专利名称：同种异体脂肪干细胞作为组织工程种子细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及同种异体脂肪干细胞，尤其是作为组织工程种子细胞的人脂肪干细胞。
背景技术：
脂肪干细胞(Adipose derived stem cells，ADSCs)是一类存在于脂肪组织基质中，增殖能力强、具有多向分化潜能的成体干细胞。
ADSCs与另一类同样起源于中胚层的成体干细胞—骨髓基质干细胞(BoneMarrow Stem Cells，BMSCs)不但具有非常相似的生物学特性，而且在细胞表面标志谱的表达方面也非常接近。免疫学研究表明，正常状态下BMSCs不表达HLAII类抗原、B7-1、B7-2、CD40、CD40L等免疫调节分子；BMSCs在体外可抑制混合淋巴细胞反应，体内系统性应用BMSCs可明显延长异体皮片移植的成活时间，在造血干细胞移植的同时移植BMSCs可明显降低移植物抗宿主反应。同种异体BMSc已经成为组织工程一类重要的种子细胞来源。
组织工程或细胞治疗的关键性问题首先在于获取大量的种子细胞，以保证治疗的有效性。成体干细胞的应用大大拓展了种子细胞的来源，并且克服了胚胎干细胞应用中存在的伦理性问题。但骨髓穿刺给病人带来很大的痛苦，而同时，临床上脂肪抽吸术后脂肪组织大多丢弃，造成了宝贵干细胞的大量浪费。
因此本领域迫切需要一种脂肪干细胞，它免疫原性低，而且具有多向分化功能。
发明内容
本发明的目的是提供一种成骨诱导、成软骨诱导和成脂肪诱导的人脂肪干细胞及其制备方法。
本发明的另一个目的是提供人脂肪干细胞的应用，可用于骨髓移植或器官移植的辅助治疗。
在本发明的第一个方面，是提供了一种人脂肪干细胞，所述的脂肪干细胞具有分化为特异组织类型细胞的能力，其中所述的特异组织类型细胞包括成骨细胞、成软骨细胞或成脂肪细胞。
所述脂肪干细胞具有分化为成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞的能力。
在另一优选例中，体外培养的第三代ADSCs在特定的诱导环境下，能够分别表达成骨、成软骨与成脂肪细胞的表型并合成相应的细胞外基质。
上述的脂肪干细胞经成骨、成软骨或成脂肪诱导后不刺激异体淋巴细胞增殖。
上述的脂肪干细胞经成骨、成软骨或成脂肪诱导后能抑制混合淋巴细胞反应；其组织相容性抗原(HLA)I类分子呈阳性表达。
在另一优选例中，所述的对混合淋巴细胞抑制反应依赖于诱导后的细胞浓度。
在另一优选例中，当诱导后的细胞浓度降低至1×102/孔时，其抑制混合淋巴细胞反应的作用消失。
在另一优选例中，所述的人脂肪干细胞，组织相容性抗原(HLA)I类分子阳性表达，不能刺激异体淋巴细胞产生增殖反应，可抑制双向混合淋巴细胞增殖反应，或可抑制非特异性淋巴细胞增殖。
在另一优选例中，所述的人脂肪干细胞，人γ-干扰素(IFN-γ)作用后，组织相容性抗原I类分子阳性表达未见明显增加，异体淋巴细胞未见明显增殖，仍可明显抑制双向混合淋巴细胞增殖反应。
在另一优选例中，所述的人脂肪干细胞在体外被诱导分化为成骨细胞、成软骨细胞或成脂肪细胞。
在另一优选例中，提供了一种所述的人脂肪干细胞的制备方法，它包括步骤a人脂肪抽吸物用I型胶原酶消化；b离心弃上清，有核细胞接种；c加入DMEM培养液，培养、传代。
在另一优选例中，所述的制备方法的步骤a中，人脂肪抽吸物用PBS冲洗，加入等体积0.1％I型胶原酶消化；步骤(a)中消化60分钟；所述的制备方法的步骤b中，有核细胞接种密度10,000-40,000个/cm2；所述的制备方法的步骤c中，DMEM培养液中含10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)，并置于37℃、5％CO2、100％饱和湿度的条件下培养；细胞融合至70～80％传代。
在另一优选例中，上述制备方法的培养液中加入γ-干扰素(IFN-γ)。
在本发明的第二个方面，提供了一种将上述的人脂肪干细胞诱导分化为成骨细胞的方法，它包括步骤在以下诱导条件下进行成骨诱导培育地塞米松(Dex)0.1±0.05μmol/L，维生素D3 10±5nmol/L与β-磷酸甘油10±5mmol/L，37±2℃，诱导时间为10-18天，从而形成成骨细胞。
