专利名称：具有抑制pttg表达作用的融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及融合蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及由具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白及其编码基因，以及该融合蛋白的表达方法和在制备治疗PTTG阳性肿瘤及与PTTG过度表达有关的疾病的药物中的应用。
背景技术：
垂体肿瘤转化基因(PTTG基因)是一个在多种肿瘤中均表达的原癌基因。近年来的研究结果表明，PTTG基因是一个强有力的肿瘤转化基因，可以通过以下多种机制参与肿瘤的形成与发展诱导细胞转化；促进其它原癌基因及促瘤因子的表达；干扰姊妹染色单体分离；促进碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)参与的肿瘤血管生成等。其中以bFGF与PTTG的关系最为密切，有学者甚至认为PTTG的某些生物学作用是通过bFGF而实现的。bFGF能够促进肿瘤的新血管形成，在肿瘤的生长和浸润过程中发挥重要作用，而肿瘤的侵袭和转移往往是治疗失败的原因。因此，将PTTG作为研究和治疗肿瘤的靶点，具有重要意义。
选择性蛋白质降解是细胞生长发育和维持自身稳定的一个特性，蛋白酶体是负责清除细胞内指令降解蛋白的蛋白质降解系统。其中泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-Proteasome Pathway)是体内最重要的高效蛋白降解途径。此途径有两步骤1)靶蛋白共价结合上多个泛素；2)多泛素化了的靶蛋白被26S蛋白酶体复合物降解。泛素结合到靶蛋白上这一过程至少需要三种酶的介导泛素激活酶(E1)，泛素结合酶(E2)和泛素连接酶(E3)。Skp1-Cullin1-F-box(SCF)复合物是一种重要的E3酶，由Skp1，Cul1，Rbx1和F-box蛋白四个部件组成，前三个是不可变组件，F-box蛋白是可变组件。F-box蛋白是一个庞大的蛋白家族，目前至少发现70种以上，其共同特征是一端具有一个F-box基序与Skp1结合，另一端具有复杂的结合区域，可以与不同的底物靶蛋白结合，从而介导靶蛋白通过SCF复合型E3泛素化后被降解。
从mRNA水平抑制相关癌基因表达来对特定癌基因进行研究和治疗，是目前较常用的方法，但是对一些由于不容易降解，长期存在而导致肿瘤发生发展的相关肿瘤蛋白，从蛋白水平抑制会更迅速，更可靠。PTTG蛋白高水平长时间滞留在细胞各周期，是造成细胞不正常转化的原因之一。
β-TrCP蛋白(基因序列GenBank号为Y14153，蛋白GenBank号为CAA74572.1)是F-box蛋白家族中的一个成员，由569个氨基酸残基组成，其蛋白结构示意图见图1；自氨基端第142至194位氨基酸为F-box基序，能与skp1结合；第195至256位氨基酸为连接肽，为有效泛素化提供了有利的空间结构；第257至569位氨基酸为7个WD-40重复序列，构成复杂的空间结构，利于与不同的底物蛋白结合。β-TrCP蛋白广泛存在于多种人类细胞中，在体内涉及多个信号途径及细胞周期的调控。
PBF(基因序列GenBank号BC019295，PBF蛋白的GenBank号AAH19295.1)是PTTG结合因子(PTTG-binding-factor)的简称，PBF基因包含一个编码180个氨基酸的开放阅读框，PBF mRNA在人体组织中普遍表达，在体内、体外均可特异性地与PTTG相互作用。PBF在第149-166位氨基酸之间包含两个NLS(nuclear localizationsignal，核定位信号)序列，NLS介导蛋白进入细胞核；PTTG不含有NLS序列，PTTG进核并发挥功能需要PBF的NLS序列的参与。另有实验证明，PBF蛋白C端包含有核定位信号的30个氨基酸对于PBF与PTTG的结合是必需的，且足够与PTTG结合。
泛素化过程中泛素连接酶E3负责特异性识别与结合底物。近年来，多个研究小组应用重组技术构建重组嵌合泛素连接酶，成功降解了正常情况下非泛素化系统天然底物的某些蛋白。例如通过修饰泛素连接酶复合物Skp1-Cullin1-F-box(SCF)的底物结合亚单位F-box构成的嵌合F-box蛋白，可靶向性地降解pRB家族蛋白成员、β-catenin和cyclin A-Cdk2。这些研究结果表明利用重组的泛素连接酶，可靶向性地降解一些疾病相关分子。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白。
本发明所提供的具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白，命名为β-TrCP-PBF，是通过连接肽在PBF或由PBF羧基(C)端的第1-30位氨基酸残基(包含核定位序列)组成的多肽的氨基(N)端连接β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基(包含F-box基序)的融合蛋白。
所述连接肽的选择是多种多样的，优选为柔性肽，其氨基酸残基序列可为序列表中SEQ ID NO1(GSGSGSGSGS)或1-3个SEQ ID NO2(GGGGS)等所示的重复序列。柔性肽易于弯曲，因而可使表达蛋白正确折叠，且不影响融合蛋白各自的活性结合区域。
具体来讲，所述具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白，是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO3；2)序列表中的SEQ ID NO4；
3)序列表中的SEQ ID NO5；4)序列表中的SEQ ID NO6；5)序列表中的SEQ ID NO7；6)将序列表中SEQ ID NO3-7的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抑制PTTG表达作用的蛋白质。
序列表中的SEQ ID NO3由446个氨基酸残基组成，自氨基端第1-256位为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列，自氨基端第257-266位为连接肽序列，自氨基端第267-446位为PBF；序列表中的SEQ ID NO4由451个氨基酸残基组成，自氨基端第1-256位为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列，自氨基端第257-271位为连接肽序列，自氨基端第272-451位为PBF；序列表中的SEQ ID NO5由446个氨基酸残基组成，自氨基端第1-256位为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列，自氨基端第257-266位为连接肽序列，自氨基端第267-446位为PBF；序列表中的SEQ ID NO6由441个氨基酸残基组成，自氨基端第1-256位为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列，自氨基端第257-261位为连接肽序列，自氨基端第262-441位为PBF；序列表中的SEQ ID NO7由296个氨基酸残基组成，自氨基端第1-256位为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列，自氨基端第257-266位为连接肽序列，自氨基端第267-296位为PBF羧基端的第1-30位氨基酸残基。
