专利名称：在螯合剂存在下具有高稳定性的变体和包含变体的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及与其亲本酶相比针对螯合剂具有改善的稳定性的α -淀粉酶变体，包含所述变体的组合物，编码所述变体的核酸，产生所述变体的方法，和使用所述变体的方法。
背景技术：
α -淀粉酶(α -I, 4_葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. I. I)由一组酶组成，其催化淀粉和其它直链和支链1，4-糖苷寡糖和多糖的水解。·α -淀粉酶在例如洗涤剂、烘焙、酿造、淀粉液化和糖化，如在制备高果糖糖浆或作为从淀粉产生乙醇的一部分中，具有悠久的产业应用历史。许多这些和其他的α-淀粉酶应用使用来源于微生物的α-淀粉酶，特别是细菌α-淀粉酶。首先使用的细菌α -淀粉酶中包括来自地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis)的α -淀粉酶，也称作Termamyl,其已经得到广泛表征并已经确定了该酶的晶体结构。碱性淀粉酶，如源自披露于WO 95/26397中的芽孢杆菌属菌种的α -淀粉酶，形成了用于洗涤剂的特定的α-淀粉酶组。已经对很多这些已知的细菌淀粉酶进行了修饰，以改进它们在具体应用中的功能性。Termamyl和很多高效α -淀粉酶的活性都需要|丐。发现Termamyl的晶体结构中四个钙原子通过带负电荷的氨基酸残基配位结合在α-淀粉酶结构中。在其他α-淀粉酶中，结合在结构中的钙离子的量可能不同。对于钙的需要在存在强螯合化合物的应用中，如在洗涤剂或从全谷物产生乙醇的过程中是缺点。如上所述，众所周知多种酶依赖于钙或其他金属离子如酶或锌以供其活性和稳定性，因此在包含螯合剂的组合物，例如含有螯合剂的洗涤剂或供用于产生生物燃料、其中植物材料或含淀粉材料具有天然螯合剂成分如例如植酸的组合物中开发既稳定又显示良好性能的酶是一个挑战。举例而言，添加或掺入螯合剂以在洗涤过程中降低水硬度，保护可能还存在的漂白剂，且螯合剂亦对一些污迹的去除具有直接作用。钙依存性酶在洗涤剂中的稳定性有时可通过将钙添加至该洗涤剂而改善，但常常这样做会随即破坏污迹去除作用。此外，将钙添加至液体洗涤剂可导致配制上的问题，即洗涤剂的物理稳定性。
发明内容
因此，提供如下α -淀粉酶的组合物和变体会是有利的，其对于螯合剂是稳定的，并优选与亲本α-淀粉酶相比具有得到保持或提高的洗涤性能。因此，本发明的第一个方面涉及组合物，其包含亲本α-淀粉酶的变体，其中所述变体在选自使用根据 SEQ ID Ν0:6 编号的 195、193、197、198、200、203、206、210、212、213 和243的一个或多个位置包含取代，并且还包含至少一种螯合剂，其中当在21°C和pH 8. O测量时，所述螯合剂在低于IOmM的浓度能够将游离钙离子的浓度从2. OmM减少至O. 10mM。另一个方面涉及组合物，其包含亲本α-淀粉酶的变体，其中所述变体在选自使用根据 SEQ ID Ν0:6 编号的 195、193、197、198、200、203、206、210、212、213 和 243 的一个或多个位置包含取代，并且还包含至少一种螯合剂，其中当在21°C和pH 8. O测量时，所述螯合剂能够在低于O. 9倍能够将钙离子的浓度从2. OmM减少至O. IOmM的柠檬酸盐浓度的螯合剂浓度将游离钙离子浓度从2. OmM减少至O. 10mM。本发明进一步涉及用于制备多肽的方法，包括(a)提供具有淀粉酶活性的亲本多肽的氨基酸序列；(b)选择占据对应于SEQ ID NO:6的成熟多肽的位置195、197、198、200、203、206、210、212、213、243的一个或多个位置的一个或多个氨基酸，并进一步选择对应于位置116、 118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447、458的一个或多个位置；(c)通过取代或缺失选定的氨基酸残基或邻接选定的氨基酸残基插入一个或多个氨基酸残基来修饰所述序列；(d)产生具有修饰序列的变体多肽；(e)测试所述变体多肽的淀粉酶活性和稳定性；和(f)选择在螯合剂存在下相对于亲本多肽稳定性增加并具有淀粉酶活性的变体多肽，其中在21°C和pH 8. 0，所述螯合剂在低于IOmM的浓度能够将游离钙离子的浓度从2. OmM 减少至 O. IOmM0在一个优选的方面，本发明涉及亲本α -淀粉酶的变体，所述变体在对应于选自195、197、198、200、203、206、210、212、213和243的位置的一个或多个位置包含改变，并进一步在对应于选自 116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447和458的位置的一个或多个位置包含改变，其中(a)所述各改变独立地为(i)紧接着该位置下游并邻接该位置插入氨基酸，(ii)缺失占据该位置的氨基酸，和/或(iii)取代占据该位置的氨基酸，(b)该变体具有α -淀粉酶活性；并且(c)每个位置对应于具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的酶的氨基酸序列的位置。