在另一优选例中，还包括对诱导形成的成骨细胞通过Von Kossa染色观察钙结节、通过RT-PCR检测碱性磷酸酶(Alkaline Phosphotase，ALP)、骨桥蛋白(Osteopondin，OPN)基因的mRNA表达情况，从而证实成骨细胞的形成。
在另一优选例中，应用BMP2(骨形态发生蛋白2)作为成骨诱导因子。
在本发明的第三个方面，提供了一种将上述的人脂肪干细胞诱导分化为成软骨细胞的方法，它包括步骤在以下诱导条件下进行成软骨诱导培育转移生长因子β110±5ng/ml，胰岛素样生长因子100±50ng/ml)，地塞米松(Dex)0.1±0.05μmol/L，37±2℃，诱导时间为5-10天，从而形成软骨细胞。
在另一优选例中，还包括对诱导形成的细胞通过免疫荧光检测II型胶原蛋白表达，通过RT-PCR检测II型胶原蛋白与Aggrecan(聚集蛋白聚糖)基因的mRNA表达。
在本发明的第四个方面，提供了一种将上述的人脂肪干细胞诱导分化为成脂肪细胞的方法，它包括步骤在以下诱导条件下进行成脂肪诱导培育3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)0.5±0.1Mm、地塞米松(Dex)1±0.05μM、胰岛素(Insulin)10±5μM、吲哚美辛(Indomethacin)200±50μM，37±2℃，诱导时间为15～30天，从而形成脂肪细胞。
在另一优选例中，还包括对诱导形成的细胞通过油红染色观察细胞内脂滴沉积，通过RT-PCR检测PPARγ2(过氧化物酶体增殖蛋白激活性受体γ2)及Leptin(瘦素)基因的mRNA表达。
在本发明的第五个方面，提供了一种上述的人脂肪干细胞的用途，它可以用于制备成骨细胞或成软骨细胞。
所述的用途还包括(a)用于制备用于器官移植中的移植物；(b)作为种子细胞用于制备同种异体间的移植物。
可见经抽吸术获得大量曾被作为“废物”摒弃的脂肪组织，为人成体干细胞的应用提供了新的充足来源。
图1 HLA表达流式细胞仪检测。
图2.ADSCs表面标志流式细胞仪检测。
图3 异体ADSCs刺激淋巴细胞反应。
图4.ADSCs抑制植物血凝素刺激淋巴细胞增殖反应。
图5.ADSCs对混合淋巴细胞反应的作用。
图6 ADSCs与BMSCs抑制混合淋巴细胞反应的比较观察。
图7 脂肪干细胞体外诱导，其中a显示了脂肪干细胞体外成骨诱导中Von Kossa染色的钙结节；b显示了脂肪干细胞体外成骨诱导中RT-PCR检测碱性磷酸酶(AlkalinePhosphotase，ALP)和骨桥蛋白(Osteopondin，OPN)基因的表达；c显示了脂肪干细胞体外成软骨诱导中免疫荧光检测II型胶原蛋白的表达；d显示了脂肪干细胞体外成软骨诱导中RT-PCR检测II型胶原蛋白与Aggrecan的mRNA表达；e显示了脂肪干细胞体外成脂肪诱导中油红染色的细胞内脂滴沉积；f显示了脂肪干细胞体外成脂肪诱导中RT-PCR检测PPARγ2及Leptin基因表达。
图8诱导ADSCs刺激异体淋巴细胞增殖反应。
图9诱导ADSCs对混合淋巴细胞反应的作用。
图10显示了手术过程。
图11显示了术后6个月的植入物A三维CT显示情况；B大体观察情况；CX光检测显示情况。
图12.显示了组织学检测结果。(HE染色，×400倍)
具体实施例方式
发明人经过广泛而深入的研究发现，从人脂肪组织中获得的脂肪干细胞具有多向分化能力，可诱导成骨、成软骨和成脂肪。该发现提示，那些被大量废弃的人脂肪抽吸物可被用于提取脂肪干细胞，所获得的脂肪干细胞可作为种子细胞用于他人；人脂肪组织中获得的脂肪干细胞可用于骨髓移植或器官移植的辅助治疗，减少排斥反应。
本文所用的术语“ADSCs(Adipose derived stem cells，脂肪干细胞)”是指从脂肪组织中得到的具有增殖分化能力的干细胞。更佳地，指同时具有多向分化能力的脂肪干细胞。
本文所用术语“BMSCs(Bone Marrow Stem Cells，骨髓基质干细胞)”是从骨髓中得到的具有增殖分化能力的干细胞。
本文所用术语“HLA分子”是人类组织相容性抗原；本文所用“B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD40、CD28、CD44、CD45、CD29、CD105、CD166”是免疫调节分子。
