预防鸡新城疫、传染性支气管炎的二联灭活疫苗的制备方法

专利名称：：预防鸡新城疫、传染性支气管炎的二联灭活疫苗的制备方法
技术领域：
：本发明涉及预防家禽传染病的疫苗，尤其涉及一种预防鸡新城疫、传染性支气管炎的二联灭活疫苗的制备方法。
背景技术：
：鸡新城疫、鸡呼吸型和肾型传染性支气管炎对养鸡业危害十分严重，目前仅有相应的单项灭活苗，如鸡新城疫灭活苗、传染性支气管炎(单价)灭活苗，需要单独分别注射，使用很不方便，防疫成本高。
发明内容本发明目的在于提供一种可预防鸡新城疫、呼吸型和肾型传染性支气管炎的二联灭活疫苗的制备方法。本发明采用以下述技术方案来实现上述目的预防鸡新城疫、传染性支气管炎的二联灭活疫苗的制备方法，选用毒种为新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M^和H化9肾型变异株，制备二联疫苗的步骤如下(1)、将新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M41和HN99肾型变异株稀释后接种SPF鸡胚尿囊腔内，收取胚液，作为毒种；(2)、将LaSota株、Mw株和,99株毒种稀释后分别接种易感鸡胚尿囊腔，分别收获LaSota株、M41株和HN99株鸡胚病毒尿囊液；(3)、将病毒尿囊液分别浓縮；(4)、浓縮病毒液分别加入灭活剂灭活，然后等量混合，用乳化法制成单相油乳剂灭活疫苗。所述的乳化法为将体积份数92—95份的兽用白油、5—8份的司本-80和占兽用白油与司本-80总重量1%—3%的硬脂酸铝混合、加热熔化并灭菌后冷却为油相；将3种灭活浓縮病毒液等量混合并充分振荡，加入占其体积百分比4%—5%的吐温-80混合为水相；按水相与油相体积比1:3—4的比例，乳化制成单相油乳剂灭活疫苗。灭活剂为体积百分比浓度O.1%—0.2%的甲醛水溶液，灭活时间为12一24小时。鸡肾型传染性支气管炎HN99株病毒为新分离鉴定的病毒，其具有以下特征(1)在电镜下见有冠状病毒粒子，直径90105nm，有囊膜，周围有长约18nm的梨状突出，呈放射状排列；(2)、发病鸡症状除呼吸道症状外，大部份死鸡均有肾脏肿大、尿酸盐沉积、花斑肾等病变；(3)、病毒分离物对NDVLaSota株病毒的繁殖产生干扰-,(4)、病毒分离物对1%鸡红细胞不产生凝集；(5)、回归SPF鸡试验可出现呼吸道症状和肾肿、花斑肾等病变；(6)、特异性血清中和结果证明，病鸡的病毒分离物与HN99阳性血清呈阳性反应，而与NDVLaSota株、IBDVB^株、AIVH具株均呈阴性反应；(7)、将HN99株阳性血清与EID5。的Mw株、Holte株、Gray株、T株和地方分离株湖北株、哈尔滨株、山东株、北京株、上海株、天津株等病毒做血清中和试验，结果显示，HNg9株阳性血清与T株、湖北株、天津株和山东株呈阳性反应，与其他株病毒均呈阴性反应。本发明选用毒种为新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M41和HN99肾型变异株，其中HN99肾型变异株为新分离鉴定的病毒，该病毒株免疫原性良好，能有效预防鸡肾型传染性支气管炎传染病，保护率达到80100%;该病毒株特异性强，专门预防鸡肾型传染性支气管炎，这是其他病毒株不能替代的。疫苗制备还应用了超滤浓縮技术，打一针该疫苗可预防鸡新城疫、呼吸型传染性支气管炎、肾病变型传染性支气管炎等三种传染病，和现有的打三针单项疫苗才能预防这三种传染病比较，该发明经济使用，简化了免疫程序，降低了防疫成本。