专利名称：益母草水提物在制备治疗缺血性心脏病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属中药制药领域，涉及中草药益母草水提物在制备药物组 合物中的应用，尤其是在制备通过促进新生血管的生长治疗缺血性 心脏病药物中的应用。
背景技术：
缺血性心肌病，是近几十年来在发达国家和发展中国家导致死亡 的首要原因。降低此类疾病的发病率和死亡率非常重要。心脏的内源
性抗氧化系统包括超氧化物歧化酶(s叩eroxide dismutase， S0D)、 过氧化氢酶(catalase， CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)和其它抗氧化剂。体内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)产生增加，超过了内源性抗氧化系统的清除能力，导 致氧化应激，可加速人体的衰老、增加肿瘤的发生率，也可引起心血 管系统的损伤，加重心肌破坏的程度。动脉粥样硬化、糖尿病、中风 等疾病过程中，氧化应激的机制也不容忽视。中草药益母草(唇形科 植物，〃er^g Z簡i/r力Chinese Motherwort),最早收载于《神农本 草经》、《本草纲目》等古籍中，有活血调经、利尿消肿的功效。中华 人民共和国药典(2000年版)中用于月经不调、痛经、经闭、恶露 不尽、水肿尿少、急性肾炎水肿等治疗。未见有关治疗缺血性心脏病 的报道。
发明内容
本发明的目的是提供中药益母草(vfe^a Zeo/H/n'， Chinese Motherwort,以下简称HL)的活性成分在治疗缺血性心脏病药物中 的新用途，尤其是在制备通过促进新生血管的生长治疗缺血性心脏病 药物中的应用。
本发明通过大量的化学和药理研究测得，中药益母草含有丰富的
生物碱类和羟基黄酮类成分，可作为药物制剂的原料。 本发明通过下述方法提取活性成分
① 取原药材益母草，除去残根、粗梗等杂质，洗净，粉碎后用
80-100度的水煎煮。
② 水煎药液经滤过、浓縮后用高效液相色谱一质谱联用技术 (High-performance liquid chromatography—mass spectrometry,
HPLC—MS)，使用光电二极管阵列探测器和电喷雾质谱检査，其中含 有水苏碱(Stachydrine)、山萘素(Kaempferol)禾口槲皮素(quercetin) 等主要成分。
本发明益母草的活性成分可作为药物原料，直接或与药学上通常 用于制剂的固体或液体混合制成适宜制剂，包括胶囊、片剂、散剂以 及复方制剂。
经体外实验和体内动物实验结果证明，益母草水提物具有较高的 血管新生活性，能促进新生血管尤其是冠状毛细血管的生长，满足缺 血性心肌的氧供需求。
图1是益母草水提物HPLC色谱图，
其中，益母草水提物50mg/ml，进样体积lOitil，碎片电压IOOV.
标记峰*为水苏碱和山萘素，**为槲皮素。 图2是体内试验中HL的抑制细胞凋亡作用和促进毛细血管新生 的作用，
其中，p53 (A) ， Fas (B), Bcl-xl (C) ， Bel-xs (D)和VEGF(E)的raRNA水 平的半定量分析，以GAPDH的基因表达为内参，*:与给水心梗治疗组 相比，有统计学意义，代0.05.tt:与假手术组相比有统计学意义， 代O. 05;
第一列HL心梗治疗组；第二列给水心梗治疗组；第三列假 手术组。
图3是体外试验中HL的抑制细胞凋亡作用和促进毛细血管新生
的作用，
其中，P53 (A) ， Fas (B) ， Bel-xl (C) ， Bel-xs (D)和VEGF (E)的mRNA水 平的半定量分析，以GAPDH的基因表达为内参，每组包括6孔细胞(标 准六孔板)并且每组试验重复两次，标准差已标识，*:与给水心梗 治疗组相比，有统计学意义，代0.05;
第一列给水低氧治疗组；第二列HL低氧治疗组；第三列 给水非低氧对照组；第四列HL非低氧对照组。
图4是体外台盼兰染色不相容试验细胞活力测定的比较， 其中，每组包括六孔细胞(标准六孔板)每组试验重复两次，标 准差标识如图；*:与给水心梗治疗组相比，代0.05。
具体实施例方式
以下例举实施例更具体地说明本发明，实施例所示成分、比率、 操作条件和顺序等可在不脱离本发明精神的限定内适当变更。 实施例l
益母草水煎药液经滤过、浓縮后用高效液相色谱一质谱联用技 术，使用光电二极管阵列探测器(DAD)和电喷雾(ESI)质谱检査， 其中含有水苏碱(Stachydrine)、山萘素(Kaempferol)和槲皮素 (quercetin)等主要成分。 实施例2