本文所用术语“成骨诱导”、“成软骨诱导”和“成脂肪诱导”是指体外培养的ADSCs分别在成骨、成软骨、成脂肪诱导条件下，表达成骨、软骨和脂肪细胞表型。
本发明所用术语“成骨细胞”和“骨细胞”可互换使用。
本发明揭示，人脂肪干细胞(ADSCs)具有多向分化潜能，能够分别表达成骨、软骨与脂肪细胞的表型并合成相应的细胞外基质。成骨、成软骨与成脂肪诱导的ADSCs均未刺激异体淋巴细胞增殖，抗原反应性未发生显著性的改变。成骨、成软骨与成脂肪诱导的ADSCs能抑制混合淋巴细胞反应，保持了作为干细胞的调节免疫反应的能力。
成骨诱导、成软骨诱导或成脂肪诱导的人脂肪干细胞，不能刺激异体淋巴细胞产生增殖反应，但能抑制混合淋巴细胞增殖，其抑制混合淋巴细胞增殖反应具有细胞数量依赖性，细胞浓度降低到1×102/孔时，抑制混合淋巴细胞增殖反应的作用消失；在人IFN-γ作用后，异体淋巴细胞没有明显增殖，仍可明显抑制双向混合淋巴细胞增殖。
成骨诱导、成软骨诱导或成脂肪诱导的人脂肪干细胞，以0.4％多聚甲醛固定后，所有分化的人脂肪干细胞对淋巴细胞增殖的抑制作用均消失。
本发明的另一方面揭示，ADSC表达HLAI类分子，但未检测到HLAII类分子阳性表达。B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD28、CD40未见明显阳性表达。人IFN-γ刺激48h后，HLAII类分子表达明显增高，HLAI类分子表达未见明显增高。异体或经IFN-γ作用的ADSC均未能刺激异体淋巴细胞增殖。同样数量的ADSC可明显抑制双向混合淋巴细胞增殖，经IFN-γ作用后抑制作用未见明显减弱。
本发明所述的人脂肪干细胞，其HLAII类分子阴性表达，而人γ-干扰素(IFN-γ)作用后，HLAII类分子表达明显增加；所述的人脂肪干细胞也不表达B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD40、CD28；人γ-干扰素(IFN-γ)作用后，B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD40、CD28也未见明显阳性表达；所述的人脂肪干细胞培养到第二代，CD44、CD45、CD29、CD105、CD166表达率维持较高水平。
本发明所述的人脂肪干细胞，其对混合淋巴细胞反应的抑制作用为非接触依赖性的，抑制双向混合淋巴细胞增殖反应具有细胞数量依赖性，随细胞数量的降低而抑制作用逐渐减弱，其抑制作用程度与骨髓干细胞相似。
本发明所述的人脂肪干细胞，抑制非特异性淋巴细胞增殖反应具有细胞数量依赖性，1×104-5数量级的人脂肪干细胞可抑制非特异性淋巴细胞增殖，细胞浓度降低到1×103时，抑制非特异性淋巴细胞增殖反应作用消失；在白介素-2(IL-2)的作用下，其抑制非特异性淋巴细胞增殖反应的作用会发生逆转。
将人脂肪干细胞诱导分化为成骨细胞是本领域中熟知的。一种优选的方法是在培养液中加入地塞米松、维生素D3与β-磷酸甘油。合适的培养液包括(但并不限于)1)F-12培养基+10％胎牛血清；2)F-12培养基+20％小牛血清；3)F-12培养基+10-20％自体(异体)人血清。此外，上述培养液中添加各种生长因子、各种转基因成分和各种细胞成分。
将人脂肪干细胞诱导分化为软骨细胞是本领域中熟知的。一种优选的方法是在培养液中加入TGFβ1、IGF与地塞米松。合适的培养液包括(但并不限于)1)F-12培养基+10％胎牛血清；2)F-12培养基+20％小牛血清；3)F-12培养基+10-20％自体(异体)人血清。此外，上述培养液中添加各种生长因子、各种转基因成分、各种细胞成分。
将人脂肪干细胞诱导分化为脂肪细胞是本领域中熟知的。一种优选的方法是在培养液中加入IBMX、Dex、Insulin与Indomethacin。合适的培养液包括(但并不限于)1)F-12培养基+10％胎牛血清；2)F-12培养基+20％小牛血清；3)F-12培养基+10-20％自体(异体)人血清。此外，上述培养液中添加各种生长因子、各种转基因成分、各种细胞成分。
本发明所述的人脂肪干细胞在同种异体间作为种子细胞的应用，可用于制备骨移植物或软骨移植物。
所述的移植物包括(a)成骨细胞或软骨细胞；(b)医学上可接受的生物可降解材料。
