专利名称：长梗南五味子提取物，其制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属中医药技术领域，具体涉及长梗南五味子提取物，其制备方法及用途。本发明还涉及含长梗南五味子提取物的组合物。
背景技术：
长梗南五味子(Kadsura longepedunculata Finet et Gagnep)系五味子科(Schisandraceae)南五味子属(Kadsura)植物，为常绿木质藤本，根部入药，民间常用其治疗风湿、胃痛、胃肠炎和跌打损伤等(宋万志等，中国五味产科药用植物中的木脂素成分，中草药，1982，1340)。近年来，已有学者从长梗南五味子的根皮、种子和茎中分离得到木脂素和三萜类成分，主要包括南五木脂素C，D，E，F，G，南五内酯A、五内酯A，B，E，F、南五内酯、五味子酸、长南酸、新南五酸A，B，C和表安五酸等(药学学报，1997，32(6)455-45；中国中药杂志，2003，28(12)1120-1124；昆明医学院学报，2004，138-40)。有发明公开从长梗南五味子茎和叶中分离到的长梗南五味内酯素类化合物以及木脂素类化合物具有抗肿瘤活性(中国专利，申请号200610010715.0)；安五脂素在离体水平可不同程度抑制兔血小板的聚集作用(复旦大学学报(医学版)，2005，32(4)467-478)；五内酯E，F和长南酸具有显著抑制白血病细胞P388形成的作用(Tetrahedron Letter，1983，24(23)2351-2354)；长梗南五味子的乙醇提取物对大鼠幽门结扎型溃疡具有较好的保护作用(中草药，1990，21(9)27-28)。
虽已有学者对长梗南五味子不同部位的药理及药化进行过研究，但这些研究多集中于脂溶性成分的研究，而对长梗南五味子部分，尤其是其根部提取物的生物活性及化学组成未有研究报道。
发明内容
本发明所需解决的技术问题之一是提供一种长梗南五味子提取物；本发明所需解决的技术问题之二是提供一种长梗南五味子提取物的制备方法；本发明所需解决的技术问题之三是提供一种长梗南五味子提取物的用途；本发明所需解决的技术问题之四是提供一种含长梗南五味子提取物的组合物；以克服现有技术的不足和缺陷。
本发明的技术方案如下本发明的长梗南五味子提取物，其制备方法如下
用6～14倍长梗南五味子根重量的水浸泡长梗南五味子根12-48小时，煎煮提取2-4次，每次提取0.5-1.5小时，合并各次水提液；过滤，浓缩水提液；加乙醇至浓缩水提液，使乙醇浓度至60～80％，放置醇沉8～24小时；过滤，回收乙醇，干燥，得长梗南五味子提取物。
所说的长梗南五味子，为其根部，可洗净干燥后，粉碎使用。
所说的水用量为药材重量的6～14倍，优选的为8～12倍，最优选的为10倍。加水量过多，增加滤液浓缩时的工作量；过少，则有效成分提取不完全。本发明的提取方法使用水为提取溶剂，与乙醇和丙酮等有机溶剂提取法不同，所得到的提取物的有效成分在种类上也有本质区别。
所说的煎煮提取为2～4次，每次提取0.5～1.5小时，合并煎液，优选的为提取3次，每次提取1小时，合并煎液。提取次数过多、时间过长，易得到较多的淀粉、多糖等杂质；提取次数过少、时间过短，则有效成分提取不完全。
所说的过滤可使用中药领域各种常规的过滤方法进行，如滤纸过滤、滤膜过滤等。
所说的浓缩可使用中药领域各种常规的浓缩方法进行，如减压旋转蒸发、超滤等。
所说的加乙醇至浓缩水提液，使乙醇浓度至60～80％，优选的乙醇浓度为70％。乙醇浓度过高，易造成有效成分损失；过低，不能有效去除蛋白质、多糖等杂质。
所说的醇沉时间为8～24小时。时间过短，不能有效沉淀杂质。
所说的干燥可使用中药领域各种常规的干燥方法进行，如水浴蒸干、减压干燥等。