本发明所述的鸡传染性支气管炎病毒株于2006年5月26日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位简称CGMCC，保藏编号CGMCCNo.1729，分类命名鸡肾型传染性支气管炎病毒，英文名称为AvainnephropathogenicInfectiousbronchitisvirusHN99Strain，拉丁文名禾尔为TarpeiapuHi，保藏单位地址北京市海淀区中关村北一条13号，邮编100080。具体实施例方式预防鸡新城疫、传染性支气管炎的二联灭活疫苗的制备方法，选用毒种为新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M41和HN99肾型变异株，制备二联疫苗的步骤如下1、毒种的来源(1)鸡新城疫采用LaSota株，效检用强毒为F48E9，由河南农业大学提供。毒种的标准及保存方法同"中华人民共和国兽用生物制品规程"(以下均简称"规程")中"鸡新城疫低毒力活疫苗制造及检验规程"1项的规定。(2)传染性支气管炎制造及检验均采用标准强毒M"株和地方分离株丽99株，均由河南农业大学提供。标准强毒Mw株和地方分离株丽99株毒力及毒种标准如下病毒含量M^株和丽99株毒种对10日龄SPF鸡胚尿囊腔内接种的感染剂量均》1065EID5。/0.lml。感染判定标准是按接种后鸡胚在24144小时内全部或部分死亡，存活的鸡胚以胎儿出现失水、蜷縮、发育小或肾肿、尿酸盐沉积等特异性病痕为标准。免疫原性免疫攻毒法毒价》10"EIDs。/0.lml的M"株和,99株易感鸡胚尿囊毒，经灭活后，分别按1:3(水相油相)的比例制成油乳剂灭活疫苗，按每羽份免疫15日龄SPF鸡8只，三周后，连同条件相同的对照鸡4只，分别攻击M"株和丽99株强毒，每只鸡气管注射M^株或HN的株强毒尿囊液各0.2ml，观察10天，对照鸡全部发病，免疫鸡保护6/8以上，或免疫鸡全部保护，对照鸡发病3/4。病毒分离试验上述免疫鸡和对照鸡攻毒后67天采集气管、肺脏和肾脏拭子，处理后分别接种鸡胚，进行病毒分离，分离不到病毒的鸡判为保护。免疫鸡》8/10分离不到病毒，而对照鸡》8/10的鸡分离到病毒。纯净毒种按"中华人民共和国兽用生物制品质量标准"(以下均简称"标准")的附录301页检验，无细菌、霉菌及支原体和外源病毒污染。特异性M,'株和朋99株毒种分别与M4,株和HN99株型特异性血清中和后，接种鸡胚不引起死亡或感染。保存在-15"C以下，湿毒保存期6个月，M"株冻干毒为3年，HN99株暂定为2年，-8(TC以下冻干毒至少可保存IO年。2、试验用鸡二联苗安全试验、检验用鸡，均采用SPF鸡或易感鸡。3、攻击用强毒及攻毒方法NDVF4sE9株强毒，用前以SPF胚传2代，毒价ELD5。为10—770.lml，肌肉或皮下注射。IBVMu株强毒，用SPF鸡胚传2代，其毒价》10"EID5。/0.lml，对l-7日龄SPF雏鸡，以10倍稀释的强毒气管内滴入0.2ml，观察10天，80%以上的雏鸡出现典型的支气管炎等症状为发病标准。IBV丽99株强毒，对鸡胚的毒价》10"EID5。/0.lml。攻毒时将毒种作IO倍稀释，对17日龄SPF鸡IO只气管内滴入O.2ml，观察10天，80%以上的雏鸡出现咳嗽，甩鼻等支气管炎症状或支气管、肺脏充血或出血，或有肾肿、尿酸盐沉积等发病症状。