在另一个方面，本发明涉及亲本α-淀粉酶的变体，所述变体在181、182、183或184的氨基酸区中包含至少一个、至少两个或至少三个缺失，并进一步在选自195、197、198、200、203、206、210、212、213和243的一个或多个位置包含改变，并进一步在选自116、118、129、133、142、146、147、149、151、152、169、174、186、235、244、303、320、339、359、418、431、434、447和458的一个或多个位置包含改变，其中(a)所述各改变独立地为(i)紧接着该位置下游并邻接该位置插入氨基酸，(ii)缺失占据该位置的氨基酸，和/或(iii)取代占据该位置的氨基酸，(b)该变体具有α -淀粉酶活性；并且
(c)每个位置对应于具有SEQ ID NO:6的氨基酸序列的酶的氨基酸序列的位置。本发明进一步涉及编码本发明的变体的分离的核苷酸序列和包含编码本发明的变体的核苷酸序列的重组宿主细胞。发明详述定义 α -淀粉酶(α -I, 4_葡聚糖_4_葡聚糖水解酶，Ε. C. 3. 2. I. I)由一组酶组成，其催化淀粉和其它直链和支链1，4-糖苷寡糖和多糖的水解。已知α -淀粉酶来源于广泛选择范围的生物，包括细菌，如来自芽孢杆菌属(Bacillus)的种，例如地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis),来自真菌的种，如米曲霉(Aspergillus oryzae) (TAKA-淀粉酶)或黑曲霉(Aspergillusniger);来自植物如大麦和来自哺乳动物。野生型酶术语“野生型” α-淀粉酶指由天然存在的微生物，如见于自然界的细菌、酵母或丝状真菌表达的α-淀粉酶。当亲本酶并非变体酶时，术语“野生型酶”和“亲本酶”可互换使用。变体酶术语“变体”在本文中定义为具有α -淀粉酶活性的多肽，其在亲本或野生型α-淀粉酶的一个或多个(或一个或几个)特定位置包含一个或多个(或一个或几个)氨基酸残基的改变，如取代、插入和/或缺失。优选少于50个修饰，更优选少于30个修饰。改变的α-淀粉酶藉由通过修饰亲本α-淀粉酶的人为介入来获得。亲本酶术语“亲本”α -淀粉酶如用于本文中意指这样的α -淀粉酶，本发明的变体α-淀粉酶是对其进行修饰而产生的。该术语还指本发明的变体与之进行比较的多肽。所述亲本可为天然存在(野生型)的多肽，或甚至可为其通过任何合适手段制备的变体。举例而言，所述亲本蛋白可为天然存在的多肽的变体，其氨基酸序列经修饰或改变。因此，所述亲本α -淀粉酶可具有一个或多个(或一个或几个)氨基酸取代、缺失和/或插入。因此所述亲本α_淀粉酶可为亲本α_淀粉酶的变体。亲本亦可为等位变体，其为由任何占据相同染色体基因座的基因的两种或更多种可选形式编码的多肽。改善的特性术语“改善的特性”在本文中定义为与变体相关的特征，其相对于亲本α-淀粉酶得到改善。此类改善的特性包括但不限于增加的淀粉分解活性，例如当如本文实施例部分中所述在EnzChek测定或PNP-G7测定中测量时，增加的洗涤性能，如污物性能，例如对含有淀粉的污物、污物去除、抗变灰色(anti-greying)的性能,稳定性例如热稳定性、PH稳定性或助洗剂包括螯合剂存在下的稳定性，在粉末、液体或凝胶洗涤剂配制物或洗碟组合物中的稳定性，改变的温度依存性性能和活性分布，PH活性，底物特异性，产物特异性和化学稳定性。洗涤性能和/或洗碟性能可如本申请中下文“材料和方法”中所述进行测量。优选本发明的变体包括改善的性质如改善的稳定性，改善的洗涤性能，改善的洗碟性能和/或改善的洗涤剂中的活性的组合。改善的稳定性包括在储藏过程中在浓缩洗涤剂产物中的稳定性和在洗涤过程中在稀释洗涤剂中的稳定性。改善的特性包括在低温下改善的洗涤或洗碟性能。活性在本文语境中，术语“活性”为淀粉分解活性，其通过在特定条件下在含有三个或更多个1，4-α-连接的D-葡萄糖单元的多糖中如例如在淀粉中，每单位时间和每单位酶蛋白水解的1，4-a -D糖苷键的数量来测量，例如，在特定条件下每mL以g计的酶蛋白的酶样品而获得的活性。所述活性可在例如下文中在“材料和方法”中所述的EnzChek测定或PNP-G7测定中测量。在本申请中，术语“活性”可与“淀粉分解活性”互换使用。术语“比活性”常常用于描述每mL (或g)的酶蛋白获得的最大活性。改善的化学稳定性术语“改善的化学稳定性”在本文中定义为变体酶在减少亲本酶的酶活性的天然存在或合成的一种或多种化学物存在下温育一段时间之后，呈现酶活性的保持。