Rgd衍生物活性同种骨的制作方法

专利名称：Rgd衍生物活性同种骨的制作方法
RGD衍生物活性同种骨RGD衍生物活性同种骨，这一发明是根据目前国内外文献，结合发明人胡永成等二十多年骨外科临床 实践及十几年基础研究，得出脇D衍生物活性同种骨制作工艺和待开发产品蛇D衍生物活性同种骨，本发 明是用于骨科填充，其目的是恢复患者功能及塑建骨结构。该产品由医生在手术过程中使用，无特殊技术 安装要求，RGD衍生物活性鬨##的,工艺，是用人的松质骨经深低温、除脂、清洗、真空，等步騸 制成骨载体，再与人工合成的RGD衍生物交联并制成RGD衍生物活性同种骨产品，实,明，RGD衍生物 活性同种骨的成骨活性商于目前临床应用的同种异体骨的成骨活性.本发明是胡永成等开发的新产品，目 前市场上尚未见同类产品上市。RGD衍生物活性同种骨发明专利和保护内容(1) RGD衍生物活性同种骨 产品(2>用人工合成的8GD衍生物(八肽)改性同种骨的制作工艺；(3)改性同种骨的方法是用物理交 联与化学交联剂的正交实验而选定(4) RGD衍生物的八肽羧基与骨条上的氨基结合，以及八肽的最低阈 值范围的设定均为本专利保护内容(5)舰衍生物活性同种骨的制作工艺还包括同种松质骨的孔隙的吸 附作用，松质骨孔隙的吸附作用和方法为本专利要求保护的内容(6) 8GD衍生物活性同种骨的生物效果 检測和评定用成骨细胞的粘附率和增殖率来表示a技术领域骨缺损的重建或修复与体外骨组织工程一样，必霱有三大要素一是细胞(骨细胞)、二是细胞外基质"#基质(包括人工合成的可降解的支架材料)，三是使细胞与细胞外基质(EQI)相互鎩附的生物活性 分子和信号分子(生长调节因子、骨诱导因子)，与骨基质功llia似的^M材料主要包括:自体骨、同种骨、 异种骨、金属、陶瓷和商分子聚M&等，生物活性分子主要有蛋白质类和多肽类。 (—)支架材料支架材料主要起以下几方面作用(1)作为连接细胞和组织的框架，弓得组织生长成特定形态；(2) 作为信号分子的载体，将其MM到骨缺根部位，并作为缓释体使骨诱导因子缓慢发挥作用；(3)作为骨组 织繁殖、分化和新陈代谢的场折，为细胞生"KM输营养，排除废物(4)支架表面特殊位点与细胞起特异 性反应，对不同类型细鹏"身份斟别"及选择載附的作用，目前，最常用的是天然骨作为骨科填充材料， 它们包括自体骨、同种骨、异种骨，但由于自体骨存在来源限制和取骨区损伤问鼉，现多采用同种骨和异 种骨移植，因其具有良好的骨传导和骨诱导能力，同时还具有理想骨载体的特性。 (二)生物活性分子将生物活性分子固定在夭然骨或人工合* 料表面，改变其表面特性，从而使这些生物"惰性-材料 具有良好的生物相容性和细胞亲和性，为种子细胞的黏附、增殖、扩展和分化提供良好的生物界面。用来 实现生物材料表面改性的生物活性分子最常见之一是多肽，不同序列的多肽有不同的生物特性，选择合适 的多肽对提离生物材料的细胞黏附性有重要意义a按多肽结构可分为蛇D序列和非RGD序列，RGD(Ar"ly-Asp)是由精氨敏-甘贫酰-天门冬氨酸组成的三肽，是具有生物活性的短肽序列之一*它是大 多数细胞表面粘附分子能Wii的配体上的最小氦基黢序列，RGD肽的作用特点是特异性、计量依赖性、无 细胞毒性、可逆性和竞争性，恥D肽对多种细胞都有增强作用，除对内皮细胞的识别、抗血栓、抑制肿癯, 治疗烧伤等具有重要的作用之外，还有助于成骨细胞的黏附和阻断骨吸收的作用。同时，RGD还可以被许 多细臘外基质蛋白(如胶原等)和细胞表面的整合素所识别并结合，形成配体(RGD)-整合素-细胞骨架 跨膜信息系统，从而激活信号传导通路，联系细胞外镦循环与细胞内代谢活动，对细胞生长，代谢起重耍 作用，并进而促进细胞黏附、伸展。