专利名称：一种多羟基开环甾醇及其制备方法和抗肿瘤用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的甾醇，具体来说是涉及一种新的多羟基开环甾醇，另外还涉及这种 甾醇的制备方法及其在制备抗癌药物方面的应用。
技术背景侧扁软柳珊瑚(5""力e/^o/^'a w6erosa)中富含倍半砲和甾醇，到目前为止国内外科研 工作者已从世界不同水域的侧扁软柳珊瑚中分离出12个倍半萜和5个甾醇，并开展了一系列 细胞毒性的筛选，发现其中部分倍半萜对人肺腺癌细胞系P_388、 A549、 HT-29细胞株和宫颈 癌HeLa细胞株显示潜在的细胞毒性。 发明内容本发明的目的在于从侧扁软柳珊瑚中分离出一个新的对癌细胞有强抑制作用的甾醇，另 一个目的是提供该留醇的制备方法，进一步的目的是提供该甾醇在制备抗癌药物方面的应用。我们通过常压柱层析及一维、二维核磁共振波谱，从南海侧扁软柳珊瑚中分离得到一个 新的多羟基开环甾醇，这个甾醇对胃癌，白血病，肝癌等癌细胞都有不同程度的抑制作用， 从而实现了本发明的目的。本发明的多羟基开环甾醇由式(1)表示式(1)结构推定式(1)的化合物，其ESIMS谱在历/z493 [M+H]+处显示准分子离子峰，结合 高分辨冊ESIMS和13C剛R (DEPT)谱，推出其分子式为C29H4806。 13C丽R (DEPT) i普显示有29 个碳信号，包括5个甲基，8个亚甲基，4个次甲基，2个季碳，l个被氧化亚甲基，2个被 氧化次甲基，2个被氧化季碳， 一个酮基(人206.2，s)]和2个双键[5e5e 113.8 (t)， 136.9 (s)， 143.4 (d)， and 149.9 (d) ] 。 'H NMR谱显示有5个甲基，4个烯氢[5 6.57 (1H, d, / =1.8Hz)， 5.82 (1H， dd, /=11.0, 17.4 Hz), 5.24 (1H, dd， /=1.9， 17.4Hz)， 5.16 (1H， dd， /= 1.9， 11.0 Hz)]， 2个被氧化的亚甲基氢[5 3.75 (2H， m)]和2个被氧化次甲 基氢[3 3.49 (1H, m)， 4.23 (1H, /= 1.8, 9.9Hz)]。和类似化合物的文献(1. Aknin M，CostantinoV， Mangoni A. Steroids, 1998， 63: 575 — 578; 2. AielloA， Fattorusso E， Me腿M， Car腦cio R， Iuvone T. Steroids, 1995， 60: 666 - 673; 3. AielloA, Esposito G， Fattorusso E， Iuvone T， Luciano P， MennaM. Steroids, 2003， 68: 719 - 723.) 相比较，表明式(1)的化合物是一个9,11-开环甾醇类化合物。将式(1)化合物的丽R数 据与从印度洋釆集的侧扁软柳珊瑚中分离到的化合物 3 P , 6 a , 11-trihydroxy-9, ll-seco-5 a -cholest-7-ene-9-one的NMR数据相比较(参考文 献1. Aknin M， Costantino V， Mangoni A. Steroids, 1998， 63: 575 — 578.)，发 现两者很相似，只是侧链有所不同。二唯核磁共振谱2D醒R (HSQC、 HMBC、 'H-'HC0SY、 N0ESY) 论证了式(l)的化合物中也含有3P， 6a ， 11-trihydroxy-9， 11-secosterol-7_ene-9-one 骨架，并推测出该化合物上有一个20,24-dihydroxy-24-ethylcholest-28-en侧链。因此， 本发明的多羟基开环甾醇的结构式由式(l)表示，命名为3e，6a,ll，20e, 24-penthydroxy-9， 11-seco-5a -24-ethylcholest-7， 28-diene-9-oneo 本发明式(1)的化合物的制备方法，其特征包括以下的步骤(1) 将侧扁软柳珊瑚用甲醇、乙醇、二氯甲垸、甲醇-二氯甲烷，乙醇-二氯甲烷中的一 种或一种以上的混合溶剂提取，将提取液浓縮得粗提取物，将粗提取物悬溶于水，用氯仿或 乙酸乙酯萃取，减压浓縮得氯仿层或乙酸乙酯层；(2) 将上述氯仿层或乙酸乙酯层进行常压硅胶柱层析，用氯仿-丙酮、氯仿-乙酸乙酯、 石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯溶剂系统为洗脱剂按照体积比100:0到0:100的变化进行梯 度洗脱，薄层层析TLC追踪合并组分，将在TLC上能用体积比8:2的氯仿-甲醇溶剂系统展 开的组分用氯仿-甲醇溶剂系统冲洗，收集在TLC上用体积比8:2的氯仿-甲醇溶剂系统展开 的/ f值为0.4 0.6，且在紫光灯波长254nm下有紫外吸收的组分，得到式(1)化合物的粗 品，纯化得到纯品。