基于茶的发酵饮料和茶饮料的制作方法

专利名称：：基于茶的发酵饮料和茶饮料的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基于茶的发酵饮料和茶饮料。
背景技术：
：以下内容是迄今已知的。(1)传统的茶叶发酵，以及包括碁石(goishi)茶、普洱茶、miang茶等的发酵茶。(2)通过以下方法获得的发酵绿茶将可以在茶叶中增殖的乳芽孢杆菌属的植物乳芽孢杆菌(Lactobacillusplantarum)种的细菌(乳酸菌)从茶叶中分离出来，在液体培养基中培养；将茶叶用热水浸渍，冷却，用培养的细菌接种并发酵预定的时间(专利文献l)。(3)用酵母和细菌在简单的生产条件下和相对较短的生产时间内，可以从茶或咖啡生产大量发酵饮料的方法(专利文献2)。(4)当病原体附着粘膜时，粘膜免疫是采取的首要的感染防御机制(非专利文献1)。(5)粘液中的分泌型IgA(S-IgA)对病原体，例如细菌、病毒等具有防御活性(非专利文献2和3),并中和由微生物产生的毒素(非专利文献4)。[专利文献l]日本专利2876006[专利文献2]日本未审专利申请公开1997-220054[非专利文献1]Brandtzaeg，P.Curr.Top.Microbiol.Immunol.146:13，1989[非专利文献2]Czinn,S，J.etal.,Vaccine11:637，1993[非专利文献3〗Renegar，K.etal.,J.Immunol.146:1972,1991[非专利文献4]Brandtzaeg,P.，APMIS103:1，1995;Kilian,M.etal.，Microbiol.Rev.52:296，1988
发明内容本发明将要解决的问题本发明的目的在于提供用乳芽孢杆菌属植物乳芽孢杆菌中的细菌(乳酸菌)发酵的茶，以及含有该细菌的茶，所述茶具有较强的促进IgA产生的活性，这是之前未知的。解决技术问题的方法本发明的发明人先前已经发现乳酸菌的两个新种，即Lactobacillus(乳芽孢杆菌)ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)，他们可以显示出优良的粘膜免疫刺激活性和生物防御机制促进活性，并可用作益生菌，并且本发明的发明人提交了关于这些乳酸菌的发明专利申请(日本专利申请No.2003-297570，PCT/JP2004/012136)。本发明的发明人进行了进一步的深入研究，并发现，当先前发现的新的乳酸菌加入到茶提取物中时，在保持其优良的促进IgA产生活性和粘膜免疫刺激活性的同时，对茶本身的味道或香味没有不良影响。本发明的发明人进一步发现，这些乳酸菌的发酵(培养，增殖)可以容易地在茶提取物中进行，并且，这样获得的基于茶的发酵饮料保持了茶本身的味道和香味而无不良影响，并可以显示出得自这些乳酸菌的优良的促进IgA产生活性和粘膜免疫刺激活性。本发明的完成是基于这些发现的进一步研究的结果。本发明提供下列项目1-23。1.基于茶的发酵饮料，包含用至少一种选自由Lactobacillus(乳芽孢杆菌)ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌发酵的基于茶的发酵液。2.根据项目l的基于茶的发酵饮料，进一步包含茶提取物。3.根据项目1或2的基于茶的发酵饮料，其中包含的乳酸菌的量可有效刺激粘膜免疫。4.根据项目1或2的基于茶的发酵饮料，其中包含的乳酸菌的量可有效促进IgA的产生。5.根据项目l或2的基于茶的发酵饮料，其中乳酸菌的含量为104cfu/ml至108cfu/ml。6.根据项目l或2的基于茶的发酵饮料，其中乳酸菌的含量为105cfu/ml至107cfu/ml。7.茶饮料，包括至少一种选自由乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌及茶提取物。8.根据项目7的茶饮料，其中包含的乳酸菌的量可有效刺激粘膜免疫。9.根据项目7的茶饮料，其中包含的乳酸菌的量可有效促进IgA的产生。10.根据项目7的茶饮料，其中乳酸菌的含量为104cfu/ml至108cfu/ml。11.根据项目7的茶饮料，其中乳酸菌的含量为105cfu/ml至107cfu/ml12.生产项目1的基于茶的发酵饮料的方法，包括在含茶培养基中培养至少一种选自由乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌的步骤。13.根据项目12的方法，进一步包括将基于茶的发酵饮料的乳酸菌含量调节至104cfu/ml-108cfu/ml的步骤。14.根据项目12或13的方法，其中含茶培养基是可以包括任选组分，并具有0.10-0.50的来自茶的白利度的茶提取物，并且其中的培养在25-5(TC进行12-32小时。15.根据项目12或13的方法，其中含茶培养基是可以包括任选组分，并具有0.18-0.30的来自茶的白利度的茶提取物，并且其中的培养在30-40'C进行15-20小时。16.生产项目2的基于茶的发酵饮料的方法，包括以下步骤(1)在含茶培养基中培养至少一种选自由乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌，从而获得基于茶的发酵液；以及(2)向步骤(1)中获得的基于茶的发酵液中加入茶提取物。17.根据项目16的方法，其中，在步骤(2)中，将茶提取物加至基于茶的发酵液中，以使最终的基于茶的发酵饮料具有0.10-0.50的来自茶的白利度，以及10、fu/ml至10Scfu/ml的乳酸菌含量。18.生产项目7的茶饮料的方法，包括将至少一种选自由乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌与茶提取物混合的步骤。19.根据项目18的方法，其中将茶提取物与乳酸菌混合，以使最终的茶饮料具有0.10-0.50的来自茶的白利度，以及104cfu/ml至108cfu/ml的乳酸菌含量。20.至少一种选自由乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌在生产具有粘膜免疫刺激活性的基于茶的发酵饮料中的应用。21.至少一种选自由乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌在生产具有促进IgA产生活性的基于茶的发酵饮料中的应用。22.至少一种选自由乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌在生产具有粘膜免疫刺激活性的茶饮料中的应用。23.至少一种选自由乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌在生产具有促进IgA产生活性的茶饮料中的应用。在本发明的基于茶的发酵饮料和茶饮料中，传统茶的味道得以完好保存。尤其是，尽管经过发酵，但本发明的基于茶的发酵饮料却仅有少许或者没有传统发酵茶等所特有的发酵的气味或味道。本发明的基于茶的发酵饮料和茶饮料促进IgA产生，并刺激粘膜免疫。以下对用于本发明的基于茶的发酵饮料和茶饮料的具体乳酸菌，及本发明的基于茶的发酵饮料和茶饮料本身进行详细描述。乳酸菌菌株新近通过下文所述分离和筛选过程从天然产物中分离并获得用于本发明的基于茶的发酵饮料和茶饮料的乳酸菌菌株，并由本发明的发明人保藏。这些菌株被称为乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)(以下有时总称为"ONRIC乳酸菌")。(1)筛选(1-1)微生物来源采用的微生物来源是分离自人的肠道内容物、植物食品和动物食品的乳酸菌，并保藏在OtsukaPharmaceuticalCo.,Ltd.公司的OtsuNutraceuticalsResearchInstitute石开究所。(1-2)筛选过程以诱导IgA产生的能力为指标，用小鼠Peyer氏斑(淋巴集结)细胞培养系统进行目标菌株的筛选。筛选的详细过程详细描述在以下的测试实施例1中。(2)通过筛选获得的微生物(2-1)乳芽孢杆菌ONRICb0239(a)宏观特征(a-1)MRS琼脂培养基圆形至轻微不规则，半球状，光滑，乳白色(a-2)BL琼脂培养基圆形至轻微不规则，半球状，光滑，白褐色(b)微观特征杆菌，不运动，无孢子(c)最佳生长温度30-33。