4、EID5、HI、HA测定方法HI、HA测定方法参照"规程"附录40页。EIDs。的测定方法同"规程"附录47页。5、制苗用毒种制备和生产用种子批的建立(1)NDVUSota株制苗用毒种制备和种子批的建立同"规程"中"鸡新城疫低毒力活疫苗制造及检验规程"的2.1项。(2)IBVM^株和HNM株的制苗用毒种制备和种子批的建立。毒种繁殖将毒种用灭菌生理盐水稀释100倍，尿囊腔内接种10-11日龄SPF鸡胚，每胚O.lml。接种后3072小时，收取活胚和死胚胚液，选择经检验无菌，对鸡胚毒价》10"EID5。，对1%鸡红细胞凝集试验为阴性的胚液作毒种用，注明收获日期、毒种代次。毒种鉴定按前述项目进行，应符合规定。毒种保存在-15r以下条件，使用期不超过6个月。毒种继代不超过3代。6、制苗用病毒液的制备及检验(1)NDVLaSota株病毒液的制备及检验同"规程"中"鸡新城疫低毒力活疫苗制造及检验规程"2.2、2.3、2.4项。(2)IBVMw株和HN99株病毒液的制备及检验制苗用材料选择发育良好的1011日龄易感鸡胚作为制苗用材料。鸡胚接种将Mw株和HN99株毒种分别用灭菌生理盐水稀释至10—2103，分别接种易感鸡胚尿囊腔，每胚O.lml，接种后密封针孔，置37"C继续孵育，停止翻蛋。孵育与观察鸡胚接种后，30小时前照蛋1次，弃去死胚，以后每隔48小时照蛋一次，死亡的鸡胚随时挑出，至72小时不论死亡与否，全部取出，气室向上，置于28"C，冷却1224小时。收获分别收获M"株和朋99株鸡胚液。将冷却的鸡胚取出，用碘酊消毒气室部位，然后以无菌方法剥除气室部位卵壳，剪破绒毛尿囊膜及羊膜(勿使卵黄破裂)，吸取鸡胚液，每若干个胚的胚液混合为一组，置于灭菌瓶中，每毫升加入青霉素、链霉素各1000单位，放28'C感作412小时。在收获胚液的同时应逐个检查鸡胚，凡胎儿腐败，胚液混浊及有任何污染可疑者弃去不用。鸡胚病毒液的检验经处理后的Mw株和丽99株鸡胚病毒液，分别按照"规程"附录50页进行无菌检查(可不移植)，应无菌生长；胚液对1%鸡红细胞应无凝集；对10日龄易感鸡胚尿囊腔内接种EIDs。应《10—"A),lml。符合以上规定的方可作为制苗用病毒液。7、病毒液的浓縮与灭活(1)浓縮设备使用美国密理博公司的MINI-PELLICON标准超滤设备。该设备由两部分装置组成。其一是病毒尿囊液预过滤装置，此装置使用平板式293圆盘过滤器，该滤器用316L不锈钢制造，全不锈钢接口。运行成本低，病毒液残留体积很小，可夹持预过滤及除菌过滤膜数片。由于NDVLaSota株和IBVM"株、丽99株鸡胚尿囊液的黏度高，采用常规的除菌滤膜流量很低，时间长会导致病毒液丢毒，因此，使用0.45"m孔径的MILLIPORE的AP2529325型号专用预过滤膜，对病毒尿囊液进行粗滤，可滤除尿囊液中的杂质和很多微生物。结合生产后期的病毒灭活步骤，可达到无菌效果。其二是病毒液超过滤浓縮装置，该装置使用316L不锈钢膜包夹具及管路，全部采用卫生接口，内外表面电抛光处理。动力装置使用不锈钢蠕动泵和硅胶蠕动泵管。超滤浓縮使用分子量为500K-800K的超滤膜包，可截留ND、IB等病毒粒子。此超滤膜包采用低蛋白吸附改良纤维材料，其蛋白吸附量仅为国际通用的聚醚砜材料的1/41/5。本超滤装置的进液口和回流口及透过口均配有隔膜压力表及隔膜阀，可控制系统的压力，保证超滤浓縮过程的安全和高效。同时膜包夹具为直立式结构，系统排放容易，残留体积小，再加上最后用灭菌生理盐水冲洗、顶洗病毒液，使病毒液损耗极小。