编码上述具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白的基因(β-TrCP-PBF)，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO8的DNA序列；2)序列表中SEQ ID NO9的DNA序列；3)序列表中SEQ ID NO10的DNA序列；4)序列表中SEQ ID NO11的DNA序列；5)序列表中SEQ ID NO12的DNA序列；5)编码序列表中SEQ ID NO3-7的DNA序列；6)与序列表中SEQ ID NO8-12限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有抑制PTTG表达作用的核苷酸序列；7)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO8-12限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件为杂交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的SEQ ID NO8由1341个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1338位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO3的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-768位碱基为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列的编码序列，自5’端第769-798位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第799-1338位碱基为PBF的编码序列；序列表中的SEQ ID NO9由1356个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1353位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO4的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-768位碱基为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列的编码序列，自5’端第769-813位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第814-1356位碱基为PBF的编码序列；序列表中的SEQ ID NO10由1341个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1338位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO5的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-768位碱基为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列的编码序列，自5’端第769-798位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第799-1338位碱基为PBF的编码序列；序列表中的SEQ ID NO11由1326个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1323位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO6的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-768位碱基为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列的编码序列，自5’端第769-783位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第784-1323位碱基为PBF的编码序列；序列表中的SEQ ID NO12由891个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-888位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO7的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-768位碱基为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列的编码序列，自5’端第769-798位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第799-888位碱基为PBF羧基端第1-30位氨基酸残基的编码序列。
含有本发明融合蛋白基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
为方便纯化，在上述重组表达载体中具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白基因的5’端还连接有His-tag或FLAG-tag编码序列。
用于构建含有本发明融合蛋白基因的重组表达载体的出发载体为任意一种原核或真核表达载体；所述原核表达载体可为pET-32a、pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)或pET-30a等；所述真核表达载体可为pCMV5、pSilence1.0-U6(Ambion，Austin，TX，USA)、pcDNA、pEGFP-N1、pSV40、pCI-neo(购于Promega公司)、pTEF1、pPICZα、pAM82或pAAh5等。
以pET-32a为出发载体，构建的含有具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白基因的重组表达载体为pET32a-βTrCP-PBF、pET32a-βTrCP-PBF3、pET32a-βTrCP-PBF2、pET32a-βTrCP-PBF1或pET32a-βTrCP-PBF30。
以pCMV5为出发载体，构建的含有具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白基因的重组表达载体为pCMV5-β-TrCP-PBF、pCMV5-β-TrCP-PBF3、pCMV5-β-TrCP-PBF2、pCMV5-β-TrCP-PBF1或pCMV5-β-TrCP-PBF30。
上述重组表达载体可按照常规方法构建。
扩增上述融合蛋白编码基因中任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种表达上述具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白的方法。
本发明所提供的表达上述具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白的方法，是将上述含有具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白。
所述宿主可为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌等，优选为大肠杆菌。
所述大肠杆菌可为E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)或E.coli Top10等。
所述酵母菌优选为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)。其中，所述巴氏毕赤酵母优选为巴氏毕赤酵母GS115、KM71(购自美国Invitrogen公司)或SMD1168(购自美国Invitrogen公司)。
上述重组菌可按照常规方法构建。
培养含有具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白基因的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。其中，培养所述重组大肠杆菌宿主时需加入诱导剂，如IPTG等，所加入IPTG的浓度为0.5-1.0mmol/L，优选为1mmol/L，诱导温度为16-37℃，优选为28℃，诱导时间为2-4小时，优选为4小时。
本发明还提供了一种治疗PTTG阳性肿瘤及与PTTG过表达相关疾病的药物。
本发明所提供的治疗性药物，它的活性成分为上述具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白或其编码基因。
所述具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白基因可存在于真核表达载体中。
所述含有具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白基因的真核表达载体可为pCMV5-β-TrCP-PBF、pCMV5-β-TrCP-PBF3、pCMV5-β-TrCP-PBF2、pCMV5-β-TrCP-PBF1或pCMV5-β-TrCP-PBF30。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述基因药物载体包括(但不仅限于)携带基因的载体，如脂质体、重组病毒载体等；携带蛋白药物的载体，如(但不仅限于)其它的蛋白或多肽成分；所述载体还包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体等。