C(d)生理生化特征革兰氏染色阳性糖的利用甘油—赤藓醇—D-阿拉伯糖—L-阿拉伯糖—核糖±D-木糖L-木糖—核糖醇—/3-甲基-D-木糖苷—半乳糖+D-葡萄糖+D-果糖+D-甘露糖+L-山梨糖—鼠李糖—卫矛醇—肌醇一甘露醇一山梨醇+a-甲基-D-甘露糖苷+a-甲基-D-葡萄糖苷N-乙酰基-葡萄糖胺+苦杏仁苷(Amygdalin)+熊果苷+七叶苷+水杨苷+纤维素二糖+麦芽糖+乳糖+蜜二糖+蔗糖+海藻糖+菊糖—松三糖一D-蜜三糖+美沙酮—糖原—木糖醇—^-龙胆二糖+D-松二糖一D-来苏糖一D-塔格糖—D-岩藻糖一L-岩藻糖_D-阿糖醇L-阿糖醇一葡糖酸盐—2-酮-葡糖酸盐一5-酮-葡糖酸盐—由上述多种特征，根据伯杰氏系统细菌学手册(Bergey'sMa皿alofSystematicBacteriology)所示标准将获得的分离物鉴定为植物乳芽孢杆菌(Lactobacillusplantarum)菌株，并命名为乳芽孢杆菌ONRICb0239，于2003年8月6日委托位于日本AISTTsukubaCentral6,1-1,Higashi1-ChomeTsukuba-Shi,Ibaraki-ken的独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(Independentadmininstrativecorporation,NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnologyInternationalPatentOrganismDepositary)保藏，保藏号为FERMP-19469。然后根据布达佩斯公约(BudapestTreaty)，其被转移至国际保藏，获得的保藏号为FERMBP-10064。(2-2)乳芽孢杆菌ONRICb0240(a)宏观特征(a-1)MRS琼脂培养基圆形至轻微不规则，半球状，光滑，乳白色(a-2)BL琼脂培养基圆形至轻微不规则，半球状，光滑，白褐色(b)微观特征杆菌，不运动，无孢子(c)最佳生长温度30-33°C(d)生理生化特征革兰氏染色阳性糖的利用甘油一赤藓醇一D-阿拉伯糖一L-阿拉伯糖一核糖±D-木糖一L-木糖—核糖醇—甲基-D-木糖苷—半乳糖+D-葡萄糖+D-果糖+D-甘露糖+L-山梨糖鼠李糖卫矛醇±肌醇—甘露醇+山梨醇+a-甲基-D-甘露糖苷一a-甲基-D-葡萄糖苷一N-乙酰基-葡萄糖胺+苦杏仁苷+熊果苷+七叶苷+水杨苷+纤维素二糖+麦芽糖+乳糖+蜜二糖+蔗糖+海藻糖—菊糖—松三糖—D-蜜三糖+美沙酮—糖原一木糖醇一/3-龙胆二糖+D-松二糖—D-来苏糖一D-塔格糖一D-岩藻糖—L-岩藻糖—D-阿糖醇—L-阿糖醇葡糖酸盐2-酮-葡糖酸盐5-酮-葡糖酸盐—由上述多种特征，根据伯杰氏系统细菌学手册(Bergey'sManualofSystematicBacteriology)所示标准将获得的分离物鉴定为植物乳芽孢杆菌菌株，并命名为乳芽孢杆菌ONRICb0240，于2003年8月6日委托《立于日本AISTTsukubaCentral6，1-1,Higashil-ChomeTsukuba-Shi，Ibaraki-ken的独立行政法人产业技术综合研究所特许生物保藏中心(Independentadmininstrativecorporation,NationalInstituteofAdvancedIndustrialScienceandTechnologyInternationalPatentOrganismDepositary)保藏，保藏号为FERMP-19470。然后根据布达佩斯公约(BudapestTreaty)，其被转移至国际保藏，获得的保藏号为FERMBP-10065。ONRIC乳酸菌实现的显著的粘膜免疫刺激作用和促进IgA产生被认为如下所述发生的肠道免疫系统的组成成分Peyer氏斑M细胞摄取肠腔内的抗原。抗原呈递细胞，例如树突细胞将该抗原呈递给CD4T细胞。当未成熟B细胞通过T细胞的抗原特异性反应成熟形成IgA抗体产生细胞时，B细胞迁移至粘膜固有层，最终分化成IgA抗体产生细胞。尽管不清楚ONRIC乳酸菌如何参与促进IgA产生的机制，但至少Peyer氏斑M细胞摄取的抗原由于ONRIC乳酸菌的存在是促进IgA产生所必需的。因此推测，ONRIC乳酸菌起到了这样一种抗原的作用。作为抗原起作用，ONRIC乳酸菌不必是活细胞。细胞可以通过常规热灭菌程序灭菌。基于茶的发酵饮料本发明的基于茶的发酵饮料包括作为必要成分的至少一种选自由乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌(ONRIC乳酸菌)的基于茶的发酵液。为必要成分的基于茶的发酵液可以通过在含茶培养基中培养ONRIC乳酸菌来制备。本发明的基于茶的发酵液包括这样培养的ONRIC乳酸菌。在本发明中，可以不经修饰而使用培养后包含ONRIC乳酸菌的含茶培养基作为本发明的基于茶的发酵液。本说明书中，含茶培养基可以是含有适当溶剂(优选冷或热水)和茶叶和/或茶叶粉(例如，粉末)；通过用适当溶剂(优选冷或热水)提取茶叶和/或茶叶粉而制得的茶提取物；或者在适当溶剂(优选冷或热水)中含有通过用喷雾干燥器等将茶提取物制成粉末而得到的粉末(提取物粉)等的培养基。可用作培养基原料的茶(茶叶，茶(TeaSinensis))的例子包括绿茶，例如煎茶(sen-cha，中级绿茶)、玉露茶(gyokuro，高品质绿茶)、茎茶(twigtea)、粉茶、番茶(劣质茶)、焙茶(烘烤的绿茶)、玄米茶(gen-mai-cha，有完整大米的茶)、抹茶(绿茶粉)等；红茶(英国茶)、乌龙茶、黑色茶(普洱茶、miang茶、碁石茶，等)；以及使用其它植物的类茶饮料，例如草药茶(herbtea)、rooibos茶、甜茶、甘茶等。这些茶可以单独或组合使用。这些茶的具体例子包括铁观音茶、色种茶、水仙茶、黄金桂茶、煎茶、被茶(kabuse)等。当用含有一种或多种上述种类的茶和/或叶粉的冷水、热水等作为含茶培养基时，对培养基中包含的茶叶和/或茶叶粉的量没有限制；然而，通常以这样的方式选择茶叶和/或茶叶粉的量，g卩，使所得培养基的来自茶的白利度范围为0.10-0.50，并优选0.18-0.30。"白利度"通常表示每100g溶液中含有的可溶性固形物的重量(g)，用示差光密度计(例如，AtagoCo.Ltd.生产的DD-5数字示差光密度计)、折光计等测量。当有多种可溶性固体溶解在溶液中时，白利度通常以其总可溶性固形物重量表示。然而，在本说明书中，"来自茶的白利度"是指仅由来自茶的可溶性固体获得的白利度。换言之，"来自茶的白利度"表示每100g含茶培养基、茶提取物、饮料成品等含有的来自茶的可溶性固形物重量(g)。当用一种或多种上述种类的茶和/或叶粉的叶提取物作为含茶培养基时，可以使用通过以茶通常适用的相同方式用冷或热水提取这些茶叶而获得的提取物。提取物的浓度不受限制，然而，通常这样选择，即，使来自茶的白利度为0.10-0.50，并优选0.18-0.30。当用含有获自一种或多种上述种类的茶的叶的粉提取物的冷或热水作为含茶培养基时，可用的粉提取物的具体例子包括FD绿茶提取物粉、FD茉莉花茶提取物粉、FD乌龙茶提取物粉(这3种提取物粉由San-EiGenFFI生产)；大麦茶提取物粉、红茶提取物粉、绿茶提取物粉(这3种提取物粉由TakasagoInternationalCorporation生产)等。这些提取物粉可以溶解在冷或热水中的水溶液的形式用作培养基。加至冷或热水中的粉提取物的量不受限制，然而，通常这样选择，即，使所得水溶液的来自茶的白利度在0.10-0.50，优选0.18-0.30的范围内。本发明的基于茶的发酵液可以通过，例如，将ONRIC乳酸菌接种至含茶培养基，使该培养基含有104-108cfU/ml的ONRIC乳酸菌，然后将培养基在25-50'C培养12-32小时而获得。对于用ONRIC乳酸菌培养(发酵)，优选事先通过将乳酸菌接种至适宜的发酵培养基制备引子。这种引子的代表性例子是通过将冷藏细胞体、冻干细胞体等形式的ONRIC乳酸菌接种至预先用常规方法在90-12rC灭菌5-20分钟的培养基，例如MRS培养基或10%脱脂奶粉培养基而获得的培养物。这样制备的引子通常每克培养物含有约104至约107cfu的ONRIC乳酸菌。用于引子的发酵培养基可以任选添加确保ONRIC乳酸菌良好生长的发酵促进物质，例如，各种碳源，如葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、山梨醇、果糖等；氮源，如蛋白胨等；维生素；以及矿物质。