含有岩藻多糖或岩藻多糖水解产物和免疫赋活材料的组合物的制作方法

专利名称：：含有岩藻多糖或岩藻多糖水解产物和免疫赋活材料的组合物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及含有岩藻多糖或岩藻多糖水解产物和免疫赋活材料，可用于以增强免疫力、调节免疫功能等为目的的饮食品、医药品、健康食品、功能性食品、化妆品等的组合物。
背景技术：
：免疫赋活材料近年来，在健康食品领域具有免疫赋活作用的材料受到关注，已开发出大量含有这些材料的健康食品。用于因增龄、精神紧张、疾病等而降低的免疫力的恢复等。这种材料中含有如乳酸菌(乳酸球菌、乳酸杆菌)、酵母、真菌类的微生物；香菇、灰树花、灵芝、阿加利格斯菇等蘑菇类；海藻类；中药等。乳酸菌在上述免疫赋活材料中，乳酸菌的免疫赋活作用受到关注，对于一部分乳酸菌，己报道其具有增强NK(naturalkiller)活性的作用、改善Thl/Th2平衡的作用等。此外，乳酸菌自古以来就用于饮食，众所周知其安全性高。因此认为，作为使降低的免疫力恢复的手段，优选乳酸菌。为了提高乳酸菌的免疫赋活作用的效果，使饮食品中的乳酸菌的含量增加即可。但是，如果在饮料等中添加大量的乳酸菌就会出现产生沉淀的问题。正因为此，以前使用乳酸菌的饮食品，几乎都是腌菜类的固体物、不介意有沉淀的饮食品(例如酸奶、乳饮料)。此外，如酸奶那样通过发酵来增加乳酸菌时，乳酸菌的数量达到一定量后就不再增加，所以增加饮食品中的乳酸菌含量是有限度的。并且，制作发酵食品时，不仅要考虑功能，还需要考虑发酵的程度、发酵后的香味、发酵后乳酸菌的数量等。因此，要使用乳酸菌开发功能性饮食品、特别是以免疫功能调节为目的的功能性发酵饮食品，必须使用发酵特性良好且免疫功能调节作用良好的乳酸菌。但是，乳酸菌的发酵特性和免疫功能调节作用根本不相关。因此，探索这种乳酸菌并不容易。近年来报道了一些提高乳酸菌等免疫赋活材料的活性的方法。例如有通过混合培养38种乳酸菌、酵母，使免疫赋活作用得到增强的报道(专利文献1)，通过并用乳酸菌和蘑菇使免疫赋活作用增强的方法(专利文献2)等报道。岩藻多糖及岩藻多糖水解产物岩藻多糖是藻类中含有的多糖硫酸酯，据报道其有抗血液凝固作用、降低血脂作用(除去血液中的胆固醇、过氧化脂质的作用)、抗肿瘤作用、癌转移抑制作用、抗艾滋病毒感染作用等各种活性，其中使生物体的免疫功能正常化的作用受到关注，认为作为具有免疫功能调节作用的医药品、健康食品的材料行之有效。但是，岩藻多糖是分子量极大的多糖硫酸酯，直接作为饮食品、医药品等使用时，存在有关吸收性、抗原性、均一性、抗凝血活性等问题。为了解决这些问题，曾多次进行了从岩藻多糖中获得低分子化合物的尝试。例如到目前为止报道了化学合成的含有岩藻糖的低聚糖(非专利文献1、2及3)，但因为这些物质是通过有机合成反应制备的，所以不优选在食品等中使用。另一方面，也报道了将岩藻多糖水解使岩藻多糖低分子化的方法。例如，专利文献3中公开了将岩藻多糖进行酸水解的方法，得到的低分子岩藻多糖具有5X103以下的分子量分布。且在专利文献4中记载了不从外部添加酸使岩藻多糖水解得到低聚糖的方法。此外，专利文献5报道了通过酶使岩藻多糖水解的方法。专利文献1日本特开2005-68092专利文献2日本特开2004-51504专利文献3日本特开平7-215990专利文献4日本特开2002-226496专利文献5日本特开2000-236889非专利文献lCarbohydrateresearch4，189-195(1967)非专利文献2Carbohydrateresearch37，75-79(1974)非专利文献3Carbohydrateresearch41,308-312(1975)
发明内容但是，专利文献1和2的方法，都是将不溶性材料相互组合的方法，并不能防止沉淀。此外，对于能够高效提高乳酸菌以外的免疫赋活材料的活性的材料，到目前为止还没有研究。因此，如果有能够使免疫赋活材料、乳酸菌的活性协同提高的水溶性材料，不仅能够开发具有更强功效的免疫功能调节剂、饮食品，而且能够在维持活性的同时减少免疫赋活材料、乳酸菌的使用量，因此，其结果能够扩大含有免疫赋活材料、乳酸菌的食品的开发范围。并且还能够减轻研究同时具备良好的发酵特性和免疫功能调节作用的乳酸菌的负担。此外，考虑到食品、医药品的用途，该物质必须是安全性高且能够简便制造的物质。因此，本发明的目的是，提供通过组合免疫赋活材料，能够增强这些材料的免疫功能调节作用的物质。这里所述的免疫功能调节作用，例如并不是如低聚木糖那样，通过改善肠内细菌群间接地调整免疫功能，而是指几种岩藻多糖所示的直接使免疫活性细胞活化的作用。本发明的更进一步的目的是，提供在饮食品或医药组合物中能够准确添加有效量的组合物。本发明者发现，通过将岩藻多糖或岩藻多糖的酸水解产物、优选低聚糖和任意的乳酸菌、免疫赋活材料组合，这些物质的免疫功能调节或免疫赋活活性得到协同增强，从而完成了本发明。在本发明中，将来自岩藻多糖的这些低聚糖称为岩藻多糖低聚糖。本发明涉及(1)组合物，其含有岩藻多糖或岩藻多糖水解产物和免疫赋活材料。(2)如(1)所述的组合物，其中，水解产物是使岩藻多糖在0.16.0N的酸中，在2510(TC下水解0.252.5小时后得到的产物。(3)如(2)所述的组合物，其中，水解产物是使岩藻多糖在0.54.0N的酸中，在309(TC下水解0.52.0小时后得到的产物。(4)如(1)(3)中任一项所述的组合物，其中，水解在盐酸或硫酸中进行。(5)如(1)(4)中任一项所述的组合物，其中，水解产物是低聚糖。(6)如(5)所述的组合物，其中，低聚糖是从由岩藻糖、硫酸基岩藻糖、乙酰基岩藻糖、以及葡萄糖醛酸组成的组中选择的至少一种糖所构成的二糖到五糖的低聚糖。(7)如(6)所述的组合物，其中，作为低聚糖，含有从下述结构式(I)、(n)、(ni)、(iv)、(v)、(vi)、(vm、(vi)、(ix)、(x)以及(xi)所示的化合物中选择的至少一种。(分子量390)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>(I)(分子量340)(分子量486)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage11</formula>20COOH(分子量420)OH(V)(分子量566)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula>(分子量850)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>(分子量858)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>(分子量900)(8)如(1)(7)中任一项所述的组合物，其中，所述免疫赋活材料是从乳酸菌(乳酸球菌和乳酸杆菌)、酵母、真菌类的微生物；香菇、灰树花、灵芝、阿加利格斯菇等蘑菇类；含有CpG基序的免疫原性寡聚脱氧核苷酸(CpG-0DN)、聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(PolyI:C)类的来自核酸的物质；脂多糖(LPS)、P—葡聚糖；海藻类；中药；腿46癌抗原类抗癌疫苗；刀豆蛋白A(ConA);Krestin(注册商标)、0K-342(Picibanil、注册商标)、Lentinan(注册商标)的B脂(生物反应修饰剂)中选择的至少一种。