本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
上述蛋白药物和基因药物的用量可采用药学领域中蛋白药物和基因药物的常规剂量，并可根据实际情况调整。
本发明提供了一种具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白β-TrCP-PBF及其编码基因。该融合蛋白保留β-TrCP蛋白N端包含F-box基序的部分而将C端的底物蛋白结合区域置换为能够特异性结合PTTG的PBF或其C端第1-30位氨基酸残基(包含核定位序列)，并用柔性连接肽(如“GSGSGSGSGS”等)把两者连结起来可以提高该融合蛋白的空间对接柔韧性。β-TrCP-PBF中的PBF区域负责对PTTG靶向性结合，F-box基序负责与Skp1结合然后形成SCF型E3，从而特异性介导PTTG蛋白泛素化、降解。实验证明，本发明的β-TrCP-PBF不仅可显著下调外源PTTG蛋白的表达水平，转染有β-TrCP-PBF基因真核表达载体的PTTG阳性细胞(如Hela细胞)内源PTTG蛋白表达水平较转染前显著下调，此外细胞的增殖能力(有一定的促调亡能力)及细胞克隆形成能力也均被抑制。本发明的融合蛋白β-TrCP-PBF及其编码基因将在PTTG的功能研究和制备治疗PTTG阳性肿瘤及与PTTG过度表达有关的疾病的药物中发挥重要作用，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为β-TrCP及本发明融合蛋白β-TrCP-PBF的结构示意2为载体pCMV5的物理图谱图3为pCMV5-β-TrCP-PBF载体的双酶切鉴定结果图4为pCMV5-β-TrCP-PBF与pEGFP-N3-PTTG共转染COS-7细胞以检测本发明融合蛋白β-TrCP-PBF对外源PTTG蛋白表达水平影响的实验结果图5为本发明融合蛋白β-TrCP-PBF对PTTG阳性的宫颈癌细胞系Hela细胞内源PTTG蛋白表达水平影响的免疫印迹检测结果图6为本发明融合蛋白β-TrCP-PBF对PTTG阳性的宫颈癌细胞系Hela细胞增殖数量影响的统计结果图7为本发明融合蛋白β-TrCP-PBF对PTTG阳性的宫颈癌细胞系Hela细胞克隆增殖能力影响的显微镜观察结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见《Molecular CloningA Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rdedition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物及DNA序列均由上海英俊生物技术有限公司合成。
实施例1、融合蛋白基因β-TrCP-PBF的获得及其真核表达载体的构建一、氨基端连接Flag-tag序列的β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基编码序列的扩增提取MCF-7细胞系(购自上海细胞所)的总RNA，反转录合成其cDNA并以此为模板，在引物TRC7(上游引物)5’-GTCTCTAGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAAATGGACCCGGCCGAGG-3’(带下划线碱基为Flag-tag编码序列)和TRC6(下游引物)5’-GTCGGATCCACTATGTCTTCCACATCTCCAATTAGATTC-3’的引导下PCR扩增氨基端连接Flag-tag序列的β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基编码序列，同时在扩增片段两端引入限制性内切酶Xba I和BamH I酶切位点。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增获得了长度为819bp的目的片段，测序结果表明获得了序列正确的5’端连接Flag-tag编码序列的β-TrCP基因自5’端第1-768位碱基构成的基因片段，即氨基端连接Flag-tag序列的β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基编码序列。回收并纯化该目的片段。
二、氨基端连接“GSGSGSGSGS”连接肽序列的PBF编码序列的克隆以MCF-7细胞系cDNA为模板，在引物PBF3(上游引物)5’-CTGGGATCCGGCTCAGGCTCAGGATCAGGCTCAATGGCGCCCGGAGTGG-3’(带下划线碱基为“GSGSGSGSGS”连接肽编码序列)和PBF2(下游引物)5’-CTTCCCGGGTTAGTTGTTTTCAAATCTAGCATACG-3’的引导下PCR扩增氨基端连接“GSGSGSGSGS”连接肽(序列表中SEQ ID NO1)序列的PBF编码序列，同时在扩增片段两端引入限制性内切酶BamH I和Sma I酶切位点。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果经PCR扩增获得了长度为585bp的目的片段，测序结果表明获得了序列正确的5’端连接“GSGSGSGSGS”连接肽编码序列的PBF基因片段，即氨基端连接“GSGSGSGSGS”连接肽序列的PBF编码序列。回收并纯化该目的片段。
此外，用普通PCR扩增的方法还获得了下述DNA片段(同时在扩增片段两端引入限制性内切酶BamH I和Sma I酶切位点)1)氨基端连接三个“GGGGS”重复序列的连接肽的PBF编码序列；2)氨基端连接二个“GGGGS”重复序列的连接肽的PBF编码序列；3)氨基端连接“GGGGS”连接肽的PBF编码序列；4)氨基端连接“GSGSGSGSGS”连接肽的PBF羧基端的第1-30位氨基酸残基组成的多肽的编码序列。
三、重组嵌合分子β-TrCP-PBF真核表达载体的构建如图2所示，载体pCMV5(GenBank号AF239249)包含CMVCMV启动子，842-913位碱基；MCS多克隆位点，902-986位碱基；SV40SV40起始位点，1817-1894位碱基；T7T7启动子，2023-2005位碱基；pBR322_originpBR322起始位点，3043-2424位碱基；Ampicillin氨苄青霉素抗药性基因，4058-3198位碱基；f1_originf1起始位点，4207-4513位碱基。用限制性内切酶Xba I和Sma I对载体pCMV5进行双酶切后，用T4 DNA连接酶将实施例1步骤一扩增的5’端连接Flag-tag编码序列的β-TrCP基因自5’端第1-768位碱基构成的基因片段(两端添加有Xba I和BamH I酶切位点)和实施例1步骤二扩增的5’端连接“GSGSGSGSGS”连接肽编码序列的PBF基因片段(两端添加有BamH I和Sma I酶切位点)与线性化的pCMV5中连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性单克隆，提取质粒，分别用Xba I和SmaI，Xba I和BamH I，BamH I和Sma I对重组质粒进行双酶切鉴定，酶切鉴定结果如图3所示(泳道M为DNA Marker，泳道1为重组质粒的Xba I和Sma I的双酶切鉴定结果，泳道2为重组质粒的Xba I和BamH I的双酶切鉴定结果，泳道3为重组质粒的BamH I和Sma I的双酶切鉴定结果)，重组质粒经Xba I和Sma I双酶切获得了约1386bp的DNA片段，重组质粒经Xba I和BamH I双酶切获得了约813bp的DNA片段，重组质粒经BamH I和Sma I双酶切获得了约579bp的DNA片段，与预期结果相符。对上述重组质粒进行测序鉴定，除去Flag-tag编码序列及酶切位点外，载体中插入的外源DNA片段具有序列表中SEQ ID NO8的核苷酸序列，由1341个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1338位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO3的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-768位碱基为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列的编码序列，自5’端第769-798位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第799-1338位碱基为PBF的编码序列。将所构建的β-TrCP-PBF的真核表达载体命名为pCMV5-β-TrCP-PBF。