关于培养条件，发酵温度通常在约25至约50'C，优选约30至约4(TC的范围内进行选择，并且发酵时间在约12至约32小时，优选约15至约20小时的范围内选择。尤其优选的培养条件是33'C、16小时。ONRIC乳酸菌培养(发酵)期间，可以在含茶培养基中添加适量的任选组分，例如适合乳酸菌维持和生长的营养素等。具体例子包括在培养微生物的培养基中使用的营养素，例如，各种碳源，如葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、山梨醇、果糖等；氮源，如蛋白胨等；维生素；矿物质；微量元素(金属)；以及其它营养素。维生素的例子包括维生素B、维生素D、维生素C、维生素E和维生素K。微量元素的例子包括锌、硒等。其它营养素的例子包括各种低聚糖，例如低聚乳糖、大豆低聚糖、乳果糖、拉克替醇、低聚果糖和低聚半乳糖。这些低聚糖加入的量不受特别限制，但优选在使其在本发明的组合物中的浓度以重量计不大于约3%的范围内进行选择。这样获得的基于茶的发酵液可以不经修饰而用作本发明的基于茶的发酵饮料。本发明的基于茶的发酵饮料还可以通过将由冻干基于茶的发酵液制得的粉提取物溶解在水等中的方式生产。也可以通过浓縮或用水等稀释这样获得的基于茶的发酵液，或者通过向该基于茶的发酵液中加入茶提取物来获得本发明的基于茶的发酵饮料。这里，加入到基于茶的发酵液中的茶提取物与通过用适当溶剂(优选冷或热水)提取含茶培养基中使用的茶叶和/或茶叶粉而获得的茶提取物相同。也可以通过将用喷雾干燥器等将茶提取物制成粉末获得的粉末(粉提取物)溶解在冷水、热水等中而使用茶提取物。其浓度不受限制。在任一情况下，即，不管是使用基于茶的发酵液还是使用其冻干物，本发明的基于茶的发酵饮料中ONRIC乳酸菌的含量适当地在约104至约108cfu/mL，优选约105至约107cfu/mL的范围内进行选择。乳酸菌含量可以通过改变含茶培养基的培养条件、接种的细胞数等，或者通过浓縮或稀释基于茶的发酵液来进行控制。当使用基于茶的发酵液的粉提取物时，ONRIC乳酸菌的含量可以通过改变加入的粉提取物的量来控制。当通过将基于茶的发酵液与茶提取物混合来生产本发明的基于茶的发酵饮料时，基于茶的发酵液和茶提取物的含量都不受限制，并可以适当地以这样一种方式进行选择，g卩，由这两种成分混合产生的本发明的基于茶的发酵饮料含有的乳酸菌在例如104至108cfWmL，优选105至10、fu/mL的范围内，并且该基于茶的发酵饮料的来自茶的白利度在0.10-0.50，更优选0.18-0.30的范围内。这里，cfu(集落形成单位)表示由以下方法测得的活细胞计数，并且并不意味着该饮料实际含有这样的活细胞数。换言之，本发明的饮料在制成成品之前可以经常规热灭菌程序灭菌，因此成品中不需要存在活细胞。在这种情况下，产品含有与灭菌前测得的活细胞计数相等的死细胞，从而达到本发明预期的效果。本说明书中，饮料中经历灭菌的细胞数由灭菌前测得的活细胞计数表示。<乳酸菌数的测量>通过用含BCP的平板计数琼脂培养基在33X:进行倾注培养，并对形成的菌落计数来测定活细胞计数。由于活细胞计数与浊度彼此相关，如果预先已测定活细胞计数与浊度的关系，则可以通过测定浊度而不是计活细胞数来计算活细胞计数。加入本发明的基于茶的发酵饮料的ONRIC乳酸菌的量可以根据要生产的饮料的类型、所用乳酸菌的种类等，利用上文提及的范围为指导适当地进行调整。如果必要，本发明的基于茶的发酵饮料可以常见食品和饮料的方式进一步包括适当的可食用载体(食品原料)。这样，便获得了本发明的基于茶的发酵饮料。这样获得的本发明的基于茶的发酵饮料可以无菌分装至适宜容器，以提供成品。这样获得的产品具有茶所固有的香味，以及可归因于ONRIC乳酸菌的粘膜免疫刺激活性或促进IgA产生的活性。本发明的基于茶的发酵饮料的用量(摄取量)可以根据受者的年龄、性别、体重和疾病的严重度等适当地进行选择，而无特别限制。通常，本发明的基于茶的发酵饮料可以相当于每天约106至约101Qcfu的活细胞计数的量给予人体，所述活细胞计数以ONRIC乳酸菌数计算。因此，根据饮料的活细胞计数，优选本发明的基于茶的发酵饮料的摄入量为约50至约1,000mL/天。本发明还提供了至少一种类型的选自由乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌在生产具有粘膜免疫刺激活性或促进IgA产生活性的基于茶的发酵饮料中的应用。茶饮料本发明还提供了含有至少一种选自由乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌的茶饮料。该茶饮料含有作为必要成分的这种乳酸菌和茶提取物。在这里，ONRIC乳酸菌可以是分离自用于获得本发明的基于茶的发酵饮料的茶发酵液的细胞体，或其冻干物。用于生产本发明的茶饮料的乳酸菌可以是含有在适当无茶培养基中培养的ONRIC乳酸菌的培养液的形式，或者可以是分离自这种培养液的细胞体或其冻干物的形式。无茶培养基的例子包括作为发酵原料的上述MRS培养基，10%脱脂奶粉培养基和其它常用于培养乳酸菌的营养培养基，以及液体，包括，例如得自蔬菜或水果的液体、豆乳(大豆乳化液)等。用于生产本发明的茶饮料的乳酸菌可以是通过在液体中培养ONRIC乳酸菌而获得的发酵液(培养液)，或用该发酵液获得的这种培养物的粗品或纯品，及其冻干物的形式。用作发酵原料的蔬菜和水果包括切断物(cuttings)、破碎物(crushings)、磨碎物(grindings)、搾汁、酶处理产物及其稀释物和浓縮物。可用的蔬菜包括，例如南瓜、胡萝卜、西红柿、甜椒、芹菜、菠菜、有色甘薯、玉米、甜菜、羽衣甘蓝、欧芹(parseley)、巻心菜和椰菜。可用的水果包括，例如苹果、桃、香蕉、草莓、葡萄、西瓜、脐橙和中国柑桔(mandarinoranges)。蔬菜或水果的切断物(cuttings)、破碎物(cmshings)或磨碎物(grindings)可以通过例如包括如下的程序获得洗涤至少一种蔬菜和/或水果，必要时，将其进行热烫处理，例如放置在热水中，然后用破碎机、搅拌器、食品加工机、粉碎机、MycolloiderTM(TokushuKikaKogyoCo.Ltd.公司产品)等将其切断、粉碎或研磨。搾汁可以通过用压滤机、榨汁-混合机等制备。榨汁还可以通过将磨碎物通过滤布等过滤来制备。酶处理产品可以通过允许纤维素酶、果胶酶、原果胶酶等对切断物(cuttings)、破碎物(crushings)、磨碎物(grindings)或搾汁进行作用来制备。稀释物包括l-50倍的水稀释物。浓縮物包括通过冷冻冷縮、减压浓縮等方法浓縮1-100倍的浓缩物。发酵原料的另一个具体例子豆乳可以用大豆原料经常规方法制备。这种豆乳的例子包括通过将去皮大豆浸泡在水中，用适宜的粉碎机，例如胶体粉碎机将大豆湿法粉碎，并用常规方法使碎粉匀浆化而制得的匀浆，及水溶性大豆蛋白的水溶液。对于用乳酸菌发酵而言，优选事先制备引子，并用该引子接种发酵原料。这种引子的代表性例子是通过将ONRIC乳酸菌接种至已预先用常规方法在90-12rC灭菌5-20分钟的添加有发酵原料的10%脱脂奶粉培养基中，然后培养ONRIC乳酸菌而获得的培养物。这样制备的引子通常每克培养物含有约107至约10、fu的ONRIC乳酸菌。用于引子的发酵原料可以任选添加确保ONRIC乳酸菌良好生长的促进发酵的物质，例如，各种碳源，如葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、山梨醇、果糖等；氮源，如蛋白胨等；维生素；以及矿物质。关于培养条件，发酵温度通常在约20至约45"，优选约25至约37。C的范围内进行选择，并且发酵时间在约10至约30小时的范围内选择。本发明的茶饮料的另一种必要成分，即茶提取物与生产上述本发明的基于茶的发酵饮料时加入到基于茶的发酵液中的茶提取物相同。ONRIC乳酸菌和茶提取物的含量都不受限制，并可以适当地以这样一种方式进行选择，即，由这两种必要成分混合产生的本发明的茶饮料含有的乳酸菌在例如10、fu/mL至108cfu/mL，优选1()Scfu/mL至10、fWmL的范围内，并且该茶饮料的来自茶的白利度在0.10-0.50，更优选0.18-0.30的范围内。由此获得了本发明的茶饮料。这样获得的本发明的茶饮料可以无菌分装至适宜的容器，以提供成品。这样获得的产品具有茶所固有的香味，以及可归因于ONRIC乳酸菌的粘膜免疫刺激活性或促进IgA产生的活性。本发明的茶饮料的用量(摄取量)可以根据受者的年龄、性别、体重和疾病的严重度等适当地进行选择，而无特别限制。