(9)如(8)所述的组合物，其中，所述免疫赋活材料是乳酸菌。(10)免疫功能调节剂，其含有(1)(9)中任一项所述的组合物。(11)饮食品，其中添加有(1)(9)中任一项所述的组合物。(12)饮食品，其中含有(1)(9)中任一项所述的组合物，并附带具有免疫功能调节作用的内容的标示。(13)医药组合物，其含有(1)(9)中任一项所述的组合物。以及(14)化妆品，其含有(1)(9)中任一项所述的组合物。本发明的岩藻多糖或其水解产物和免疫赋活材料的组合物，与单独使用这些物质时相比较，具有协同增强的免疫功能调节或免疫赋活作用。因此，能够开发出比以往的使用免疫赋活材料的饮食品、医药品更有效的产品。并且，因为高效，所以能够减少免疫赋活材料在饮食品、医药品、化妆品中的添加量。这些优点在将乳酸菌用作免疫赋活材料时特别重要。例如，对于水溶性低的乳酸菌来说，如果能够减少其添加量，就可防止其沉淀。并且也可省略筛选同时具备免疫赋活活性和良好发酵特性的乳酸菌的过程。结果能够有利地推进含有乳酸菌的产品的开发。另外，作为本发明组合物的构成要素的岩藻多糖或其水解产物，因为是从食品材料中分离的，所以作用温和，安全性极高。因此，本发明的组合物非常有效，其应用范围不仅适用饮食品，也可适用于医药品和化妆品o此外，作为低聚糖，通过使用含有从上述结构式(i)、(n)、(m)、(iv)、(V)、(VI)、(W)、(VID)、(K)、(X)以及(XI)所示的化合物中选择的至少一种的低聚糖，能够简便且正确地进行质量管理。此外，因为这些来自岩藻多糖的低聚糖是低分子，容易处理且可简便制造，又因为其安全性高，所以将这些低聚糖和免疫赋活材料组合的组合物，可用于饮食品、医药品等各种用途。图1是表示从日本冲绳海蕴中通过热水提取得到的岩藻多糖的糖组成分析的HPLC图谱。图2A表示水解岩藻多糖时使用的酸浓度对免疫赋活活性的影响。图2B表示水解岩藻多糖时使用的酸浓度对免疫赋活活性的影响。图3A表示水解岩藻多糖时反应温度对免疫赋活活性的影响。图3B表示水解岩藻多糖时反应温度对免疫赋活活性的影响。图4表示水解岩藻多糖时反应时间对免疫赋活活性的影响。图5表示式(I)表示的分子量为340的岩藻多糖低聚糖的MS光谱。图6表示式(II)表示的分子量为486的岩藻多糖低聚糖的MS光谱。图7表示式(I)表示的分子量为340的岩藻多糖低聚糖的^-丽R光谱。图8表示式(I)表示的分子量为340的岩藻多糖低聚糖的130應R光谱。图9表示式(II)表示的分子量为486的岩藻多糖低聚糖的'H-丽R光谱。图10表示式(II)表示的分子量为486的岩藻多糖低聚糖的13C-丽R光谱。图11表示式(III)表示的分子量为390的岩藻多糖低聚糖的力-歷R光谱。图12表示式(III)表示的分子量为390的岩藻多糖低聚糖的13C-薩R光谱。图13表示式(V)表示的分子量为566的岩藻多糖低聚糖的W-丽R光谱。图14表示式(V)表示的分子量为566的岩藻多糖低聚糖的13C-醒R光谱。图15表示式(VI)表示的分子量为712的岩藻多糖低聚糖的'H-丽R光谱。图16表示式(VI)表示的分子量为712的岩藻多糖低聚糖的13C-丽R光谱。图17表示式(VD)表示的分子量为754的岩藻多糖低聚糖的'H-NMR光谱。图18表示式(Vn)表示的分子量为754的岩藻多糖低聚糖的13C-醒R光谱。图19表示式(VI)表示的分子量为808的岩藻多糖低聚糖的^-丽R光谱。图20表示式(V1II)表示的分子量为808的岩藻多糖低聚糖的13C-丽R光谱。图21表示式(IX)表示的分子量为850的岩藻多糖低聚糖的丽R光谱。图22表示式(DO表示的分子量为850的岩藻多糖低聚糖的13C-丽R光谱。图23表示使式(VI])表示的分子量为754的岩藻多糖低聚糖再生后的丽R光谱。图24表示使式(VH)表示的分子量为754的岩藻多糖低聚糖再生后的TOF-MS光谱。图25表示使式(VE)表示的分子量为754的岩藻多糖低聚糖再生后的ESI-MS/MS光谱。图26表示式(W)表示的分子量为420的岩藻多糖低聚糖的FAB-MS光谱。图27表示式(IV)表示的分子量为420的岩藻多糖低聚糖的MS/MS光谱。图28表示式(X)表示的分子量为858和式(XI)表示的分子量900的岩藻多糖低聚糖的FAB-MS光谱。图29表示式(X)表示的分子量为858的岩藻多糖低聚糖的FAB-MS/MS光谱。图30表示式(XI)表示的分子量为900的岩藻多糖低聚糖的FAB-MS/MS光谱。图31表示水解日本冲绳海蕴后，用ABEE荧光标记的ESI-MS图谱。图32A表示并用式(I)表示的岩藻多糖低聚糖和乳酸菌可协同提高脾细胞的IFN-Y诱导效果。图32B表示并用式(II)表示的岩藻多糖低聚糖和乳酸菌可协同提高脾细胞的IFN-Y诱导效果图33表示并用岩藻多糖低聚糖混合物和乳酸菌可协同提高脾细胞的IFN-Y诱导效果。图34表示并用岩藻多糖低聚糖和乳酸菌可协同提高树突状细胞的IL-12诱导效果。图35表示并用岩藻多糖低聚糖和乳酸菌可协同提高树突状细胞的IL-IO诱导效果。图36表示并用岩藻多糖低聚糖和乳酸菌可协同提高CTL活性。图37表示利用几乎无活性的乳酸菌和岩藻多糖水解产物使IL-12的产生协同增强。图38表示利用乳酸菌以外的免疫赋活剂和岩藻多糖水解产物使IFN-Y的产生协同增强。图39表示通过体内(invivo)证明乳酸菌和岩藻多糖水解产物协同增强NK活性。图40表示并用岩藻多糖和乳酸菌可协同提高脾细胞的IFN-Y诱导效果。具体实施方式免疫赋活材料免疫赋活材料，是指具有增强动物的免疫应答能力的作用的材料，也称为免疫强化材料。本发明中使用的免疫赋活材料没有特别限定，包括乳酸菌(乳酸球菌、乳酸杆菌)、酵母、真菌类的微生物；香菇、灰树花、灵芝、阿加利格斯菇等蘑菇类；含有CpG基序的免疫原性寡聚脱氧核苷酸(CpG-0DN)、聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(PolyI:C)类的来自核酸的物质；脂多糖(LPS);海藻类；中药；癌疫苗(例如丽46癌抗原)，刀豆蛋白A(ConA)，Krestin(注册商标)、0K-432(Picibanil、注册商标)、Lentinan(注册商标)等BRM(生物反应修饰剂)等公知的免疫赋活剂。CpG-0DN是含有非甲基化胞嘧啶一鸟嘌呤二核苷酸(CpG)的(短)寡聚脱氧核苷酸(0DN)，含有这样的CpG基序的CpG-ODN，能够使抗原提呈细胞直接活化。