此外，用上述方法将实施例1步骤一扩增的5’端连接Flag-tag编码序列的β-TrCP基因自5’端第1-768位碱基构成的基因片段(两端添加有Xba I和BamH I酶切位点)分别和实施例1步骤二扩增的5’端连接三个“GGGGS”重复序列连接肽编码序列的PBF基因片段(两端添加有BamH I和Sma I酶切位点)、5’端连接二个“GGGGS”重复序列连接肽编码序列的PBF基因片段(两端添加有BamH I和Sma I酶切位点)、5’端连接“GGGGS”重复序列连接肽编码序列的PBF基因片段(两端添加有BamH I和Sma I酶切位点)、5’端连接“GSGSGSGSGS”连接肽编码序列的PBF羧基端的第1-30位氨基酸残基组成的多肽的编码序列与线性化的pCMV5中连接，得到下述重组真核表达载体1)含有连接肽为三个“GGGGS”重复序列的融合蛋白基因的真核表达载体，命名为pCMV5-β-TrCP-PBF3，该融合蛋白基因具有序列表中SEQ ID NO9的核苷酸序列，由1356个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1353位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO4的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-768位碱基为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列的编码序列，自5’端第769-813位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第814-1356位碱基为PBF的编码序列；2)含有连接肽为二个“GGGGS”重复序列的融合蛋白基因的真核表达载体，命名为pCMV5-β-TrCP-PBF2，该融合蛋白基因具有序列表中SEQ ID NO10的核苷酸序列，由1341个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1338位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO5的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-768位碱基为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列的编码序列，自5’端第769-798位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第799-1338位碱基为PBF的编码序列；3)含有连接肽为“GGGGS”的融合蛋白基因的真核表达载体，命名为pCMV5-β-TrCP-PBF1，该融合蛋白基因具有序列表中SEQ ID NO11的核苷酸序列，由1326个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1323位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO6的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-768位碱基为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列的编码序列，自5’端第769-783位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第784-1323位碱基为PBF的编码序列；4)含有连接肽为“GSGSGSGSGS”的在由PBF羧基端的第1-30位氨基酸残基组成的多肽的氨基端连接β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基的融合蛋白基因的真核表达载体，命名为pCMV5-β-TrCP-PBF30，该融合蛋白基因具有序列表中SEQ ID NO12的核苷酸序列，由891个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-888位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO7的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第1-768位碱基为β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基序列的编码序列，自5’端第769-798位碱基为连接肽的编码序列，自5’端第799-888位碱基为PBF羧基端第1-30位氨基酸残基的编码序列。将本发明的融合蛋白基因统称为β-TrCP-PBF，其编码蛋白统称为β-TrCP-PBF，该蛋白的结构示意图见图1。
实施例2、检测本发明融合蛋白β-TrCP-PBF对PTTG基因表达的抑制作用一、检测本发明融合蛋白β-TrCP-PBF对外源PTTG-EGFP融合蛋白表达情况的影响将实施例1构建的携带有本发明融合蛋白基因的真核表达载体pCMV5-β-TrCP-PBF与携带有绿色荧光蛋白标记的PTTG蛋白基因的质粒pEGFP-N3-PTTG(pEGFP-N3-PTTG是PTTG-EGFP融合蛋白基因的真核表达载体，转染真核细胞后能表达出带绿色荧光蛋白标记的PTTG蛋白，此融合蛋白在蓝色激发光下能发出绿色荧光。质粒pEGFP-N3-PTTG的构建方法提取MCF-7细胞系的总RNA，反转录合成其cDNA并以此为模板，在引物MP5(上游引物)5’-CGTCAATTCGCCACCATGGCTACTCTGATCTATGTTG-3’和MP6(下游引物)5’-CAGGGATCCAATATCTATGTCACAGCAAACAG-3’的引导下PCR扩增PTTG基因片段(Genbank号AF095287)，并在扩增片段两端分别添加EcoR I和BamH I酶切为点，然后将载体pEGFP-N3(CLONTECH生物技术公司)用限制性内切酶EcoR I和BamH I进行双酶切后，用T4 DNA连接酶将上述PCR扩增的PTTG基因片段与线性化的pEGFP-N3连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，筛选阳性单克隆，提质粒，酶切鉴定及测序鉴定，最终得到携带PTTG-EGFP融合蛋白基因的目标质粒pEGFP-N3-PTTG。)瞬时共转染COS-7细胞，检测本发明融合蛋白对PTTG表达的影响，具体方法为将对数生长期的COS-7细胞以每孔1×105细胞量接种于24孔培养板内，培养液为含10％胎牛血清(HYCLONE公司)的DMEM培养基(GIBCO公司)，在5％CO2、37℃培养箱中培养。次日当细胞长至90-95％时，用脂质体LipofectamineTM2000试剂(Gibco公司)并参照说明书将质粒pCMV5-β-TrCP-PBF和pEGFP-N3-PTTG按1∶1的比例共转染COS-7细胞，对照细胞以同样的方法共转染pCMV5空载体和pEGFP-N3-PTTG(1∶1)，转染后48小时，用荧光显微镜(OLYMPUS IX51)观察和拍照，用Image-pro plus v5.02Sofeware分析转染细胞中PTTG的表达情况。结果如图4所示(ApCMV5空载体和pEGFP-N3-PTTG共转染细胞，BpCMV5-β-TrCP-PBF和pEGFP-N3-PTTG共转染细胞)，pCMV5-β-TrCP-PBF和pEGFP-N3-PTTG共转染细胞的荧光亮度明显比空质粒pCMV5和pEGFP-N3-PTTG共转染细胞的荧光亮度弱，表明本发明的融合蛋白β-TrCP-PBF能显著下调外源PTTG蛋白的表达。
用上述相同方法还将pCMV5-β-TrCP-PBF3、pCMV5-β-TrCP-PBF2、pCMV5-β-TrCP-PBF1、pCMV5-β-TrCP-PBF30分别和pEGFP-N3-PTTG共转染COS-7细胞，以检测本发明连接肽为1-3个“GGGGS”重复序列的融合蛋白β-TrCP-PBF以及连接肽为“GSGSGSGSGS”的在由PBF羧基端的第1-30位氨基酸残基组成的多肽的氨基端连接β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基的融合蛋白对外源PTTG蛋白表达的影响，结果转染有携带本发明融合蛋白基因的真核表达载体的细胞的荧光亮度明显比空质粒pCMV5和pEGFP-N3-PTTG共转染细胞的荧光亮度弱，表明本发明的融合蛋白β-TrCP-PBF能显著下调外源PTTG蛋白的表达。