本发明的长梗南五味子提取物可单独使用，也可与药学上可接受的载体组成药物组合物。提取物加入制备不同剂型时所需的各种常规辅料，如稀释剂、崩解剂、黏合剂、润滑剂、矫味剂、防腐剂等，以常规的中药制剂方法可制备成任何一种常用口服剂型，如丸剂、散剂、片剂、胶囊剂、口服液等。
本发明的有益效果在于长梗南五味子提取物的制备工艺简单、成本较低、重现性好。
所得到的长梗南五味子水溶性提取物具有明显的抗菌、抗氧化、抗溃疡及抗腹泻效果，且大鼠口服急性毒性较低，可成为临床治疗胃肠道疾病的有效药物。
以本发明的长梗南五味子提取物为主药，可制备多种长梗南五味子的现代中药制剂，方便患者使用。
图1为长梗南五味子提取物紫外吸收图谱。适量实施例2中的长梗南五味子提取物溶于甲醇中，190～700nm扫描，表明该提取物在220及280nm处具有最大吸收峰。
具体实施例方式
实施例通过下面的具体实施例可进一步了解本发明。但它们不是对本发明的限定。
实施例1用6倍长梗南五味子根重量的水浸泡过夜，提取2次，每次提取1.5小时，合并煎液；过滤，浓缩水提液；加乙醇至浓缩水提液，使乙醇浓度至60％，放置8小时；过滤，回收乙醇，干燥，得长梗南五味子提取物。
实施例2用8倍长梗南五味子根重量的水浸泡过夜，提取3次，每次提取1小时，合并煎液；过滤，浓缩水提液；加乙醇至浓缩水提液，使乙醇浓度至70％，放置12小时；过滤，回收乙醇，干燥，得长梗南五味子提取物。
实施例3用10倍长梗南五味子根重量的水浸泡过夜，提取4次，每次提取0.5小时，合并煎液；过滤，浓缩水提液；加乙醇至浓缩水提液，使乙醇浓度至80％，放置24小时；过滤，回收乙醇，干燥，得长梗南五味子提取物。
实施例4用6倍长梗南五味子根重量的水浸泡过夜，提取3次，每次提取1.5小时，合并煎液；过滤，浓缩水提液；加乙醇至浓缩水提液，使乙醇浓度至60％，放置10小时；过滤，回收乙醇，干燥，得长梗南五味子提取物。
实施例5用8倍长梗南五味子根重量的水浸泡过夜，提取2次，每次提取1小时，合并煎液；过滤，浓缩水提液；加乙醇至浓缩水提液，使乙醇浓度至70％，放置16小时；过滤，回收乙醇，干燥，得长梗南五味子提取物。
实施例6用10倍长梗南五味子根重量的水浸泡过夜，提取4次，每次提取1小时，合并煎液；过滤，浓缩水提液；加乙醇至浓缩水提液，使乙醇浓度至80％，放置20小时；过滤，回收乙醇，干燥，得长梗南五味子提取物。
实施例7用6倍长梗南五味子根重量的水浸泡过夜，提取4次，每次提取1.5小时，合并煎液；过滤，浓缩水提液；加乙醇至浓缩水提液，使乙醇浓度至70％，放置8小时；过滤，回收乙醇，干燥，得长梗南五味子提取物。
实施例8用8倍长梗南五味子根重量的水浸泡过夜，提取3次，每次提取0.5小时，合并煎液；过滤，浓缩水提液；加乙醇至浓缩水提液，使乙醇浓度至80％，放置12小时；过滤，回收乙醇，干燥，得长梗南五味子提取物。
实施例9用10倍长梗南五味子根重量的水浸泡过夜，提取2次，每次提取0.5小时，合并煎液；过滤，浓缩水提液；加乙醇至浓缩水提液，使乙醇浓度至60％，放置24小时；过滤，回收乙醇，干燥，得长梗南五味子提取物。
实施例10～14中所使用的药物为实施例2中的长梗南五味子提取物。
实施例10长梗南五味子提取物体外抑菌、杀菌效果1菌种金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌，产气肠杆菌，酿酒酵母2培养基营养琼脂培养基，营养肉汤培养基，沙氏培养基，沙氏培养液均有上海疾病预防控制中心提供。
3实验器材压力蒸气灭菌器(上海医用核子仪器厂，型号YXQ-SG4b-280)、恒温培养箱(太仓市实验设备厂，型号THZ-C)、净化工作台(苏州仪器厂，型号SW-CJ-2FD)、游标卡尺等。
4实验方法1)抑菌圈测定无菌平皿内加入20ml已熔化的固体培养基，固定后加入100μl含菌(106个/毫升)的生理盐水溶液，用涂布棒将其均匀分散于固体培养基上。每平皿内用直径6mm的无菌金属打孔器均匀打孔4～6个，去除孔内琼脂，加入受试药液，细菌组置37℃培养箱内培养18～24小时，真菌组置30℃培养箱内培养48小时，观察结果。