可用于本发明的组织工程化软骨的材料是医学上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)(a)人工合成的高分子可降解性材料，例如聚α-羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟基乙酸PGA、聚羟基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；(b)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐、藻酸钙凝胶等；各种脱细胞基质；(c)上述材料的混合物或复合材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料。
本发明骨移植物中的骨细胞的浓度为1×106/ml至1×107/ml或更高，本发明软骨移植物中的软骨细胞浓度通常约为1×106/ml至1×108/ml或更高。当材料为可注射性材料时，以该液体材料调整骨细胞或软骨细胞浓度；当材料为固体性材料时，以培养液调整骨细胞或软骨细胞浓度，然后与固体性材料混合，其中混合时培养液与固体性材料的比例没有特别限制，但是以该固体材料能够吸附的培养液最大量为准。
在本发明的组织工程化软骨移植物中，还可添加或复合其他各种细胞、生长因子、各种转基因成分，从而保持骨细胞或软骨细胞表型、促进骨细胞或软骨细胞生长或基质合成能力等，或者促进组织生长和血管神经的长入等。
本发明的骨移植物或软骨移植物的制备方法简便，将一定数量的所述骨细胞或软骨细胞与药学上可接受的生物可降解材料混合即可。
本发明所述的人脂肪干细胞在骨髓或器官移植中的应用，是制备用于骨髓移植或器官移植中的移植物。代表性的移植物包括(但并不限于)骨移植物、软骨移植物或脂肪移植物。
本发明的主要优点在于1.将大量废弃的脂肪抽吸物加以利用，为大量提供种子细胞开辟了充足的来源；2.首次将人脂肪干细胞用于移植治疗，减少排斥反应。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1人脂肪干细胞的制备(1)脂肪抽吸物PBS反复冲洗，加入等体积0.1％I型胶原酶(WORTHINGTON公司，美国)，37℃恒温摇床消化1h；(2)300rpm/10min，弃上清，以4×104个有核细胞/cm2密度接种于100mm培养皿(Franklin Lakes NJ公司，美国)；(3)加入含10％胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)DMEM培养液(GIBCO公司，美国)，置于37℃、5％CO2、100％饱和湿度的条件下培养，得到人脂肪干细胞；(4)细胞融合至70-80％时进行传代培养，得到传代的人脂肪干细胞。
对于获得的人脂肪干细胞，通过实验例1-6所述的方法进行检测。
实验例1
HLA表达流式细胞仪检测取实施例1所得的人脂肪干细胞体外培养的第二代细胞进行检测(1)0.25％胰蛋白酶(上海思吉生物制品有限公司)消化收集细胞，细胞浓度调整为1.5～3×106/ml；(2)离心，将沉淀细胞用100ul流式缓冲液(含1％FBS的PBS)重悬，分别加入鼠抗人PE标记的HLAI抗体(1∶10，美国，Santa Cruz公司)，鼠抗人FITC标记的HLAII抗体(1∶10，美国，BD公司)，4℃避光孵育45-60min，流式缓冲液洗涤；1％多聚甲醛固定；(3)通过同型对照设定阳性细胞阈值，流式细胞仪检测；(4)ADSCs培养液中加入IFN-γ(20ng/ml，Sigma公司)，作用48h，流式细胞仪检测HLAI、HLAII的表达。结果见图1。
结果显示ADSCs细胞表达HLAI类分子，但未检测到HLAII类分子阳性表达。人IFN-γ刺激48h后，HLAII类分子表达明显增高(P＜0.05)，HLAI类分子表达无明显改变(P＞0.05)。