通常，本发明的茶饮料可以相当于每天约106至约1(^cfu的活细胞计数的量给予人体，所述活细胞计数以ONRIC乳酸菌数计算。因此，根据饮料的活细胞计数，优选本发明的茶饮料的摄入量是约50至约1,000mL/天。本发明还提供了至少一种类型的选自由乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌在生产具有粘膜免疫刺激活性或促进IgA产生活性的茶饮料中的应用。本发明的作用本发明提供了保持茶本身的味道和香味而未受不良影响，并具有优良的促进IgA产生的活性和粘膜免疫刺激活性的基于茶的发酵饮料和茶饮料。由于优良的促进IgA产生的活性和粘膜免疫刺激活性，故推测这些饮料的摄入能增强生物防御。不同味道和香味，例如淡香和清爽酸味，淡香和纯正口味，或暗褐色和温和味道可以通过利用不同种类的茶叶作为原料和/或不同比例的基于茶的发酵液、茶提取物等赋予本发明的基于茶的发酵饮料和茶饮料。本发明的饮料始终具有茶所固有的令人愉快的香味和味道。图1是显示给予乳芽孢杆菌ONRICb0240对Peyer氏斑细胞IgA产生的影响的图表。图2是显示给予乳芽孢杆菌ONRICb0240对IgG产生的影响的曲线图。图3是显示给予乳芽孢杆菌ONRICb0240(非活细胞)(相当于2xl0、fu/天)后第21天，人唾液中S-IgA总量的变化的图表。实施本发明的最佳模式以下提供的是描述本发明的基于茶的发酵饮料和茶饮料的生产工艺的实施例，以及对用于本发明的基于茶的发酵饮料和茶饮料的特定乳酸菌的测试实施例。实施例和测试实施例的提供是为了更详细地说明本发明，而不希望限制本发明的范围。实施例和测试实施例中，除非另有说明，百分数均以重量计。实施例1基于茶的发酵饮料的生产工艺1(1)冷冻保存的细菌细胞的生产前预培养将100pL在-8(TC冷冻保存的乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)解冻，并加至lOmL已在高压灭菌器内于121"C灭菌15分钟的MRS液体培养基(Difco生产)中。将所得混合物在33。C静置培养16小时，制备乳芽孢杆菌ONRICb0240的前预培养液(细胞计数约109cfu/mL)预培养将以上制得的前预培养液IOOpiL接种至10mL已在高压灭菌器内于12rC灭菌15分钟的MRS液体培养基(Difco生产)中，然后在33'C静置培养16小时，以制备乳芽孢杆菌ONRICb0240的预培养液(细胞计数约109cfu/mL)。培养将以上制得的预培养液10mL接种至1L已在高压灭菌器内于121。C灭菌15分钟的MRS液体培养基(Difco生产)中，然后在33匸静置培养16小时，以制备乳芽孢杆菌ONRICb0240的培养液(细胞计数约109cfu/mL)。收集和洗涤将1L培养液在11000rpm下离心IO分钟，以收集细菌细胞，然后用已在高压灭菌器内于121。C灭菌15分钟的磷酸盐缓冲盐水洗涤。进一步进行离心，收集细菌细胞。再次用已灭菌的磷酸盐缓冲盐水洗涤收集的细菌细胞，并离心收集。单独将2g绿茶提取物粉(San-EiGenF.F.I.,Inc.)溶解在1000g去离子水中。将该溶液置于高压灭菌器内于121'C灭菌15分钟，将收集的细菌细胞悬浮于该溶液中，并在-80'C保存该悬浮液。这样获得的冷冻保存的细菌细胞的细胞计数为1.6X109cfu/mL。(2)基于茶的发酵饮料的生产向2000g去离子水中加入3.4g绿茶提取物粉(San-EiGenF.F.I.,Inc.)，并加热至6(TC，在相同温度下搅拌IO分钟，使提取物溶解。所得溶液冷却至室温，并将2000mL该溶液转移至无菌试剂瓶中。该溶液来自茶的白利度为0.32。将200AtL冷冻保存的乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065，细胞计数1.6X109cfu/mL)接种至试剂瓶中。接种后于33'C加热试剂瓶内容物16小时，然后静置培养，以制备基于绿茶的发酵液。该液体的乳酸菌细胞计数为107cfu/mL。单独向20g乌龙茶(MitsuiNorinCo.,Ltd.)中加入1000mL温度为93。C的去离子水，以6分钟的间隔搅拌3次，g卩，分别在开始，中间和结束时搅拌。所得含茶叶的液体用不锈钢滤器过滤，滤液在冰浴上冷却至30'C或更低。冷却的滤液用2000mL去离子水稀释。所得茶提取物来自茶的白利度为0.24。以上制备的基于绿茶的发酵液1000mL与1000mL乌龙茶(茶提取物)混合。向混合物中加入500mg/L的维生素C。所得液体混合物经热灭菌后倒入适宜的容器中，制成本发明的基于茶的发酵饮料。这样制得的基于茶的发酵饮料具有淡香和清爽酸味。pH为5.2，细胞计数为5.2X106cfu/mL。下述测试实施例的试验显示，本发明的基于茶的发酵饮料具有优良的促进IgA产生活性和粘膜免疫刺激活性。实施例2基于茶的发酵饮料的生产工艺2(1)冷冻保存的细菌细胞的生产前预培养将100]LiL在-8(TC冷冻保存的乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)解冻，并加至10mL已在高压灭菌器内于121'C灭菌15分钟的MRS液体培养基(Difco生产)中。将所得混合物在33'C静置培养16小时，制备乳芽孢杆菌ONRICb0240的前预培养液(细胞计数约109cfu/mL)预培养将以上制得的前预培养液IOOptL接种至10mL已在高压灭菌器内于121'C灭菌15分钟的MRS液体培养基(Difco生产)中，然后在33'C静置培养16小时，以制备乳芽孢杆菌ONRICb0240的预培养液(细胞计数约109cfu/mL)。培养将以上制得的预培养液10mL接种至1L已在高压灭菌器内于121°。灭菌15分钟的MRS液体培养基(Difco生产)中，然后在33'C静置培养16小时，以制备乳芽孢杆菌ONRICb0240的培养液(细胞计数约109cfu/mL)。收集和洗涤将1L培养液在11000rpm下离心IO分钟，以收集细菌细胞，然后用已在高压灭菌器内于12rC灭菌15分钟的磷酸盐缓冲盐水洗涤。进一步进行离心，收集细菌细胞。再次用己灭菌的磷酸盐缓冲盐水洗涤收集的细菌细胞，并离心收集。单独将20g绿茶提取物粉(San-EiGenF.F.I.,Inc.)溶解在1000g去离子水中。将该溶液置于高压灭菌器内于12rC灭菌15分钟，将收集的细菌细胞悬浮于该溶液中，悬浮液冷冻干燥。这样获得的冷冻保存的细菌细胞的细胞计数为3.7X109cfU/g。(2)基于茶的发酵饮料的生产向2000g去离子水中加入4g绿茶提取物粉(San-EiGenF.F.I.,Inc.)，并加热至6(TC,在相同温度下搅拌10分钟，使提取物溶解。所得溶液冷却至室温，将2000mL该溶液转移至无菌试剂瓶中。该溶液来自茶的白利度为0.36。将25mg冻干的乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065，细胞计数3.7X109cfU/g)接种至试剂瓶中。于33'C加热接种后的试剂瓶内容物16小时，将细菌细胞静置培养(估计初始细胞计数5X107cfu/mL)。向这样获得的培养液中加入500mg/L的维生素C。所得液体混合物经热灭菌后倒入适宜的容器中，制成本发明的基于茶的发酵饮料。(3)基于茶的发酵饮料的质量评价所得基于茶的发酵饮料具有以下物理特性。<用冻干细菌获得的本发明的基于茶的发酵饮料>pH:4.75细胞计数4.1X106cfu/mL(按日本食品卫生法(JapaneseFoodSanitationLaw)测量乳酸菌计数的方法测定)浊度0.038(用Hitachi,Ltd.生产的U-3000分光光度计测量)乳酸含量14.8mg/100mL(用JASCO生产的高效液相柱色谱测定)乙酸含量0.6mg/100mL(用JASCO生产的高效液相柱色谱测定)柠檬酸含量1.2mg/100mL(用JASCO生产的高效液相柱色谱测定)来自茶的白利度0.24(用AtagoCo,Ltd.生产的DD-5数字示差折光计测量)感官评价茶香和酸味(取4'C的实验用茶作为样品进行评价)下述测试实施例的试验显示，本发明的基于茶的发酵饮料具有优良的促进IgA产生活性和粘膜免疫刺激活性。实施例3茶饮料的生产工艺1向40g乌龙茶(MitsuiNorinCo.，Ltd.)中加入1000mL温度为93'C的去离子水，以6分钟的间隔搅拌3次，g卩，分别在开始，中间和结束时搅拌。所得含茶叶的液体用不锈钢滤器过滤，滤液在冰浴上冷却至30'C或更低。