专利名称：益母草碱在制备防治炎症相关疾病药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属中药制药领域，涉及中草药益母草中的特异单体益母草碱在制备药物组合物中的应用，尤其是在制备防治炎症相关疾病的药物组合物中的应用。
背景技术：
目前，研究证实炎症反应是缺血性心脏病的首要发病因素之一，并在其发生发展过程及愈后中始终伴有重要角色。缺血心肌中的炎症反应是内皮细胞和心肌细胞功能紊乱的诱因，同时又是心肌内氧化应激的诱因。干预其免疫相关炎症反应将有效的预防心肌缺血损伤的发生、发展。通过干预缺血心肌中的炎症反应将可有效的防止缺血引起的心肌功能紊乱。中草药益母草(唇形科植物，Herba Leonuri，Chinese Motherwort)，最早收载于 《神农本草经》、《本草纲目》等古籍中，有活血调经、利尿消肿的功效。中华人民共和国药典 (2000年版)中用于月经不调、痛经、经闭、恶露不尽、水肿尿少、急性肾炎水肿等治疗。益母草碱(Leonurine)是传统中药益母草的特异成分，有文献报道益母草碱能通过抑制外钙内流和内钙释放而显著的抑制血管平滑肌收缩，且益母草碱对心肌缺血的具有保护作用，但益母草碱对炎症方面的作用未见有报道。
发明内容
本发明的目的是提供中草药益母草中的特异单体益母草碱在制备药物组合物中的新用途，具体涉及益母草碱在制备防治炎症相关病的药物组合物中的应用。本发明所述的益母草碱的分子式为C14H21N305 (可市购)。本发明通过肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor- α，TNF-α )诱导的人脐静脉内皮细胞炎症模型观察了益母草碱对炎症反应的保护作用。通过real-time PCR和western blot方法检测益母草碱对单核细胞趋化蛋白-1 (monocyte chemoattractant protein-1， MCP-1)，细胞间黏附分子(intercellar adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管细胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)、P-选择蛋白(P-selectin)、E_ 选择蛋白(E-selectin)及炎症酶环氧合酶_2 (cyclooxygena se_2，C0X-2)、诱导型一氧化氮合酶(nitricoxide synthase, iNOS)等的转录及表达，及细胞上清中释放一氧化氮(NO)的影响，结果表明，益母草碱明显抑制症酶环氧合酶-2 (C0X-2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、 细胞间黏附分子(ICAM-I)、血管细胞黏附分子(VCAM-I)的表达和转录，同时减少培养液中一氧化氮的释放(NO)。本发明通过检测相应的信号转导通路丝裂原激活物蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases (MAPK/NF- κ B)的激活，明确益母草碱抑制心肌细胞炎症的调控机制。结果表明，益母草碱能够抑制肿瘤坏死因子α (TNF-α )对ρ38ΜΑΗ(的激活，抑制NF-K B的激活及转位，从而抑制炎症反应。结果表明，益母草碱能够明显抑制肿瘤坏死因子诱导的炎症反应。
本发明中，所述的益母草碱通过抑制炎症相关基因的转录水平来发挥抗炎作用。 本发明中，所述的益母草碱通过通过抑制炎症相关基因的蛋白表达水平来发挥抗炎作用。本发明中，所述的益母草碱能抑制单核细胞趋化蛋白-1的释放而发挥抗炎作用。本发明中，所述的益母草碱能抑制一氧化氮的释放而发挥抗炎作用。本发明中，所述的益母草碱能抑制相应的信号转导通路及转录因子而发挥抗炎作用。
尤其是，所述的益母草碱对TNF-α诱导的炎症反应具有明显的保护作用；所述的益母草碱抑制TNF- α对信号通路ρ38ΜΑΡΚ的激活，抑制转录因子NF- κ B的激活及转位，从而抑制炎症反应。进一步，本发明所述的益母草碱可制备防治炎症相关疾病药物。
图1是用Real-time PCR方法检测炎症相关基因VCAM-1，MCP-1，C0X_2和iNOS的 mRNA水平，其中，数据用目的基因和内参GAPDH相比，Dex 阳性对照药地塞米松;# 和未处理组细胞相比ρ < 0. 05，* 益母草碱治疗组和模型组相比P < 0. 05，** 益母草碱治疗组和模型组相比P < 0.01。图2是用western blot方法检测相关基因VCAM-1，ICAM-1，C0X-2和iNOS的蛋白水平，其中，数据用目的基因和相应内参GAPDH相比，Dex 阳性对照药地塞米松;# 和未处理组细胞相比ρ < 0. 05，* 益母草碱治疗组和模型组相比ρ < 0. 05，** 益母草碱治疗组和模型组相Kp < 0.01。