实验例2ADSCs表面标志流式细胞仪检测取实施例1所得的人脂肪干细胞体外培养的第二代细胞进行检测(1)0.25％胰蛋白酶(上海思吉生物制品有限公司)消化收集细胞，细胞浓度调整为1.5～3×106/ml；(2)离心，将沉淀细胞用100ul流式缓冲液(含1％FBS的PBS)重悬，分别加入鼠抗人PE标记的CD34(1∶10，美国，Dako)、CD14(1∶10，美国，Serotec公司)、CD44(1∶10，美国，Sigma公司)、CD29(1∶10，美国，Santa Cruz公司)、CD166(1∶10，美国，Serotec公司)、HLAII(1∶10，美国，BD公司)、B7-1、B7-2、CD40抗体(1∶10，美国，Chemicon公司)和鼠抗人PE标记的CD105、CD45、HLAI抗体(1∶10，美国，Santa Cruz公司)，4℃避光孵育45-60min，流式缓冲液洗涤；1％多聚甲醛固定；(3)通过同型对照设定阳性细胞阈值，流式细胞仪检测；(4)ADSCs培养液中加入IFN-γ(20ng/ml，Sigma公司)，作用48h，流式细胞仪检测HLAI、HLAII的表达。结果见图2。
结果显示B7-1(CD80)、B7-2(CD86)等第二信号均未见明显表达，说明ADSc刺激T淋巴细胞的能力较低。同时，B细胞活化也同样需要CD40、CD40L第二信号的作用，提示CD40在ADSCs表面表达也很低。说明ADSCs可能具有与BMSc相似的调节淋巴细胞反应的免疫调节功能。
实验例3异体ADSCs刺激淋巴细胞反应取实施例1所得的人脂肪干细胞体外培养的第二代细胞进行检测(1)抽取外周血10ml，密度梯度离心分离单个核细胞；(2)加入细胞培养液RPMI 1640基础培养液(美国，GIBCO公司)，25mmol/L的HEPES(Sigma公司，美国)，青霉素(100U/mL，上海先锋药业公司)，链霉素(100μg/mL，华北制药股份有限公司)，L-谷氨酰胺(2mmol/L，上海思吉生物制品有限公司)，10％胎牛血清(美国，Hyclone公司)，细胞计数后以1×105/ml接种于96孔板；(3)ADSCs经PBS反复冲洗后，以1×105/孔数量分别加入，与淋巴细胞共培养6天；(4)另一组在ADSCs接种时加入IFN-γ(20ng/ml)，刺激HLAII抗原表达，共培养6天；(5)收获前16-18小时每孔加入氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-thymidine，3H-TDR)(中国科学院上海核技术开发公司)，放置于37℃、5％二氧化碳培养箱中培养；(6)收集样品于玻璃纤维滤纸上，烤干后β液闪仪计数。增殖水平用CPM值(count per minute)表示。体外培养第二代真皮成纤维细胞(DermalFibroblast，FB)为阴性对照。结果见图3。
结果显示脂肪干细胞未能刺激淋巴细胞增殖(ADSC)，具有较低的免疫原性；应用IFN-γ刺激(IFN-γ)、多聚甲醛作用(Fixed)失活的ADSCs，均未见刺激淋巴细胞增殖；成纤维细胞(Fb+P)与异体淋巴细胞(Px)为阳性对照。
(*与ADSC组比较P＜0.05；**与ADSC组比较P＞0.05)实验例4ADSCs抑制植物血凝素刺激淋巴细胞增殖反应取实施例1所得的人脂肪干细胞体外培养的第二代细胞进行检测(1)获取外周血淋巴细胞，细胞计数后以1×105/ml接种于96孔板；(2)加入PHA(Sigma公司，美国)，浓度为2μg/ml；(3)ADSCs经PBS反复冲洗后，以1×102～5/孔数量分别加入共培养6天，测CPM值；(4)另一组在ADSCs接种时加入IL-2(50units/ml)，共培养6天后测CPM值。结果见图4。
结果显示以PHA刺激淋巴细胞增殖，发现1×104-5数量级的ADSCs可抑制非特异性的淋巴细胞增殖反应，抑制作用呈浓度依赖性，细胞浓度降低到1×103时，抑制作用基本消失。加入IL-2后，对淋巴细胞增殖的抑制作用可得到逆转。
实验例5ADSCs对混合淋巴细胞反应的作用取实施例1所得的人脂肪干细胞体外培养的第二代细胞进行检测(1)收集外周血淋巴细胞，按照反应细胞(responding cells)、刺激细胞(stimulating cells)接种于96孔板，细胞数目均为1×105个；(2)“第三者”(Third Party)ADSCs经PBS反复冲洗后，以1×102～5细胞/孔数量分别加入，与淋巴细胞共培养6天，同法加入3H-TDR，测定CPM值。
(3)参照Chestnut方法，ADSCs离心收集后弃上清，加入0.5％多聚甲醛作用20min使细胞失活，同样数量接种并与淋巴细胞共同培养；(4)另一组在ADSCs接种时加入IFN-γ(20ng/ml)，刺激HLAII抗原表达，共培养6天后测CPM值。结果见表1和图5。