抗菌作用表现为孔周围出现无细菌生长的地带，即抑菌圈，选择均匀而完全无菌生长的抑菌圈进行测量，用游标卡尺记录抑菌圈的直径(包括孔径)。实验重复三次。阿齐霉素(6.4μg/片或孔)为阳性对照，阴性对照为水。结果见表1。
2)最低抑菌浓度(MIC)及最低杀菌浓度(MBC)测定用蒸馏水对倍稀释实验药物，取各稀释实验药液2.5ml加入到含有2.5ml双倍浓度营养肉汤的试管中。取50μl含菌量为106个/毫升菌悬液分别接种于含药液(实验组)及不含药液(阳性对照组)的试管中，另取3支含营养肉汤的试管，作为阴性对照。细菌组置37℃培养箱内培养18～24小时，真菌组置30℃培养箱内培养48小时，观察结果。阳性对照管有菌生长(浑浊)，阴性对照管无菌生长(透明)，实验组以肉眼观察无菌生长的药液浓度即为MIC。从无菌生长的实验管中取100μl，分别加入营养琼脂平板内，37℃培养24小时或30℃培养48小时，观察细菌生长情况，无菌落形成的药液最小浓度为MBC，实验重复4次。结果见表2。
5实验结果1)长梗南五味子提取物的抑菌作用，结果见表1。可知药液在50mg/ml时对受试菌均具有明显的抑制作用，其中对革兰氏阳性菌的抑制效果显著优于革兰氏阴性菌及酿酒酵母。
表1长梗南五味子提取物的抑菌作用
注“NA”表示无明显抑菌效果。
2)最低抑菌浓度及杀菌浓度测定结果见表2。可知药液浓度较低时即能对革兰氏阳性菌起到抑菌及杀菌作用，而对革兰氏阳性菌及酿酒酵母而言，则需较高的药液浓度。
表2长梗南五味子提取物的MIC及MBC
注“-”表示无菌生长；“+”表示有菌生长。
实施例11长梗南五味子提取物体外抗氧化效果1抑制肝匀浆脂质自氧化作用取SD大鼠，断头处死，取肝脏，于4℃的生理盐水中洗净，剪成小碎块；称取10g组织，加100ml生理盐水，用匀浆机制成肝匀浆(8000-10000rpm)。将离心管编号，取新鲜大鼠肝匀浆(100mg/ml)1.5ml分别加入各离心管中，实验管分别加入不同浓度长梗南五味子提取物溶液或维生素C溶液0.1ml，对照管加入生理盐水0.1ml，每组平行3管，37℃振荡温育2h，取出后加入1.5ml20％的三氯醋酸终止反应。另设空白对照管，温育前加入1.5ml20％的三氯醋酸，37℃振荡温育2h。混匀后静置10min，3000rpm离心10min。取上清溶液1.5ml，加入1ml硫代巴比妥酸，沸水浴加热10min。冷却后532nm波长处测定吸收度。
表3长梗南五味子提取物对大鼠肝匀浆自氧化的抑制作用
注“-”表示未进行该组实验。
结果见表3，表明长梗南五味子提取物对大鼠肝匀浆具有明显的抑制作用，且该抑制作用随药液浓度的增加而增强。其半数有效量(IC50)为0.2mg/ml，低于对照品维C的IC50(0.8mg/ml)。
2抑制过氧化氢诱发的大鼠红细胞氧化溶血作用红细胞的制备SD大鼠尾静脉取血，肝素抗凝，2000rpm离心5min，生理盐水洗涤3次，配成10％(v/v)的红细胞悬液。实验分为对照组(不加药液，加入同样量的生理盐水)、药物组(药物浓度分别为50.0和25.0mg/ml)，每组平行三管。取红细胞悬液0.5ml，分别加入生理盐水或药物溶液0.15ml，37℃温育10min后，加入100mmol/L的过氧化氢溶液0.5毫升(空白管不加过氧化氢)，继续温育2h，加入3倍量的生理盐水稀释，3000rpm离心6min，取上清液，541nm波长处测定吸收度。以对照组为100％溶血计算对照组和药物组的溶血度和抑制度。
表4长梗南五味子提取物对过氧化氢诱发的大鼠红细胞氧化溶血的抑制作用
结果见表4，表明长梗南五味子提取物对过氧化氢诱发的大鼠红细胞氧化溶血具有明显的抑制作用，药物浓度为50.0mg/ml时，其抑制率达82％。随着药物浓度的增加，其对红细胞氧化溶血的抑制作用增强。