步骤(1)所述的溶剂最好是体积比2:1的乙醇-二氯甲烷混合溶剂，所述的浓縮可以采用常规的方法例如减压浓縮，步骤(2)所述的纯化可以采用常规的方法例如过柱和重结晶等。 下述实验结果证明，本发明式(l)的化合物可以在治疗胃癌，白血病和肝癌中应用。 通过体外活性筛选，发现本发明的化合物对人胃癌细胞株SGC-7901的半数抑制率IC5。为0. 089 mg/mL，对人红白血病细胞株K562的半数抑制率IC;。为0. 052 mg/mL，对人肝癌细胞株H印G2的半数抑制率ICs。为和0. 189 mg/mL。
具体实施方式
以下的实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。实施例l :以湿重3. 0 Kg的侧扁软柳珊瑚为原料，冷冻干燥切碎后用14 L乙醇和7 L 二氯甲烷的
混合有机溶剂提取3次，将提取液减压浓縮得粗提取物，将粗提取物悬溶于水，依次用氯仿 萃取3次，每次600 mL，减压浓縮得氯仿层50g。用氯仿和甲醇的混合溶剂将氯仿层溶解拌 硅胶，用2500 mL氯仿拌900 g硅胶进行湿法装柱，以体积比从100:0到0:100变化的氯仿 -丙酮溶剂系统梯度洗脱，薄层层析TLC (GF^)追踪合并得8个组分。将在TLC (GF254)上能 用体积比8:2的氯仿-甲醇溶剂系统展开的组经S印hadex LH-20柱层析，用体积比1:1的 氯仿-甲醇溶剂系统冲洗得3个小组分，再将其中在薄层层析TLC (GF254)上用体积比为8:2 氯仿-甲醇的溶剂系统展开时A值为0. 4 0. 6，且在紫外灯254 nm波长下有紫外吸收的一个 小组分，经硅胶柱层析，用体积比从10:1到8:2变化氯仿-甲醇溶剂系统冲洗，得粗品，将 该粗品用氯仿-甲醇的混合溶剂重结晶，得到的产物经光谱数据验证，证实是纯的式(1)化 合物。其光谱数据如下'H丽R (500 MHz, CD3OH) 1.84， 1.47 (each 1H， m， H-l), 1.88，I. 47 (each 1H, m， H-2), 3,49 (1H, m, H-3)， 2.28 (1H， br d, 12.9 Hz, H-4a)， 1.41 (IH， m， H—4b), 1.75 (IH， ra， H-5)' 4.23 (1H' dd' /= 1. 8, 9. 9 Hz, H-67), 6,57 (IH， d, /= 1.8 Hz， H—7)， 3.75 (2H， m， H-ll)， 1.73， 1.12 (each 1H, m， H—12), 3.31 (1H, m, H—14), 1.84, 1.73 (each 1H, m， H—15), 1.69' 1.61 (each 1H， m, H—16), 2.11 (1H, t， / =9. 6 Hz, H—17), 0.90 (3H, s, Me_18)， 1,14 (3H， s, Me—19), 1.29 (3H， s， Me_21), 1.67 and 1.51 (each 1H, m, H-22), 1.70 and 1.55 (each 1 H， m, H-23), 1.74 (1H， m, H-25), 0.92 (3H, d， /= 6.9 Hz， H-26) ， 0.94 (3H, d, / = 6.8 Hz, H-27) ， 5.82 (IH， dd， / =II. 0， 17.4Hz, H-17)'5.24 (1H, dd， /=1.9, 17.4 Hz， H-29a)， 5.16 (1H, dd， /=1.9， 11.0 Hz, H-29b). 13C丽R (125 MHz, CDC13) 33.3 (t' C-l), 31.3 (t， C-2)， 70.8 (d, C一3), 33.7 (t, C-4)， 49.9 (d' C_5)， 69.7 (d， C_6), 149.9 (d， C—7)， 136.9 (s， C—8), 206.2 (s， C-9), 46.1 (s， C一IO)， 59.1 (t, C—11)， 42.0 (t， C-12), 47.4 (s， C-13), 43.5 (d, C-14)， 24.1 (t， C-15)， 27.5 (t， C-16), 53.9 (d, C-17)， 19.7 (q， C-18), 16.5 (q, C-19), 76.0 (s' C-20), 76.0 (s, C-20), 76.0 (s， C-20), 76.0 (s， C-20)， 76.0 (s, C-20)， 76.0 (s, C-20), 27.1 (q， C-21), 35.7 (t， C-22), 33.2 (t， C-23), 78.6 (s， C-24), 37.7 (d, C-25), 17,2 (q， C—26)， 18.1 (q, C_27)， 143.4 (d， C—28)， 113.8 (t， C—29). ESIMS (+) ffl/z: 493 [M+H]+。