表2ADSCs对双向混合淋巴细胞反应的作用 *与异体淋巴细胞、成纤维细胞比较P＜0.05；#与10^5比较P＜0.05结果显示，ADSC抑制双向混合淋巴细胞反应，细胞浓度降低至1×102抑制作用明显降低(ADSC)，这种抑制作用具有一定的细胞数量依赖性，随细胞数量的降低而抑制作用逐渐减弱；经过γ-干扰素作用的各数量组ADSCs，抑制淋巴细胞增殖的作用与未作用组无明显差别；细胞固定后抑制作用消失(Fixed)，表明ADSCs抑制淋巴细胞增殖的作用，并非由细胞间直接的物理性接触所致；成纤维细胞(Fb)为阳性对照。
实验例6ADSCs与BMSCs抑制混合淋巴细胞反应的比较观察取实施例1所得的人脂肪干细胞体外培养的第二代细胞进行检测(1)髂前上嵴骨穿法抽取健康成年人骨髓3-5ml(肝素100u/ml抗凝)，采用percoll密度梯度离心法获取单个核细胞；(2)以20×106有核细胞接种直径100mm培养皿，于含10％FBS的DMEM培养液培养；(3)第三代细胞以1×104～1×105细胞/孔数量分别加入，与混合淋巴细胞共培养6天，同法加入3H-TDR，测定CPM值。结果见图6。
结果显示在细胞数量分别为1×104与1×105，ADSCs与骨髓基质干细胞(BMSCs)抑制淋巴细胞增殖反应的程度差别无显著性。
(Px混合淋巴细胞反应程度；P1刺激异体淋巴细胞增殖情况；*与BMSCs相比P＜0.01)实施例2脂肪干细胞体外成骨诱导(1)取实施例1所得的人脂肪干细胞体外培养的第三代细胞进行培养；(2)细胞培养液中加入地塞米松(0.1μmol/L)，维生素D3(10nmol/L，Sigma公司，美国)与β-磷酸甘油(10mmol/L，ICN Biomedical公司，美国)；(3)诱导14天后，行Von Kossa染色观察钙结节、RT-PCR检测碱性磷酸酶(Alkaline Phosphotase，ALP)、骨桥蛋白(Osteopondin，OPN)基因的表达等。
结果见图7a与b。结果显示，表达成骨细胞表型。
实施例3脂肪干细胞体外成软骨诱导(1)取实施例1所得的人脂肪干细胞体外培养的第三代细胞进行培养；(2)细胞培养液中加入TGFβ1(10ng/ml，R&D公司，美国)，IGF(100ng/ml，R&D公司，美国)，地塞米松(0.1μmol/L，Sigma公司，美国)；(3)诱导7天后，免疫荧光检测II型胶原蛋白表达，RT-PCR检测II型胶原蛋白与Aggrecan的mRNA表达。
结果见图7c与d。结果显示，表达软骨细胞表型。
实施例4脂肪干细胞体外成脂肪诱导(1)取实施例1所得的人脂肪干细胞体外培养的第三代细胞进行培养；(2)细胞培养液中加入IBMX 0.5Mm、1μM Dex、10μM胰岛素、200μM吲哚美辛；(3)诱导21天后，油红染色观察细胞内脂滴沉积，RT-PCR检测PPARγ2及Leptin基因表达。
结果见图7e与f。结果显示，表达脂肪细胞表型。
结果证实，人脂肪干细胞具有多向分化潜能。
对于实施例2-4获得的经诱导的人脂肪干细胞，通过实验例7-8所述的方法进行检测。
实验例7诱导ADSCs刺激异体淋巴细胞增殖反应(1)抽取外周血20ml，分离外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte，PBL)；(2)加入细胞培养液RPMI1640基础培养液(美国，GIBCO公司)，25mmol/L的HEPES(Sigma公司，美国)，青霉素(100U/mL，上海先锋药业公司)，链霉素(100μg/mL，华北制药股份有限公司)，L-谷氨酰胺(2mmol/L，上海思吉生物制品有限公司)，10％胎牛血清(美国，Hyclone公司)；(3)台盼蓝染色观察细胞活力并细胞计数，以1×105/ml接种于96孔板；(4)分别以1×105/孔数量加入实施例2、实施例3和实施例4所得的成骨、成软骨、成脂肪诱导的ADSCs；(5)作用6天后，加入氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-thymidine，3H-TDR)，放置于37℃、5％二氧化碳培养箱中(Forma，美国)培养；(6)收集样品于玻璃纤维滤纸上，烤干后β液闪仪计数；(7)增殖水平用CPM(count per minute)值表示。结果见图8。