二、检测本发明融合蛋白β-TrCP-PBF对PTTG阳性癌细胞增殖及细胞内源PTTG表达水平的影响以人宫颈癌细胞系Hela细胞为例，将实施例1构建的携带有本发明融合蛋白基因的真核表达载体pCMV5-β-TrCP-PBF转染PTTG阳性癌细胞，以检测本发明融合蛋白β-TrCP-PBF对PTTG阳性癌细胞增殖及细胞内源PTTG表达水平的影响，具体方法为将对数生长期的Hela细胞以每孔2×105细胞量接种于24孔培养板内，培养液为含10％胎牛血清的DMEM培养基，在5％CO2、37℃培养箱中培养。次日当细胞长至90-95％时，用脂质体LipofectamineTM2000试剂将质粒pCMV5-β-TrCP-PBF转染Hela细胞，对照细胞以同样的方法转染pCMV5空载体。转染后48小时收获细胞，首先用免疫印迹(Western blot)检测融合蛋白β-TrCP-PBF对PTTG蛋白水平的影响，一抗为抗PTTG抗体(购自SANTA CRUZ)，二抗为羊抗兔(购自SANTA CRUZ)，检测结果如图5所示，与转染pCMV5的对照细胞比较，转染pCMV5-β-TrCP-PBF的Hela细胞中PTTG蛋白水平显著下调，表明本发明的融合蛋白β-TrCP-PBF能下调内源PTTG蛋白的表达水平。同时还统计了两组转染细胞转染后第1、2、3、4天的细胞数量，细胞数量统计结果如图6所示，与转染pCMV5的对照细胞相比，转染pCMV5-β-TrCP-PBF的Hela细胞的增殖明显受到抑制，表明本发明的融合蛋白β-TrCP-PBF能有效抑制与PTTG过度表达有关的细胞(PTTG阳性肿瘤细胞)的增殖，并有促凋亡的作用。此外，将分别转染pCMV5、pCMV5-β-TrCP-PBF的Hela细胞以每孔1×103细胞量接种于24孔培养板内，并于第7天在显微镜下观察细胞克隆形成情况，结果如图7所示，与转染pCMV5的对照细胞相比，转染pCMV5-β-TrCP-PBF的Hela细胞细胞克隆形成明显减少，表明本发明的融合蛋白β-TrCP-PBF能有效抑制与PTTG过度表达有关的细胞(PTTG阳性肿瘤细胞)的克隆增殖能力。
用上述相同方法还将pCMV5-β-TrCP-PBF3、pCMV5-β-TrCP-PBF2、pCMV5-β-TrCP-PBF1、pCMV5-β-TrCP-PBF30分别转染Hela细胞，以检测本发明连接肽为1-3个“GGGGS”重复序列的融合蛋白β-TrCP-PBF以及连接肽为“GSGSGSGSGS”的在由PBF羧基端的第1-30位氨基酸残基组成的多肽的氨基端连接β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基的融合蛋白对内源PTTG蛋白表达水平及PTTG阳性细胞增殖能力及细胞克隆形成能力的影响，结果转染有携带上述本发明融合蛋白基因的真核表达载体的Hela细胞内PTTG的表达水平明显比空质粒pCMV5转染细胞内PTTG的表达水平低，且细胞细胞增殖数量及细胞克隆形成与对照空质粒pCMV5转染细胞比也均明显减少，表明本发明的融合蛋白β-TrCP-PBF能显著下调内源PTTG蛋白的表达，PTTG阳性细胞增殖能力及细胞克隆形成能力，可用于制备治疗PTTG阳性肿瘤及与PTTG过度表达有关疾病的药物。
实施例3、本发明融合蛋白β-TrCP-PBF的原核表达用限制性内切酶Xba I和Sma I对原核表达载体pET-32a(Novagen公司)进行双酶切后，用T4 DNA连接酶将实施例1步骤一扩增的5’端连接Flag-tag编码序列的β-TrCP基因自5’端第1-768位碱基构成的基因片段(两端添加有Xba I和BamH I酶切位点)和实施例1步骤二扩增的5’端连接“GSGSGSGSGS”连接肽编码序列的PBF基因片段(两端添加有BamH I和Sma I酶切位点)与线性化的载体pET-32a连接，得到本发明融合蛋白β-TrCP-PBF的原核表达载体，命名为pET32a-βTrCP-PBF用同样方法还获得了含有连接肽为三个“GGGGS”重复序列的β-TrCP-PBF基因的原核表达载体(命名为pET32a-βTrCP-PBF3)，含有连接肽为二个“GGGGS”重复序列的β-TrCP-PBF基因的原核表达载体(命名为pET32a-βTrCP-PBF2)，含有连接肽为“GGGGS”的β-TrCP-PBF基因的原核表达载体(命名为pET32a-βTrCP-PBF1)，含有连接肽为“GSGSGSGSGS”的在由PBF羧基端的第1-30位氨基酸残基组成的多肽的氨基端连接β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基的β-TrCP-PBF基因的原核表达载体(命名为pET32a-βTrCP-PBF30)，再将上述原核表达载体分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性重组菌，然后按1∶100的比例将阳性重组菌接种至含100mg/mL氨苄青霉素的1000mL LB液体培养基中在37℃下进行大量培养，培养至对数生长期(OD600值约为0.8)，加入化学诱导剂IPTG至终浓度为1mmol/L，在37℃下继续培养4小时。培养结束后，4℃、6000rpm离心15min收集菌体，用100mL TE缓冲液(20mmol/L，pH8.0)重悬菌体沉淀，加入溶菌酶(1mg/mL)于室温磁力搅拌10min；冰浴中超声波(30s/开，20s/停，15个循环)破碎菌体；4℃、12000rpm离心20min分别收集包涵体沉淀和上清。将包涵体沉淀用1mol/L的NaCl(TE配制)洗涤1次，4℃、12000rpm离心20min以去除包涵体中的杂蛋白，弃上清后再用TE缓冲液洗涤2次，4℃、12000rpm离心20min收集沉淀，利用Flag-tag对表达的上述融合蛋白β-TrCP-PBF进行纯化，得到纯化的本发明连接肽为“GSGSGSGSGS”的β-TrCP-PBF、连接肽为三个“GGGGS”重复序列的β-TrCP-PBF、连接肽为二个“GGGGS”重复序列的β-TrCP-PBF、连接肽为“GGGGS”的β-TrCP-PBF及连接肽为“GSGSGSGSGS”的在由PBF羧基端的第1-30位氨基酸残基组成的多肽的氨基端连接β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基的β-TrCP-PBF。
序列表<160>12<210>1<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>1Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser1 5 10<210>2<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210>3<211>446<212>PRT<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3Met Asp Pro Ala Glu Ala Val Leu Gln Glu Lys Ala Leu Lys Phe Met1 5 10 15Asn Ser Ser Glu Arg Glu Asp Cys Asn Asn Gly Glu Pro Pro Arg Lys20 25 30Ile Ile Pro Glu Lys Asn Ser Leu Arg Gln Thr Tyr Asn Ser Cys Ala35 40 45Arg Leu Cys Leu Asn Gln Glu Thr Val Cys Leu Ala Ser Thr Ala Met50 55 60Lys Thr Glu Asn Cys Val Ala Lys Thr Lys Leu Ala Asn Gly Thr Ser65 70 75 80Ser Met Ile Val Pro Lys Gln Arg Lys Leu Ser Ala Ser Tyr Glu Lys85 90 95Glu Lys Glu Leu Cys Val Lys Tyr Phe Glu Gln Trp Ser Glu Ser Asp100 105 110Gln Val Glu Phe Val Glu His Leu Ile Ser Gln Met Cys His Tyr Gln115 120 125His Gly His Ile Asn Ser Tyr Leu Lys Pro Met Leu Gln Arg Asp Phe130 135 140Ile Thr Ala Leu Pro Ala Arg Gly Leu Asp His Ile Ala Glu Asn Ile145 150 155 160Leu Ser Tyr Leu Asp Ala Lys Ser Leu Cys Ala Ala Glu Leu Val Cys165 170 175Lys Glu Trp Tyr Arg Val Thr Ser Asp Gly Met Leu Trp Lys Lys Leu180 185 190Ile Glu Arg Met Val Arg Thr Asp Ser Leu Trp Arg Gly Leu Ala Glu195 200 205Arg Arg Gly Trp Gly Gln Tyr Leu Phe Lys Asn Lys Pro Pro Asp Gly210 215 220