图3是用western blot方法检测转录因子NF- κ B的激活，其中，数据用目的基因和相应内参相比，Dex 阳性对照药地塞米松;# 和未处理组细胞相比ρ < 0. 05，* 益母草碱治疗组和模型组相比P < 0. 05，** 益母草碱治疗组和模型组相比P < 0.01。图4是用酶联免疫吸附试验检测细胞培养液中MCP-I的含量，其中，含量用pg/ml表示，A图表示TNF-α诱导6小时，B图表示TNF-α诱导M 小时；Dex 阳性对照药地塞米松;# 和未处理组细胞相比ρ < 0. 05，* 益母草碱治疗组和模型组相比P < 0. 05，** 益母草碱治疗组和模型组相比ρ < 0. 01。图5是用Griess法检测细胞培养液中NO的含量，其中，正常组数据用100%表示，其余各组和正常组的相对浓度表示，Dex:阳性对照药地塞米松和未处理组细胞相比ρ < 0. 05, * 益母草碱治疗组和模型组相比P < 0. 05，** 益母草碱治疗组和模型组相比ρ < 0.01ο图6是用western blot方法检测益母草碱对TNF- α激活MAPKs的信号通路的作用，其中，数据用目的基因蛋白和相应内参GAPDH相比，Dex 阳性对照药地塞米松 ’ # 和未处理组细胞相比ρ < 0. 05，* 益母草碱治疗组和模型组相比ρ < 0. 05，** 益母草碱治疗组和模型组相比ρ < 0. 01。
具体实施例方式实施例1益母草碱对体外人脐静脉内皮细胞炎症反应的保护作用分组将IX IO5个内皮细胞或心肌细胞种入6cm培养皿培养3天达85-90%，细胞同步化6-12h，随机分成6组，即①正常对照组；②模型组；③益母草碱低剂量组；④益母草碱中剂量组；⑤益母草碱高剂量组；⑥阳性药组。给药③-⑤加入终浓度为5 μ M、 10 μ Μ、20 μ M的益母草碱，⑥地塞米松10 μ Μ，培养4h。加入TNF-α (10ng/ml)培养诱导内皮细胞炎症反应。提取mRNA，采用real time RT-PCR测定炎症相关基因的转录水平。测定的炎症相关基因VCAM-1、MCP-I、iNOS、C0X-2。实验数据进行单因素方差分析，ρ < 0. 05， 结果显示益母草碱能抑制炎症相关基因VCAM-I、MCP-l、iN0S、C0X-2的表达。采用western blot方法检测炎症相关蛋白VCAM-1、ICAM-U iNOS、C0X-2的蛋白表达。结果表明，益母草碱明显抑制炎症相关基因的转录和表达。实验结果证明，所述的益母草碱对TNF-α诱导的炎症反应具有明显的保护作用， 可制备防治炎症相关疾病的药物。实施例2益母草碱对TNF-α诱导的内皮细胞炎症反应调控机制的影响分组将IX IO5个内皮细胞或心肌细胞种入6cm培养皿培养3天达85-90%，细胞同步化6-12h，随机分成6组，即①正常对照组；②模型组；③益母草碱低剂量组；④益母草碱中剂量组；⑤益母草碱高剂量组；⑥阳性药组。给药③-⑤加入终浓度为5 μ M、 10 μ Μ、20 μ M的益母草碱，⑥地塞米松10 μ Μ,培养4h。加入TNF- α (10ng/ml)作用15min 后，收集细胞蛋白，采用 Western blotting 测定 MAPK (p38、ERK1/2, JNK1/2)和 NF- κ Βρ65 的激活，结果表明，益母草碱抑制TNF-α对信号通路？38嫩冊的激活，抑制转录因子顺_1^8 的激活及转位，从而抑制炎症反应。
权利要求
1.益母草碱在制备防治炎症相关性疾病药物中的用途，所述的益母草碱的分子式为 C14H21N305。
2.按权利要求1的用途，其特征是，所述的炎症相关性疾病是人脐静脉内皮细胞症。
3.按权利要求1的用途，其特征是，所述的炎症相关性疾病是TNF-α诱导的内皮细胞炎症。
4.按权利要求1的用途，其特征是，所述的益母草碱抑制炎症相关基因的转录水平。
5.按权利要求1的用途，其特征是，所述的益母草碱抑制炎症相关基因的蛋白表达水平。
6.按权利要求1的用途，其特征是，所述的益母草碱抑制单核细胞趋化蛋白-1的释放。
7.按权利要求1的用途，其特征是，所述的益母草碱抑制一氧化氮的释放。
8.按权利要求1的用途，其特征是，所述的益母草碱抑制相应的信号转导通路及转录因子。
全文摘要
本发明属中药制药领域，涉及中草药益母草中的特异单体益母草碱在制备药物组合物中的应用，尤其是在制备炎症相关疾病的药物组合物中的应用。本发明通过体外炎症模型实验研究，结果显示了所述的益母草碱抑制炎症介质的转录和表达，能减少炎症诱导的一氧化氮的释放，明确益母草碱抑制细胞炎症的调控机制，实验证实，所述的益母草碱对炎症相关疾病具有明显的抗炎作用，可制备防治炎症相关疾病的药物。
文档编号A61P29/00GK102258510SQ20101018496
公开日2011年11月30日 申请日期2010年5月27日 优先权日2010年5月27日
发明者刘新华, 朱依谆, 潘礼龙 申请人:复旦大学