结果显示成骨(osteo)、成软骨(chondro)、成脂肪(adipo)诱导后ADSCs未刺激异体淋巴细胞增殖，双向混合淋巴细胞反应(Px)为阳性对照，淋巴细胞的反应性与对照组(未经诱导的ADSCs)无显著差别。经过体外诱导分化过程后，ADSCs的抗原反应性未发生显著性的改变。
实验例8诱导ADSCs对混合淋巴细胞反应的作用(1)收集外周血淋巴细胞，按照反应细胞(responding cells)、刺激细胞(stimulating cells)接种于96孔板，细胞数目均为1×105个；(2)“第三者”(Third Party)分别为实施例2、实施例3和实施例4所得的成骨、成软骨、成脂肪诱导的ADSCs，经PBS反复冲洗后，以1×102～5细胞/孔数量分别加入，与淋巴细胞共培养6天；(3)加入3H-TDR，测定CPM值；(4)参照Chestnut方法，ADSCs离心收集后弃上清；(5)加入0.5％多聚甲醛作用20min使细胞失活，同样数量接种并与淋巴细胞共同培养，观察失活的ADSCs对淋巴细胞增殖的抑制情况；(6)另一组在ADSCs接种时加入IFN-γ(20ng/ml)，刺激HLAII抗原表达，共培养6天后测CPM值。结果见图9。
结果显示ADSCs分别向成骨(osteo)、成软骨(chondro)、成脂肪(adipo)诱导后，可降低混合淋巴细胞增殖反应，表明诱导的ADSCs保持了作为干细胞的调节免疫反应的能力。细胞浓度降低至1×102/孔，抑制作用消失。双向混合淋巴细胞反应(Px)为阳性对照。
实施例5骨细胞-生物材料复合物的制备将实施例2获得的骨细胞的原代、第一代、第二代、第三代、第四代、第五代、第六代细胞悬液分别离心(1500r/min)，倾去上清，将细胞沉淀与生物材料Pluronic F-127(一种市售的聚环氧乙烯商品)在4℃下充分混合，浓度为5×107个细胞/ml，制成骨细胞-聚环氧乙烯复合物。用2ml注射器吸取复合物备用。
实施例6软骨细胞-生物材料复合物的制备将实施例3获得的软骨细胞的原代、第一代、第二代、第三代、第四代、第五代、第六代细胞悬液分别离心(1500r/min)，倾去上清，将细胞沉淀与生物材料Pluronic F-127(一种市售的聚环氧乙烯商品)在4℃下充分混合，浓度为5×107个细胞/ml，制成软骨细胞-聚环氧乙烯复合物。用2ml注射器吸取复合物备用。
实施例7制备用于器官移植中的移植物材料与方法一、主要材料和试剂1.实验动物Beagle犬3只，一岁龄，雌雄不限，体重约15公斤。
2.DMEM、RPMI-1640培养基，购自GIBCO公司，USA。
3.I型胶原酶，购自Worthington，U.S.A。
二、实验动物分组Beagle犬3只，每条犬可在颅骨两侧分别制造一个标准缺损，一侧用自体细胞修复作为实验组，另一侧用单纯材料修复，作为对照组。
三、ADSCs获得和体外成骨诱导培养1.Beagle犬，1岁龄，雌雄不限。氯胺酮10mg/kg肌注诱导后，肌注速眠新0.1ml/kg全麻，常规消毒铺巾。取腹股沟脂肪组织约15g，置于50ml离心管中(内装PBS)。
2.细胞-生物材料复合物制备珊瑚预先制备成2×2×0.3cm3片状，细胞培养同实施例2。收集细胞，调整细胞浓度为20×106/ml四、手术回植狗麻醉前禁食12小时，禁水4小时。氯胺酮10mg/kg肌注，进行诱导麻醉，速眠新0.1ml/kg肌注麻醉，整个过程中动物保持俯卧位。动物麻醉平稳后，常规消毒铺巾，头部正中矢状切口，暴露双侧颅骨区，使用颅骨转，双侧各形成2×2cm2全层颅骨缺损，同时去除缺损区骨膜，彻底止血。按上述动物实验分组中的设计予以修复。见图10。
五、术后新生骨的评价1.三维CT检查术后3，6月颅骨三维CT检查。
2.大体观察术后6月取材时，暴露双侧颅骨区观察愈合情况。
3.X线检查取下颅骨，去除周围软组织，从中间锯开，拍摄X光片。
4.组织学术后6月取材，实验组和对照组标本中部和边缘分别取材，固定、脱钙、脱水、石蜡包埋，组织学切片，进行HE。