3提取物还原力的测定取不同浓度的药物溶液0.1ml，加入0.2mol/L pH6.6的磷酸缓冲溶液0.5ml、1％的铁氰化钾溶液0.5ml，混匀，50℃保温20min，再加入10％的三氯乙酸溶液0.5ml，振荡混匀后，4000rpm下离心10min。取上清溶液1ml，加入1ml蒸馏水和0.2ml 0.1％的氯化铁溶液，静置10min后，体系由黄色变为蓝色，700nm处测定吸收度。阳性对照为0.2mg/ml的维生素C溶液。
表5长梗南五味子提取物的还原力
结果见表5，表明随着长梗南五味子提取物浓度的增加，其还原力提高。药物浓度为2.5mg/ml时，其还原力高于阳性对照。
实施例12长梗南五味子提取物对大黄致腹泻小鼠的治疗作用取小鼠40只，雌雄各半，体重20±2g，由复旦大学实验动物中心提供。禁食12h后，随机分为4组正常对照组、大黄组、低剂量给药组和高剂量给药组。正常对照组和大黄组灌胃给予生理盐水，低剂量给药组和高剂量给药组分别灌胃给予长梗南五味子提取物4.8g/kg和6.0g/kg。给药1h后，除正常对照组外，其余各组均灌胃给予大黄水浸液(1g生药/ml)12.5g生药/kg。单只分笼观察，给予大黄水煎液2h后，记录排便点数，共记录6h。
表6长梗南五味子提取物对大黄致小鼠腹泻的抑制作用
结果见表6，表明给药剂量为6.0g/kg时，长梗南五味子提取物对大黄所致腹泻有明显的止泻作用。
实施例13长梗南五味子提取物对大黄致腹泻小鼠的治疗作用1)对盐酸-乙醇致大鼠急性胃粘膜损伤的影响取SD大鼠，雌雄各半，由复旦大学实验动物中心提供。随机分为5组正常大鼠组、高剂量给药组、中剂量给药组、低剂量给药组、洛赛克组。实验前，大鼠禁食24h，可自由饮水。正常对照组灌胃给予生理盐水，低剂量给药组、中剂量给药组和高剂量给药组分别灌胃给予长梗南五味子提取物0.7g/kg、1.4g/kg和2.0g/kg，洛赛克组灌胃给予奥美拉唑镁10mg/kg。给药1h后，每只大鼠灌胃给予盐酸-乙醇溶液1.5ml(每100毫升盐酸-乙醇溶液含盐酸1.7毫升，无水乙醇60毫升，蒸馏水配制)。1h后处死大鼠，结扎贲门端，自幽门端注入1％甲醛溶液5ml，结扎幽门端，固定10min，取出胃，沿胃大弯剪开胃壁，以胃粘膜损伤长度总和作为溃疡指数(直径超过1毫米者长度加倍)，计算溃疡抑制百分率。
表7长梗南五味子提取物对盐酸乙醇致胃粘膜损伤的抑制作用
结果见表7，表明高、中、低给药剂量时，长梗南五味子提取物对盐酸乙醇溶液所致胃粘膜损伤具有明显的抑制作用。给药量为2.0g/kg时，抑制效果与市售药物洛赛克相近。
2)对大鼠应激性胃溃疡的影响(水浸拘束法)
取SD大鼠，雌雄各半，由复旦大学实验动物中心提供。随机分为5组正常大鼠组、高剂量给药组、中剂量给药组、低剂量给药组、洛赛克组。实验前，大鼠禁食24h，可自由饮水。正常对照组灌胃给予生理盐水，低剂量给药组、中剂量给药组和高剂量给药组分别灌胃给予长梗南五味子提取物0.7g/kg、1.4g/kg和2.0g/kg，洛赛克组灌胃给予奥美拉唑镁10mg/kg。给药1h后，将大鼠固定在金属网制的小笼内，浸于(20±1)℃的水中，液面保持在大鼠胸骨剑突水平。18h后，取出大鼠，处死，结扎贲门端，自幽门端注入1％甲醛溶液5ml，结扎幽门端，固定10min，取出胃，沿胃大弯剪开胃壁，放大镜下测量溃疡长度总和，作为溃疡指数，计算溃疡抑制百分率。
表8长梗南五味子提取物对冷水拘浸致胃溃疡的抑制作用
结果见表8，表明高、低给药剂量时，长梗南五味子提取物对冷水应激溃疡具显著的抑制作用。
实施例14长梗南五味子提取物的急性毒性预实验中，灌胃给于长梗南五味子提取物溶液，小鼠均未出现死亡，无法测出半数致死量，故测定其最大耐受量。
取昆明小鼠，20±2g，由复旦大学实验动物中心提供。分为三组，每组15只，灌胃给药，每天2次，间隔8h，连续观察14天，记录小鼠死亡个数。
表9长梗南五味子提取物小鼠口服急性毒性