Asn Ala Pro Pro Asn Ser Phe Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Lys Ile Ile225 230 235 240Gln Asp Ile Glu Thr Ile Glu Ser Asn Trp Arg Cys Gly Arg His Ser245 250 255Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Met Ala Pro Gly Val Ala260 265 270Arg Gly Pro Thr Pro Tyr Trp Arg Leu Arg Leu Gly Gly Ala Ala Leu275 280 285Leu Leu Leu Leu Ile Pro Val Ala Ala Ala Gln Glu Pro Pro Gly Ala290 295 300Ala Cys Ser Gln Asn Thr Asn Lys Thr Cys Glu Glu Cys Leu Lys Asn305 310 315 320Val Ser Cys Leu Trp Cys Asn Thr Asn Lys Ala Cys Leu Asp Tyr Pro325 330 335Val Thr Ser Val Leu Pro Pro Ala Ser Leu Cys Lys Leu Ser Ser Ala340 345 350Arg Trp Gly Val Cys Trp Val Asn Phe Glu Ala Leu Ile Ile Thr Met355360 365Ser Val Val Gly Gly Thr Leu Leu Leu Gly Ile Ala Ile Cys Cys Cys370 375 380Cys Cys Cys Arg Arg Lys Arg Ser Arg Lys Pro Asp Arg Ser Glu Glu385 390 395 400Lys Ala Met Arg Glu Arg Glu Glu Arg Arg Ile Arg Gln Glu Glu Arg405 410 415Arg Ala Glu Met Lys Thr Arg His Asp Glu Ile Arg Lys Lys Tyr Gly420 425 430Leu Phe Lys Glu Glu Asn Pro Tyr Ala Arg Phe Glu Asn Asn435 440 445<210>4<211>451<212>PRT
<213>人工序列<220>
<223>
<400>4Met Asp Pro Ala Glu Ala Val Leu Gln Glu Lys Ala Leu Lys Phe Met1 5 10 15Asn Ser Ser Glu Arg Glu Asp Cys Asn Asn Gly Glu Pro Pro Arg Lys20 25 30Ile Ile Pro Glu Lys Asn Ser Leu Arg Gln Thr Tyr Asn Ser Cys Ala35 40 45Arg Leu Cys Leu Asn Gln Glu Thr Val Cys Leu Ala Ser Thr Ala Met50 55 60Lys Thr Glu Asn Cys Val Ala Lys Thr Lys Leu Ala Asn Gly Thr Ser65 70 75 80Ser Met Ile Val Pro Lys Gln Arg Lys Leu Ser Ala Ser Tyr Glu Lys85 90 95Glu Lys Glu Leu Cys Val Lys Tyr Phe Glu Gln Trp Ser Glu Ser Asp100 105 110Gln Val Glu Phe Val Glu His Leu Ile Ser Gln Met Cys His Tyr Gln115 120 125His Gly His Ile Asn Ser Tyr Leu Lys Pro Met Leu Gln Arg Asp Phe130 135 140Ile Thr Ala Leu Pro Ala Arg Gly Leu Asp His Ile Ala Glu Asn Ile145 150 155 160Leu Ser Tyr Leu Asp Ala Lys Ser Leu Cys Ala Ala Glu Leu Val Cys165 170 175Lys Glu Trp Tyr Arg Val Thr Ser Asp Gly Met Leu Trp Lys Lys Leu180 185 190Ile Glu Arg Met Val Arg Thr Asp Ser Leu Trp Arg Gly Leu Ala Glu195 200 205
Arg Arg Gly Trp Gly Gln Tyr Leu Phe Lys Asn Lys Pro Pro Asp Gly210 215 220Asn Ala Pro Pro Asn Ser Phe Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Lys Ile Ile225 230 235 240Gln Asp Ile Glu Thr Ile Glu Ser Asn Trp Arg Cys Gly Arg His Ser245 250 255Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met260 265 270Ala Pro Gly Val Ala Arg Gly Pro Thr Pro Tyr Trp Arg Leu Arg Leu275 280 285Gly Gly Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ile Pro Val Ala Ala Ala Gln290 295 300Glu Pro Pro Gly Ala Ala Cys Ser Gln Asn Thr Asn Lys Thr Cys Glu305 310 315 320Glu Cys Leu Lys Asn Val Ser Cys Leu Trp Cys Asn Thr Asn Lys Ala325 330 335Cys Leu Asp Tyr Pro Val Thr Ser Val Leu Pro Pro Ala Ser Leu Cys340 345 350Lys Leu Ser Ser Ala Arg Trp Gly ValCys Trp Val Asn Phe Glu Ala355 360365Leu Ile Ile Thr Met Ser Val Val Gly Gly Thr Leu Leu Leu Gly Ile370 375 380Ala Ile Cys Cys Cys Cys Cys Cys Arg Arg Lys Arg Ser Arg Lys Pro385 390 395 400Asp Arg Ser Glu Glu Lys Ala Met Arg Glu Arg Glu Glu Arg Arg Ile405 410 415Arg Gln Glu Glu Arg Arg Ala Glu Met Lys Thr Arg His Asp Glu Ile420 425 430Arg Lys Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Glu Glu Asn Pro Tyr Ala Arg Phe435 440 445Glu Asn Asn450