(2)超滤浓縮工艺方法粗滤将病毒尿囊液先用灭菌的100目/cm2的不锈钢漏斗滤过，除去大颗粒杂质，或用30005000rpm/min的离心机离心30min，去除沉渣，吸取上清液至一消毒的容器内。预过滤将293圆盘平板滤器及管道等高压蒸汽消毒(12rC，30min)，把盛有病毒液的容器通过管道与滤器连接充入除菌的空气加压后，(一般控制在0.05upa)，病毒液在一定压力下通过平板滤器的滤膜，从出口流出。用消毒的容器收集从平板滤器滤过后流出的病毒液，完成预过滤。超滤浓縮先将超滤装置用蒸馏水反复冲洗干净，然后用1N浓度的氢氧化钠溶液浸泡过夜12小时以上，使用时先用消毒的蒸镏水反复冲洗，将NaOH冲洗干净，使冲洗后的废弃液近中性。然后将预过滤的病毒液容器通过消毒管道与超滤装置连接，开启蠕动泵，使其流量达到4L/分钟，这样高的流速保证超滤膜包较长的使用寿命和最佳的超滤效果。经超滤浓縮的病毒液盛入密闭的容器内，并反复循环通过超滤装置，直至达到要求的浓縮终点。(3)浓縮效果测定3种病毒浓縮前和浓縮后，用测血凝价HA或EIDM、TCIDs。等方法进行检查，并确定浓缩终点。浓縮终点的确定以抗原量表示如下NDV浓縮终点的确定"鸡新城疫灭活疫苗制造及检验规程"中规定，单相油苗中LaSota株尿囊液的病毒含量为108QEID5。，由此可知，二联苗中LaSota株的浓縮终点的病毒含量应》3X10"EID5。。IBVM"株和HN99株浓縮终点的确定从"M"株和HI^株免疫原性、保存期测定"试验可知，IBVM^株或,99株单相油苗中的病毒含量为10">EID5(,，由此可知，二联苗中M"株或丽99株的浓縮终点的病毒含量为应》3X10fiOEID5O。3种病毒液按上述浓縮终点进行浓縮，浓縮后的病毒应达到浓縮终点的要求，同时对浓縮过程中的废弃液应随时抽样进行检查，检査其EIDs。应为零值。(4)浓縮病毒液的灭活与检验浓縮后的3种病毒液，分别加入10%的甲醛水溶液，使其最终浓度为O.1%，当苗温升至37""C时开始计算灭活时间，共灭活16小时。灭活后的3种病毒液，分别接种鸡胚，进行HA、EIDs。测定，证明病毒已彻底灭活。同时按"规程"P50页方法作无菌检验。证明无细菌生长者，方可作为制苗抗原。8、二联苗的乳化与分装(1)油相制备兽用白油为杭州炼油厂生产，司本-80为上海大众制药厂生产，硬脂酸铝为上海远航化工厂生产。以上三种成份混合、加热熔化至透明，经高压灭菌后冷却备用。(2)水相制备经检验合格后的3种灭活浓缩病毒液，等量混合并充分振荡均匀，加入灭菌冷却后的吐温-80(上海大众制药厂生产)，混合均匀备用。(3)疫苗的乳化应用"规程"(P8485)方法，把水相、油相混合后用胶体磨或与匀浆泵配合使用的方法，进行乳化。乳化工具胶体磨JTM50为沈阳新光机械厂制造，匀浆泵为上海东华机械厂制造。使用前先用0.5%甲醛溶液浸泡消毒8小时以上，用前以灭菌的热蒸馏水冲洗干净。用后用热水反复冲洗，彻底消除残留油苗。具体乳化法为将体积份数92—95份的兽用白油、5—8份的司本-80和占兽用白油与司本-80总重量1%—3%的硬脂酸铝混合、加热熔化并灭菌后冷却为油相；将3种灭活浓縮病毒液等量混合并充分振荡，加入占其体积百分比4%—5%的吐温-80混合为水相；按水相与油相体积比1:3—4的比例，乳化制成单相油乳剂灭活疫苗。