实施例2: MTT法测试式(1)化合物体外抑制人胃癌细胞SGC-7901的细胞生长的实验 收集对数生长期SGC-7901细胞，接种于96孔培养板，每孔细胞数为1.0X10V100叱，置 于5%0)2培养箱培养，次日去掉培养基，加入不同浓度药物100叱(药物浓度采用对倍稀释)， 阴性对照组不加药物，48h后，每孔加入MTT 10叱，继续培养4h，再每孔加入DMS0 lOOWi冬止 反应，常温放置lh，用酶标仪检测各孔在570nm处的吸光度A值，计算细胞生长抑制率，计算
式如下生长抑制率(％) = [ (A阴性-A实验)/ (A阴性-A空白)]X100% 式(2) 得到的半数抑制率ICs。为0. 089 mg/mL。实施例3: MTT法测试式(1)化合物体外抑制白血病细胞K562的细胞生长的实验 收集对数生长期K562细胞，接种于96孔培养板，每孔细胞数为2 . 0X 105 / 501^，加入不同 浓度药物50A (药物浓度采用对倍稀释)，阴性对照组不加药物，48h后，每孔加入MTT10化， 继续培养4h，再每孔加入DMSO IOO叱终止反应，常温放置lh，用酶标仪检测各孔在570nm处的 吸光度A值，按照式(2)计算细胞生长抑制率，得到的半数抑制率IC5。为0.052 mg/mL。 实施例4: MTT法测试式(1)化合物体外抑制肝癌细胞H印G2的细胞生长实验 收集对数生长期H印G2细胞，接种于96孔培养板，每孔细胞数为1.0X10V100叱，置于5% C02培养箱培养。次日去掉培养基，加入不同浓度药物100化(药物浓度采用对倍稀释)，阴 性对照组不加药物，48h后，每孔加入MTT10叱，继续培养4h，再每孔加入DMSO IOO叱终止反 应，常温放置lh，用酶标仪检测各孔在570nm处的吸光度A值，按照式(2)计算细胞生长抑制 率，得到的半数抑制率I"为O. 189 mg/mL。
权利要求
1.式(1)的化合物。式(1)
2. 式(1)的化合物的制备方法，其特征包括以下的步骤(1) 将侧扁软柳珊瑚(&力er《o^/aOT6ero幼)用甲醇、乙醇、二氯甲垸、甲醇-二氯甲烷， 乙醇-二氯甲烷中的一种或一种以上的混合溶剂提取，将提取液浓縮得粗提取物，将粗提取物 悬溶于水，用氯仿或乙酸乙酯萃取，减压浓縮得氯仿层或乙酸乙酯层；(2) 将上述氯仿层或乙酸乙酯层进行常压硅胶柱层析，用氯仿-丙酮、氯仿-乙酸乙酯、 石油醚-丙酮或石油醚-乙酸乙酯溶剂系统为洗脱剂，按照体积比100:0到0:100的变化进行 梯度洗脱，薄层层析TLC追踪合并组分，将在TLC上能用体积比8:2的氯仿-甲醇溶剂系统 展开的组分用氯仿-甲醇溶剂系统冲洗，收集在TLC上用体积比8:2的氯仿-甲醇溶剂系统展 开的A值为0.4 0.6，且在紫光灯波长254咖下有紫外吸收的组分，得到式(1)化合物。
3. 根据权利要求2所述的式(1)的化合物的制备方法，其特征是步骤(1)所述的混合 溶剂是体积比2:1的乙醇-二氯甲垸，所述的浓縮是减压浓縮，步骤(2)得到的式(1)的化 合物通过过柱和重结晶进行纯化。
4. 式(l)的化合物在制备治疗胃癌，白血病和肝癌药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种式(1)表示的新的多羟基开环甾醇，还涉及这种甾醇的制备方法及其在抗肿瘤的应用。首先将侧扁软柳珊瑚(Subergorgia suberosa)用有机溶剂提取得到的粗提取物悬溶于水，用氯仿或乙酸乙酯萃取，减压浓缩得氯仿层或乙酸乙酯层，然后将氯仿层或乙酸乙酯层进行常压硅胶柱层析，并用薄层层析TLC追踪合并组分，收集在TLC上用体积比8∶2的氯仿-甲醇溶剂系统展开的R<sub>f</sub>值为0.4～0.6，且在紫光灯波长254nm下有紫外吸收的组分，纯化得到式(1)化合物。本发明的化合物对胃癌，白血病，肝癌等癌细胞都有一定的抑制作用。
文档编号A61K35/00GK101130511SQ20071002984
公开日2008年2月27日 申请日期2007年8月23日 优先权日2007年8月23日
发明者偲 张, 漆淑华 申请人:中国科学院南海海洋研究所