<210>5<211>446<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>5Met Asp Pro Ala Glu Ala Val Leu Gln Glu Lys Ala Leu Lys Phe Met1 5 10 15Asn Ser Ser Glu Arg Glu Asp Cys Asn Asn Gly Glu Pro Pro Arg Lys20 25 30Ile Ile Pro Glu Lys Asn Ser Leu Arg Gln Thr Tyr Asn Ser Cys Ala35 40 45Arg Leu Cys Leu Asn Gln Glu Thr Val Cys Leu Ala Ser Thr Ala Met50 55 60Lys Thr Glu Asn Cys Val Ala Lys Thr Lys Leu Ala Asn Gly Thr Ser65 70 75 80Ser Met Ile Val Pro Lys Gln Arg Lys Leu Ser Ala Ser Tyr Glu Lys85 90 95Glu Lys Glu Leu Cys Val Lys Tyr Phe Glu Gln Trp Ser Glu Ser Asp100 105 110Gln Val Glu Phe Val Glu His Leu Ile Ser Gln Met Cys His Tyr Gln115 120 125His Gly His Ile Asn Ser Tyr Leu Lys Pro Met Leu Gln Arg Asp Phe130 135 140lle Thr Ala Leu Pro Ala Arg Gly Leu Asp His Ile Ala Glu Asn Ile145 150 155 160Leu Ser Tyr Leu Asp Ala Lys Ser Leu Cys Ala Ala Glu Leu Val Cys165 170 175
Lys Glu Trp Tyr Arg Val Thr Ser Asp Gly Met Leu Trp Lys Lys Leu180 185 190Ile Glu Arg Met Val Arg Thr Asp Ser Leu Trp Arg Gly Leu Ala Glu195 200 205Arg Arg Gly Trp Gly Gln Tyr Leu Phe Lys Asn Lys Pro Pro Asp Gly210 215 220Asn Ala Pro Pro Asn Ser Phe Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Lys Ile Ile225 230 235 240Gln Asp Ile Glu Thr Ile Glu Ser Asn Trp Arg Cys Gly Arg His Ser245 250 255Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Pro Gly Val Ala260 265 270Arg Gly Pro Thr Pro Tyr Trp Arg Leu Arg Leu Gly Gly Ala Ala Leu275 280 285Leu Leu Leu Leu Ile Pro Val Ala Ala Ala Gln Glu Pro Pro Gly Ala290 295 300Ala Cys Ser Gln Asn Thr Asn Lys Thr Cys Glu Glu Cys Leu Lys Asn305 310 315 320Val Ser Cys Leu Trp Cys Asn Thr Asn Lys Ala Cys Leu Asp Tyr Pro325 330 335Val Thr Ser Val Leu Pro Pro Ala Ser Leu Cys Lys Leu Ser Ser Ala340 345 350Arg Trp Gly Val Cys Trp Val Asn Phe Glu Ala Leu Ile Ile Thr Met355 360 365Ser Val Val Gly Gly Thr Leu Leu Leu Gly Ile Ala Ile Cys Cys Cys370 375 380Cys Cys Cys Arg Arg Lys Arg Ser Arg Lys Pro Asp Arg Ser Glu Glu385 390 395 400Lys Ala Met Arg Glu Arg Glu Glu Arg Arg Ile Arg Gln Glu Glu Arg405 410 415Arg Ala Glu Met Lys Thr Arg His Asp Glu Ile Arg Lys Lys Tyr Gly420 425 430
Leu Phe Lys Glu Glu Asn Pro Tyr Ala Arg Phe Glu Asn Asn435 440 445<210>6<211>441<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>6Met Asp Pro Ala Glu Ala Val Leu Gln Glu Lys Ala Leu Lys Phe Met1 5 10 15Asn Ser Ser Glu Arg Glu Asp Cys Asn Asn Gly Glu Pro Pro Arg Lys20 25 30Ile Ile Pro Glu Lys Asn Ser Leu Arg Gln Thr Tyr Asn Ser Cys Ala35 40 45Arg Leu Cys Leu Asn Gln Glu Thr Val Cys Leu Ala Ser Thr Ala Met50 55 60Lys Thr Glu Asn Cys Val Ala Lys Thr Lys Leu Ala Asn Gly Thr Ser65 70 75 80Ser Met Ile Val Pro Lys Gln Arg Lys Leu Ser Ala Ser Tyr Glu Lys85 90 95Glu Lys Glu Leu Cys Val Lys Tyr Phe Glu Gln Trp Ser Glu Ser Asp100 105 110Gln Val Glu Phe Val Glu His Leu Ile Ser Gln Met Cys His Tyr Gln115 120 125His Gly His Ile Asn Ser Tyr Leu Lys Pro Met Leu Gln Arg Asp Phe130 135 140Ile Thr Ala Leu Pro Ala Arg Gly Leu Asp His Ile Ala Glu Asn Ile145 150 155 160
Leu Ser Tyr Leu Asp Ala Lys Ser Leu Cys Ala Ala Glu Leu Val Cys165 170 175Lys Glu Trp Tyr Arg Val Thr Ser Asp Gly Met Leu Trp Lys Lys Leu180 185 190Ile Glu Arg Met Val Arg Thr Asp Ser Leu Trp Arg Gly Leu Ala Glu195 200 205Arg Arg Gly Trp Gly Gln Tyr Leu Phe Lys Asn Lys Pro Pro Asp Gly210 215 220Asn Ala Pro Pro Asn Ser Phe Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Lys Ile Ile225 230 235 240Gln Asp Ile Glu Thr Ile Glu Ser Asn Trp Arg Cys Gly Arg His Ser245 250 255Gly Gly Gly Gly Ser Met Ala Pro Gly Val Ala Arg Gly Pro Thr Pro260 265 270Tyr Trp Arg Leu Arg Leu Gly Gly Ala Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ile275 280 285Pro Val Ala Ala Ala Gln Glu Pro Pro Gly Ala Ala Cys Ser Gln Asn290 295 300Thr Asn Lys Thr Cys Glu Glu Cys Leu Lys Asn Val Ser Cys Leu Trp305 310 315 320Cys Asn Thr Asn Lys Ala Cys Leu Asp Tyr Pro Val Thr Ser Val Leu325 330 335Pro Pro Ala Ser Leu Cys Lys Leu Ser Ser Ala Arg Trp Gly Val Cys340 345 350Trp Val Asn Phe Glu Ala Leu Ile Ile Thr Met Ser Val Val Gly Gly355 360 365Thr Leu Leu Leu Gly Ile Ala Ile Cys Cys Cys Cys Cys Cys Arg Arg370 375 380Lys Arg Ser Arg Lys Pro Asp Arg Ser Glu Glu Lys Ala Met Arg Glu385 390 395 400Arg Glu Glu Arg Arg Ile Arg Gln Glu Glu Arg Arg Ala Glu Met Lys405 410 415