改善的化学稳定性亦可导致在此类化学物的存在下能够更好地催化反应的变体。在本发明的一个具体方面，所述改善的化学稳定性是在洗涤剂中，特别是在液体洗涤剂中改善的稳定性。所述改善的洗涤剂稳定性具体而言是当本发明的α-淀粉酶变体混合入包含螯合剂的液体洗涤剂配制物中时，改善的α -淀粉酶活性的稳定性，其中所述液体亦包括凝胶或糊剂。所述液体洗涤剂配制物可指在洗衣或自动洗碟过程中添加的浓缩的洗涤齐U，或稀释的洗涤剂如洗涤溶液，即添加了所述浓缩洗涤剂的水溶液。在本发明中，液体洗涤剂具体而言可用作液体洗衣洗涤剂。稳定性术语“稳定性”包括储藏稳定性和使用过程中，例如洗涤工艺过程或其他工业工艺中的稳定性，且淀粉酶的稳定性反映为时间的函数，例如，当将淀粉酶保持在溶 液，特别是在洗涤剂溶液中，保留了多少活性。举例而言，所述α-淀粉酶变体可在31°C下18小时之后，具有超过70%的剩余活性，即保留活性的量。所述稳定性受许多因素影响，例如PH，温度，洗涤剂组成例如助洗剂、表面活性剂等的量和类型。淀粉酶稳定性使用“材料和方法”中所述的EnzCheck测定或PNP-G7测定来进行测量。改善的稳定性术语“改善的稳定性”在本文中定义为变体酶呈现增加的稳定性，所述稳定性比亲本ct -淀粉酶的稳定性更高,例如，当在“材料和方法”中所述的EnzCheck测定中测量时，在31°C在1.5%(w/v)DTPA的存在下在pH 8下18小时之后，相对于亲本具有超过70%的剩余活性,或具有至少IOpp剩余活性的改善。变体相对于亲本在剩余活性上的百分点(PP)改善计算为“材料和方法”中所述的变体的剩余活性和亲本的剩余活性之间的差异。助洗剂助洗剂可通过M. K. Nagarajan 等,JAOCS, Vol. 61, no. 9 (September1984)，pp. 1475-1478描述的测试进行分类以确定在溶液中在pH 8将水硬度从2. OmM(按CaCO3)降至O. IOmM所需的最低助洗剂水平。所述助洗剂可具体而言为螯合剂，其与例如钙和镁离子形成水溶性络合物。螯合剂为与某些金属离子形成分子，使所述离子失活从而使其无法与其他元素反应的化学物，因此为通过形成螯合物抑制化学活性的结合剂。螯合作用是配体和单个中心原子之间的两个或更多个单独结合的存在或形成。所述配体可为任何有机化合物、硅酸根或磷酸根。在本文语境下，术语“螯合剂”包括与金属离子如钙和镁形成水溶性络合物的螯合剂、络合剂或掩蔽剂。螯合作用描述螯合配体对金属离子的亲和力相对于类似的一组非螯合配体对相同金属的亲和力的增强。螯合剂具有与金属离子特别是钙(Ca2+)离子的结合能力，并广泛应用于洗涤剂，和一般用于洗涤如洗衣或洗碟的组合物。然而，螯合剂自身呈现出抑制酶活性。在本申请中，术语螯合剂与“络合剂”或“螯合剂”可互换使用。由于大多数α -淀粉酶具有钙敏感性，螯合剂的存在可影响酶活性。α -淀粉酶的钙敏感性可通过将给定α-淀粉酶在强螯合剂的存在下温育，并分析该温育对所述α-淀粉酶的活性的影响来确定。钙敏感性α-淀粉酶会在温育过程中丧失其活性的主要部分或全部。
表征性螯合剂如上所述，螯合作用描述螯合配体对金属离子的亲和力相对于一组类似的非螯合配体对相同金属的亲和力的增强。然而，该螯合作用的强度可通过多种类型的测定或测量方法决定，由此根据其螯合作用(或强度)对螯合剂进行区分和排位。在一个优选的测定中，螯合剂可表征为其在pH 8. O将游离钙离子(Ca2+)浓度从2. OmM减少至O. IOmM或更低的能力，例如通过以M. K. Nagarajan等，JAOCS, Vol. 61，no. 9 (September 1984)，pp. 1475-1478 所述的方法为基础的测试进行。使用基于Nagarajan等的方法对螯合剂进行表征的实例描述于实施例2a。优选地，本发明的螯合剂涵盖当在21°C在pH 8. O下测量时，能够在低于10mM，优选低于9. 5mM，优选低于9mM,优选低于8. 5mM,优选低于8mM，优选低于7. 5mM,优选低于7mM，优选低于6. 5mM,优选低于6mM,优选低于5. 5mM,优选地,优选低于5mM,优选低于4. 5mM,低于4mM,优选低于3. 5mM,优选低于3mM，优选低于2. 5mM，优选低于2mM，优选低于I. 5mM或优选低于ImM的浓度将游离钙离子的浓度从2. OmM减少至O. ImM或更低的螯合剂。优选地，本发明的螯合剂涵盖当在21 °C在pH 8，在80mM氯化钾和49mM EPPS((4-(2-羟乙基)哌嗪-I-丙磺酸))中测量时，能够在低于10mM，优选低于9. 5mM，优选低于9mM，优选低于8. 5mM,优选低于8mM，优选低于7. 5mM,优选低于7mM，优选低于6. 5mM,优选低于6mM,优选低于5. 5mM,优选地,优选低于5mM,优选低于4. 5mM,低于4mM,优选低于
