岁以上的老人中有10％受到累及。Small等人，(1997)JAMA 2781363-1371。随着人类寿命的不断延长，AD呈现为增长的健康危机。
分子神经科学的进展以及对神经变性疾病生物标志的鉴定已使人们能详细描述疾病病理。特别地，已经在临床前和疾病早期临床阶段使用神经成像生物标志描述神经变性的表现型。积累的证据显示，包括阿尔茨海默病在内的神经变性紊乱的特征在于在明显的临床症状出现之前存在长期的渐进性神经元功能丧失。因此，强烈的兴趣集中在开发可延缓或防止临床表现的有效临床前治疗剂上。见DeKosky等人，(2003)Science 302830-834；Silverman(2004)J.Nucl.Med.2004 45594-607。预期将临床AD发病延缓5年的临床前干预可使临床AD的发病率降低50％。在理论上，额外的延缓可真正消除疾病。Brookmeyer等人，(1998)Am.J.PublicHealth 881337-1342。
尽管人们对神经变性疾病的早期治疗很感兴趣，但是目前临床前AD的有效治疗剂还是未知的。为了鉴定能够在出现临床表现之前延缓或阻止脑功能退化的药物并且评价症状发生前阶段现有治疗剂的用途，本发明提供了AD动物模型中神经成像生物标志的相关指标。
发明概述本发明提供了鉴定用于在临床前阶段治疗神经变性紊乱的化合物的方法。也提供了鉴定治疗神经变性紊乱的病症缓解性化合物的方法。该方法通常包括以下几个步骤(a)向神经变性紊乱的临床前动物模型施用一种或更多种候选化合物；(b)评价相对于对照动物中一种或更多种疾病生物标志的测量值，动物模型中一种或更多种疾病生物标志的变化；(c)选择引起一种或更多种疾病生物标志向对照动物中一种或更多种疾病生物标志的测量值方向变化的候选化合物。作为一个实例，所公开方法可用于鉴定用于在症状发生前治疗阿尔茨海默病的病症缓解性药物。
发明详述本发明提供了鉴定针对神经变性疾病的病症缓解性治疗剂的方法。以AD为例，病症缓解性治疗剂是在淀粉样蛋白斑和认知退化发生前具有疗效的药剂。所公开方法代表了集中于临床前干预的AD药物发现的新途径。
I.神经变性疾病诊断和进展的生物标志如本文所述，在动物模型中检测生物标志可用于开发神经变性紊乱临床前诊断的指标以及鉴定在临床前疾病阶段中具有疗效的药物。在本发明的特定方面，提供成像特征以检测AD中脑功能的损伤。
术语生物标志通常指可客观测量并作为生物过程指示物评价的特征、性状或特点。生物标志还可描述为遗传的、影像学的、分子/生物化学的和临床的生物标志。见DeKosky等人，(2003)Science 302830-834。这些名称通常指检测方法，从而可用上述类型生物标志中的一种或更多种描述生物状态或者变化。
疾病生物标志为与非疾病状态或对照状态相比具有统计学显著差异的生物标志，如与对照状态相比至少大约2倍的差异，或者至少大约5倍的差异，或者至少大约10倍的差异，或者至少大约20倍的差异，或者至少大约50倍的差异，或者至少大约100倍的差异。用于开发用于早期疾病检测的成像特征的对照动物为没有显示出临床或临床前疾病测量值的动物。为评价含有转基因、诱导突变或定点突变的动物模型中的疾病生物标志，不具有转基因或突变的亲代品系动物构成了适当的对照动物。
术语临床前和症状发生前可互换地使用来指根据本领域所用的已知标准诊断神经变性疾病之前，即临床疾病表现前的受试者状态。临床前患者包括处于发展成神经变性疾病风险的患者(例如，携带与疾病风险增加相关遗传突变的患者)，或者表现出与疾病发展可能性增加相关的指标的患者。
临床AD的特征在于神经元丢失相关的渐进性认知下降、神经毡(淀粉状蛋白斑)和脑血管(淀粉状蛋白血管病)中淀粉状蛋白β(Aβ，其包括Aβ40或Aβ42，或者其片段)的积累以及神经原纤维缠结(NFT)的存在。见Lee等人，(2001)Annu.Rev.Neurosci.241121-1159，Selkoe(2001)Physiol.Rev.81(2)741-766。AD还被定义为是非诊断为多发性梗死性痴呆(MID)、路易体痴呆(DLB)、额颞叶痴呆(包括尼-皮病)、帕金森病，或者酒相关性痴呆(科尔萨科夫综合征)的痴呆。
β-淀粉状蛋白前体蛋白(APP)、早老蛋白1(PS1)、早老蛋白2(PS2)和载脂蛋白E(APOE)基因的突变与AD的家族性形式有关。见Tandon等人，(2000)Curr.Opin.Neurol.13377-383。也存在非遗传危险因素。例如轻度认知缺损(MCI)患者发展成为可诊断AD的几率增加。Morris等人，(2001)Arch.Neurol.58397-405；Petersen(2001)Neurology56(9)1133-1142。其它的危险因素包括明显的海马萎缩和近期测试中记忆下降。Petersen(2003)Mild Cognitive ImpairmentAging to Alzheimer’sDisease，牛津大学出版社，纽约。临床前AD也包括根据国家神经和传染紊乱和中风研究院(National Institute of Neurological and CommunicatedDisorders and Stroke)的标准诊断为可能的/轻度AD的患者，其需要证明足够大的两个或更多个领域区域的认知衰退(包括记忆)而干扰工作或社会功能()。见McKhann等人，(1984)Neurology 34939-944。
如本文所用，描述神经变性紊乱动物模型的术语临床前动物模型指处于疾病症状表现前发展阶段的神经变性紊乱动物模型。临床前疾病阶段的生物标志在人类患者和动物模型中具有可比的特征。例如，临床前AD动物模型的特征在于淀粉样蛋白斑和/或神经原纤维缠结(NFT)发生前脑血流量降低和葡萄糖利用减少。代表性的AD动物模型在下文描述。