所得茶提取物来自茶的白利度为0.96。单独将1mL冷冻保存的乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)细菌细胞(实施例1-(1)中制备)接种至1000mL含15%胡萝卜汁的水溶液中，然后在33C培养24小时。离心分离培养液，在6(TC灭菌10分钟或更长时间，制备含细菌浓縮液(细胞计数约101()cfu/mL)。将4mL乳芽孢杆菌ONRICb0240的含细菌浓縮液加入1000mL乌龙茶滤液(茶提取液)中。向所得液体混合物中加入500mg/L维生素C，用水稀释至总量为4000mL。将稀释的液体混合物倒入适宜容器，得到本发明的茶饮料产品。这样获得的茶饮料具有淡香和纯正口感。pH为5.5，细胞计数为2.6X107cfu/mL。下述测试实施例的试验显示，本发明的茶饮料具有优良的促进IgA产生的活性和粘膜免疫刺激活性。实施例4茶饮料的生产工艺2本发明的茶饮料的制备除了用普洱茶(MitsuiNorinCo.，Ltd.)替代乌龙茶作为起始原料，用乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMP-10064)(用实施例1-(1)的相同方法制备的冷冻保存的细菌细胞)代替乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMP-10065)外，其它均按照实施例3的程序进行。本发明的茶饮料显示暗褐色，具有温和味道和独特的香味。pH为5.5，细胞计数为2.6X107cfu/mL。下述测试实施例的试验显示，本发明的茶饮料具有优良的促进IgA产生的活性和粘膜免疫刺激活性。实施例5基于茶的发酵饮料的生产工艺3除了用乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMP-10064)代替乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMP-10065)夕卜，按照实施例2的程序制备本发明的基于茶的发酵饮料。本发明的基于茶的发酵饮料具有茶香和酸味。pH是5.0，细胞计数为4.0X106cfu/mL。下述测试实施例的试验显示，本发明的基于茶的发酵饮料具有优良的促进IgA产生的活性和粘膜免疫刺激活性。实施例6基于茶的发酵饮料的生产工艺4除了用红茶提取物粉代替绿茶提取物粉作为起始原料，用红茶代替乌龙茶并用乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMP-10064;冷冻保存细菌细胞)代替乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMP-10065)夕卜，按照实施例1的程序制备本发明的基于茶的发酵饮料。本发明的基于茶的发酵饮料保留了红茶的味道。pH为5.8,细胞计数为1.2X107cfu/mL。下述测试实施例的试验显示，本发明的基于茶的发酵饮料具有优良的促进IgA产生的活性和粘膜免疫刺激活性。测试实施例1本实施例中，根据Yasui等人和Ikenaga等人描述的方法[Yasui,H.，etal.，MicrobialEcologyinHealthandDisease,5,155(1992》Ikenaga，T.:etal.,MilkScience,51,27(2002)]，用Peyer氏斑细胞培养系统在体外测试了ONRIC乳酸菌诱导IgA产生的能力。测试程序如下。(1)实验动物使用SPE/VAFBALB/cAnNCrj近交系雌性小鼠。所得供试小鼠检疫一周。检疫期间随意提供MF固体食物(OrientalYeastCo.Ltd.产品)和自来水。(2)Peyer氏斑细胞培养法检疫期后，按各组平均体重基本相同的方式将80只小鼠分成8组，每组10只小鼠。分组后，每天处死IO只小鼠，取出小肠，并从小肠中解剖出Peyer氏斑。将Peyer氏斑置于含MEM[Eagle'sMEM(NISSUI产品)、2mM谷氨酰胺(GIBCO产品)、1mM丙酮酸钠(GIBCO产品)和MEM非必需氨基酸(GIBCO产品)]的离心管中，用冰冷却。使细胞通过筛孔，制备单细胞悬液，并用5mLMEM洗涤孔。过滤细胞悬液，在4'C以1,000转/分钟的速度离心10分钟。离心后，吸去培养上清液，沉淀悬浮在5mLMEM中。重复该程序两次后，沉淀悬浮在10mL含5%FBS(GIBCO产品)的MEM中，并对活的Peyer氏斑细胞进行计数。将细胞悬液接种至96孔板，以制备细胞培养板。(3)供试细胞的制备用乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)作为供试细胞。将这些细菌在适合其培养的培养基中培养至达到稳定生长期，然后所得培养物在7,000g离心10分钟(4°C)。细胞用PBS(-)洗涤3次，并悬浮在5mL生理盐水中。在660nm测定浊度，以确定细胞计数。然后细胞在IO(TC高压灭菌30分钟。660nm处测得的1.0的浊度相当于2.0xl(^个细胞/mL。(4)培养上清液中IgA浓度的测定以上(2)中制备的Peyer氏斑细胞悬浮在含5。/。FBS的MEM中，并调节至2.5xloe个细胞/mL,取200jtiL悬浮液接种至96孔细胞培养板。向培养板各孔中加入上述(3)中制备的浓度为2.0xl(^个细胞/mL的供试细胞悬液20/zL，在37'C于5%C02存在下培养7天。用20pL浓度为50pg/mL的脂多糖(LPS)代替20piL的上述细胞，作为阳性对照。随后用市场上可以买到的试剂盒通过酶联免疫吸附分析法(ELISA)测定所得培养上清液的总IgA浓度。(5)ONRIC乳酸菌的促进IgA产生的活性下表1以刺激指数(S丄)，g卩，上述(4)中测得的含ONRIC乳酸菌上清液的总IgA浓度以对照培养上清液的总IgA浓度为参照(l.O)的相对值的方式显示了ONRIC乳酸菌的促进IgA产生的活性，所述对照培养上清液通过向MEM中加入lOjitLPBS(-)，并以相似方式将无细胞培养基培养7天而制得。用各种已知乳酸菌进行的试验结果见表1-4。阳性对照(LPS50gg/mL)的试验结果标示为"阳性对照(LPS)"。表中"菌株号"下所示縮写代表下列微生物保藏单位ATCC:美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection);Manassas,VA，美国JCM:日本理化学研究所微生物系统保藏中心(JapancollectionofMicroorganism,TheInsitituteofPhysicalandChemicalResearch，RIKEN)NRIC:东京农业大学应用生物化学部菌株保藏中心(NODAICultureCollectionCenter,TokyoUniversityofAgriculture;Setagaya-ku，曰本东京表1<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>NRIC1963乳芽孢杆菌(Lactobacillus)干酪乳芽孢杆菌(casei)干酪乳芽孢杆菌干酪亚种(casei)1.05NRIC1968乳芽孢杆菌(Lactobacillus)干酪乳芽孢杆菌(casei)干酪乳芽孢杆菌干酪亚种(casei)1.07NRIC1975乳芽孢杆菌(Lactobacillus)弯曲乳芽孢杆菌(curvatus)1.02NRIC1976乳芽孢杆菌(Lactobacillus)弯曲乳芽孢杆菌(curvatus)1.14NRIC1977乳芽孢杆菌(Lactobacillus)弯曲乳芽孢杆菌(curvatus)1.04NRIC1978乳芽孢杆菌(Lactobacillus)弯曲乳芽孢杆菌(curvatus)1.11NRIC1979乳芽孢杆菌(Lactobacillus)弯曲乳芽孢杆菌(curvatus)0.99NRIC0191乳芽孢杆菌(Lactobacillus)德彼利氏乳芽孢杆菌(delbrueckii)德彼利氏乳芽孢杆菌保加利亚亚禾中(bulgaricus)1.07NRIC1682乳芽孢杆菌(Lactobacillus)德彼利氏乳芽孢杆菌(delbrueckii)德彼利氏乳芽孢杆菌乳酸亚种(lactis)1.12NRIC0129乳芽孢杆菌(Lactobacillus)发酵乳芽孢杆菌(fermentum)1.00NRIC0131乳芽孢杆菌(Lactobacillus)发酵乳芽孢杆菌(