其结果，用CpG-ODN使NK细胞等活化，促进诱发Thl型应答和产生细胞毒性T细胞(日本特表2004-519453)。PolyI:C是含有肌苷酸和胞嘧啶核苷酸的多聚核苷酸共聚物，也称为聚肌苷酸聚胞嘧啶核苷酸。已知其在灵长类中具有提高干扰素在体液中的浓度的作用。已知脂多糖是诱导自然免疫体系的诱因物质。醒46是乳癌或肿瘤的一种，匿46癌抗原等抗癌疫苗，因为攻击癌细胞而使免疫功能赋活，所以用于癌的预防、治疗。ConA是来自刀豆种子的植物凝血素，已知其具有各种免疫赋活作用。BRM是在癌症治疗中通过增强、调节宿主的免疫功能等，修饰肿瘤和宿主的相互关系，得到治疗效果的药剂、治疗方法。在这种药剂中包括0K-432、Krestin(注册商标)、Lentinan(注册商标)等。OK-432是含有作为主成分的化脓性链球菌(str印tococcuspyogenes)(A群3型)Su株的青霉素处理冷冻干燥粉末、干燥菌体的抗恶性肿瘤剂淋巴管肿瘤治疗剂。Krestin是，含有作为主成分的从云芝菌丝体中得到的与蛋白质结合的多糖类的治疗癌症使用的药剂。Lentinan是从香菇中得到的e-l，3—葡聚糖。乳酸菌本发明使用的乳酸菌不限于特定的菌株，优选乳杆菌属(Lactobacillus),其中优选能够使植物材料发酵的植物性乳酸菌。更优选普兰特任菌(Lactobacillusplantarum)或戊糖乳杆菌(Lactobacillusperrtosus)。在本发明中与岩藻多糖或其水解产物组合使用时，乳酸菌可以是活的，也可以是死的。岩藻多糖作为本发明的组合物的原料使用的岩藻多糖，可以为各种结构，也可从任何藻类中获取。藻类含有包括黑顶藻目(Sphacelariales)、索藻目(Chordariales)、萱藻目(Scytosiphonales)、网管藻目(Dictyosiphonales)、马鞭藻目(Cutleriales)、毛头藻目(Sporochnales)、网地藻目(Dictyotales)、海带目(Laminariales)、墨角藻目(Fucales)的褐藻纲Phaeophyceae的海藻。优选使用来自海蕴、更优选使用来自日本冲绳海蕴的岩藻多糖。岩藻多糖的提取方法从藻类中提取岩藻多糖的方法己进行了各种探讨，并己公知(例如，日本特开平10-245334记载的使用水的方法，日本特开平10-195106记载的使用酸的方法，日本特开2002-262788记载的使用碱性水溶剂的方法等)。在本发明中作为原料使用的岩藻多糖可通过这些公知的方法获得。在本发明中，例如使用根据以下方法获得的岩藻多糖。在藻类(例如日本冲绳海蕴)中加入510倍量的蒸馏水，在5010(TC提取数分钟5小时，优选在609(TC提取0.52.0小时，更优选在809(TC约提取1小时。通过将这样得到的藻类提取物进行冷却、吸引过滤、脱盐及干燥，能够容易地得到溶解于水中的岩藻多糖组分。这样得到的岩藻多糖组分，可以不经过精制在下一道工序中使用，也可以进一步精制后使用。岩藻多糖，优选使用上述从藻类中提取的岩藻多糖，但也能够以含有在藻类中的状态使用。将岩藻多糖或含有其的藻类通过以下水解工序，得到岩藻多糖水解产物。岩藻多糖水解产物岩藻多糖水解产物，是指含有通过水解作为多糖硫酸酯的岩藻多糖可得到的单糖和多糖类的糖衍生物及其混合物。岩藻多糖水解产物，优选为多糖类，更优选为含有210个单糖的低聚糖，进一步优选为含有25个单糖的低聚糖。在本发明中，将水解岩藻多糖得到的上述低聚糖也称为岩藻多糖低聚糖。构成低聚糖的单糖，优选岩藻糖、硫酸基岩藻糖、乙酰基岩藻糖及/或葡萄糖醛酸。特别优选低聚糖为上述式(I)oa)的化合物。岩藻多糖水解产物如下述方法制造。岩藻多糖水解产物的制造(1)岩藻多糖的水解作为本发明的构成要素的岩藻多糖水解产物，如专利文献35所述，可通过使用酸、酶的方法水解岩藻多糖而得到。进行酸水解时，可使用盐酸、硫酸、磷酸、硝酸等无机酸，也可使用醋酸、柠檬酸、草酸、琥珀酸、甲酸、丙酸等有机酸。优选酸为盐酸和硫酸。优选使用以下的酸水解条件。即将含有上述从藻类中得到的岩藻多糖的组分或岩藻多糖，使用酸、优选盐酸，在含有0.16.0N、优选0.54.0N、进一步优选0.52.ON的盐酸的25100°C、优选309(TC、更优选508(TC的水性溶剂中，进行0.13小时、优选0.252.5小时、更优选0.52.0小时水解。将得到的反应物用碱例如约1N的NaOH中和后，通过用电渗析或凝胶过滤等适当的手段脱盐、干燥(例如冷冻干燥)，能够得到含有岩藻多糖低聚糖混合物的水解产物。上述得到的水解产物可以直接作为岩藻多糖水解产物使用，也可通过精制使其活性提高。(2)水解产物的精制和低聚糖的分离岩藻多糖水解产物的精制，可以单独或并用色谱法、重结晶、渗析、乙醇沉淀等方法。例如按照以下操作进行精制。首先，将含有低聚糖混合物的岩藻多糖水解产物提供给使用阴离子交换树脂的色谱法，分离出不被吸附而通过的含有不含硫酸基的低聚糖组分(中性，酸性糖组分)、和含有被酸性洗脱液洗脱的含有大量硫酸基的低聚糖的组分(硫酸化糖组分)。在本发明中，优选将上述得到的各组分作为岩藻多糖水解产物使用，也可如下所述，使用进一歩精制分离的低聚糖。使中性*酸性糖组分进一步通过凝胶过滤，能够得到式(I)表示的二糖和式(II)表示的三糖。另一方面，将硫酸化糖组分提供给色谱法，能够分离出硫酸化低聚糖(in)、(w)、(v)、(w)、(vn)、(vii)、(ix)、(x)或(xi)各成分。各低聚糖，为了更容易地进行精制、结构分析，可将其适当标记或形成衍生物。例如，低聚糖可用4-氨基苯甲酸乙酯(ABEE)类的试剂进行荧光标记，这样就使低聚糖的检测变得容易。将被标记的各低聚糖分离后，除去标记的部分，能够得到纯净的低聚糖。岩藻多糖或其水解产物和免疫赋活材料的组合本发明是含有上述得到的岩藻多糖或其水解产物和免疫赋活材料的组合的组合物。通过这样的组合，岩藻多糖或其水解产物和免疫赋活材料的免疫功能调节作用及/或免疫赋活作用得到协同增强。在该组合物中，也可将一种岩藻多糖低聚糖作为岩藻多糖水解产物和免疫赋活材料(例如乳酸菌)组合使用。此外，也可使用多种如3种或3种以上的岩藻多糖低聚糖和免疫赋活材料组合。将乳酸菌用于本发明的组合中时，可以使用活的，也可以使用死的乳酸菌。与此相对，如低聚木糖是作为益生菌而被公知的低聚糖，主要是通过促进乳酸菌的增殖来增强免疫功能调节作用。本发明的水解产物也可增强死菌的免疫调节作用，这一点比以往作为益生菌使用的低聚糖良好。使用的岩藻多糖或其水解产物相对于免疫赋活材料的优选比率为，重量比1:110000:1，更优选250:11000:1。此外，本发明还包括通过组合使用岩藻多糖或其水解产物和免疫赋活材料，协同增强这些物质的免疫功能调节及/或免疫赋活作用的方法。将本发明的组合用于例如饮食品、医药品及化妆品等中，能够使其具有免疫功能调节作用。免疫功能调节剂本说明书中的免疫功能调作用，是指使生物体内降低的免疫反应提高及/或抑制亢进的免疫反应的作用。因此，其作用包括免疫赋活作用和免疫抑制作用。本说明书中的免疫功能调节作用，可用该