如实施例所述，于症状发生前阶段在神经变性动物模型和人类受试者中评价神经成像生物标志来鉴定神经变性的诊断指标。特别地，当单独使用或者与其他神经成像生物标志联合使用或者与一种或更多种遗传、分子/生物化学或临床生物标志联合使用时，葡萄糖利用、脑血流量的临床前减少以及代谢物水平的变化可具有诊断价值。例如，额外测量神经元活性、神经元完整性、神经化学/代谢物水平、神经胶质增生、淀粉样蛋白沉积、神经原纤维缠结的存在和/或脑体积可用于改善对临床前和临床疾病进展过程中以及治疗后恢复过程中AD相关变化的测量。
在施用药物后的神经变性动物模型(包括临床前模型)和患者中评价神经成像生物标志以鉴定用于治疗监测的指标。用于治疗监测的指标鉴定为与疾病进展(包括发展为临床阶段疾病的可能性)中的显著变化相关的可测量变化。
I.A.AD动物模型可在所公开的方法中使用任何相关的神经变性模型，这包括转基因动物或带有天然存在的、诱导的或定向突变的动物。本领域已知数种AD动物模型。
过量表达人APP695突变形式的Tg2576转基因小鼠表现为年龄依赖性的Aβ水平升高以及AD的神经病理、行为和代谢的损伤。见Hsiao等人，(1995)Neuron 15(5)1203-1218；Hsiao等人，(1996)Science274(5284)99-102；Hsiao(1998)Exp.Gerontol.33(7-8)883-889；Holcomb(1999)Behav.Genet.29(3)177-185；Niwa等人，(2002)Neurobiol.Dis.9(1)61-68；美国专利号5,877,399。在大约4个月大小和淀粉样蛋白斑发生前可检测到TG2576小鼠的认知缺陷。认知缺陷的发作与脑Aβ水平的积累有关。Aβ水平提高的Tg2576小鼠也显示出对脑内皮细胞产生血管松弛因子的损伤、低血压过程中不能维持足够的血流量、对基于行为的脑血流量增加的破坏和脑葡萄糖利用的减少(Niwa等人，(2002)Neurobiol.Dis.9(1)61-68；Niwa等人，(2002)Am.J.Physiol.Heart Circ.Physiol.283(1)H315-23；Iadecola等人，(1999)Acta.Neuropathol.(Berl.)989-14)。PSAPP小鼠过量表达突变体淀粉样蛋白前体蛋白和突变体早老蛋白1转基因并且显示出疾病进展迅速。到大约10周大小可在扣带皮质中检测到Aβ沉积。到6个月，淀粉样蛋白沉积广泛分布，包括在海马、皮质和其他脑区域中的沉积。见McGowan等人，(1999)Neurobiol.Dis.6(4)231-244。
可用于所公开方法的其他AD动物模型包括具有编码APP的转基因和至少一种阿尔茨海默病相关突变，例如Swedish突变(赖氨酸595-蛋氨酸596突变成天冬氨酸595-亮氨酸596(美国专利号6,509,515和6,586,656)的动物；过量表达含有人APPV717F突变的小基因的PDAPP转基因小鼠(Games等人，(1995)Nature 373523-527；美国专利号6,717,031)；具有编码人APP99-103氨基酸羧基末端部分的转基因的动物模型(美国专利号6,037,521)；具有编码人APP羧基末端100个氨基酸的转基因的动物模型(美国专利号5,849,999和5,894,078)；具有编码人APP751和APP695的转基因的动物模型(美国专利号5,850,003)；具有编码突变的FAD早老蛋白-1(PS-1)基因的突变蛋白产物的转基因和人APP695 Swedish突变的动物模型(美国专利号5,898,094)；具有基因定向突变的FAD早老蛋白-1(PS-1)基因和人APP695 Swedish突变的动物模型(美国专利号6,734,336)；具有基因定向突变的FAD早老蛋白-1(PS-1)基因、人FAD Swedish突变和人源化Aβ突变的动物模型(美国专利号6,734,336)；称为TgCRND8的具有编码人APP695突变的转基因(其还包括K670N、M671L和V717F突变)的动物模型(美国专利申请号0030093822)；具有编码717位点突变的APP770的转基因的动物模型(美国专利号6,300,540)；具有编码tau蛋白的转基因的动物模型(美国专利号6,593,512和6,664,443)；具有编码人晚期糖基化终末产物受体(RAGE)的转基因并且也具有编码带有家族性阿尔茨海默病相关突变的人APP的转基因的动物模型(美国专利号6,563,015)；过量表达TGF-β1，任选组合表达人APP的转基因动物模型(美国专利号6,175,057)和基于一种或更多种前述突变组合制备的动物。
动物模型一般为啮齿动物模型，然而其他相关动物中(例如灵长类、猫、兔、豚鼠、山羊、马、牛等等)制备的模型也用于本发明。
I.B.神经成像生物标志本文所用的术语神经成像生物标志指可在体内检测的功能性脑活动的变化或者其他神经系统的变化。可用成像方法，如磁源性成像和闪烁照相技术在受试者中评价神经成像生物标志。