fermerituni)1.19NRIC0132乳芽孢杆菌(Lactobacillus)发酵乳芽孢杆菌(fermentum)1.03NRIC0135乳芽孢杆菌(Lactobacillus)发酵乳芽孢杆菌(fermentum)1.02NRIC0139乳芽孢杆菌(Lactobacillus)发酵乳芽孢杆菌(fermentum)1.14<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>表3<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>NRIC1980乳芽孢杆菌(Lactobacillus)罗伊氏乳芽孢杆菌(reuteri)1.31NRIC1599乳芽孢杆菌(Lactobacillus)清酒乳芽孢杆菌(sakei)0.97NRIC1600乳芽孢杆菌(Lactobacillus)清酒乳芽孢杆菌(sakei)1.52NRIC1601乳芽孢杆菌(Lactobacillus)清酒乳芽孢杆菌(sakei)1.07NRIC1602乳芽孢杆菌(Lactobacillus)清酒乳芽孢杆菌(sakei)1.37NRIC1603乳芽孢杆菌(Lactobacillus)清酒乳芽孢杆菌(sakei)1.03NRIC1575明串珠菌属(Leuconostoc)乳酸明串珠菌(lactis)0.85NRIC1576明串珠菌属(Leuconostoc)乳酸明串珠菌(lactis)0.92NRIC1578明串珠菌属(Leuconostoc)乳酸明串珠菌(lactis)1.00NRIC1580明串珠菌属(Leuconostoc)乳酸明串珠菌(lactis)1.03NRIC1582明串珠菌属(Leuconostoc)乳酸明串珠菌(lactis)0.93NRIC1750明串珠菌属(Leuconostoc)乳酸明串珠菌(lactis)1.03NRIC1087明串珠菌属(Leuconostoc)肠系膜状明串珠菌(mesenteroides)肠系膜状明串珠菌肠系膜状亚种(mesenteroides)1.33NRIC1507明串珠菌属(Leuconostoc)肠系膜状明串珠菌(mesenteroides)肠系膜状明串珠菌肠系膜状亚种(mesenteroides)1,02<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>表4<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>如表1-4所示，以PBS对照的IgA产生量为1，则阳性对照的平均S.I.为13.1，这表明阳性对照具有较强的促进IgA产生的活性。这样便证明了该培养系统可以用于评价Peyer氏斑细胞的IgA产量。各种乳酸菌就诱导IgA产生的能力的比较表明，本发明的乳酸菌，乳芽孢杆菌ONRICb0239和乳芽孢杆菌ONRICb0240分别具有5.61和6.31的S丄值，因此，与S.I.值为0.8-1.4的其它菌株相比，本发明的乳酸菌具有明显更强的诱导IgA产生的能力。IgA抑制病原菌入侵，中和病毒和毒素，并抑制食物变应原侵入。该IgA的增加对宿主防御很重要。测试实施例2本实施例中，以下述方法在体内测试了乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)诱导IgA产生的能力。(1)实验动物及其饲养购买50只雄性8周龄BALB/c小鼠，检疫一周。检疫期及随后的测试期间，任意提供MF固体食物(OrientalYeastCo.Ltd.产品)和自来水。检疫期过后，将小鼠分成3组，即，生理盐水给予组(15只小鼠)、乳芽孢杆菌ONRICb0240(活细胞)给予组(15只小鼠)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(非活细胞)给予组(15只小鼠)。(2)用于口服给予的乳芽孢杆菌ONRICb0240的制备根据以下方法制备用于口服给予的乳芽孢杆菌ONRICb0240(活细胞和非活细胞)。活细胞乳芽孢杆菌ONRICb0240在MRS培养基中培养至达到稳定生长期，所得培养物在3,500rmp离心10分钟(4°C)。细胞用生理盐水离心洗涤两次，悬浮在生理盐水中，达到4xl09cfu/mL的浓度。非活细胞将这样获得的活细胞悬液高压灭菌(在121'C加热15分钟)，然后用超声清洗器(BRANSON2510)超声45分钟。(3)测试方法每天早上以109cfu/250juL/小鼠/天的量向乳芽孢杆菌ONRICb0240(活细胞)给予组的15只小鼠(5+5+5=15只小鼠)口服给予(2)中制备的乳芽孢杆菌ONRICb0240(活细胞)共7天(5只小鼠)、14天(5只小鼠)或21天(5只小鼠)。同样，向乳芽孢杆菌ONRICb0240(非活细胞)给予组的15只小鼠口服给予(2)中制备的乳芽孢杆菌ONRICb0240(非活细胞)共7天(5只小鼠)、14天(5只小鼠)或21天(5只小鼠)。其各自的给予期过后，将各组小鼠断头处死，收集其血液于试管中，血液在4。C以3，000转/分钟的速度离心IO分钟，获得血清。Peyer氏斑细胞通过下述方法制备。处死各组的小鼠之后，取出小肠，用眼科剪解剖，从小肠中取出Peyer氏斑。Peyer氏斑在含不完全培养基(含IOmg庆大霉素的RPMI1640)的24孔微量滴定板中用冰冷却。使所得培养物过筛，制备单细胞悬液，并用5mL不完全培养基洗涤孔。所得细胞悬液过滤，在4'C以1，000转/分钟的速度离心IO分钟。离心后，吸去培养上清液，沉淀悬浮在5mL不完全培养基中。将上述由洗涤、过滤、离心和吸除培养上清液组成的程序重复一次后，用所得沉淀作为Peyer氏斑细胞。生理盐水给予组的对照小鼠U5只小鼠)的饲养未给予乳芽孢杆菌ONRICb0240(活细胞和非活细胞)，其血清和Peyer氏斑细胞依照上述相同方法在试验开始后的7天(5只小鼠)、14天(5只小鼠)或21天(5只小鼠)制备。IgA产生试验将这样制备的Peyer氏斑细胞(沉淀)悬浮在0.5mL完全培养基(含2mML-谷氨酰胺、50/iM巯基乙醇、100U/mL青霉素、100/Ag/mL链霉素和10%FBS的RPMI1640)中，并调节细胞浓度至2xl(^个细胞/mL。活细胞计数后，向96孔细胞培养板的各孔中接种100/iL的细胞悬液。通过两种方法分析Peyer氏斑细胞产生的IgA的量，即，一种包括培养Peyer氏斑细胞和测量产生的IgA的量的方法，及一种包括在含乳芽孢杆菌ONRICb0240(非活细胞)作为Peyer氏斑细胞刺激物质的培养系统中培养Peyer氏斑细胞并测量产生的IgA的量的方法。我们认为后者方法中使用的条件更接近于真实的体内环境。更特别的是，本试验中，当口服给予乳芽孢杆菌ONRICb0240(活细胞或非活细胞)时，预计摄入的乳酸菌可对Peyer氏斑细胞提供一些刺激。根据下述方法制备作为Peyer氏斑细胞刺激物质的乳芽孢杆菌ONRICb0240(非活细胞)。用于Peyer氏斑刺激的乳芽孢杆菌ONRICb0240(非活细胞)将以上制备的用于口服给予的乳芽孢杆菌ONRICb0240(活细胞)悬浮液进一步用磷酸缓冲液稀释至107cfu/mL(660nm处的浊度0.275)的浓度，所得细菌细胞悬液高压灭菌(在12rC加热15分钟)，然后用超声清洗器(BRANSON2510)超声45分钟。在使用Peyer氏斑细胞刺激物质的方法中，向各孔加入10/iL用于Peyer氏斑细胞刺激的乳芽孢杆菌ONRICb0240(非活细胞)，然后向各孔加入100piL无FCS的RPMI1640，在37。C于5%(302存在下培养Peyer氏斑细胞7天。在不使用Peyer氏斑细胞刺激物质的方法中，用10]uL生理盐水替代乳芽孢杆菌ONRICb0240(非活细胞)加至各孔中，然后进行上述程序，培养Peyer氏斑细胞。(4)测量经离心从从细胞培养液中分离培养上清液，在-80'C冷冻保存，直至用其测量培养上清液中产生的IgA的总浓度。用市场上可以买到的试剂盒通过酶联免疫吸附分析法(ELISA)测定培养上清液的IgA总浓度及血清的IgG总浓度。(5)结果图1和2显示了结果(分别为IgA浓度和IgG浓度)。图1是显示培养上清液IgA浓度(pg/mL)的柱状图。图1中，白色柱显示对照生理盐水给予组的结果(标示为"生理盐水")。阴影柱显示乳芽孢杆菌ONRICb0240(活细胞)给予组的结果(标示为"b0240活细胞")。