各实施例具体成分配比如下:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>三批疫苗0203、0204、0205，分别作如下试验。(1)二联苗的物理性状检验剂型将三批二联苗滴于冷水表面，不分散为W/0型，分散为0/W型。粘度用出口内径1.2毫米的lml吸管，在室温条件下吸取lml二联苗，计算垂直放出0.4ml所需的时间。稳定性将二联苗以3000rpm离心15分钟，观察疫苗分层情况。将疫苗放37"C条件下经21天，观察疫苗分层情况。(2)无菌检验按"规程"附录50页的方法对三批二联苗进行无菌检验。(3)安全试验用3周龄的SPF鸡，肌肉注射二联苗2ml(4羽份)，观察二周，并进行解剖，记录试验鸡的反应情况和剖检情况。(4)效力检验ND效力检验每批疫苗用1月龄SPF鸡15只(NDHI〈1:4)，其中10只各皮下或肌肉注射二联苗20ixl，另5只不免疫作为对照，3周后，每只鸡肌肉注射ND强毒F48E9/E2，剂量为105ELD5Q，观察14天，记录免疫鸡与对照鸡存活与死亡情况。IB效力试验每批疫苗用3周龄SPF鸡16只，皮下或肌肉注射二联苗一羽份(0.3ml)，另外8只不免疫作为对照。三周后其中8只免疫鸡连同对照鸡4只，气管内滴入Mw含毒尿囊液(EIDs。》10670.lml)O.2ml，观察1周，记录免疫鸡与对照鸡的反应和死亡情况。另外8只免疫鸡和4只对照鸡气管内滴入丽99株病毒液EID5。》10670.lml)O.2ml，观察1周，记录免疫鸡与对照鸡的反应和剖检情况。(5)二联苗不同免疫剂量试验取上述二联苗三批，每批苗分别按0.1，0.2，0.3，0.4的剂量，分别免疫3周龄非免疫鸡，3周后照上述方法测定免疫鸡抗体水平，并攻击强毒，观察并记录免疫鸡和对照鸡的抗体水平、反应和病变情况。10、二联苗的实验室检验结果(1)二联苗物理性状检验结果剂型02030205三批二联苗检验样品滴于冷水表面，基本不分散，为W/0(油包水)型。粘度用出口内径1.2毫米的1毫升吸管，在室温条件下吸取3批二联苗各lml，垂直放出0.4ml所需的时间均在8秒以内，符合"规程"中"鸡新城疫灭活疫苗制造及检验规程"中关于油乳剂的粘度要求。稳定性3批二联苗以3000rpm离心30分钟，疫苗不分层、不破乳。二联苗在28X:保存一年，2(TC25。C保存半年，疫苗不分层，37°C放一个月不分层，二个月疫苗表面有2mm左右的油层，摇荡后即成均匀的乳剂。结果如表l。表l二联苗物理性状检验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>(3)安全试验用3周龄的SPF鸡，肌肉注射二联苗2ml(4羽份)。疫苗注射后部分试验鸡出现短时间精神不振，12小时后即恢复正常。共观察3周，所有试验鸡精神良好，吃喝正常。三周后捕杀，所有脏器未见异常变化。注射局部有少量未吸收的疫苗，但无肿胀溃烂。试验证明疫苗安全，结果如表3。表3二联苗安全检验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注"-"表示无反应，"±"表示有少量未吸收疫苗。(4)效力试验ND效力试验每批疫苗用1月龄SPF鸡10只，其中5只皮下注射，5只肌肉注射，剂量为二联苗20W，另5只不免疫作为对照，34周后，每只鸡肌肉注射ND强毒F48E9/E2，105ELD5。，观察14天，对照鸡全部死亡，三批疫苗免疫鸡全部保护，达到"规程"中"鸡新城疫油乳剂灭活疫苗制造及检验规程"的效力检验标准。