3.5mM，优选低于3mM，优选低于2. 5mM，优选低于2mM，优选低于I. 5mM或优选低于ImM的浓度将游离钙离子的浓度从2. OmM减少至O. ImM的螯合剂。在一个具体的优选实施方案中，所述螯合剂当在pH 8和21°C，在80mM氯化钾和49mM EPPS中测量，并如“材料和方法”中所述使用钙离子选择性电极确定游离钙浓度时，能够将游离钙离子浓度从2. OmM减少至O. ImM。因此优选地，所述螯合剂涵盖当如“材料和方法”中所述在PH 8. O和21°C测试时，能够在低于10mM，优选低于9. 5mM,优选低于9. OmM,优选低于8. 5mM,优选低于8. OmM,优选低于
7.5mM,优选低于7. OmM,优选低于6. 5mM,优选低于6. OmM,优选低于5. 5mM,优选地，优选低于5. OmM,优选低于4. 5mM,低于4. OmM,优选低于3. 5mM,优选低于3. OmM,优选低于2. 5mM,优选低于2. OmM,优选低于I. 5mM或优选低于I. OmM的浓度将游离钙离子浓度从2. OmM减少至0. IOmM的螯合剂。在一个特别优选的实施方案中，所述螯合剂当在pH 8和21°C在80mM氯化钾和49mM EPPS中测量时，能够以9mM至0. 5mM,优选9mM至ImM，优选8mM至ImM，优选7mM至ImM,优选6mM至ImM,优选5mM至ImM,优选4mM至ImM,优选3mM至ImM,优选2mM至ImM,优选 9. OmM 至 I. 5mM,优选 8. OmM 至 I. 5mM,优选 7. OmM 至 I. 5mM,优选 6. OmM 至 I. 5mM,优选
5.OmM 至 I. 5mM,优选 4. OmM 至 I. 5mM,优选 3. O 至 I. 5mM,优选 2. 5mM 至 I. OmM,优选 2. OmM至I. ImM，优选I. 85mM至I. OmM的浓度将游离钙离子的浓度从2. OmM减少至0. 10mM。游离钙离子浓度从2. OmM Ca2+减少至0. IOmM,对应于将水硬度从200ppm(按CaCO3，在酸性CO2存在下为Ca(HCO3)2的形式)减少至lOppm。最低助洗剂水平从螯合剂的钠盐计算，并基于100%干螯合剂。螯合剂的螯合作用亦可相对于柠檬酸盐(citrate)测量。将能够将游离钙离子浓度的量从2. OmM减少至0. IOmM的柠檬酸盐的浓度的值指定为1，并将螯合剂的结果与该值相比较。根据本发明优选的螯合剂当在PH 8. O和21°C测量时，能够以与柠檬酸盐的浓度相比低至低于0. 9，如低于0. 8，如低于0. 7，如低于0. 6，如低于0. 5，如低于0. 4，如低于0. 3，如低于O. 2，如低于O. I倍的浓度将游离钙离子的浓度从2. OmM减少至O. 10mM。根据本发明优选的螯合剂当使用钙离子选择性电极确定游离钙浓度时，当在21°C和pH 8. O在80mM氯化钾和49mM EPPS中测量时，能够以与柠檬酸盐的浓度相比低至低于O. 9，如低于O. 8，如低于O. 7，如低于O. 6，如低于O. 5，如低于O. 4，如低于O. 3，如低于O. 2，如低于O. I倍的浓度将游离钙离子的浓度从2. OmM减少至O. 10mM。在一个特别优选的实施方案中，当在pH 8. O和21°C测量时，所述螯合剂能够以与下述柠檬酸盐浓度相比低至低于I. O至O. I，如低于O. 9至O. I，如低于O. 8至O. 1，如低于O. 7至O. 1，如低于O. 6至O. 1，如低于O. 5至O. 1，如低于O. 4至O. 1，如低于O. 35至O. 1，如低于O. 3至O. I倍的螯合剂浓度将游离钙离子的浓度从2. OmM减少至O. 10mM，所述柠檬酸盐的浓度能够将游离钙离子的浓度从2. OmM减少至O. 10mM。因此本发明的一个优选实施方案涉及组合物，其包含亲本α-淀粉酶的变体，其
中所述变体使用根据SEQ ID Ν0:6的编号在193至213范围的一个或多个位置包含取代，且进一步包含至少一种螯合剂，其中当在21°C和pH 8测量时，所述螯合剂能够在低于下述柠檬酸盐浓度的O. 9倍的螯合剂浓度将游离钙离子浓度从2. OmM减少至O. 10mM，所述柠檬酸盐的浓度能够将将游离钙离子的浓度从2. OmM减少至0. 10mM。本发明的一个进一步的实施方案涉及组合物,其包含亲本α-淀粉酶的变体，其中所述变体α-淀粉酶使用根据SEQ ID Ν0:6的编号在选自193、195、197、198、200、203、206、210、212和213的一个或多个位置包含取代，且进一步包含至少一种螯合剂，其中当在21°C和pH 8. O测量时，所述螯合剂能够在低于IOmM的浓度将游离钙离子浓度从2. OmM减少至 0. 10mM。