技术领域：
公知的方法测定。例如可将诱导具有免疫功能调节作用的细胞因子的作用作为指标测定。该目的使用的细胞因子包含干扰素-Y，白介素-10、12等。此外，免疫功能调节作用，也可将与免疫应答相关的树突状细胞的成熟化、细胞毒性T细胞(CTL)的活性作为指标测定。本发明的免疫功能调节剂可用来增进健康，但对肿瘤、癌转移、病毒性疾病(例如感冒、艾滋病、病毒性肝炎)、过敏性疾病(例如花粉症、过敏性鼻炎、遗传性过敏症、哮喘)、自身免疫疾病(例如风湿性关节炎)、炎症性疾病、糖尿病类疾病或状态有效。含有岩藻多糖或其水解产物和免疫赋活材料的食品添加剂及饮食品将本发明的岩藻多糖或其水解产物和免疫赋活材料的组合物用于饮食品时，优选制成含有该组合物且具有免疫功能调节作用的食品添加剂和饮食品，以及添加有该组合物且具有免疫功能调节作用的健康食品。将这些物质和公知的甜味料、酸味料、维生素等各种成分混合，能够制成符合客户嗜好的产品。饮食品，例如能够以片剂、胶囊剂、清凉饮料、茶饮料、健康饮料、酸奶、乳酸菌饮料等乳制品，调味料，加工食品，餐后甜点类，点心(例如口香糖、糖果、果冻)等的形态提供。本发明的饮食品还包括在容器、说明书上附带具有免疫功能调节作用内容的标示的功能性食品(包括特定保健用食品、附加条件的特定保健用食品)。标示位置可以为容器或添付的说明书等，但并不限于此。容器包括瓶、罐、聚酯瓶、塑料瓶、纸袋等，但并不限于此。此外，标示的方法包括印刷、刻印、贴纸等，但并不限于此。此外，饮食品也可以为作为宠物的饵食而加工的宠物食品、动物饲料等。含有岩藻多糖或其水解产物和免疫赋活材料的组合物的医药组合物将本发明的组合物作为医药品使用时，例如，可作为免疫功能调节剂、免疫赋活剂、抗过敏剂以及免疫抑制剂使用。因此，在一种方式中，本发明是含有岩藻多糖或其水解产物和免疫赋活材料且具有免疫功能调节作用、免疫赋活作用、抗过敏作用及/或免疫抑制作用的医药组合物。医药组合物，可以在主药中使用稀释剂、载体、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、矫味矫臭剂、助溶剂、悬浮剂、包衣衣料等医药制剂
技术领域：
通常使用的公知的辅助剂进行制剂化。剂型可以为片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、液剂、糖浆剂、栓剂、乳膏剂、软膏剂、乳剂、巴布剂、注射剂等，无特别限定。本医药品的给药途径，例如可以为口服给药、直肠给药、胃肠道给药等，无特别限定。含有岩藻多糖或其水解产物和免疫赋活材料的组合物的化妆品通过使用本发明的组合物，能够制造具有免疫功能调节作用的化妆品。含有本发明的组合物的化妆品，例如为面部用、皮肤用、头发用的乳膏、化妆水、凝胶、摩丝、洗发液、护发素等。与其他成分的并用含有本发明的组合物的组合物，在饮食品、医药组合物以及化妆品中可以单独使用，优选与其他的具有免疫功能调节作用或免疫赋活作用的食品材料或物质并用。作为这种食品材料或物质，可以为乳酸菌、香菇、岩藻多糖等。本发明的饮食品或组合物中，除这些活性成分以外，根据具体的形态，可以配合一般的成分如载体、稀释剂、赋形剂、或添加剂等成分。这里作为稀释剂、载体、赋形剂，只要不影响岩藻多糖或其水解产物以及免疫赋活材料的生理活性，无特别限定。例如可以为蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖、淀粉、糖稀、异性化液糖等糖类，乙醇、丙醇、甘油等醇类，山梨糖醇、甘露醇、赤藓醇、拉克替醇、木糖醇、麦芽糖醇、还原性异麦芽酮糖、还原性淀粉分解物等糖醇类，三乙酸甘油酯等溶剂，阿拉伯胶、卡拉胶、黄原胶、瓜尔胶、结冷胶、果胶等多糖类或水。此外，作为添加剂，可以为鳌合剂等助剂、香料、香辛料提取物、防腐剂等。只要不损坏本发明的效果，可以配合稀释剂、载体、添加剂等。饮食品、医药组合物及化妆品中的岩藻多糖或其水解物和免疫赋活材料的配合量，根据与选择的其他配合成分的关系等进行适当选择，无特别限定。但是，通常的岩藻多糖或其水解产物和免疫赋活材料的合计量，在饮料或食品中、医药组合物中添加时，相对于个体体重60kg，为0.01g10g/日、优选0.05glg/日、特别优选0.05g0.5g/日。在化妆品中，使用0.0120重量％，优选0.0515重量％。本发明的岩藻多糖或其水解产物和低聚糖，可将其提取精制品、合成制品单独用于饮食品、医药组合物或化妆品。本发明并不限于上述各实施方式，在权利要求书所示的范围内可做各种变更，将不同的实施方式中分别公开的技术手段适当组合得到的实施方式也包括在本发明的技术范围内。实施例以下根据实施例对本发明进行具体说明，但本发明的范围并不限于这些实施例中。在以下实施例中，如果没有特别明确记载，均使用ECA-600型核磁共振装置(日本电子株式会社)进行丽R分析。使用重水(D20)作为测定溶剂。组成糖的结合方式用2D-N服分析。实施例1岩藻多糖组分的制备在日本冲绳海蕴藻体100g中加蒸馏水1000ml，IO(TC提取1小时。将得到的提取物冷却后，进行抽滤、电渗析(脱盐)并冷冻干燥，得到岩藻多糖组分2g。使该岩藻多糖在含有2NH2S04的10(TC的水溶液中水解1小时，得到的水溶液用2NNaOH中和，通过用ABEE荧光标记，制备分析单糖用样品。确认该组成糖的组成为，SFuc(硫酸基岩藻糖)GlcA(葡萄糖醛酸)Fuc(岩藻糖)Xyl(木糖)=49.3:4.9:12.1:1(图1)。色谱柱CosmosilC18AR—II(4.6mm4>X250mm)流动相含有10%乙腈的0.2M硼酸钾缓冲液流速LOml/分温度45°C检测荧光检测器(株式会社岛津制作所)、Ex:305nm、Em:360nm。实施例2岩藻多糖水解产物的制造和免疫功能调节作用的测定在下述各种条件下得到岩藻多糖水解产物，使用这些水解产物和乳酸菌的组合物，探讨免疫功能调节作用。水解的酸浓度对免疫功能调节活性的影响使实施例l得到的岩藻多糖在O.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、6.0N的HC1(80°C)中水解1小时，然后分别向其中添加0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、2.0、4.0、5.0、6.ON的NaOH中和后，经过用电渗析脱盐、冷冻干燥，得到岩藻多糖水解产物。将该水解产物以100ug/ml的浓度添加到从C57BL/6小鼠(8周龄、雄性、日本CharlesRiver株式会社)中分离的脾细胞(5X106cells/ml)中。30分钟后添加0.1Ug/ml的乳酸菌(Lactobacilluspentosus;FERMABP_10028)，培养24小时，回收培养上清，IFN-y的产生量用ELISA试剂盒(0ptEIA、BDPharmingen)测定(图2A)。