IB效力试验每批疫苗用3周龄SPF鸡16只，皮下和肌肉注射各8只，每只剂量0.3ml，三周后其中8只免疫鸡(4只肌肉注射，4支皮下注射)连同条件相同的对照鸡4只，气管内注射M^含毒尿囊液(EK10-"/0.lml)0.2ml，观察二周，结果免疫鸡保护7/8以上。M41株对照鸡全发病，发病鸡有咳嗽、甩头等典型支气管炎症状，2只鸡解剖后支气管、肺脏有充血、出血等病变，另外8只免疫鸡和对照鸡4只，气管内注射丽99株含毒尿囊液(EID5Q《1(T70.lml)，观察二周，结果免疫鸡全保护，对照鸡3/4发病，发病鸡有咳嗽、呼吸快、甩头等支气管炎症状，其中1只鸡有肾肿、1只鸡支气管、肺脏充血和出血的解剖症状。符合"国家质量标准"中"鸡传染性支气管炎灭活疫苗"效力检验标准的要求。详细结果见表4。表4二联苗效力试验疫苗效检免疫剂量免疫ND攻毒前抗体攻毒对照结批号项目(ml)鸡数HI(L0g2)保护情况果ND0.02108.510/100/5活合格0203M410.387/84/4发病HN990.388/83/4发病ND0.02108.2510/100/5活合格0204M410.388/84/4发病HN990.388/83/4发病ND0.02108.510/100/5活各格0205M410.387/84/4发病HN卵0.388/83/4发病注攻毒剂量NDV:FE9-E2，105ELD5()，肌肉注射。IBV:M"E4和,99株，含毒尿囊液(EK1(T65/0.lml)气管内滴入0.2ml，并施行冷剌激。11、二联苗不同免疫剂量的效力试验用二联苗0203、0204、0205三批疫苗，分别用0.1、0.2、0.3、0.4的免疫剂量，按照第2.6.4项效力检验的方法，免疫试验鸡。21天后，采血测定NDHI,并分别攻击ND、IBM"和,99强毒，观察攻读结果。如<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>从表5的结果可以看出，三批二联苗免疫O.l0.4ml，试验鸡攻毒后，免疫试验鸡ND攻毒后，保护7/1010/10，IBM^和HN^攻毒保护6/88/8，攻毒结果均达到"规程"和"标准"的规定标准。12、二联苗实验室试验结果分析(1)IBVM"株和朋99株基础种毒代数为最高代次Es，生产用种毒最高代次为第3代；冻干毒在-18"C以下，保存期至少3年，生产用毒种(鸡胚尿囊液)在-15"C以下保存，不超过6个月。(2)二联苗制苗用病毒液的制备用"规程"中的方法测定，NDVLaSota株鸡胚尿囊液的病毒含量》10"EID5。，HA》1:640;IBVM"株、丽99株鸡胚尿囊液的病毒含量^Ur。EID5。。三种病毒液经无菌检验均无菌生长，符合制苗的要求。(3)二联苗3种病毒液的浓縮试验结果二联苗中3种病毒液用美国密里博超滤装置浓縮病毒的工艺是可行的。选用适宜孔径的超滤膜包，用测定病毒含量或HA的方法，按照予先设计的浓縮终点，可以达到浓缩NDV、IBV3种病毒液的目的。浓缩后的废弃液，采用检査EIDs。的方法，证明浓縮后的排放液中不含病毒，浓縮效果较为理想。(4)二联苗浓縮病毒液的灭活试验证实，3种浓縮病毒液，采用0.1%甲醛溶液，在37T条件下灭活16小时后，LaSota株、M41株、HN9g株病毒灭活液0.2ml接种鸡胚，结果鸡胚在规定时间内，全部健活，3种病毒液经灭活后均失去活性，证明灭活彻底。