本发明的一个进一步的实施方案涉及组合物,其包含亲本α-淀粉酶的变体，其中所述变体α-淀粉酶使用根据SEQ ID Ν0:6的编号在选自193、195、197、198、200、203、206、210、212和213的一个或多个位置包含取代，且进一步包含至少一种螯合剂，其中当在21°C和pH 8. O测量时，所述螯合剂能够在低于IOmM的浓度将游离钙离子浓度从2. OmM减少至0. IOmM,且任选地包含清洗助剂(cleaning adjunct)。本发明的一个进一步的实施方案涉及组合物,其包含亲本α-淀粉酶的变体，其中所述变体α -淀粉酶包含与SEQ ID NO:6至少70%相同的氨基酸序列，并进一步使用根据 SEQ ID Ν0:6 的编号在选自 193、195、197、198、200、203、206、210、212 和 213 的一个或多个位置包含取代，且进一步包含至少一种螯合剂，其中当在21°C和pH 8. O测量时，所述螯合剂能够在低于IOmM的浓度将游离钙离子浓度从2. OmM减少至0. 10mM。因此，本发明的螯合剂能够在低于下述柠檬酸盐的浓度的浓度将游离钙离子浓度从2. OmM减少至0. IOmM,所述柠檬酸盐的浓度是在相同条件下将游离钙离子浓度从2. OmM减少至0. IOmM所必需的。或者，由螯合剂和金属离子如钙和/或镁之间形成的络合物的强度表示为log K值(平衡或结合或解离或稳定常数)。该常数可在给定PH，在给定温度和在给定离子强度测量。如上所述，由螯合剂和金属离子如钙和/或镁之间形成的络合物的强度可表示为log K值(平衡或结合或解离或稳定常数)，所述常数可如A. Nielsen等，Anal. Biochem.Vol. 314, (2003)，pp 227-234 中所述从 K 值通过等温滴定量热法(isothermal titrationcalorimetry, ITC)来测量,所述log K可计算为K值的对数(以10为底)。通过该方法测得的log K值会取决于温度、pH、离子强度，因此当比较log K值时，重要的是它们是在类似地，优选相同的条件下确定的。此外，通过导入标样如柠檬酸盐作为参照，可减少实验中差异导致的影响。优选地，log K是如本申请“材料和方法”中所述确定的，因此在本发明的一个实施方案中，当log K在pH 10和19°C如“材料和方法”中所述测量时，根据本发明的组合物中的螯合剂具有至少3，如至少4，如至少5，如至少6，如至少7，如至少8，如至少9，如至少10，如至少11的log K。根据本发明的组合物中的螯合剂的log K值亦可在3-11，如3-10，如 3-9，如 3-8，如 4-11，如 5-11 如 6-11，如 4-10，如 5-10，如 4-9，如 5-9，如 4-8，特别是5-8的范围。优选地，根据本发明的组合物中的螯合剂的log K是如在“材料和方法”中所述确定的柠檬酸盐的log K的至少1，如至少I. 33，如至少I. 67，如至少2，如至少2. 33，如至少2. 67，如至少3，如至少3. 33，如至少3. 67倍。根据本发明的组合物中的螯合剂亦可为如在“材料和方法”中所述确定的柠檬酸盐的log K的1-3. 67，如1-3. 33，如1-3. 00，如 1-2. 67，如 I. 33 - 3. 67，如 I. 33-3. 33，如 I. 33-3. 00，如 I. 33-2. 67，如 I. 67-3. 67，如1.67-3. 33，如 I. 67-3，特别是 1.67-2. 67 倍的范围。
可用的螯合剂可为，但不限于下述N-(1，2-二羧基-乙基)-D，L_天冬氨酸(IDS)，N- (2-羟乙基)亚胺二乙酸(EDG)，天冬氨酸-N- —乙酸(ASMA)，天冬氨酸-N，N- 二乙酸(ASDA)，天冬氨酸-N-—丙酸(ASMP)，亚胺二琥珀酸(IDA)，N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS), N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)，N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)，N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)，N-甲基亚胺基二乙酸(MIDA)，α -丙氨酸-N，N- 二乙酸(a -ALDA)，丝氨酸-N，N-二乙酸(SEDA)，异丝氨酸-N，N-二乙酸(ISDA)，苯丙氨酸-N，N-二乙酸(PHDA)，邻氨基苯甲酸-N，N- 二乙酸(ANDA)，对氨基苯磺酸-N，N- 二乙酸(SLDA)，牛磺酸-N，N- 二乙酸(TUDA)，磺甲基-N，N-二乙酸(SMDA)，N-(羟乙基)-乙二胺三乙酸(HEDTA)，二乙醇甘氨酸(DEG)，氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)。优选的螯合剂可含有氨基基团，并可为例如氨基聚羧酸或膦酸盐。