结果术后6月三维CT显示，ADSCs/珊瑚复合物形成新骨(左)，单纯珊瑚逐渐降解(右)，见图11A；术后6月取材，大体观察显示，ADSCs/珊瑚复合物形成新骨(左)，单纯材料的缺损区质软，为纤维组织覆盖(右)，见图11B；术后6月取材，X光检测显示ADSCs/珊瑚复合物侧为高密度影(左)，单纯珊瑚的缺损区为低密度影(右)，见图11C；组织学检测显示ADSCs/珊瑚复合物术区内有新骨形成，并有骨髓样结构及立方形成骨细胞形成，见图12左；组织学检测显示单纯珊瑚的缺损区纤维组织，没有骨样结构，见图12右。
讨论各种外伤和脑外科术后造成的颅骨缺损是临床常见疾病，当缺损面积大于颅骨面积的十分之一后，即不能通过自体周围骨组织再生修复缺损。目前常用的治疗手段均有其自身无法弥补的缺点，不能达到外形和功能的良好修复，采用组织工程技术有望达到良好的修复效果。作为临床应用的基础，首先在大型哺乳动物(狗)中形成颅骨缺损模型，利用组织工程技术进行修复。
本发明的实验证明从犬腹股沟脂肪组织可以获取具有多向分化潜能的细胞、并且该细胞能够同天然珊瑚材料良好复合，且仍具有成骨活性。
本发明采用的自体脂肪干细胞(ADSCs)为种子细胞，珊瑚为组织工程支架材料，修复狗颅骨缺损动物模型。表明该种方法对颅骨缺损的修复效果及其潜在的临床应用价值。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种人脂肪干细胞，其特征在于，所述的脂肪干细胞具有分化为特异组织类型细胞的能力，其中所述的特异组织类型细胞包括成骨细胞、成软骨细胞或成脂肪细胞。
2.如权利要求1所述的人脂肪干细胞，其特征在于，所述脂肪干细胞具有分化为成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞的能力。
3.如权利要求1所述的人脂肪干细胞，其特征在于，所述的脂肪干细胞经成骨、成软骨或成脂肪诱导后不刺激异体淋巴细胞增殖。
4.如权利要求1所述的人脂肪干细胞，其特征在于，所述的脂肪干细胞经成骨、成软骨或成脂肪诱导后能抑制混合淋巴细胞反应。
5.如权利要求4所述的人脂肪干细胞，其特征在于，所述的脂肪干细胞中，组织相容性抗原I类分子呈阳性表达。
6.一种将权利要求1所述的人脂肪干细胞诱导分化为成骨细胞的方法，其特征在于，它包括步骤在以下诱导条件下进行成骨诱导培育地塞米松0.1±0.05μmol/L，维生素D310±5nmol/L与β-磷酸甘油10±5mmol/L，37±2℃，诱导时间为10-18天，从而形成成骨细胞。
7.一种将权利要求1所述的人脂肪干细胞诱导分化为成软骨细胞的方法，其特征在于，它包括步骤在以下诱导条件下进行成软骨诱导培育转移生长因子β110±5ng/ml，胰岛素样生长因子100±50ng/ml，地塞米松0.1±0.05μmol/L，37±2℃，诱导时间为5-10天，从而形成软骨细胞。
8.一种将权利要求1所述的人脂肪干细胞诱导分化为成脂肪细胞的方法，其特征在于，它包括步骤在以下诱导条件下进行成脂肪诱导培育3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5±0.1Mm、地塞米松1±0.05μM、胰岛素10±5μM、吲哚美辛200±50μM，37±2℃，诱导时间为15～30天，从而形成脂肪细胞。
9.一种如权利要求1所述的人脂肪干细胞的用途，其特征在于，用于制备成骨细胞或成软骨细胞。
10.一种如权利要求1所述的人脂肪干细胞的用途，其特征在于，所述的用途包括(a)用于制备用于器官移植中的移植物；(b)作为种子细胞用于制备同种异体间的移植物。
全文摘要
本发明提供具有多向分化能力的人脂肪干细胞及其成骨、成软骨和成脂肪诱导的制备方法。所述的人脂肪干细胞HLAI类分子阳性表达，不表达CD80、CD86、CD40、CD28，而在人IFN－γ作用后，HLAI类分子阳性表达未见明显增加；这种人脂肪干细胞免疫原性低，有一定的免疫调节功能，人γ－干扰素作用后，没有明显改变。本发明提供的成骨诱导、成软骨诱导和成脂肪诱导的人脂肪干细胞，同诱导前的功能一样，人γ－干扰素作用后，也没有明显改变。可见经抽吸术获得大量曾被作为“废物”摒弃的脂肪组织，为人体成体干细胞的应用提供了新的充足来源。
文档编号A61F2/02GK101033461SQ20061002446
公开日2007年9月12日 申请日期2006年3月8日 优先权日2006年3月8日
发明者崔磊, 尹烁, 曹谊林 申请人:上海国睿生命科技有限公司