对于AD患者，包括诊断为可能的AD患者和处于发展为AD风险中的患者，功能性脑活动的相关标志包括脑萎缩/脑体积(例如通过MRI评价)、脑血流量(CBF)或脑血体积(CBV)(例如通过MRI评价)、氧气摄取(例如通过15O2SPECT评价)、葡萄糖摄取(例如通过[18F]氟代脱氧葡萄糖(FDG)PET评价)；脑代谢物水平，如N-乙酰天冬氨酸和肌-肌醇(例如通过MRS评价)、小胶质细胞活化(例如通过PK11195(1-(2-氯苯基)-N-甲基-N-(1-甲基-丙基)-3-异喹啉甲酰胺)PET评价)以及淀粉样蛋白斑沉积(例如通过11C-BIP(11C-匹兹堡化合物B(Pittsburgh Compound B))PET评价)。虽然淀粉样蛋白斑和神经原纤维缠结为临床AD的指示，但是可在临床前阶段检测到其他的神经成像生物标志的异常。见例如Schott(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99(7)4703-4707(在AD早期阶段检测的中间颞叶结构萎缩速度的提高以及对萎缩速度的外推表明病理萎缩在有症状疾病之前数年出现)；Rusinek等人，Radiology 229691-696(6年来对患者的纵向研究表明，中间颞叶萎缩速度增加预示着将来认知下降)；Bookheimer等人，(2000)N.Engl.J.Med.343(7)450-456和Smith等人，(1999)Neurology 531391-1396(有症状的疾病发生前也可在带有AD相关遗传突变的患者中观察到脑血管的变化)；Reiman等人，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(6)3334-3339；Small等人，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(11)6037-6042(早期疾病阶段AD患者中葡萄糖利用改变)；Cagnin等人，(2002)Eur.Neuropsychopharmacol.12581-586(发生临床痴呆前，具有最小认知损伤的患者在一些区域出现神经炎症，随后在这些区域出现萎缩)；Jessen等人，(2001)Neurology 57930-932和Jaarsma等人，(1994)J.Neurol.Sci.127230-233(AD患者中N-乙酰天冬氨酸水平降低)；Parnetti等人，(1996)J.Am.Geriat.Soc.44133-138(AD患者中肌-肌醇水平提高)。
I.B.1.磁源性成像可用基于特定化学环境中水质子的相对释放速度产生图像的磁共振成像(MRI)进行血流量和脑体积的神经成像。如本文所用，术语磁共振成像或MRI指磁源技术，其还可描述为常规磁共振成像、磁化传递成像(MTI)、质子磁共振波谱(MRS)、扩散加权成像(DWI)、基于灌注的成像和功能性磁共振成像(fMRI)的一种或更多种。见例如Rovaris等人，(2001)J.Neurol.ScL 186 Suppl 1S3-9；Pomper&Port(2000)Magn.Reson.Imaging Clin.N.Am.8691-713；以及其中引用的参考文献。
ASL(动脉自旋标记)和CASL(连续动脉自旋标记)是依赖于与静态组织磁性状态不同的流入血液自旋变化的功能性磁共振成像技术。MR图像通过流入目的组织层面的磁性标记血液敏化。这种灌注测量法完全是非侵入性的并且不需要施用对照药剂。从未进行自旋标记的图像中扣除由流入自旋标记后的组织获得的图像产生灌注加权图像。灌注变化可通过比较其他参数，如组织T1和自旋标记效率定量。CASL包括施用一系列射频脉冲，其中血液水进行反复饱和。标记的自旋和脑组织水的交换达到稳定状态，从而大脑中的局部磁化与脑血流量直接相关。见例如Calamante等人，(1999)J.Cereb.Blood Flow&Metab.19701-735；Detre等人，(1992)Magn.Reson.Med.23(1)37-45；Floyd等人，(2003)J.Magn.Reson.Imaging 18(6)649-655。
对ASL/CASL以外的MRI技术来说，可用对照药剂辅助信号检测。用于磁源性成像的对照药剂包括但不限于顺磁或超顺磁离子、氧化铁颗粒，例如单晶氧化铁纳米微粒(MION)(Weissleder等人，(1992)Radiology182(2)381-385.；Shen(1993)Magn.Reson.Med.29(5)599-604)和水溶性对照药剂。顺磁和超顺磁离子可选自铁、铜、锰、铬、铒、铕、镝、钬和钆。从磁源衍生的图像可用例如超导量子干涉器件磁强计(SQUID以及用法可从Quantum Design of San Diego，California获得)得到。见美国专利号5,738,837。
实施例3和实施例7分别描述了AD动物模型和AD患者中脑血流量ASL检测的代表性方法。动物模型中血流量磁共振成像的其他代表性方法可在van Bruggen等人，(1998)J.Cereb.Blood Flow Metah.18(11)1178-1183；Mandeville等人，(1998)Magn.Reson.Med.39615-624；Mueggler等人，(2001)Magn.Reson.Med.46292-298中找到。
可用MRS进行局部脑代谢的成像，其基于磷脂、高能化合物、无机磷酸盐、神经递质和氨基酸的水平测量细胞活性。例如，可通过测定腺苷酸和肌酸磷酸盐(ATP，ADP，AMP，CP)、糖酵解和三羧酸(TCA)循环的中间产物、TCA酶、氧化磷酸化、电子传递链复合体和ATP酶(如K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶)的水平评价大脑中的能量代谢。
实施例4和实施例8分别描述了用MRS评价AD动物模型和AD患者中神经化学特征的代表性方法。测定动物模型和患者中代谢物水平的其他方法在Dedeoglu等人，(2004)Brain Res.101260-65和Sanacora等人，(2002)Am.J.Psychiatry 159663-665中描述。