其可为含有一个、两个或三个氨基基团的单体分子(通常为仲胺或叔胺基团)，且其可含有两个、三个、四个或五个羧基基团或甚至更多的羧基基团。所述螯合剂可含磷或不含磷。有许多方式将螯合剂归类，一种方式可如下所述螯合剂可为羧酸盐，或可基于羧酸基团，如EDTA (乙二胺四乙酸)、NTA(2，2’，2〃-氮三乙酸)、柠檬酸盐、2-羟基丙烷-1，2，3-三羧酸、DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、MGDA(甲基甘氨酸二乙酸或N，N’ - 二(羧甲基)丙氨酸)、EGTA(乙二醇四乙酸)、EDDS (乙二胺-N，N’ - 二琥珀酸)、GLDA (L-谷氨酸-N，N- 二乙酸)、聚羧酸如PAA [聚丙烯酸]、PAA/PMA (丙烯酸/马来酸共聚物)。含磷的螯合剂可为多磷酸盐或膦酸盐，如三磷酸钠(STP)、HEDP(I-羟基亚乙基-1，I-二膦酸)、EDTMP[二(膦酰甲基)氨基]甲基膦酸]或(乙二胺四(亚甲基膦酸))、EDTMPA (乙二胺四亚甲基四膦酸)、DTPMP (二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸))、DTMPA (二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸))。所述螯合剂可含氮，如EDTA、NTA、DTPA, PDTA, GLDA, MGDA,EDDS, EDTMP, EDTMPA,以及 DTPMP 或 ASMA、ASDA, ASMP, IDA、SMAS, SEAS、SMGL, SEGL, MIDA、a -ALDA、SEDA、ISDA、PHDA, ANDA, SLDA, TUDA, SMDA, HEDTA, DEG, ATMP,或其混合物。因此，优选的螯合剂可为，但不限于下述乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸(DTMPA，DTPMP)、羟基乙烷二膦酸(HEDP)、乙二胺N，N’ - 二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、丙二胺四乙酸(TOTA)、2_羟基吡啶-N-氧化物(HPNO)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸N，N- 二乙酸(N，N- 二羧甲基谷氨酸四钠盐)(GLDA)和氮三乙酸(NTA)或其混合物。所述螯合剂可以其酸形式或盐存在，优选所述螯合剂可作为钠盐、铵盐或钾盐存在。其他螯合剂可为来源于植物材料的螯合剂，如例如下文详述的含淀粉材料。此类天然螯合剂的实例为，但不限于植酸(亦称作肌醇六磷酸(IP6)，或植酸(phytin)，或当盐形式时称作植酸盐)、肌醇二磷酸、肌醇三磷酸或肌醇五磷酸。螯合剂可以以O. 000Iwt %至20wt%嘛优选O. 01至IOwt %,更优选O. I至5wt%的量存在于组合物中。亲本α -淀粉酶亲本α -淀粉酶可理论上为任何α -淀粉酶，对其期望制备在储藏过程中或在使用中，例如在洗涤过程中或在淀粉水解工艺中具有改善的稳定性的变体。因此，所述改善的稳定性可观察为在储藏过程中淀粉分解活性丧失的减少或在使用过程中 活性和性能的增加。已知的α-淀粉酶来源于广泛的生物选择范围，包括细菌，如来自芽孢杆菌属(Bacillus)的种,例如地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis);来自真菌的种，如米曲霉(Aspergillus oryzae) (TAKA-淀粉酶)或黑曲霉(Aspergillus niger);来自植物如大麦，和来自哺乳动物。亲本α-淀粉酶理论上可为任何此种α-淀粉酶而不论其来源。众所周知许多由芽孢杆菌属的种产生的α -淀粉酶在氨基酸水平高度类似。因为见于这些α-淀粉酶之间的高度同一丨!■生(substantial identity),它们被认为属于同一类α -淀粉酶，即“ Termamyl样α -淀粉酶”类。相应地，在本文语境中，术语“Termamyl样” α -淀粉酶旨在表示下述α -淀粉酶，特别是芽孢杆菌α -淀粉酶，所述α -淀粉酶在氨基酸水平与具有本文SEQID NO:20中所示的氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(Termamyl )呈现高度同一性，即至少60%同一性。Termamyl 样 α _ 淀粉酶许多已知的芽孢杆菌属α -淀粉酶的同一性可见于下表I :表I
权利要求
1.一种包含亲本α-淀粉酶的变体的组合物，其中使用根据SEQ ID Ν0:6的编号，所述变体在一个或多个选自195，193，197，198，200，203，206，210，212，213和243的位置包含取代，并进一步包含至少一种螯合剂，其中当在21°C和pH 8. O测量时所述螯合剂在低于IOmM的浓度能够将游离钙离子的浓度从2. OmM减少至O. 10mM。