此外，为了探讨岩藻多糖水解产物的单独效果，不用乳酸菌进行上述同样的操作(白色柱形图)。作为比较对照，使用不添加任何物质的样品(白色柱形图中的"none")、仅添加乳酸菌的样品(黑色柱形图中的"none")。其结果是，使水解得到的产物和乳酸菌并用后，与单独使用得到的结果相比较，IFN-y的产生得到协同增强。该协同效果通过在0.54.0N的HC1中水解得到的产物得到证明。此外，仅使用水解前的岩藻多糖进行上述实验，与其他样品比较效果(图2B)。其结果证明，在0.54.0N的HC1中水解得到的水解产物(图2B、白色柱形图)仅显示与水解前的岩藻多糖(图2B"岩藻多糖")同等程度的活性，但加入乳酸菌后(图2B、黑色柱形图)，显示高于岩藻多糖得到的活性。反应温度的影响将岩藻多糖在25、30、40、50、60、70、80、90、100°C的1NHC1中水解l小时，其后添加lNNaOH中和后，经过用电渗析脱盐、冷冻干燥，得到岩藻多糖水解产物。将该水解产物以100ug/ml的浓度添加到从C57BL/6小鼠(8周龄、雄性、日本CharlesRiver株式会社)中分离的脾细胞(5X10scells/ml)内。30分钟后添加0.lug/ml的乳酸菌(Lactobacilluspentosus;FERMABP-10028)，培养24小时，回收培养上清，IFN-y的产生量用ELISA试剂盒(OptEIA、BDPharmingen)测定(图3A)。此外，为了探讨岩藻多糖水解产物的单独效果，不用乳酸菌进行上述同样的操作(白色柱形图)。作为比较对照，使用不添加任何物质的样品(白色柱形图中的none)、仅添加乳酸菌的样品(黑色柱形图中的none)。其结果证明，通过并用在HC1中水解得到的岩藻多糖水解产物和乳酸菌，与单独使用时的结果相比，IFN-y的产生得到协同增强。该协同效果通过在2510(TC水解得到的全部产物得到证明，特别是在3090°C(优选508(TC)水解时效果良好。此外，仅使用水解前的岩藻多糖进行上述实验，比较该效果和本发明的效果。其结果证明，使在5010(TC的HC1中水解得到的产物和乳酸菌并用后，显示出比水解前的岩藻多糖的同等程度高的活性(图3B)。反应时间的影响使岩藻多糖在1N的HC1(80°C)中水解30、60、120分钟，然后添加1NNaOH中和后，经过用电渗析脱盐、冷冻干燥，得到岩藻多糖水解产物。将该水解产物以100yg/ml的浓度添加到从C57BL/6小鼠(8周龄、雄性、日本CharlesRiver株式会社)中分离的脾细胞(5X1(fcells/ml)内。30分钟后添加0.1yg/ml的乳酸菌(Lactobacilluspentosus;FERMABP-10028),培养24小时，回收培养上清，IFN-y的产生量用ELISA试剂盒(OptEIA、BDPharmingen)测定(图4)。此外，为了探讨岩藻多糖水解产物的单独效果，不用乳酸菌进行上述同样的操作。作为比较对照，使用不添加任何物质的样品、仅添加乳酸菌的样品。其结果证明，通过并用水解30120分钟后得到的全部产物和乳酸菌，与单独得到的结果相比，IFN-y的产生得到协同增强。因此证明，岩藻多糖水解产物通过和乳酸菌并用，具有协同增强的免疫功能调节或免疫赋活作用。实施例3精制的岩藻多糖水解产物的免疫功能调节作用将100ral的2NHC1加入到岩藻多糖lg中，8CTC酸水解1小时。接着用1NNaOH中和。使得到的反应液通过凝胶过滤(生物凝胶P-6(Bio-Rad))进行脱盐，进行冷冻千燥后得到含有岩藻多糖低聚糖混合物的组分(低聚糖组分)，将得到的岩藻多糖低聚糖混合物，提供给使用用甲酸活化的阴离子交换树脂(日本东曹株式会社(TosohCorporation))的色谱法。其结果，低聚糖组分被分离为含有用水洗脱得到的不含硫酸基的低聚糖的组分(Fr.B)，和含有用2NHC1洗脱得到的含有大量硫酸基的低聚糖的组分(硫酸化糖组分)。使硫酸化糖组分通过凝胶过滤(生物凝胶P-6)，分为分子量小于500的Fr.A和500以上的Fr.C。将上述精制的岩藻多糖水解产物的各组分分别以100yg/ml的浓度，添加到从C57BL/6小鼠(8周龄、雄性、日本CharlesRiver株式会社)中分离的脾细胞(5X106cells/ml)内。30分钟后添加0.1yg/ml的乳酸菌(Lactobacilluspentosus;FERMABP-10028)，培养24小时，回收培养上清，IFN-Y的产生量用ELISA试剂盒(OptEIA、BDPharmingen)测定(表l)。其结果是，对于岩藻多糖来说，浓度低时表现有活性，但其浓度增高后活性消失。另一方面，对于全部的水解产物(低聚糖各组分、Fr.AC、硫酸化糖各组分)来说，随着浓度的增加免疫赋活能力提高，并且要比岩藻多糖的活性强。特别是，证明低聚糖经过精制后活性增强。作为比较对照使用的单糖(岩藻糖、硫酸基岩藻糖)、作为益生菌被广泛使用的低聚木糖无上述作用。[表1]+0.1〃g/mI乳酸菌31030100Til)岩藻多糖9.810.25.2n.d.岩藻糖1.21.9—2.9硫酸基岩藻糖1.30.5一n.d.低聚糖组分n.d.n.d.5.59.6Fr.A10.517.221.215.8Fr.B4.66.711.021.2Fr.C5.011.519.321.0硫酸化糖组分0.019.8一21.3低聚木糖n.dn.d.一n.d乳酸菌00.1g/mln.d.n.d.实施例4岩藻多糖低聚糖的制造a)岩藻多糖的水解及低聚糖混合物的分离在实施例1得到的岩藻多糖组分lg中加入100ml的2NHCl，在50100°C酸水解1小时，接着用INNaOH中和。将得到的反应液通过凝胶过滤(生物凝胶P-6(Bio-Rad))进行脱盐，进行冷冻干燥后得到895mg岩藻多糖低聚糖混合物。将得到的岩藻多糖低聚糖混合物，提供给使用用甲酸活化的阴离子交换树脂(日本东曹株式会社)的色谱法。其结果，低聚糖混合物被分离为含有用水洗脱得到的不含硫酸基的低聚糖的组分(中性*酸性糖组分)280mg，和含有用2NHC1洗脱得到的含有大量硫酸基的低聚糖的组分(硫酸化糖组分)425mg。b)化合物(I)和(II)的分离将a)得到的中性'酸性糖组分100mg通过凝胶过滤(生物凝胶P-4(Bio-Rad)、洗脱溶剂0.2M硼酸钾(K2BA)水溶液)，从该组分中分离出分子量为340的二糖和分子量为486的三糖(化合物I、II:图5、6)。这些分子量通过FAB-MS求出(化合物(I)[M-H]—:339.2、化合物(II)[M-H]—:485.0)。在5mg这些化合物中加入水lml、ABEE(4—氨基苯甲酸乙酯)1.6g、NaBH3CN(氰基硼氢化钠)350mg、甲醇3.5ml、乙酸410ul，65。C搅拌4小时。通过使反应液在三氯甲烷和水中分配得到荧光标记的上述二糖和三糖约79mg。对这些标记的低聚糖测定的薩R及13C-NMR图谱如图710所示，其分析结果如表2、3所示。