I.B.2.闪烁照相成像闪烁照相成像通常指基于放射性标记的成像，包括正电子发射断层照相术(PET)、单光子发射计算机断层术(SPECT)、γ照相机成像和直线扫描。大多数SPECT系统基于使用一个或多个绕分析对象周围旋转γ照相机，从而整合了一维以上的放射性。PET系统包含环中的探测器阵列，其还在多个维度检测放射性。γ照相机和直线扫描器每一个代表了检测单个平面放射性的仪器。也可使用闪烁照相成像的相关装置，如包括大量传感器的放射成像装置，其中所述的传感器带有具有源焦点(common source focus)的校准结构。
闪烁照相技术可用于AD生物标志的神经成像，AD生物标志包括氧和葡萄糖利用、小胶质细胞活化和晚期标志如淀粉样蛋白斑和神经原纤维缠结(NFT)。在Aβ积累和神经原纤维缠结前可在AD动物模型和AD患者中检测到葡萄糖利用的变化。因此，这些测量可特别地用于开发临床前阶段的诊断和治疗指标。见Niwa等人，(2002)Neurobiol.Disease 961-68和Alsop等人，(2000)Ann.Neurol.4793-100。其他配基也可用于闪烁照相成像，即任何特异地与参与功能性脑活动的分子(例如受体、抗体、酶和离子通道)结合的配基，任何以足够成像的数量递送到脑并迅速从正常脑组织中清除的配基。
用于闪烁照相成像的标记包括57钴、62铜、64铜、67镓、51铬、166钬、111铟、113m铟、122碘、123碘、125碘、131碘、132碘、81m氪、177镥、197汞、203汞、99钼、42钾、32磷、186铼、81铷、82铷、72硒、75硒、99锝、201铊、127氙、133氙、169镱和62锌。也可使用回旋加速器放射性同位素，例如11碳、13氮、15氧和18氟。
实施例2和实施例6分别描述了在AD动物模型和AD患者中通过[18F]氟代脱氧葡萄糖(FDG)PET进行葡萄糖利用神经成像的代表性方法。可如Shah等人，(1994)Nucl.Med.Biol.21573-581或者Ramsay等人，(1992)Lancet 339(8800)1054-1055所述进行激活的小胶质细胞的神经成像。PK11195[1-(2-氯苯基)-N-甲基-N-(1-甲基-丙基)-3-异喹啉甲酰胺]用作示踪分子，其为吞噬细胞上大量存在的外周苯并二氮结合位点的配基。淀粉样蛋白斑可用苯并三唑淀粉样蛋白结合示踪分子如PIB或BTA(2-(4′甲基氨基苯基)苯并三唑)成像。检测淀粉样蛋白沉积的其他示踪分子在Mathis等人，(2002)Bioorg.Med.Chem.Lett.12295-298；Lee等人，(2003)Nucl.Med.Biol.30(6)573-580；Wang等人，(2002)J.Mol.Neurosci.19(1-2)11-16中描述。在AD患者中，已知含有大量淀粉样蛋白沉积物的联合皮层区域(包括前皮层、顶皮层、颞皮层和枕叶皮层以及纹状体)保留PIB淀粉样蛋白示踪物。Klunk等人，(2004)Ann.Neurol.55306-319。神经原纤维缠结可以使用配体如1，1-二氰-2-[6-(二甲基氨基)萘-2-基]丙烯(FDDNP)显现出来(Agdeppa等人，(2003)Mol.Imaging Biol.5(6)404-17)。还可参见Small等人，(2002)J.Mol.Neurosci.19323-327和美国专利号6,660,530。
I.C.分子生物标志术语生物化学生物标志或分子生物标志通常指可用体外测定法在生物样品，如CSF或血清中检测到的分子。用常规技术，如ELISA(酶联免疫吸附测定)、蛋白质印迹、对组织学染色后的组织进行分析等等可容易地检测分子生物标志。大体上，此类测定法使用特异结合分子生物标志并包括可检测的标记(例如放射标记的酶、荧光团等等)的抗体或抗体片段。分子生物标志可包括上述神经成像生物标志的体外检测，例如用体外测定法检测Aβ的提高。
可在AD患者中检测的其他分子生物标志包括异前列烷、磷酸化的Tau(pTau)和总的CSF Tau(tTau)(Hampel等人，(2004)Dement.Geriatr.Cogn.Disord.17350-354；Hampel等人，(2004)J.Neural Transm.111(3)247-272)以及神经元线蛋白(NTP)(de la Monte等人，(2002)Front.Biosci.7d989-996)。其他的分子生物标志在美国专利号6,717,031中描述。
I.D.临床生物标志术语临床生物标志通常指临床上表现出的神经变性疾病的可计量测量。用于在AD动物模型和AD患者中评价疾病的有用临床生物标志包括环境恐惧条件反射(Corcoran等人，(2002)Learn.Mem.9(5)243-252.)和条件性眨眼测试。用于AD患者的其他代表性临床生物标志包括CANTAB(Cambridge Neuropsychological Test Automated Battery)配对相关学习测试(Blackwell等人，(2004)Dement.Geriatr.Cogn.Disord.2004；17(1-2)42-48.)、Cognitive Log(Alderson等人，(2003)Arch.Phys.Med.Rehabil.84668-672)、Mini-Cog(Borson 2003)、简易智能量表(MMSE)(Folstein等人，(1975)J.Psychiatr.Res.12189-198)、阿尔茨海默病评价量表-认知部分(ADAS-Cog)(Rosen等人，(1984)Am.J.Psychiatry1411356-1364)和计算机化神经心理测试组合(CNTB)(Caramelli等人，(2004)Arq.Neuropsiquiatr.62(2B)379-384)。