黑色柱显示乳芽孢杆菌ONRICb0240(非活细胞)给予组的结果(标示为"b0240非活细胞")。"无刺激物"表示得自各组的小鼠的Peyer氏斑细胞在不含乳芽孢杆菌ONRICb0240(非活细胞)的培养系统中培养的情况。"细胞刺激"表示通过向培养系统中加入乳芽孢杆菌ONRICb0240，使得自各组的小鼠的Peyer氏斑细胞在乳芽孢杆菌ONRICb0240(非活细胞)的刺激下培养的情况。各组中用5只小鼠获得的结果表示为均值士标准偏差(平均值士SD)。结果上方的p值代表Studentt检验中相对于对照的显著水平。图l所示结果清楚地表明了以下内容(1)给予7天在细胞刺激的情况下，与对照生理盐水给予组相比，乳芽孢杆菌ONRICb0240(非活细胞)给予组显示出明显更高的值(p=0.010)。(2)给予14天在无刺激的情况下，乳芽孢杆菌ONRICb0240(非活细胞)给予组显示出明显高于对照(给予生理盐水后无刺激)的值(p^0.048)(无剌激物的黑色柱)。在细胞刺激的情况下，乳芽孢杆菌ONRICb0240(非活细胞和活细胞)给予组均显示出明显高于对照(给予生理盐水)的值(p值分别为0.034和0.002)。(3)给予21天在无刺激的情况下，乳芽孢杆菌ONRICb0240(非活细胞)给予组显示出明显高于对照组的值(p=0.047)。在细胞刺激的情况下，乳芽孢杆菌ONRICb0240(非活细胞和活细胞)给予组均显示出明显高于对照组的值(p值分别为0.015和0.005)。图2是显示给予乳芽孢杆菌ONRICb024021天对IgG的产生的影响的柱状图。血清IgG浓度(Mg/mL)绘制于纵坐标上。图2所示结果清楚地表明，乳芽孢杆菌ONRICb0240(非活细胞)给予组显示出明显高于对照(给予生理盐水)的血清IgG浓度(p=0.0064);以及乳芽孢杆菌ONRICb0240(活细胞)给予组也显示出明显高于对照(给予生理盐水)的血清IgG浓度。我们认为上述结果是这样产生的乳芽孢杆菌ONRICb0240通过刺激Peyer氏斑或肠上皮细胞中的免疫活性细胞及周围的免疫活性细胞诱导粘膜免疫反应，这最终增加了Peyer氏斑细胞的总IgA产量。结果还清楚地显示，给予乳芽孢杆菌ONRICb0240不仅可以增加IgA，还可以增加血清IgG。这些结果提示，ONRIC乳酸菌的摄入不仅刺激粘膜免疫，而且还刺激系统免疫，这样便使得体内免疫反应得到双重刺激，从而能保护宿主生物免受内部和外部攻击。由于活细胞、非活细胞均表现出这种活性，因此ONRIC乳酸菌有望用于新的益生方法(probioticmethods)，例如口服疫苗。测试实施例3本实施例是为了证明ONRIC乳酸菌预防下呼吸道流行性感冒感染的效果。为研究ONRIC乳酸菌基于IgA的感染保护效果，使用了流行性感冒病毒(IFV)到达下呼吸道的小鼠下呼吸道感染模型，并以感染后存活的天数为指标对摄入用乳芽孢杆菌ONRICb0240制备的发酵组合物的感染保护效果进行了评价。试验按以下方式进行。(1)实验动物购自CharlesRiverJapanInc.的5周龄SPF/VA/VAF近交雌性小鼠(品系BALB/cAnNCrj)在下文所示条件下检疫4天，并以各组平均体重基本相同的方式将其分成3组(蒸馏水组、牛奶组和含乳芽孢杆菌ONRICb0240的发酵奶组)。饲料供应MF固体食物(OrientalYeastCo.Ltd.产品)/自由进食水的供应自来水/从瓶中任意饮水环境温度，23土2。C;湿度，60±10%光照时间光照期，7:00至19:00;黑暗期，19:00至7:00(2)测试方法与MF固体食物一起向各组(n=45)小鼠给予供试物质((1)蒸馏水，(2)牛奶或(3)含乳芽孢杆菌ONRICb0240的发酵奶)2周。用蒸馏水将LL奶(Oaso牛奶；RakunouMothers(熊本乳品合作幼、会，KumamotoDairyCooperativeAssociation)产品)稀释至75%，制成供试牛奶。以悬浮在10%脱脂奶水溶液中，并于-80'C冷冻保存的乳芽孢杆菌ONRICb0240为引子，制备含乳芽孢杆菌ONRICb0240的供试发酵奶。将引子(活细胞计数108cfiO加入1L牛奶中，在33'C发酵16小时，以达到5xl07cfu/mL的细胞含量，用蒸馏水稀释至75%。通过供水瓶任意喂食供试物质。饲料摄入量通过比较供试物质的初始重量与喂食后的重量，根据供试物质的减少量来计算。开始摄入两周后，各组小鼠用"Ketalar"(盐酸氯胺酮)麻醉，并以10、102或103pfu/50/aLPBS/小鼠(各15只小鼠)的浓度经一个鼻腔鼻接种50pLIFV溶液，使之感染IFV。每天检査各组小鼠的存活或死亡情况。从感染到确认死亡的时间里，允许小鼠自由摄取供试物质。用保存在OtsukaPharmaceuticalCo.,Ltd.的微生物研究所(MicroorganismResearchInstitute)的IFV:A/PR/8/34/H1N1株作为IFV株。将该病毒株悬浮在含0.1%BSA和10mMHEPES的MEM中，用PBS(+)稀释至病毒含量为10-103pfu/50/iL，从而提供了用于IFV接种的病毒溶液。将9.55gPBS(-)粉末(Kojin-BioCo.产品)、100.00mg无水CaCl2和46.90mg无水MgCl2溶解在蒸馏水中，加蒸馏水至体积为1,000mL，即制成PBS(+)。结果通过每天早上(8:00-9:00)和晚上(17:30-18:00)，即，一天两次观察，检查各组小鼠的鼻接种IFV后存活的天数。当以1(^pfu/小鼠的浓度接种病毒时，对照组(蒸馏水给予组)和比较组(comparativegroup)(牛奶给予组)所有小鼠到第7天时均死亡。当以10Spfu/小鼠的浓度接种病毒时，这两组所有小鼠到第6天晚上时均死亡。相比之下，含乳芽孢杆菌ONRICb0240发酵奶给予组显示出存活期比对照组延长的趋势。当以10pfu/小鼠的浓度接种病毒时，在第14天，所有组中均有70%或更多的小鼠仍然存活；含乳芽孢杆菌ONRICb0240的发酵奶给予组中有86.7%的小鼠存活，从而显示了与对照组的存活率(80%)相比，存活率增加的趋势。从开始摄入供试物质到感染当天，用电子秤每两天测量一次各组小鼠的重量，此后每天早上(8:30-9:00)测量一次。每个测量日对存活小鼠进行测量，以同一组中所有小鼠的测量值的平均值作为获得值显示。在所有组中，从第二天开始均观察到轻微的重量下降。这种重量改变的趋势在所有组中均相似，并未观察到实质性差异。探讨根据本试验的结果及测试实施例1和2中所示试验结果得出结论ONRIC乳酸菌及含有ONRIC乳酸菌的发酵组合物具有对IFV感染的保护效果。本发明提供了含有能刺激粘膜免疫并促进IgA产生的ONRIC乳酸菌的基于茶的发酵饮料和茶饮料。其摄入可以抑制病原微生物通过粘膜侵入，因此提供了宿主保护效果。测试实施例4本实施例是为了证明接种ONRIC乳酸菌(非活细胞)在预防下呼吸道感染流行性感冒中的效果。(1)供试物质用乳芽孢杆菌ONRICb0240(非活细胞)作为供试物质。(2)实验动物购自JapanSLCInc.的5周龄BALB/c/CrSic(SPF)雌性小鼠在下文所示条件下检疫7天并分组。饲料供应CRF-1固体食物(OrientalYeastCo.Ltd.产品)/自由进食水的供应已用高压灭菌器在123-124'C灭菌100分钟的自来水/从瓶中任意饮水环境温度，23±2°C;湿度，55±15%通风15分钟/小时光照时间光照期，8:00至20:00;黑暗期，20:00至8:00(3)病毒的制备MDCK细胞(狗肾细胞；RCB0995系)用在细胞培养基(含10%FBS的EagleNEM(Gibco))中冷冻干燥并保存在超低温冰箱中的流行性感冒病毒A(IFVA:PR8株)以0.01的感染复数(M.O.I.)感染，并在37'C于5%(:02存在下培养72小时(第1次传代)。大量生产连续传代培养5次的细胞，用蔗糖梯度离心法分离并纯化病毒液。将病毒液分成1mL的小份并保存在-8(TC的超低温冰箱中，直至实验开始。将一部分病毒液稀释10倍，以证实细胞变性，从而确定病毒效价(TCIDso)。(4)测试方法(4-1)分组将小鼠分成6组(4个接种病毒组和2个未接种病毒组)。4组接种病毒的浓度为10"TCID5。/mL。每组各分配10只已安全接种病毒的小鼠。给小鼠指定识别号，并随机分配。未接种病毒小鼠的数量也是10(4-2)供试物质的给予检疫和检验完成后，在整个测试期内，每天一次向事先已饲养一周的各6周龄BALB/c雌性小鼠强制性口服给予0.2mL供试物质。