由这些结果可知，得到的分子量为340的二糖是用式(I)表示的a一D—GlcA—(1—2)—L一Fuc，分子量为486的三糖是用式(II)表示的a—D一GlcA—(1—2)—a—L—Fuc—(1—3)—L一Fuc。[表2]表2:荧光标记的化合物(i)的力-nmr和13c-mr分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>[表3]表3:荧光标记的化合物(II)的'H-MR和"C-MR分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>c)化合物an)(xi)的制造使硫酸化糖组分通过凝胶过滤(生物凝胶P-6(Bio-Rad))进行脱盐。在得到的硫酸化糖组分lOOmg中，加入水lml、ABEE(4—氨基苯甲酸乙酯)1.6g、NaBH3CN(氰基硼氢化钠)350mg、甲醇3.5ml、乙酸410ul，65。C搅拌4小时。将得到的产物在真空下干燥，在水和三氯甲垸中分配，将水层通过用反相柱(载体Lichropr印RP-8(25—40tim)(Merck)、小IOX220mm;溶剂条件5%CH3CN/0.1%TFA(100ml)、8%CH3CN/0.1%TFA(100ml)、15fl/。CH3CN/0.P/oTFA(lOOml)、20%CH3CN/0.1%TFA(100ml))处理，得到荧光标记的低聚糖混合物。将得到的荧光标记化合物利用HPLC(色谱柱cosmosil5C18—AR—II、4>10.OX250mm;溶剂条件:12.5%CH3CN/0.1%TFA(5分钟)、12.5-27.5%CH3CN/0.1%TFA(50分钟)；流速3ml/分钟)，用乙腈0.1%TFA水溶液以530%的浓度梯度洗脱，从混合物中分离出分子量为539、715、861、903、957、999的具有硫酸基的6个标记的岩藻多糖低聚糖(分子量用ESI—MS确定)。对得到的标记低聚糖测定丽R光谱，分析其结果。标记的低聚糖的力-NMR和13C-NMR的图谱如图1122所示，其分析结果如表47所示。根据上述结果，证明分子量539、715、861、903、957、999的化合物，分别是化合物(III)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)、(IX)的标记体。为了确认，将各低聚糖上结合的ABEE除去，得到再生的低聚糖的纯品。艮口、在所述分离的各标记低聚糖10mg(100nl)中，加入过氧化氢、乙酸各10ul，放置一昼夜后，干燥固化。在这样得到的再生低聚糖中，从分子量903的化合物中得到的化合物通过'H-丽R(图23)、T0F—MS(装置VoyagerDE-STR(AppliedBiosystems)、Ionmode:negative、Modeofoperation:reflector、Acceleratingvoltage:20kV、Matrix:2，5-dihydroxybenzoicacid)(图24)、ESI—MS/MS(图25)分析，结果表明的确是式(VII)的结构。此外，对于无法用上述方法分离的分子量420、858、900的化合物(分别为(IV)、(X)、(XI))，通过将反应混合物用FAB-MS/MS(装置HXU0A/HX110A(JEOL)、Ionmode:MS,MS/MS(negative)、Xeatombeam:5kV、Ionsourceacceleratingpotential:10kV、Collisionenergy:2keV、Matrix:Glycerol),以及ESI—MS—MS分析，确认其存在。图26表示(IV)的FAB-MS图谱，图27表示MS/MS图谱。此外，图28表示(X)和(XI)的FAB-MS图谱，图29、30分别表示各MS/MS图谱。根据上述结果可知，分子量为390的二糖是化学式(III)表示的a—L一Fuc—4一0—S0「一(1—3)—L一Fuc，分子量为420的二糖是化学式(IV)表示的a—D—GlcA-(1—2)—L一Fuc，分子量为566的三糖是化学式(V)表示的a—L—Fuc—4一0—S(V—(1—3)—[a—D_GlcA—(1—2)]—L—Fuc，分子量为712的四糖是化学式(VI)表示的a—L一Fuc—4一0—S(V—(1—3)—[a—D—GlcA—(1—2)]_a—L一Fuc—(1—3)—L—Fuc，分子量为754的四糖是化学式(VII)表示的a—L一Fuc—4—0—S0「一(1—3)—[a—D一GlcA—(1—2)]—a—L—Fuc—4—0—乙酰一(1—3)—L—Fuc，分子量为808的5糖是化学式(VIII)表示的[a—D—GlcA—(1—2)—a—L一Fuc—(1—3)]—[a—D—GlcA—(1—2)]—a—L—Fuc—(1—3)—L—Fuc，分子量为850的5糖是化学式(IX)表示的[a—D—GlcA—(1—2)—a—L一Fuc—(1—3)]—[a—D—GlcA—(1—2)]—4—0—乙酰一a—L一Fuc—(1—3)一L一Fuc，分子量为858的5糖是化学式(X)表示的a—L一Fuc—4一0—S0「一(1—3)—a—L一Fuc—(1—3)—[a—D—GlcA—(1—2)]—a—L一Fuc一(1—3)—L一Fuc，分子量为900的5糖是化学式(XI)表示的a—L一Fuc—4—0—S(V—(1—3)—a—L—Fuc—(1—3)—[a—D—GlcA—(1—2)]一a—L一Fuc—4—0—乙酰一(1—3)—L—Fuc。[表4]表4:荧光标记的化合物(III)的力-NMR和"C-NMR分析结果Position1-NMR(l),O)-N，(U:!0)ABEE-l]〗7.3_2，6131.8ir、115—.9「二414S).2H一O108.f)4331(2H,u,/=7.2llz)SI1i-343(311t,/=7.1Hz)Fuc-i((:h」、、.17.8-1、(W.7-3、cr一1onn:7S.4-4:l709(1H,dd,乂—-6.2,'丄)'■llz)力.4.(111,dq'/=12.(),3.1Hz)(;(;.!—一二[H,1—194(3H,〔1,/=(i.4liz)IK-7SFuc-1;J.081(IH.cl,/=9Hz)-2;182;idd,./=U).8,4.i仅)-3工;II、。:68.6」+sa「1，■，;、肌3—一;l:〗.歸(1H,q,/:(i.3llz)-C1L1.(J8i(3h,d，/=6.tiH'/.)15.9'表5:荧光标记的化合物(V)的W-NMR和W-NMR分析结果Position'H-顺(謂"C-NMR(D.力)(5一ABEE-1画画1!7.8-2.67.794(饥d，/=8.5Hz>13U-3,56.699(2H,d，/=8,2H幻112.4-4—-oo-169.44.257(mq，p7.1则61.81.