II.筛选方法本发明提供了通过测定疾病的临床前指标鉴定症状缓解性治疗剂，即对疾病的病理病源机制具有影响的治疗剂的方法。在临床前动物模型中检测生物标志也用于表征现有症状性治疗剂，即缓解原发或继发疾病症状而非治疗潜在病理生理的药物，其可揭示以前未认识到的症状缓解性作用。既然已知一些神经变性的临床前指标，但尚未描述在临床前阶段向患者施用以避免进展到临床阶段的药物以及用于鉴定在临床前阶段起作用的药物的方法。因此，本发明还提供了通过所公开筛选测定法所鉴定的新的症状缓解性药物。
根据所公开的方法，通过测定疾病生物标志的变化在临床前动物模型中开展筛选测定法。通过评价相同的生物标志在人类患者中验证所鉴定治疗剂的效力。见实施例1-10。如上文所述，神经成像特征尤其用于描述这些早期变化的特征。
例如，本发明的筛选测定法可包括(a)向神经变性紊乱的临床前阶段动物模型施用一种或更多种候选化合物；(b)评价相对于对照动物中一种或更多种神经成像生物标志的测量值，动物模型中一种或更多种神经成像生物标志的变化；(c)选择引起一种或更多种神经成像生物标志向对照动物中一种或更多种神经成像生物标志的测量值方向变化的候选化合物。见实施例1-4。
鉴定药物效力的标准包括测量至少一种疾病生物标志，例如神经成像生物标志，并且优选两种或更多种神经成像生物标志的组合。药物效力还可通过另外评价遗传生物标志、生物化学/分子生物标志和临床生物标志来定义。
筛选测定法中所用的对照动物是接受安慰剂替代治疗的动物。促进神经变性疾病生物标志向对照数值恢复的化合物在本文指神经保护性药剂。优选地，神经保护性药剂与治疗前情况相比或与接受安慰剂治疗的对照动物相比在统计学上显示显著差异(p＜0.05)。例如，神经保护性药剂被鉴定为其中与对照动物相比生物标志变化至少大约2倍，或者至少5倍的差异，或者至少大约10倍的差异，或者至少大约20倍的差异，或者至少大约50倍的差异，或者至少大约100倍的差异。本发明还提供了通过所公开的筛选方法鉴定的神经保护性药剂。
本文所用的术语药物指任何具有生物活性的物质，其包括任何天然的或合成的化学分子，包括小分子(例如有机化合物)、肽、蛋白质、糖、脂类、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶或者核酸。相关的候选药物包括能影响认知的药物，例如调节神经递质水平的药物(例如乙酰胆碱脂酶抑制剂、胆碱能受体激动剂或5-羟色胺受体拮抗物)、调节可溶性Aβ水平或淀粉样蛋白斑负载(amyloid plaque burden)的药物(例如γ-分泌酶抑制剂、β-分泌酶抑制剂、抗体治疗剂和降解酶)和保护神经元完整性的药物(例如抗氧化剂、激酶抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂和激素)。用于所公开筛选方法的其他代表性候选药物包括胆碱脂酶抑制剂(例如他克林(COGNEX)、盐酸多奈哌齐(ARICEPT)、雷司替明(EXELON)和加兰他敏(REMINYL))、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、加兰他敏、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)抑制剂、5-HTR1a拮抗物、5-HT6拮抗物、BACE抑制剂、α-分泌酶、抑免蛋白、胱天蛋白酶-3抑制剂、Src激酶抑制剂、PDE4抑制剂、TPA激活剂、AMPA调节剂、M4激动剂、JNK3抑制剂、LXR激动剂、H3拮抗物、血管紧张肽IV拮抗物等等。
III临床应用用本文所公开的神经成像特征在AD动物模型和AD患者中鉴定的AD进展指标可用于检测出现临床疾病表现前的脑功能损伤。这些指标也用于监测对临床前治疗反应的脑功能改善。
在利用临床前神经变性疾病动物模型的筛选测定法中鉴定的临床前治疗药物旨在用于人类患者。见实施例2。在所公开的筛选测定法中鉴定的症状缓解性药物可用于临床前阶段以及临床阶段患者的治疗。
AD临床前治疗的药物也可治疗相关的产生淀粉样蛋白的疾病，如痒病、传染性海绵状脑病(TSE)、冰岛型遗传性淀粉样变脑出血(HCHWA-I)、荷兰型遗传性淀粉样变脑出血(HCHWA-D)、家族性地中海热、带有荨麻疹和聋的家族性淀粉样肾病(穆-韦综合征)、淀粉样蛋白相关的骨髓瘤或巨球蛋白血症相联系的自发病、家族性淀粉样蛋白多神经病(葡萄牙)、家族性淀粉样蛋白心肌症(丹麦)、全身性老年淀粉样变、家族性淀粉样蛋白多神经病(爱荷华州)、家族性淀粉样变(芬兰)、杰茨曼-斯脱司勒-史茵克综合征、甲状腺髓样癌、孤立性心房淀粉样变性、II型糖尿病和胰岛瘤。
如本文所述鉴定的神经保护性药剂可制备用来安全有效的临床应用。向受试者施用的适宜制剂包括水成的和非水成的无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、抗菌剂和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、酚、抗坏血酸和柳硫汞)、使制剂与目的受体的体液等渗的溶质(例如糖、盐和多元醇)、悬浮剂和增稠剂。适当的溶剂包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)和其混合物。制剂可在单位剂量或多次剂量容器中提供，例如在密封的安醅瓶或小瓶中提供，并且可在冷冻或冷冻干燥(冻干)的条件下保存，其只需要在即将给受试者施用前加入无菌液体载体。