小鼠给药后无体重减少、食欲减退等不良反应，观察14天未见小鼠死亡，尸检未见主要器官异常。结果表明长梗南五味子提取物小鼠口服最大耐受量大于30g/kg，毒性较低。
由实施例10～14可知1)本发明的长梗南五味子提取物对常见微生物具有明显的抑制及杀灭作用，其中对革兰氏阳性菌的抑制作用较为明显，其在60及120μg时即能对金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌产生抑制作用。
2)本发明的长梗南五味子提取物具有明显的抗氧化活性。体外能够显著抑制肝匀浆自氧化程度、过氧化氢引起的红细胞溶血，且具有一定的还原力。
3)本发明的长梗南五味子提取物能在一定程度上减轻大黄致小鼠腹泻症状，具抗脾虚、抗腹泻作用。
4)本发明的长梗南五味子提取物抗溃疡效果显著，能有效抑制盐酸-乙醇溶液及冷水拘浸引起的胃粘膜损伤及溃疡的发生。
5)大鼠急性毒性试验表明本发明的长梗南五味子提取物口服毒性较小，最大耐受量超过30g/kg，具良好的开发前景。
实施例15长梗南五味子提取物胶囊剂将长梗南五味子提取物粉碎，过筛，加入5％的微粉硅胶，混匀，加入60％乙醇制软材，制粒，干燥，过20～40目筛，装入明胶硬胶囊即得。
实施例16长梗南五味子提取物颗粒剂将长梗南五味子提取物粉碎，过筛，加入4倍量的糖粉和1倍量糊精，混匀，加入60％乙醇制软材，制粒，干燥，整粒，即得。
实施例17长梗南五味子提取物片剂将长梗南五味子提取物粉碎，过筛，加入10％淀粉，混匀，加入60％乙醇制制软材，制粒，干燥，整粒，加入1％硬脂酸，混匀，压片，即得。
实施例16长梗南五味子提取物糖浆剂将长梗南五味子提取物粉碎，过筛，加入100倍量的单糖浆和适量防腐剂，加热溶解，冷却，即得。
权利要求
1.一种长梗南五味子提取物，其特征在于按如下步骤制备获得用6～14倍长梗南五味子根重量的水浸泡长梗南五味子根12-24小时，然后煎煮提取2-4次，每次提取0.5-1.5小时，合并各次水提液；过滤，浓缩水提液；加乙醇至浓缩水提液，使乙醇浓度至60～80％，放置醇沉8～24小时；过滤，回收乙醇，干燥，得长梗南五味子提取物。
2.一种长梗南五味子提取物的制备方法，其特征在于具体步骤如下用6～14倍长梗南五味子根重量的水浸泡长醒南五味子根12-24小时，然后煎煮提取2-4次，每次提取0.5-1.5小时，合并各次水提液；过滤，浓缩水提液；加乙醇至浓缩水提液，使乙醇浓度至60～80％，放置醇沉8～24小时；过滤，回收乙醇，干燥，得长梗南五味子提取物。
3.根据权利要求2所述的长梗南五味子提取物的制备方法，其特征在于水的用量为药材重量的8～12倍。
4.根据权利要求1所述的长梗南五味子提取物的制备方法，其特征在于所说的煎煮提取为提取3次，每次提取1小时。
5.根据权利要求1所述的长梗南五味子提取物的制备方法，其特征在于乙醇浓度为70％。
6.根据权利要求1所述的长梗南五味子提取物在制备治疗胃痛、胃肠炎和胃溃疡制剂中的应用。
7.一种治疗胃肠道疾病的药物组合物，其特征在于，含有权利要求1所述的长梗南五味子提取物及药学上可接受的载体。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其特征在于为片剂、颗粒剂、胶囊剂或糖浆剂。
全文摘要
本发明属中医药技术领域，具体为长梗南五味子提取物，其制备方法及用途。本发明的长梗南五味子提取物，按如下步骤制备获得将长梗南五味子根部洗净、切碎、加水煎煮，浓缩水提液，醇沉，过滤，回收乙醇，干燥即得。其具有抗菌、抗氧化、抗溃疡及抗腹泻的作用，且毒性较低。与现有技术相比，本发明的长梗南五味子提取物具水溶性，可用于胃痛、胃肠炎和胃溃疡的治疗。
文档编号A61P29/00GK1969956SQ20061011929
公开日2007年5月30日 申请日期2006年12月7日 优先权日2006年12月7日
发明者印春华, 宋蕾, 唐翠 申请人:复旦大学