加(組t,/二Y.1Hz)13.7Fuc-1(CH2)3.595(1H,dd'/:14.8'4.7Hz)3.557(mt,/二3.5Hz)-43.6-24.076-4-G55UH'm)77.0_33.860(m,d，/=8.7Hz)77.3-43.729(1h,d,/=8.5Hz)73.2_54109(ih,q，/=6.5起65.61.173(3H,d,/=6.4Hz)1S.6G!cA-J5.川(m,d,/=3.4Hz)98.5-23.556-3.526(1H，m)70.9_33.644(1H,t,/二9.2Hz)72.6—43.柳(l比t,/UHz)-54.l化UH,d,_/=Hz)71.2-C00H-17U5.036UH,d'_/=3.7Hz)跳6-23.768(1H,dd,/=10.8.3.7Hz)68.2-33.843t,/=5.bHz)能64.371m)肌3_53,911uh'q,/=6.4Hz)66.91.038(犯，d,/=6.4Hz)15.8[表6]表6:荧光标记的化合物(VI)的111-NMR和"C-NMR分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>[表7]表7:荧光标记的化合物(\U)的'H-NMR和"C-NMR分析结果<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>实施例5在日本冲绳海蕴藻体100g中加入1000ml的2NHC1，在50100。C酸水解1小时。将得到的提取物冷却后，进行抽滤、电渗析(脱盐)并冷冻干燥，得到2g岩藻多糖组分。将得到的岩藻多糖组分用ABEE荧光标记后通过ESI—MS(4000QTRAPLC/MS/MS体系(A卯liedBiosystems)分析条件Polarity:Negativeionmode;DeclusteringPotential:-50v;Collisionenergy:-10eV;Temperature:550°C)分析的结果，得到图31所示的图谱，确认式(I)(XI)所示的岩藻多糖低聚糖存在。实施例6岩藻多糖低聚糖化合物和乳酸菌组合的协同效果对小鼠脾细胞的IFN-y诱导作用在与实施例3同样制备的脾细胞5X106Cells/ml中，使分子量为340的岩藻多糖低聚糖(化合物(I))为衡g/ml，添加到培养孔(well)内。作为比较对照使用等量的岩藻糖和硫酸基岩藻糖(匿分别为164、244)、低聚木糖(X0S)。30分钟后，分别在各培养孔中添加乳酸菌(Lactobacilluspentosus;FERMABP-10028)(死菌)0.lyg/ml。培养24小时后，回收培养上清，IFN-y的产生量用ELISA试剂盒(0ptEIA、BDPharmingen)测定(图32A)。此外，为了确认糖的单独效果，不用乳酸菌进行上述同样的操作。此外，对于化合物(11)，进行与化合物(I)同样的实验。使用的化合物(II)的量，在培养孔中为10、100和300lig/ml(图32B)。对于化合物(I)，将其和乳酸菌并用后得到显著增强的IFN-y诱导能力(图32A)。该作用强度之大是根据分别单独使用化合物(I)和乳酸菌得到的效果(图32A中从左开始的第2个到从右开始的第5个)所无法预料的，证明通过两者并用产生协同效果。此外，对于化合物(n)，也同样证明其和乳酸菌的协同效果(图32B)。组成成分的岩藻糖、硫酸基岩藻糖没有这样的活性，作为益生菌被广泛使用的低聚木糖也没有这种作用。因此，本发明的岩藻多糖低聚糖通过和乳酸菌并用，可协同活化脾细胞，在生物体免疫功能调节方面非常有用。此外，在同样制备的脾细胞中，将化合物(I)(VII)中的化合物任意3种均等混合后的混合物以50ug/ml的浓度添加到其中，30分钟后将乳酸菌(Lactobacilluspentosus;FERMABP-10028)(死菌)以0.1ug/ml分别添加到各培养孔中。培养24小时后，回收培养上清，测定IFN-Y的产生量(图33)。如图所示，使用(V)、(VI)和(VII)的混合物，(1)、(V)和(VI)的混合物，以及(1)、(V)和(VII)的混合物后，观察到高的IFN-y产生量。由此可知，即使化合物(I)(XI)混合时，通过和乳酸菌并用，也会提高免疫功能调节活性。实施例7岩藻多糖低聚糖的对来自小鼠的树突状细胞的IL-IO、12诱导作用和CTL活性增强作用从BALB/c小鼠(8周龄、雄性、日本SLC株式会社)的大腿骨分离骨髓细胞，使其悬浮于含有10%FBS、20ng/mlGM-CSF(P印rotec)、20ng/ml1L—3(P印rotec)的RPMI1640培养基中，调整为1X106cells/ml，在24孔板上培养。培养开始第3、5天更换培养基，得到黏性未成熟树突状细胞。将得到的树突状细胞用化合物(1)、(H)、(III)、(V)、(VI)和(VII)分别以50"g/ml的浓度进行预处理。在预处理30分钟后，将乳酸菌(Lactobacilluspentosus;FERMABP-10028)(死菌)以0.1ng/ml分别添加到各培养孔内。培养2天后，回收培养上清和细胞。此外，为了确认糖化合物的单独效果，不添加乳酸菌进行上述同样的操作。对回收的培养上清用ELISA试剂盒测定IL-12和IL-IO。结果分别如图34、35所示。化合物(I)和乳酸菌并用后协同诱导IL-12(图34)。此外，化合物(11)、(III)和(V)和乳酸菌并用后诱导IL-10(图35)。由上述可知，本发明发现的岩藻多糖低聚糖具有对生物体免疫功能进行正及负调节(使降低的免疫活化，或使抑制过剩的免疫反应)的功能。低聚木糖没有这种作用。对回收的细胞计数，制备成1X105cells/ml后，在lml的细胞悬浮液中处理丝裂霉素C(50yg/ml)，37t:反应30分钟。反应结束后，用PBS洗涤除去丝裂霉素C，添加lml根据常法制备的C57BL/6小鼠的脾细胞(5X106Cells/ml)，混合培养4天。回收培养后细胞，将具有C57BL/6小鼠的同种异型抗原的P-815细胞(5000cells/100ix1)作为耙细胞，以E:T比为40:1和80:1的比例反应4小时，通过用流式细胞仪对杀伤的P-815的数量计数，求出CTL活性(图36)。确认化合物(1)、(III)、(V)、(VI)、(VII)和乳酸菌并用后，也能增强CTL活性。实施例7的结果也表明，通过使本发明的岩藻多糖水解产物和乳酸菌组合，能够得到协同增强的免疫功能调节或免疫赋活作用。实施例8与几乎没有免疫功能调节活性的乳酸菌并用协同增强IL-12的产生给BALB/C小鼠(8周龄、雄性、日本SLC株式会社)腹腔内投与4.05%硫乙醇酸盐培养基(Difco)，4天后使用10ml的PBS回收腹腔内浸润的细胞。然后制备成lX106cells/ml，在24孔板上培养。培养开始3小时后，通过交换培养基除去浮游细胞，得到巨噬细胞。