神经保护性药剂也可制备成包括可药用载体，例如大的缓慢代谢的大分子，如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、多聚乳酸、多聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和灭活的病毒颗粒。也可使用可药用盐，例如无机酸盐，如氢氯酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐；或者有机酸盐，如醋酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和安息香酸盐。制剂还可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇；和/或在此类组合物中存在辅助物质，如润湿剂或乳化剂或pH缓冲物质。
本发明提供了在临床前和/或临床阶段通过施用有效量的神经保护性药剂治疗神经变性紊乱的方法。术语有效剂量在本文使用以描述足够引起所需生物反应的神经保护性药剂数量。例如当向AD动物模型或AD患者施用时，有效剂量包含足以延迟或阻止神经变性或脑萎缩的数量，或者足以改善脑功能的数量，例如足以增加脑血流量和/或葡萄糖利用的数量。
制备本发明的神经保护性药剂并施用使CSF中和大脑中达到有效剂量。例如，具有能穿越血脑屏障的亲脂性特性的神经保护性药剂可静脉内施用。施用也可包括鞘内、病灶内、腹膜内或肌肉内注射；输注；轰击(bombardment)；经局部、鼻、口腔、眼或耳递送。这些施用途径也可用于递送筛选测定法中的候选化合物。
可在如本文所述的那些动物模型中估计治疗有效量和施用方案。然后此类信息可用于确定在人类中施用的有用剂量和途径。一般地，施用最小剂量，并且在不存在剂量限制性细胞毒性的条件下逐步提高剂量。有效剂量的确定和调整以及估计何时及如何进行这样的调整是医药领域的普通技术人员已知的。所选的剂量和方案依赖于多种因素，包括治疗组合物的活性和稳定性(即半衰期)、制剂、施用途径、其他药物或治疗的联合、待检测或治疗的疾病或紊乱的严重性和所治疗的受试者生理状况和先前医疗病史。
本发明的神经保护性药剂可与其他治疗剂联合使用，如已知的用于神经变性紊乱的症状性治疗剂；抗炎剂；免疫原，如用于免疫治疗的淀粉样蛋白-β或非淀粉样蛋白衍生的肽(non-amyloidogenic peptide)(Schenk等人，(1999)Nature 400(6740)173-177；美国专利号6,713,450)；和/或清除淀粉样蛋白斑的药剂，如抗淀粉样蛋白-β抗体(Bacskai等人，(2001)NatureMed.7(3)369-372；Bard等人，(2000)Nature Med.6(8)916-919)或升麻属(Cimicifuga)提取物(美国专利号6,649,196)。
为施用多种治疗剂，包括临床施用或在筛选测定法中使用，神经保护性药剂和其他治疗剂在任何适于进行所需治疗或诊断的时间范围施用。因此，单个制剂基本上可同时施用(即作为单一制剂或在数分钟或数小时内施用)或者以任何顺序连续施用。例如，每一种单个治疗剂可在大约1年内施用，如大约10、8、6、4或2个月内施用，或者4、3、2或1周内施用，或者大约5、4、3、2或1天内施用。
关于制备、剂量、施用方案和可测量治疗结果的其它指导见Berkow等人，(2000)The Merck Manual of Medical Information，Merck&Co.，Inc.，Whitehouse Station，New Jersey；Ebadi(1998)CRC Desk Referenceof Clinical Pharmacology，CRC出版社，Boca Raton，Florida；Gennaro(2000)RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia，Pennsylvania；Katzung(2001)Basic&Clinical Pharmacology，Lange Medical Books/McGraw-Hill Medical Pub.Div.，New York；Hardman等人，(2001)Goodman&Gilman′s thePharmacological Basis of Therapeutics，The McGraw-Hill Companies，Columbas，Ohio；Speight&Holford(1997)Avery′s Drug TreatmentAGuide to the Properties，Choices，Therapeutic Use and Economic Value ofDrugs in Disease Management，Lippincott，Williams，&Wilkins，Philadelphia，Pennsylvania。
实施例包括下列实施例以描述本发明的实施方式。根据本共同发明者发现和考虑的在实践本发明过程中有效的技术和流程描述下列实施例的某些方面。考虑到本公开和本领域技术人员的一般水平，技术人员会意识到，下列实施例仅为例证性的，并且可在不脱离本发明范围的情况下对本发明进行大量更改、修饰和改变。
实施例1在阿尔茨海默病动物模型中评价临床前生物标志神经成像生物标志在AD动物模型和适当的对照动物中评价。代表性的AD动物模型包括Tg2576转基因小鼠和PSAAP小鼠，其在更早期阶段发生更严重的斑块。
比较Tg2576或PSAPP转基因小鼠与野生型同窝小鼠以确定是否可在淀粉样蛋白沉积前检测到疾病生物标志的改变。在5个月和16个月大分析四组Tg2576转基因小鼠和野生型小鼠，每一组有4-10只同窝小鼠。考虑到它们的疾病进程更快，在2个月和6个月大检测PSAPP动物。开展了额外的观察性研究，其中分别从4个月和2个月大小开始每月评价Tg2576和PSAPP小鼠一次。对每一个测试组来说，在连续3天的相同时间评价疾病生物标志。在动物间和同种动物的多个测定间确定每一种生物标志的变异性和动态范围。鉴定受影响的脑区域并用于建立包括症状发生前诊断在内的AD诊断的指标。例如，在观察到淀粉样蛋白沉积前，与对照动物相比在AD动物模型中观察到葡萄糖利用和脑血流量水平降低。