近年来随着研究的深入，以RGD为基础的各种多肽不断出现，如GRGD(甘-精-甘-天门冬贫酸〉，GRGDY (甘-精-甘"^门冬-酪氨酸)RGDS (精-甘-天门冬-丝氨醵)，RGDT (精-甘-天门冬-沐氨酸)、RGDC (精-甘-天门冬-半臃氣酸)，GlffiDS沃门冬-精-甘-天门冬-丝贫酸)、G恥DSPC(甘-精-甘-天门冬-丝-脯-半膽氨酸)、EP8GDNYR(谷-鹏-精-甘-天门冬-天门冬BllgMS-精氨酸)，8GDS 、 蛇OT 、 RGDC等都可增强骨细胞的生&, G蛇DSPC对骨键基质细胞粘附能力最强，H^ROTYR可诱导骨组织 再生》我们采用人工合成的Att,RGPre (谷-脯-精-甘-天门冬-天门冬ilfi-n-精氨酸》作为激活成骨的 生物活性分子。通过动物实,实，接入蛇D的同种骨比未改性的移植物产生了更多的含有更商无tyfr素含量的新骨(3倍)。8GD接入的移植物在组织学和新生骨的无机质量上都比那些未改性移植效果更好。(四)多肽的固定法由于生长爾子一般在有水存在及窒温环境下容易失去生物活性，HAS接使用生长因子时常会由于体 内的环境而失活，达不到所期望的生物效应。因此，如何在身体环境下保持并尽可能延长生长闳子的生物 活性，是便生长因子能真正在临床发挥作用的关键。现可用物理法(如紫外线或脱水热处理)或化学法(如 交联剂、甲醛、戊二酵等)方法进行交联，鬨定在材料单位表面上的促细胞繊的数目应超过一定的解值， 并与预定的细胞群有足够的时间接触，可使之充分发挥載附、介导作用，
1. 物理法活性肽都是小分子物质，一般趁可溶性，所以必须有载体才能发挥其,作用， 通过物理法可将BGD的羧基("C00H)接枝到载体的表面上。
2. 通过共价键在生物材料表面阖定多胜"碳二亚胺法在反应时，一种分子中的羧基先与碳二亚胺反探生成一个加成中间产物，再与另一分于上的氨基M形成iys键，实现两者的交联*可以在冷却时的条件，酸碱度中性自中进狞-2) 活泼翻法(改进碳二亚胺法)3) SPDP试剂法异性型双功能交联剂3.通过非共价键的作用将材料固定在材料表面,使活性物质与无活性蛋白经共价结合，从而结合物 即可被吸附。.^^^发明人胡永成天津骨科医院肿癯科主任,多年从事骨科基础与临床研究,特别是对骨肿癍手术中的骨 缺损治疗有丰富的临床经验，发表医学论文60余篇,多项国家及省部,课邇，现为主住医师博士、硕士 研究生导师。从2000年开始研究与同种骨相关的课趣，并极据美国组织库协会(AATB》和欧洲组,协 会(EATB》提出的骨组织*#准而制备同种骨。发明人王由从1998年开始研究软硬组织充填荆，并于2001 年9月W曰正式申请专利(专利号ZL W131437.0,授权公告号CN 123甜47 C,授权公吿曰2006年1月 關)。 (—)研究组成员姓名性别年龄职 称学位专业胡永成男44主任医师博士医学博士骨 科李永岚女71主任医师本科基舰究王维民男打主任医师本科基础研究王由女44主治医师本科基础研究(二)研究组成员发表的相关文章及专判
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l)。 实癧树二 8GD衍生物与同种骨的交联(—)实验目的文献记载人工合成的EP腳鹏八肽分别接入和不接入脱矿化、冻干的骨基质中,进行整胸物实验， 结果证实改性的脱矿骨基质新骨形成能力比未改性的脱矿骨基质新骨形成能力高三倍，同时还不影响骨 的质量。并展望这一方法是开辟了提离同种骨移植成功率的新途径，交联法(接枝)可以用物理法和化学^W法，为使该八tt^到骨胶原上，本实验交联法采用物理法 和化学法，并比较二者的交联的效果，故设计了接枝法的正交实验，(二) 接枝法的正交实验为了选择成骨细胞的培养时间的最佳实验条件，本研究用同等大小的薄(60 300湘)骨片、采用物 理和化学的接枝法的正交实验。(三) Lg (34)四因素、三水平实验结果采用正交实验"(3"四因索、三水平的实验，其结果的判定是用成骨细臃粘附率来表示，1. 成骨细胞粘附率的表示法(1) 0分对覼组无交联(物理、化学法)的成骨细胞粘附率定 (2》l分成骨细胞粘附率大于对照组的5 2讽 (3)2分成骨细胞粘附率大于对照组的20 4(m， ")3分成骨细胞粘附率大于对照组的幼~60%或>60%:2. 