2.前述任一项权利要求的组合物，其中当在21°C和pH 8. O在80mM氯化钾和49mMEPPS中测量时所述螯合剂在低于IOmM的浓度能够将游离钙离子的浓度从2. OmM减少至O. 10mM。
3.前述任一项权利要求的组合物，其中当在“材料和方法”中描述的测定法中测量时所述螯合剂在低于IOmM的浓度能够将游离钙离子的浓度从2. OmM减少至O. 10mM。
4.前述任一项权利要求的组合物，其中所述螯合剂能够在低于8mM，优选低于7mM，优选低于6mM，优选低于5mM，优选低于4mM的螯合剂浓度将游离钙离子的浓度从2. OmM减少至 O. IOmM0
5.包含亲本α-淀粉酶的变体的组合物，其中使用根据SEQID Ν0:6的编号，所述变体在一个或多个选自195，193，197，198，200，203，206，210，212，213和243的位置包含取代，并进一步包含至少一种螯合剂，其中当在21 °C和pH 8测量时所述螯合剂能够在低于O. 9倍能够将游离钙离子的浓度从2. OmM减少至O. IOmM的柠檬酸盐浓度的螯合剂浓度将游离钙离子的浓度从2. OmM减少至O. 10mM。
6.前述任一项权利要求的组合物，其中所述螯合剂能够在低于O.7倍，如低于O. 5倍，如低于O. 3倍能够将游离钙离子的浓度从2. OmM减少至O. IOmM的柠檬酸盐浓度的螯合剂浓度将游离钙离子浓度从2. OmM减少至O. 10mM。
7.前述任一项权利要求的组合物，其中所述变体在一个或多个对应于SEQID N0:6的成熟多肽的位置195，193，197，198，200，203，206，210，212，213或243的位置包含至少两个取代。
8.前述任一项权利要求的组合物，其中所述亲本α-淀粉酶序列通过至少一个下述取代修饰位置193是[G，Α，S，T或Μ];位置195是[F，W, Y，L，I或V];位置197是[F，W, Y，L，I 或 V];位置 198 是[Q 或 N];位置 200 是[F，W, Y，L，I 或 V];位置 203 是[F，W, Y，L，I 或V];位置 206 是[F，W，Y，N，L，I, V, H，Q，D 或 E];位置 210 是[F,ff,Y,L, I 或 V];位置 212 是[F，W, Y，L，I 或 V];位置 213 是[G，A，S，T 或 M]或位置 243 是[F，W, Y，L，I 或 V]。
9.前述任一项权利要求的组合物，其中所述亲本α-淀粉酶序列通过至少一个下述取代修饰位置193是T ;位置195是F或Y ;位置197是F或L ;位置198是N ;位置200是F ;位置203是F ;位置206是Y ;位置210是Y ;位置212是V，位置213是A或位置243是F。
10.前述任一项权利要求的组合物，其中使用SEQID Ν0:6用于编号，所述变体在181，182，183或184的氨基酸区中进一步包含至少一个、至少两个、或至少三个缺失。
11.前述任一项权利要求的组合物，其中所述变体在一个或多个对应于SEQID Ν0:6的成熟多肽的位置195，193，197，198，200，203，206，210，212，213或243的位置包含取代并在一个或多个对应于位置 116，118，129，133，142，146，147，149，151，152，169，174，186,235,244，303，320，339，359，418，431，434，447 或 458 的位置包含取代。
12.前述任一项权利要求的组合物，其中所述变体在螯合剂存在下在pH8和31°C18小时之后具有至少60%剩余活性，其中所述螯合剂在21°C和pH 8. O在低于IOmM的浓度能够将游离钙离子的浓度从2. OmM减少至O. 10mM。
13.前述任一项权利要求的组合物，其中所述变体在螯合剂存在下在pH8和31°C18小时之后具有至少70%剩余活性，其中所述螯合剂在21°C和pH 8. O在低于IOmM的浓度能够将游离钙离子的浓度从2. OmM减少至O. 10mM，且其中所述剩余活性如“材料和方法”中所述测量。
14.前述任一项权利要求的组合物，其中当如“材料和方法”中所述在AMSA中测量时，所述变体相对于亲本α-淀粉酶具有改善的洗涤性能。
15.权利要求I至14任一项所述的组合物，其中所述螯合剂选自下组EDTA，MGDA,EGTA，DTPA，DTPMP 和 HEDP。