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165170 175Lys Glu Trp Tyr Arg ValThr Ser Asp Gly Met Leu Trp Lys Lys Leu180185 190Ile Glu Arg Met Val Arg Thr Asp Ser Leu Trp Arg Gly Leu Ala Glu195 200 205Arg Arg Gly Trp Gly Gln Tyr Leu Phe Lys Asn Lys Pro Pro Asp Gly210 215 220Asn Ala Pro Pro Asn Ser Phe Tyr Arg Ala Leu Tyr Pro Lys Ile Ile225 230 235 240Gln Asp Ile Glu Thr Ile Glu Ser Asn Trp Arg Cys Gly Arg His Ser245 250 255Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Arg Ala Glu Met Lys Thr260 265 270Arg His Asp Glu Ile Arg Lys Lys Tyr Gly Leu Phe Lys Glu Glu Asn275 280 285Pro Tyr Ala Arg Phe Glu Asn Asn290 295<210>8<211>1341<212>DNA<213>人工序列<220>
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1.具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白，是通过连接肽在PBF或由PBF羧基端的第1-30位氨基酸残基组成的多肽的氨基端连接β-TrCP自氨基端第1-256位氨基酸残基的融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于所述连接肽的氨基酸残基序列为序列表中SEQ ID NO1或1-3个SEQ ID NO2所示的重复序列。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白是下述氨基酸残基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO3；2)序列表中的SEQ ID NO4；3)序列表中的SEQ ID NO5；4)序列表中的SEQ ID NO6；5)序列表中的SEQ ID NO7；6)将序列表中SEQ ID NO3-7的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有抑制PTTG表达作用的蛋白质。
4.编码权利要求1或2或3所述具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白的基因。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于所述基因是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO8的DNA序列；2)序列表中SEQ ID NO9的DNA序列；3)序列表中SEQ ID NO10的DNA序列；4)序列表中SEQ ID NO11的DNA序列；5)序列表中SEQ ID NO12的DNA序列；5)编码序列表中SEQ ID NO3-7的DNA序列；6)与序列表中SEQ ID NO8-12限定的核苷酸序列具有90％以上同源性且具有抑制PTTG表达作用的核苷酸序列；7)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO8-12限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
6.含有权利要求4或5所述基因的表达载体、转基因细胞系和宿主菌。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于所述重组表达载体中具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白基因的5’端还连接有His-tag或FLAG-tag编码序列；用于构建含有所述具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白基因的重组表达载体的出发载体为pET-32a、pET-28a、pET-28b、pET-28c、pET-21a(+)、pET-30a、pCMV5、pSilence1.0-U6、pcDNA、pEGFP-N1、pSV40、pCI-neo、pTEF1、pPICZα、pAM82或pAAh5；以pET-32a为出发载体，构建的含有所述具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白基因的重组表达载体为pET32a-βTrCP-PBF、pET32a-βTrCP-PBF3、pET32a-βTrCP-PBF2、pET32a-βTrCP-PBF1或pET32a-βTrCP-PBF30；以pCMV5为出发载体，构建的含有所述具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白基因的重组表达载体为pCMV5-β-TrCP-PBF、pCMV5-β-TrCP-PBF3、pCMV5-β-TrCP-PBF2、pCMV5-β-TrCP-PBF1或pCMV5-β-TrCP-PBF30。
8.一种表达权利要求1或2或3所述的具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白的方法，是将权利要求6或7所述含有具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白基因的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白；所述宿主为大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞或枯草杆菌。
9.权利要求1或2或3所述的具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白在制备治疗PTTG阳性肿瘤及与PTTG过表达相关疾病药物中的应用。
10.权利要求3或4所述的具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白基因在制备治疗PTTG阳性肿瘤及与PTTG过表达相关疾病药物中的应用；所述具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白基因存在于真核表达载体中；所述含有具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白基因的重组表达载体为pCMV5-β-TrCP-PBF、pCMV5-β-TrCP-PBF3、pCMV5-β-TrCP-PBF2、pCMV5-β-TrCP-PBF1或pCMV5-β-TrCP-PBF30。
全文摘要
本发明公开了一种具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白及其编码基因与应用。其目的是提供一种具有抑制PTTG表达作用的融合蛋白及其编码基因与其在制备治疗PTTG阳性肿瘤药物中的应用。该融合蛋白是通过连接肽在PBF或由PBF羧基端的第1－30位氨基酸残基组成的多肽的氨基(N)端连接β－TrCP自氨基端第1－256位氨基酸残基的融合蛋白。本发明的融合蛋白β－TrCP－PBF及其编码基因将在PTTG的功能研究和制备治疗PTTG阳性肿瘤及与PTTG过度表达有关的疾病的药物中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号A61P35/00GK1995065SQ20061016970
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月27日 优先权日2006年12月27日
发明者蒋宇扬, 谢振华, 莫卓华, 李文鹏 申请人:清华大学深圳研究生院