实验结果1) 化学试剂交联法与物理交联法可以单独使用，其效果类似a如化学试荆交联与物理交联法联合 使用，效果较，使用略佳'2) 八肽的浓度对成骨细胞的粘附作塌有影响， 实鶬树三产品KGD衍生物活性两种骨成骨活性实验(—)实验目的成骨细胞是促骨生长的细胞，可加速骨组织改造及重建，因此，成骨细胞能否黏附于移植骨的表面， 是 ^植成功的关镍，为验证产品恥》衍生物活性同种#||否增加骨的形成能力，本实验采用成骨细胞黏 附到骨板的黏附率，和增殖率表示产品8GD衍生物Stt同种骨的生物活性效果，本实验是在细M;K平上观 察产品RGD衍生物活性同种骨诱导成骨细胞的黏附、分化和增殖，进而证明产品RGD衍生物活性同种骨提 高了移植的成功率和新骨形成率。 (二》按接枝法的正交实验确定的絲做下述实验1. 成骨细胞黏附率的翻定其实验结果随着八肽浓度的增高，成骨细胞的黏附率虽曲线增长，2. 成骨细胞的增殖率湖定,其实验结果不同培养时间成骨细胞的塘殖率呈直线增长，附圉说明附图l人工合成的八肽离效液相色谱阁
权利要求
1. 一种RGD衍生物活性同种骨产品。
2、 一种RGD衍生物活性同种骨制作工艺，该工艺包括下述方法 (D EPRGDNYR八肽的合成，产物EPRGDNYR八肽(2) 同种骨载体与(1)经交联，RGD衍生物活性同种骨(3) RGD衍生物活性同种骨的检測和质量标准的评定。
3、 本发明的制作工艺与目前市场上同种骨制作工艺方法区别在于(1) EPRGDOTR八肽与同种骨进行交联，应在控制溶液的黢碱度值的,下，将Aft的羧S^同种 骨上的第基结合起来*(2) 采用相关实验法确定八肽的最低稱值和范围，(3) 松质骨内含有大量的孔隙，在旨殊处理后，空虚的孔隙可以吸附八肽分子，(4) 蛇D衍生物活性同种骨的检漏和评定是用成骨细胞的粘附,增殖率来表示。
4、 根据权利要求1所述的RGD衍生物活性同种骨产品为本专利旨的范围，
5、 根据:R^要求2(D所述RGD衍生物活性同种骨制作工艺方法, #征在于八肽浓度确定为0.04 9.50毫克当，度。
6、 根据权利要求2 (2)所述的RGD衍生物活性同种骨制作工艺^，其特征在于交联法是通过正交 实验(L9(34)四函素、三水平表)选定，交联法可以采用物理法、化学法，或二者兼之，物理法时间在5 720分钟，化学交联剂量在0.052 4.90毫克当量浓度，时间2分钟 5小时，
7、 根据权利要求3 (1)所述的8GD衍生物活性同种骨制作工艺方法，其特征在于樓液酸碱度值范围 在3 9之间。
8、 根据权利要求3 (3)所述的脇D衍生物活性同种骨制作工艺方法，其特征在于处理^包括冷处 理和热处理，^a度范围在一70n +65t。
9、 根据权利要求2 (3)和3 (4)所述的RGD衍生物活性同种骨制作工艺方法，，征在于RGD衍生 物活性同种骨检鑭结果用成骨细胞的粘附率和增殖率来表示。
全文摘要
本发明名称为RGD衍生物活性同种骨，属于骨移植生物材料的技术领域。本发明是用于骨科填充，其目的是恢复患者功能及塑建骨结构。本产品是用人的松质骨经低温、除脂、清洗、等步骤制成同种骨载体，再与人工合成的RGD衍生物交联制成RGD衍生物活性同种骨产品。RGD衍生物活性同种骨须经冷冻干燥、真空包装、辐照灭菌。本产品在提供自然骨基质支架材料的同时，还提供生物活性物质——EPRGDNYR八肽。成骨活性高于目前临床应用的同种骨。本发明的制作工艺与目前市场上同种骨的制作工艺区别RGD衍生物人工合成产物-EPRGDNYR八肽与同种异体骨进行交联，生成具有生物活性的同种骨。交联法通过物理法与化学交联法做L₉(3⁴)四因素、三水平正交实验而选定的。本产品的检测和评定标准为成骨细胞的粘附率和增殖率来表示。
文档编号A61L27/00GK101209359SQ20061017021
公开日2008年7月2日 申请日期2006年12月25日 优先权日2006年12月25日
发明者由 王, 胡永成 申请人:胡永成;王 由