选择测试物质的浓度，使测试物质的给予量为500、100或20mg/mL/kg体重。以同样的方式分别向阴性对照给予生理盐水。(4-3)接种IFVA按分配给各小鼠的识别号的顺序，向各6周龄BALB/c雌性小鼠的后腿经肌内给予每20g动物重量0.2mL20倍稀释的盐酸氯胺酮(50mg/mL，SankyoCo.，Ltd.生产)禾卩0.1mL20倍稀释的氟哌利多(2.5mg/mL，SankyoCo.,Ltd.生产)。连续3周口服给予小鼠供试物质或生理盐水。注射后，对小鼠行全身麻醉。在全身麻醉下，将上述(3)中制备的50pLIFVA经鼻接种至各小鼠的右侧鼻腔。分别向未接种病毒组注射50ML的生理盐水。(4-4)存活率的测定接种IFVA后，通过观察检查小鼠两周。将各组接种IFVA的存活动物数除以各组动物总数，所获得的值乘以100，即得到存活率。(5)统计学应用用Kruskal-WallisH检验或Mann-WhitneyU检验分析实验对照组与给予供试物质的各组之间差异的显著性。显著水平小于5%。用Fisher氏检验分析观察期间存活时间(时间段)差异的显著性。(6)结果结果见表5。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>对于感染病毒的动物，生理盐水给予组的存活率和平均存活时间分别为0%和8.5天。相比之下，给予供试物质的组，即500mg/kg给予组、100mg/kg给予组和20mg/kg给予组的存活率和平均存活时间分别是80.0%和13.1天、30.0%和9.2天以及0%和8.5天。对于病毒感染后观察期间的存活时间及观察期结束时的存活率，给予500mg/kg供试物质的组显示了与对照组相比明显更高的值(p分别等于0.0002和0.0007)。对于未感染病毒的动物，给予供试物质的组和未给予供试物质的组的存活率及平均存活时间都是100%和14.0天。测试实施例5为显示连续给予ONRIC乳酸菌(非活细胞)对人唾液中IgA产量的影响，进行了本试验。20位成年女性参与本试验，根据筛选期间人唾液中的S-IgA总量将其分成2组，即给予水的组(对照组)和给予乳芽孢杆菌ONRICb0240(非活细胞)(相当于2Xl(^cfu/天)的组。试验期间，给予水或含乳芽孢杆菌ONRICb0240(细菌细胞计数相当于2Xl(^cfu，200ml/天)的水。给予供试物质之前和之后，按照下述方法测量人唾液中的S-IgA总量。在唾液收集日于指定的时间用蒸馏水漱口。漱口后5分钟，用唾液收集器(salivettes)收集唾液1分钟，称重。根据唾液分泌量，重复该步骤2或3次。收集期间，用计时器精确测量收集期并记录。所得唾液离心前在4'C冷藏。在同一天将样品以2500rpm的速度离心10分钟，去除沉淀。当得到的上清液的量较少时，则再进行一次离心。收集上清液于1.5ml微型管中，测量之前在-3(TC冷冻保存。用已用封闭液(lg/50ml鱼胶(SIGMA,St.Louis，MO)的PBS溶液，含0.05%聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯(等同于吐温20，NakalaiTesqueInc.，京都))稀释2000倍的样品进行测量。用ELISA法(一抗兔抗人IgA(DAKO，丹麦)；二抗HRP标记的兔抗人IgA(DAKO);标准抗体纯化的人分泌型IgA(Cappel，Aurora,OH))测定IgA的浓度。通过用每分钟唾液分泌量乘以S-IgA浓度，计算S-IgA总量。通过用给予供试物质后第21天唾液中的S-IgA总量减去给予供试物质前唾液中的S-IgA总量，得到试验期间增加的唾液中总S-IgA的量。所得结果见表3。对于试验期间增加的唾液中总S-IgA的量，给予乳芽孢杆菌ONRICb0240(非活细胞)(相当于2Xl()9cfu/天)的组(52.21±24.41Mg)显示出与给予水的组(-21.81±28.33Mg)相比明显更高的值。差异具有统计学显著性(p=0.0001)。权利要求1.基于茶的发酵饮料，包含用至少一种选自由Lactobacillus(乳芽孢杆菌)ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌发酵的基于茶的发酵液。2.根据权利要求1的基于茶的发酵饮料，进一步包含茶提取物。3.根据权利要求1的基于茶的发酵饮料，其中包含的乳酸菌的量可有效刺激粘膜免疫。4.根据权利要求1的基于茶的发酵饮料，其中包含的乳酸菌的量可有效促进IgA的产生。5.根据权利要求1的基于茶的发酵饮料，其中乳酸菌的含量为104cfu/ml至108cfu/ml。6.根据权利要求1的基于茶的发酵饮料，其中乳酸菌的含量为105cfu/ml至107cfu/ml。7.茶饮料，包括至少一种选自由乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌及茶提取物。8.根据权利要求7的茶饮料，其中包含的乳酸菌的量可有效刺激粘膜免疫。9.根据权利要求7的茶饮料，其中包含的乳酸菌的量可有效促进IgA的产生。10.根据权利要求7的茶饮料，其中乳酸菌的含量为10、fu/ml至108cfu/ml。11.根据权利要求7的茶饮料，其中乳酸菌的含量为10、fii/ml至107cfu/ml。12.生产权利要求1的基于茶的发酵饮料的方法，包括在含茶培养基中培养至少一种选自由乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌的步骤。13.根据权利要求12的方法，进一步包括将基于茶的发酵饮料的乳酸菌含量调节至104cfu/ml-108cfu/ml的步骤。14.根据权利要求12的方法，其中含茶培养基是可以包括任选组分，并具有0.10-0.50的来自茶的白利度的茶提取物，并且其中的培养在25-50'C迸行12-32小时。15.根据权利要求12的方法，其中含茶培养基是可以包括任选组分，并具有0.18-0.30的来自茶的白利度的茶提取物，并且其中的培养在30-40'C进行15-20小时。16.生产权利要求2的基于茶的发酵饮料的方法，包括以下步骤(1)在含茶培养基中培养至少一种选自由乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌，从而获得基于茶的发酵液；以及(2)向步骤(1)中获得的基于茶的发酵液中加入茶提取物。17.根据权利要求16的方法，其中，在步骤(2)中，将茶提取物加至基于茶的发酵液中，以使最终的基于茶的发酵饮料具有0.10-0.50的来自茶的白利度，以及10、fu/ml至108cfii/ml的乳酸菌含量o18.生产权利要求7的茶饮料的方法，包括将至少一种选自由乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌与茶提取物混合的步骤。19.根据权利要求18的方法，其中将茶提取物与乳酸菌混合，以使最终的茶饮料具有0.10-0.50的来自茶的白利度，以及10、fu/ml至108cfu/ml的乳酸菌含量。20.至少一种选自由乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌在生产具有粘膜免疫刺激活性的基于茶的发酵饮料中的应用。21.至少一种选自由乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌在生产具有促进igA产生活性的基于茶的发酵饮料中的应用。22.至少一种选自由乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌在生产具有粘膜免疫刺激活性的茶饮料中的应用。23.至少一种选自由乳芽孢杆菌ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌在生产具有促进IgA产生活性的茶饮料中的应用。全文摘要本发明提供了含有用至少一种选自由乳芽孢杆菌(Lactobacillus)ONRICb0239(FERMBP-10064)和乳芽孢杆菌ONRICb0240(FERMBP-10065)组成的组的乳酸菌产生的茶发酵液的茶发酵饮料；本发明还提供了含有该乳酸菌的茶饮料。文档编号A61P37/02GK101128122SQ20068000582公开日2008年2月20日申请日期2006年2月22日优先权日2005年2月23日发明者冈松洋,吴博圣,山平聪子,户羽正道,远藤理惠子申请人:大塚制药株式会社