(5)二联苗的乳化与分装二联苗三种灭活后的病毒液等量混合后，按照水相油相为l:3的比例，用胶体磨分别乳化后，再经匀浆机充分乳化并混合均匀，可以制备出理想的单相油乳剂灭活疫苗。13、疫苗的田间试验田间试验中使用的产品批数、批号0203、0204、0205三批试验时间和地点郑州市荥阳鸡场2002年6月份主要试验内容和结果三批二联苗分别免疫罗曼90日龄和210日龄产蛋鸡各1000只，每只肌肉注射O.5ml。注射后共观察14日，所有注射鸡均无全身症状出现，吃食、饮水正常，210日龄产蛋鸡产蛋率未受影响。少数鸡因注射时抓鸡有应激反应，当天不产蛋，但次日即恢复正常。所有免疫鸡的注射部位反应正常，无红肿或溃烂现象。说明三批二联苗对开产前母鸡和正在产蛋的鸡使用后无不良的全身症状和局部症状出现，产蛋率不受影响。试验证明，三批二联苗使用安全。三批二联苗免疫后第三周，采血测定抗体，NDHI(iQg2)由原来的7.08.25升至9.011.5，IB中和抗体价由原来的1:8升至1:161:32。试验证明，三批二联苗免疫三周后，NDHI、IB中和抗体上升到较高的水平。4个月后回访客户，免疫鸡均未发生ND、IB这二种传染病。三批二联苗免疫7日龄非免疫雏鸡各500只，每鸡注射0.3ml，注射后观察14日，所有免疫鸡均未出现任何全身症状和局部症状，免疫雏鸡饮食、精神正常，发育正常，注射部位未有红肿、溃烂等异常情况，证明二联苗对雏鸡安全性良好。上述三批二联苗免疫雏鸡二周后按"规程"和"标准"的方法，分别用,F』9强毒105ELD5。的剂量和IBVM"株和丽99株强毒尿囊液0.2ml分别以肌肉注射和气管滴入法进行攻击，结果三批二联苗ND免疫雏鸡均全保护，对照死亡5/5，传支M"和HN99均保护8/8，对照3/4发病，证明二联苗对雏鸡免疫效果较好。14、二联苗中试生产及检验结果按照"农业部兽用新生物制品管理办法"的要求，在完成实验室的基础上，在北京兽医生物药品厂进行了二联苗的中间试产，共试制二联苗6批，并参照"中华人民共和国兽用生物制品规程"(以下简称"规程")和"中华人民共和国兽用生物制品质量标准"(以下简称"国标")的方法对6批疫苗进行了安全试验、效力试验、物理性状检测、无菌检验等，各项检验结果均达到了"规程"和"国标"的要求。详细结果见表6、7、8。表6二联苗中试物理性状检验及无菌检验<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表7:<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注(一)表示无异常反应。表8二联苗中试生产效力检验<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>15、二联苗大面积区域性试验利用中试生产的6批二联苗，在河南省漯河市阳光禽业有限公司、南阳市蒲山种鸡场、南阳市冯楼种鸡场、康佳种鸡场、漯河市日日红禽业有限公司等5个种鸡场，进行了大面积的区域性试验。共注射罗曼、海兰、海赛、AA等品种的种鸡46000只。注射后观察23周，注射鸡的精神、采食、饮水都正常，注射当日产蛋率因应激反应下降23个百分点，次日即恢复正常。注射部位基本无肿胀、溃烂、发炎等情况。注射后NDHl较注射前上升34l。g2，从区域性试验用户的反应情况，证明二联苗安全性好，效力可靠。详细结果见表9。表9二联苗区域性试验情况疫苗批号试验鸡场注射品种、曰龄注射数量(只)局部反应全身反应注射前NDHIG。