为鉴定用于治疗监测(包括临床前阶段)指标，施用药物之后在AD动物模型中评价疾病生物标志，其中所述的药物包括如实施例10所述鉴定的药物和目前用于症状治疗的已知药物。例如，短期治疗研究如下进行，其中从上述观察性研究中检测到海马功能显著变化的最初观察开始，将Tg2576或PSAPP小鼠治疗一周。向Tg2576小鼠施用逐步提高的药物剂量，然后每周监测疾病生物标志直到其恢复到对照水平(即对照动物中生物标志的相应测量值)。为在临床前阶段评估已知症状性药物，以治疗有效量施用药物，例如有效提高认知能力的数量。也可进行长期治疗研究，其中将Tg2576或PSAAP小鼠治疗3个月并且每隔一个月与未治疗的对照小鼠比较，直到6个月初期或直到疾病生物标志恢复到对照水平。
实施例2在阿尔茨海默病动物模型中测定葡萄糖利用如实施例1所述，基本如Toyama等人，(2004)J.Nucl.Med.45(8)1398-1405所述用[18F]氟代脱氧葡萄糖(FDG)PET在AD动物模型中评价葡萄糖利用。在糖血量正常条件下(例如在异氟醚麻醉或清醒状态下)向AD动物模型和对照动物施用FDG。用小动物PET扫描器测定局部葡萄糖利用。
实施例3在阿尔茨海默病动物模型中测定脑血流量基本如Detre等人，(1992)Magn.Reson.Med.23(1)37-45所述用ASL在AD动物模型中测定脑血流量(见实施例1)。用层面选择饱和成像序列(slice-selective saturation imaging sequence)在颈部区域饱和流向大脑的血液。在配有15cm直径梯度嵌入的40cm磁孔的4.7T NMR分光计上进行质子MRI。用7cm直径体积线圈的代表性的条件如下恢复时间＝2秒，回声时间＝30毫秒，视野＝5cm，片层厚度＝2mm，基质大小＝64×64。在成像序列中应用梯度以在最小干扰组织水的同时消除血管中流入自旋的影响。流入自旋的翻转通过TR时期在存在磁场梯度条件下连续应用低能射频场实现。在大脑中交换饱和的自旋和大量的水之后通过局部血流量和局部T1测定饱和自旋的局部浓度。脑外等距应用的远侧饱和用作饱和脉冲影响的对照。还可参见Williams等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89212-216和Sun等人，(2004)Magn.Reson.Med.51893-899。
可用在动脉自旋标记阶段降低大分子自旋饱和的多级螺旋系统获得多层面MRI序列。例如可用二级螺旋系统，其由一个标记动脉水自旋的小表面螺旋和MRI脱偶联头螺旋(decoupled head coil)组成。见Silva等人，(1995)Magn.Reson.Med.33(2)209-214。
实施例4在阿尔茨海默病动物模型中测定神经化学特性在使用20mm正弦鸟笼螺旋(sinusoidal birdcage coil)的4.7T上，使用联合光谱的MR成像评估AD动物模型中的神经化学特性(见实施例1)。以大约0.1×0.2mm的平面和1mm的层面的空间分辨率收集T2加权的自旋回声MR影像。体素(voxels)集中在所选脑区域上并且根据脑大小调整体素大小。例如，用2.2秒的TR与144和272毫秒的TE值的PRESS技术记录光谱。用光谱的曲线拟合处理数据并且将强度积分。共振积分对肌氨酸峰归一化。收集多个TE值以修正AD动物模型和对照动物间的T2数据。测定代谢物的变化，其中所述的代谢物包括例如N-乙酰天冬氨酸、肌-肌醇、牛磺酸、蟹-肌醇、胆碱、Cr-CH3、GSH、天冬氨酸盐、谷氨酰胺、琥珀酸盐、谷氨酸盐、GABA、丙氨酸和乳酸盐中的一种或更多种。
实施例5在AD患者中评价临床前生物标志在根据DSM-IV-TR和国家神经和传染紊乱和中风研究院的标准所选择的具有可能/轻微AD的患者中进行双盲交叉研究(McKhann等人，(1984)Neurology 34939-944)。在短期研究中，在两个月的时间内每隔两周治疗和评价患者。在长期评估中，患者治疗六个月，两个月监测一次。也在AD发生风险提高的患者中进行研究。
实施例6在AD患者中测定葡萄糖利用基本如Small等人，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97(11)6037-6042所述，用[18F]氟代脱氧葡萄糖(FDG)PET在可能/轻微AD患者中或AD发生风险提高的患者中评价葡萄糖摄入(见实施例5)。370MBq FDG示踪注射液通过静脉内注射施用。FDG注射之后大约40分钟用例如CTI/Seimens 831-08或CTI 962扫描仪进行扫描。扫描与眦耳线平行获得，并且发射测量用于衰减修正。
实施例7在AD患者中测定脑血流量基本如Alsop等人，(2000)Ann.Neurol.4793-100所述，在可能/轻微AD患者中或AD发生风险提高的患者中评价脑血流量(见实施例5)。在多个邻近的5mm轴向断层中获得动脉自旋标记的血流量影像。在颈颅连接处应用绝热电磁标记以将颈动脉和脊椎动脉中的流入自旋翻转。代表性的射频放射振幅为36mG并且磁场梯度为0.25高斯/厘米。从使用大约250Hz或大约125Hz的调幅对照辐射(应用于相同位置)获得的对照影像中扣除标记的影像。在1.5T MRI扫描仪中进行成像。将血流量影像转化成标准的解剖学空间以进行一个体素一个体素的分析。