在各培养孔中将化合物(I)和实施例3记载的低聚糖组分以100ug/ml的浓度添加，30分钟后，将免疫功能调节活性强的乳酸菌(LactobacilluspentosusDS84C株;独立行政法人产业技术综合研究所专利生物寄存中心2004年5月26日收领的FERMABP-10028)、或几乎没有免疫功能调节活性的乳酸菌(市售的Lactobacilluspentosus(以下称乳酸菌A))(市售的Lactobacillusplantarum(以下称乳酸菌B))以0.1ug/ml的浓度添加，培养24小时。然后回收培养上清，测定IL-12的产生量(图37)。为了比较，分别单独使用上述3种菌株进行与上述同样的操作。不论是乳酸菌A还是乳酸菌B，其自身均没有显示可检测程度的IL-12诱导活性，但将这些菌株和化合物(I)或低聚糖组分并用后，得到了显著增大的IL-12诱导活性。由此证明，本发明得到的岩藻多糖水解产物，即使与没有免疫功能调节活性的乳酸菌并用，也能发挥协同增强的免疫功能调节作用。实施例9与乳酸菌以外的物质的协同效果从C57BL/6小鼠(8周龄、雄性、日本CharlesRiver株式会社)中分离脾细胞，制备成5X106CellS/ml，在24孔板上培养。使实施例3的Fr.C组分分别成为30yg/ml，并添加到各培养孔中。30分钟后，作为具有免疫赋活作用或免疫功能调节作用的物质，分别将PolyI:C(SIGMA)5ug/ral、LPS(SIGMA)2ng/ml、CpG-0DN(5，—TCCATGACGTTCCTGATGCT—3，从IntegratedDNATechnologies,Inc.得到)3yg/ml、腿46癌抗原(将醒46乳腺癌细胞在HANK，s溶液(NacalaiTesque)中均质化，从中提取的蛋白质帝京大学医真菌研究中心提供)50ngprotein/ml、ConA(和光纯药)0.25yg/ml，分别添加到培养孔内。培养24小时后，回收培养上清，IFN-y的产生量用ELISA试剂盒(0ptEIA、BDPharmingen)测定(图38)。为了比较，不使用Fr.C进行上述同样操作。各免疫功能调节物质在本次实验中使用的浓度下，几乎没有诱导IFN-y。但是，将这些物质和Fr.C即岩藻多糖水解产物(低聚糖)并用后，得到强的IFN-y诱导能力。由此证明，岩藻多糖水解产物和从其中得到的低聚糖，不仅在和乳酸菌并用时，和其他免疫赋活材料并用时也能使这些材料的免疫赋活或免疫功能调节作用提高。实施例10NK活性增强效果(体内)(Invivo)将C57BL/6小鼠(8周龄、雄性、日本CharlesRiver株式会社)分为4组，分别将单独的岩藻多糖水解产物(实施例3记载的硫酸化糖组分500mg/kg、图39的"岩藻多糖低聚糖")、单独的乳酸菌(0.2mg/kg)、岩藻多糖水解产物+乳酸菌(图39的"乳酸菌+岩藻多糖低聚糖")混在饮水中，使其自由摄取。使对照组摄取自来水。摄取开始1周后，根据规定方法从小鼠内分离脾细胞，将Yac-l细胞(5000cells/100u1)作为耙细胞测定NK活性。NK活性通过下述方法求出，即使以E:T比为20:1、40:1的比例反应4小时后，用流式细胞仪对杀伤的Yac-1的数量计数(图39)。摄取从岩藻多糖中得到的岩藻多糖低聚糖后NK活性提高。进而通过并用岩藻多糖和乳酸菌，NK活性更高。因此，通过体内(Invivo)也可确认通过摄取岩藻多糖水解产物和乳酸菌的组合物，使免疫功能活化。实施例11岩藻多糖和乳酸菌组合的协同效果对小鼠脾细胞的IFN-y诱导作用在与实施例3同样制备的脾细胞5X106Cells/ml内，使岩藻多糖A(株式会社SouthProduct)、岩藻多糖B(株式会社冲绳发酵化学)、岩藻多糖C(实施例l制备)分别为1、10、100yg/ml，并添加到培养孔内。添加岩藻多糖30分钟后，分别将乳酸菌(Lactobacilluspentosus;FERMABP—10028)(死菌)以O.lug/ml添加到各培养孔内。培养24小时后，回收培养上清，IFN-y的产生量用ELISA试剂盒(0ptEIA、BDPharmingen)测定(图40)。此外，为了确认岩藻多糖的单独效果，不用乳酸菌进行与上述同样的操作。分别单独使用3种岩藻多糖时，确认有IFN-y诱导能力。进而将这些物质与乳酸菌并用，其活性比预想的更强。由此证明，岩藻多糖通过和乳酸菌并用，能够协同地使脾细胞活化，在生物体的免疫功能调节方面非常有用。权利要求1.组合物，其含有岩藻多糖或岩藻多糖水解产物和免疫赋活材料。2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述水解产物是使岩藻多糖在0.l6.0N的酸中，在25100。C下水解0.252.5小时后得到的产物。3.如权利要求2所述的组合物，其中，所述水解产物是使岩藻多糖在0.54.ON的酸中，在309(TC下水解0.52.0小时后得到的产物。4.如权利要求13中任一项所述的组合物，其中，所述水解在盐酸或硫酸中进行。5.如权利要求14中任一项所述的组合物，其中，所述水解产物是低聚糖。6.如权利要求5所述的组合物，其中，所述低聚糖是从由岩藻糖、硫酸基岩藻糖、乙酰基岩藻糖、以及葡萄糖醛酸组成的组中选择的至少一种糖所构成的二糖到五糖的低聚糖。7.如权利要求6所述的组合物，其中，作为所述低聚糖，含有从下述结构式(i)、(n)、(m)、(rv)、(v)、(vi)、(vn)、(週)、(do、(x)以及(xi)所示的化合物中选择的至少一种。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula><formula>formulaseeoriginaldocumentpage6</formula>8.如权利要求17中任一项所述的组合物，其中，所述免疫赋活材料是从乳酸菌、酵母、真菌类的微生物；香菇、灰树花、灵芝、阿加利格斯菇等蘑菇类；含有CpG基序的免疫原性寡聚脱氧核苷酸、聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸类的来自核酸的物质；脂多糖、e—葡聚糖；海藻类；中药；腿46癌抗原类的抗癌疫苗；刀豆蛋白A;B腹中选择的至少一种。9.如权利要求8所述的组合物，其中，所述免疫赋活材料是乳酸菌。10.免疫功能调节剂，其含有权利要求19中任一项所述的组合物。11.饮食品，其中添加有权利要求19中任一项所述的组合物。12.医药组合物，其含有权利要求19中任一项所述的组合物。13.化妆品，其含有权利要求19中任一项所述的组合物。全文摘要提供使乳酸菌等免疫赋活材料的活性增强的材料。通过提供这样的材料，可使免疫赋活材料的使用量减少。并且，通过提供这样的材料，可缩短用于筛选具有强的免疫赋活活性和良好的发酵特性的乳酸菌的时间。为了实现上述目的，将由酸水解岩藻多糖得到的产物或低聚糖和免疫赋活材料组合使用。通过这样的组合，使所述物质的免疫功能调节作用或免疫赋活活性协同增强。文档编号A61K45/00GK101282732SQ20068003601公开日2008年10月8日申请日期2006年7月28日优先权日2005年7月29日发明者安元健,楠元俊英,直木秀夫,野中裕司申请人:三得利株式会社;热带科技中心株式会社