16.—种用于制备多肽的方法,包括 (a)提供具有淀粉酶活性的亲本多肽的氨基酸序列； (b)选择占据对应于SEQID NO: 6的成熟多肽的位置195，197，198，200，203，206，210，212，213或243的一个或多个位置的一个或多个氨基酸，并进一步选择对应于位置116，118，129，133，142，146，147，149，151，152，169，174，186，235，244，303，320，339，359，418，431，434，447或458的一个或多个位置； (c)通过取代或缺失选定的氨基酸残基或邻接选定的氨基酸残基插入一个或多个氨基酸残基来修饰所述序列； (d)产生具有修饰序列的变体多肽； (e)测试所述变体多肽的淀粉酶活性和稳定性；和 (f)选择在螯合剂存在下相对于亲本多肽稳定性增加并具有淀粉酶活性的变体多肽，其中在21°C和pH 8. 0，所述螯合剂在低于IOmM的浓度能够将游离钙离子的浓度从2. OmM减少至O. 10mM。
17.一种亲本α-淀粉酶的变体，所述变体在对应于选自195，197，198，200，203，206，210,212,213,243的位置的一个或多个位置包含改变，并进一步在对应于选自116，118，129，133，142，146，147，149，151，152，169，174，186，235，244，303，320，339，359，418，431，434，447和458的位置的一个或多个位置包含改变，其中 (a)所述各改变独立地为 (i)紧接着该位置下游并邻接该位置插入氨基酸， ( )缺失占据该位置的氨基酸，和/或 (iii)取代占据该位置的氨基酸， (b)所述变体具有α-淀粉酶活性；并且 (c)每个位置对应于具有SEQID Ν0:6的氨基酸序列的酶的氨基酸序列的位置。
18.一种亲本α-淀粉酶的变体，所述变体在181，182，183或184的氨基酸区中包含至少一个，至少两个或至少三个缺失，并进一步在选自195，197，198，200, 203，206，210，212，213和243的一个或多个位置包含改变，并进一步在选自116，118，129，133，142，146，147，·149，151，152，169，174，186，235，244，303，320，339，359，418，431，434，447 和 458 的一个或多个位置包含改变，其中 (a)所述各改变独立地 (i)紧接着该位置下游并邻接该位置插入氨基酸，( )缺失占据该位置的氨基酸，和/或 (iii)取代占据该位置的氨基酸， (b)所述变体具有α-淀粉酶活性；并且 (c)每个位置对应于具有SEQID Ν0:6的氨基酸序列的酶的氨基酸序列的位置。
19.权利要求17或18的变体，所述变体在包含螯合剂的组合物中相对于亲本α-淀粉酶或相对于SEQ ID Ν0:6具有改善的稳定性，其中所述螯合剂在21°C和pH 8. O在低于IOmM的浓度能够将游离钙离子的浓度从2. OmM减少至O. 10mM。
20.权利要求17至19任一项所述的变体，其中所述变体在螯合剂存在下在pH818小时之后具有至少60%剩余活性，其中所述螯合剂在21°C和pH8. O在低于IOmM的浓度能够将游离钙离子的浓度从2. OmM减少至O. 10mM，其中所述剩余活性如“材料和方法”中所述测量。
21.权利要求17至20任一项所述的变体，其中当如“材料和方法”中所述在AMSA中测量时，所述变体相对于亲本α -淀粉酶具有改善的洗涤性能。
22.权利要求17至21任一项所述的变体，其中具有淀粉分解活性的变体具有如下氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID Ν0:6,8,10，12，18或20的成熟多肽具有优选至少60%，更优选至少65%，更优选至少70%，更优选至少75%，更优选至少80%，更优选至少85%，甚至更优选至少90%，并且最优选至少95%同一性。
23.权利要求17至22任一项所述的变体，其中具有淀粉分解酶活性的亲本多肽由如下多核苷酸编码，所述多核苷酸在优选至少低严格条件下，更优选至少中等严格条件下，甚至更优选至少中-高严格条件下，并且最优选至少高严格条件下与以下杂交(i)SEQ IDNO: 5，7，9或11，17，19的成熟多肽编码序列；(ii)包含SEQ ID NO: 5，7，9，11，17，19的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列；或(iii)⑴或(ii)的全长互补链。
24.一种分离的核苷酸序列，其编码权利要求17至23任一项的变体。
25.一种重组宿主细胞，其包含SEQ ID N0:24的核苷酸序列。
全文摘要
本发明涉及相对于其亲本酶具有改善的针对螯合剂的稳定性的α-淀粉酶变体，包含所述变体的组合物，编码所述变体的核酸，产生所述变体的方法和使用所述变体的方法。
文档编号C12N9/28GK102869759SQ201180018387
公开日2013年1月9日 申请日期2011年2月10日 优先权日2010年2月10日
发明者A.斯文森, A.H.约翰森, M.E.比约恩瓦德, F.W.拉斯马森, M.斯科约特, S.E.拉森, J.奥布罗, S.卡斯嘉德, L.贝耶尔 申请人:诺维信公司