实施例8在AD患者中测定神经化学特性基本如Krishnan等人，(2003)Am.J.Psychiatry 1602003-2011所述，用联合光谱的MR成像在可能/轻微AD患者中或AD发生风险提高的患者中评价神经化学特性(见实施例5)。用1.5T磁源进行MRI和1H-MRS研究。可用1.5mm邻近切层获得轴向T1加权的三维梯度回声MRI(基质＝256×128，视场＝22cm)。第三脑室水平的影像在单一的片层中提供皮层灰质、脑室周物质、白质和皮层下灰质。1H-MRS(二维化学位移成像)用于评价N-乙酰天冬氨酸、胆碱部分、肌氨酸、肌-肌醇等等的数量和区域。还可参见Lazeyras等人，(1998)Psychiatry Res.8295-106和Charles等人，(1996)Magn.Reson.Med.35606-610。
实施例9在AD患者测定神经元完整性用M1毒蕈碱性受体的碘-123二苯羟乙酸-3-喹咛环酯(123I-QNB)SPECT成像在可能/轻微AD患者中或AD发生风险提高的患者中评价神经元完整性(见实施例5)。简言之，合成(R，R)QNB异构体，基本如Weinberger等人，(1992)Clin.Neuropharmacol.15 Suppl 1 PtA194A-195A所述使用高效液相层析技术用123I标记。以大约160Mq的剂量通过静脉内注射向AD患者施用经标记的QNB。用SMV DST-XL双头γ照相机获得X射线断层图像。将影像预先过滤，修正衰变和衰减并用斜面滤波器重建。重建的图像重叠为标准立体空间内的单一SPECT模板图像组，其被平滑并且针对图像内的平均计算值归一化。用统计学参数软件如SPM99评价治疗组和对照组的组比较。见Kemp等人，(2003)J.Neurol.Neurosurg.Psychiatry 741567-1570。
实施例10鉴定症状缓解性AD治疗剂的筛选测定法在AD动物模型中测试候选的症状缓解性药物。以多种数量和/或联合并通过任何适当途径施用候选药物，例如通过静脉内注射或直接注射到脑中施用候选药物。施用药物后，如实施例2-4所述评价疾病生物标志。通过在临床前阶段检测一种或更多种疾病生物标志的变化评价治疗反应，以使改变的一种或更多种疾病生物标志特性与对照动物中所观察到的更相似。
例如，短期筛选测定法如下进行，其中从在上述观察性研究中检测到海马功能显著变化的最初观察开始治疗Tg2576或PSAPP小鼠1周。给Tg2576或PSAPP小鼠施用一种或更多种候选药物并每周监测一次疾病生物标志，直到其恢复到对照水平(即对照动物中生物标志的相应测量值)。
在本说明书中引用的参考文献在此全部引用到它们支持并使得能实践所公开发明的程度。
权利要求
1.鉴定用于在临床前阶段治疗神经变性紊乱的化合物的方法，该方法包括(a)向神经变性紊乱的临床前动物模型施用一种或更多种候选化合物；(b)评价与对照动物中一种或更多种疾病生物标志的测量值相比动物模型中一种或更多种疾病生物标志的变化；(c)选择引起一种或更多种疾病生物标志向对照动物中一种或更多种疾病生物标志的测量值方向变化的候选化合物。
2.权利要求1的方法，其中神经变性紊乱为阿尔茨海默病。
3.权利要求2的方法，其中动物模型为Tg2576小鼠。
4.权利要求2的方法，其中动物模型为PSAPP小鼠。
5.权利要求1的方法，其中疾病生物标志为神经成像生物标志。
6.权利要求5的方法，其中神经成像生物标志为脑血流量。
7.权利要求6的方法，其中脑血流量通过动脉自旋标记(ASL)评价。
8.权利要求5的方法，其中神经成像生物标志为葡萄糖利用。
9.权利要求8的方法，其中葡萄糖利用通过[18F]氟代脱氧葡萄糖(FDG)PET评价。
10.权利要求5的方法，其中神经成像生物标志为脑代谢物的水平。
11.权利要求10的方法，其中脑代谢物的水平通过磁共振波谱(MRS)评价。
12.权利要求1的方法，其还包括(d)评价与对照动物中两种或更多种神经成像的、遗传的或分子的疾病生物标志的测量值相比动物模型中两种或更多种神经成像的、遗传的或分子的疾病生物标志的变化。
13.鉴定用于在临床前阶段治疗神经变性紊乱的症状缓解性化合物的方法，该方法包括(a)向神经变性紊乱的临床前动物模型施用一种或更多种候选化合物；(b)评价与对照动物中一种或更多种疾病生物标记的测量值相比动物模型中一种或更多种疾病生物标志的变化；(c)选择引起一种或更多种疾病生物标志向对照动物中一种或更多种疾病生物标志的测量值方向变化的候选化合物。
14.权利要求13的方法，其中神经变性紊乱为阿尔茨海默病。
15.权利要求14的方法，其中动物模型为Tg2576小鼠。
16.权利要求14的方法，其中动物模型为PSAPP小鼠。
17.权利要求13的方法，其中疾病生物标志为神经成像生物标志。
18.权利要求17的方法，其中神经成像生物标志为脑血流量。
19.权利要求18的方法，其中脑血流量通过动脉自旋标记(ASL)评价。
20.权利要求17的方法，其中神经成像生物标志为葡萄糖利用。
21.权利要求20的方法，其中葡萄糖利用通过[18F]氟代脱氧葡萄糖(FDG)PET评价。
22.权利要求17的方法，其中神经成像生物标志为脑代谢物的水平。
23.权利要求22的方法，其中脑代谢物的水平通过磁共振波谱(MRS)评价。
24.权利要求13的方法，其还包括(d)评价与对照动物中两种或更多种神经成像的、遗传的或分子的疾病生物标志的测量值相比动物模型中两种或更多种神经成像的、遗传的或分子的疾病生物标志的变化。
全文摘要
神经变性紊乱的动物模型用于建立临床前诊断和治疗指标的用途和用于鉴定有效的临床前治疗剂的筛选方法的用途。
文档编号A61K51/04GK101072591SQ200580041699
公开日2007年11月14日 申请日期2005年11月3日 优先权日2004年11月5日
发明者J·L·鲁特科夫斯基, J·S·雅各布森, O·胡尔科 申请人:惠氏公司