g2)注射后NDHI(bg2)0601漯河市阳光种鸡场海兰、1102000无异常反应精神、饮食正常6.09.0康佳种鸡场海赛、1253000无异常反应精神、饮食正常8910130602漯河市阳光种鸡场海兰、1102000无异常反应精神、饮食正常6.09.00603南阳蒲山种鸡场海兰、开产刖3000无异常反应精神、饮食正常67911康佳种鸡场海赛、1253000无异常反应精神、饮食正常8910130604南阳蒲山种鸡场海兰、开产前3000无异常反应精神、饮食正常679110605漯河日R红种鸡场AA、185000无异常反应精神、饮食正常68810南阳冯楼种鸡场罗曼开产后半年10000无异常反应精神、饮食和产蛋正常91110140606南阳冯楼种鸡场罗曼开产后半年10000无异常反应精神、饮食和产蛋正常9111014漯河日日红种鸡场AA、185000无异常反应精神、饮食正常68810权利要求1、预防鸡新城疫、传染性支气管炎的二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，选用毒种为新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M41和HN99肾型变异株，制备二联疫苗的步骤如下(1)、将新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M41和HN99肾型变异株稀释后接种SPF鸡胚尿囊腔内，收取胚液，作为毒种；(2)、将LaSota株、M41株和HN99株毒种稀释后分别接种易感鸡胚尿囊腔，分别收获LaSota株、M41株和HN99株鸡胚病毒尿囊液；(3)、将病毒尿囊液分别浓缩；(4)、浓缩病毒液分别加入灭活剂灭活，然后等量混合，用乳化法制成单相油乳剂灭活疫苗。2、如权利要求l所述的预防鸡新城疫、传染性支气管炎的二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的乳化法为将体积份数92—95份的兽用白油、5—8份的司本-80和占兽用白油与司本-80总重量1%—3%的硬脂酸铝混合、加热熔化并灭菌后冷却为油相；将3种灭活浓縮病毒液等量混合并充分振荡，加入占其体积百分比4%—5%的吐温-80混合为水相；按水相与油相体积比1:3—4的比例，乳化制成单相油乳剂灭活疫苗。3、如权利要求1或2所述的预防鸡新城疫、传染性支气管炎的二联灭活疫苗的制备方法，其特征在于，灭活剂为体积百分比浓度0.1%—0.2%的甲醛水溶液，灭活时间为12—24小时。全文摘要本发明涉及预防家禽传染病的疫苗，尤其涉及一种预防鸡新城疫、传染性支气管炎的二联灭活疫苗的制备方法，选用毒种为新城疫病毒LaSota株、传染性支气管炎病毒M₄₁株和HN₉₉肾型变异株制备二联灭活疫苗，制备步骤如下将两种病毒稀释后分别接种SPF鸡胚尿囊腔内，收取活胚和死胚的胚液作为毒种，稀释后分别接种易感鸡胚的尿囊腔，分别收获病毒尿囊液，然后通过超滤装置浓缩，浓缩后病毒液分别加入甲醛水溶液灭活后混合，用乳化法制成疫苗。使用本发明可同时预防鸡新城疫、鸡肾型和呼吸型传染性支气管炎，可减少打针次数，降低防疫成本，使用方便，经济实用。文档编号A61K39/12GK101099864SQ200610018069公开日2008年1月9日申请日期2006年7月3日优先权日2006年7月3日发明者崔保安,张素梅,徐端红,莉王,王学斌,舒德广,高文明,魏占勇申请人:河南农业大学