取益母草水提物，添加适量微晶纤维素、淀粉或其他赋形剂，按 常规方法分别制成胶囊剂、片剂、散剂、颗粒剂、丸剂等内服剂型。 实施例3 HL的抑制细胞凋亡作用和促进毛细血管新生的作用体内
试验
体内试验检测凋亡基因和VEGF基因的表达常规方法进行 p53 (A) ， Fas (B) ， Bcl-xl (C) ， Bel-xs (D)和VEGF (E)的mRNA水平的半定
量分析，以GAPDH的基因表达为内参，结果显示HL心梗治疗组的 凋亡基因Ps3和Fas的表达明显低于给水心梗治疗对照组，代0.05。 相反，该组的凋亡抑制基因Bcl-xl的表达却明显高于对照组。Bcl-xs 的基因表达水平则在两组间没有明显的差异性。四例被检测样本中有 三例证实HL对凋亡有抑制作用，表明HL在体内对全身各系统有潜在 抑制凋亡的作用。VEGF的基因在AMI组虽有表达，但在假手术组并 未检测到该基因的表达(图l)。结果表明组织损伤或低氧等状态 可以诱导VEGF基因表达的突然增加，引发血管新生以满足氧供需求 得增加。HL心梗治疗组的VEGF的基因表达明显高于对照组(代O. 05), 说明前者有较高的血管新生活性。 进一步进行冠状毛细血管的计数， 使用工具药治疗的心梗对照组的左心室毛细血管数 (221.2±22.5)明显低于
HL心梗治疗组(316.8土16.5) (;XO. 05)。三组的心肌组织切片在梗 死区均有坏死现象存在。对照组的血管数量普遍较少。HL治疗组左心 室非心梗区的血管数也比较少。
实施例4 HL抑制细胞凋亡作用和促进毛细血管新生作用的体 外试验，
体外试验检测凋亡基因和VEGF表达水平的变化与体内试验结果 相似，HL低氧治疗组的尸幼尸as，价7-xs的mRNA低于对照组，代O. 05 (图2)。同时，Bel-xl基因表达水平在HL低氧治疗组和对照组之间 没有明显的差异。低氧介导的VSMC凋亡现象不依赖的Bc1-xl基因的表 达。此外，HL非缺氧治疗组(HLC)和对照组(WC)之间的上述四个 基因的表达没有明显差异，说明HL提取物对于生理状态下的VSMC没有 细胞凋亡和血管新生作用，说明了HL有较少的负作用。本试验与体内 试验结果一致，HL缺氧治疗组的VEGF基因表达水平明显高于低氧对照 组代0.05 ，但两个非缺氧不同处理组之间该基因的表达没有明显差 异性。上述实验结果证实HL可能在缺氧的条件下通过进一步上调VEGF 基因表达促进毛细血管的新生，但在非缺氧的条件下正常剂量的H L并不发挥该作用。
在上述体外试验中，细胞的基因相对表达水平没有根据细胞的数
量进行校正。在利用Material等人描述的胰蛋白酶一EDTA的方法检测
细胞活力之后，这类细胞就不能再次用来提取RNA和进行后续的RNA
水平的分析。为了避免由于细胞数量的不同带来的误差，本试验没有 利用细胞计数修正RNA水平，只是将细胞计数的结果作为解释RNA水平
变化的一个参考值。
实施例4体外细胞活力的测定
采用台盼兰不相容试验的方法检测细胞活力。结果显示，HL低氧 治疗组的细胞活力稍高于对照组，代0.05 (图3)。低氧组的细胞数 量和细胞活力均明显低于非缺氧组，代0.05 ， HL低氧治疗组和对照 组之间细胞活力没有明显差异，提示HL在该剂量下对细胞没有损害作 用。尽管这种差异没有统计学意义，但HL低氧治疗组的全部细胞数量 高于低氧对照组。
权利要求
1、益母草水提物在制备治疗缺血性心脏病药物中的应用，所述的益母草水提物含有主要成分水苏碱、山萘素和槲皮素。
2、 权利要求l所述的应用，其特征是所述的应用是所述的益母 草水提物促进新生血管生长治疗缺血性心脏病。
3、 权利要求2所述的应用，其特征是所述的新生血管是冠状毛 细血管。
全文摘要
本发明属中药制药领域，涉及中草药益母草水提物在制备药物组合物中的应用，尤其是在制备通过促进新生血管的生长治疗缺血性心脏病药物中的应用。经体外实验和体内动物实验结果证明，益母草水提物具有较高的血管新生活性，能促进新生血管尤其是冠状毛细血管的生长，满足缺血性心肌的氧供需求。本发明益母草的活性成分可作为药物原料，直接或与药学上通常用于制剂的固体或液体混合制成适宜制剂，包括胶囊、片剂、散剂以及复方制剂。
文档编号A61K36/185GK101176747SQ200610118079
公开日2008年5月14日 申请日期2006年11月8日 优先权日2006年11月8日
发明者朱依纯, 朱依谆 申请人:复旦大学