专利名称：α-羟基酸在制备癌瘤体内注射治疗药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药技术领域，具体涉及a -羟基酸在制备癌瘤体内注射治疗 药物中的应用。
背景技术：
原发性肝癌(简称肝癌)是恶性程度较高的常见恶性肿瘤之一，以肝细胞癌 (Hepatocellularcarcinoma, HCC)为主。至今肝切除仍是治疗肝癌的最佳治疗方 法，但由于原发性肝癌发病隐匿，发展快速，确诊时能手术切除者仅为10%左 右，即使施行手术，仍有许多病例无法完全切除或肿瘤难以避免术后复发。对 于晚期肝癌，多因肝功能不全而无法手术。这一部分病人，需通过各种非手术 切除的方法进行治疗，或者先行非手术治疗，让肿块縮小局限，再行手术切除 治疗，即二期切除，可使病人获得较好的益处。肝癌的非手术治疗包括肿瘤的 局部治疗、化学治疗、放射治疗、免疫治疗和基因治疗。由于影像学的发展， 肝癌的介入治疗被认为是目前应用最广、效果最好的非手术治疗，效果明显好 于全身化疗，部分病人尚可获得二期手术切除的机会。经皮肝癌瘤体内注射治疗是肝癌血管外介入治疗的常见的一种，主要有以 下几种治疗方法1、无水酒精注射(PEIT)治疗小肝癌，即在超声或CT引导下 经皮肝穿注射无水酒精治疗肝癌，其机理是利用无水酒精对癌细胞的蛋白质变 性和脱水作用及癌内小血管的凝固作用，而安全有效地杀灭癌细胞达到治疗目 的。国内外学者一致认为对《3cm的肝癌，治疗效果可与手术相媲美。其缺 点是患者会出现疼痛、发热和一过性转氨酶升高等副反应，部分患者对酒精过 敏，而且随着应用研究的不断深入，发现酒精渗透能力有限，需较大剂量和多 次多部位注射才能使肿瘤完全坏死，这就不可避免地增加了各种副反应和并发 症发生的可能性。经皮瘤内注射高温蒸馏水(PHDI)是使用注射器抽取沸腾的蒸 馏水并迅速在30 60秒内均匀注入瘤内，利用高温效应，使得癌细胞内的蛋白 质合成障碍，从而杀灭癌细胞，蒸馏水的低渗特性引起癌细胞肿胀甚至崩解死 亡，安全性高，本身无刺激性和毒性，适用范围广。其适应症主要是直径《3 cm的肝癌结节。效果与PEIT相当，其缺点是灭活癌细胞的可控性和彻底性欠佳以及针道有烫伤的可能。2、钇一90、磷一32、钬一166等也可用于瘤内注射 治疗，其系纯(3射线以玻璃微—球形式存在，能均匀地注射到整个瘤体内，局部 灭活瘤细胞可靠，疗效突出。但因其属于放射性核素，该方法要有医疗保护措 施跟上，加上药源供给等问题，其临床应用受到限制。3、经皮乙酸注射(PAI)， 是在超声或CT导引下经皮穿刺进入肝肿瘤内注射乙酸破坏肿瘤组织以达到局 部灭活的治疗目的。(参见文献OhnishiK， OhyamaN， ho S， et al. Small hepatoeellular carcinoma: treatment with as-guided intratumoral injection of acetic acid. Radiology, 1994， 193: 747)通过乙酸、酒精动物实验对比研究，从光 镜、电镜的病理结果显示乙酸对肝脏的破坏是非细胞特异性的，主要通过两个 途径发挥损伤效应 一是弥散进入细胞后，利用酸的固有特性，直接引起蛋白 质的凝固；二是直接破坏膜性结构，影响膜的通透性，加速凝固性坏死形成。 PAI的适应证范围比较广泛(l)原发性肝癌、肝转移瘤的治疗， 一般认为病灶 数不超过3个，最大病灶直径不超过3cm的小肝癌疗效最佳，也适合于直径 >3cm、 〈7cm的中等大小肝癌的治疗(参见文献Ohnishi K， YoshiokaH ， ho S， et al. Treatment of nodular hepatoeellular carcinoma larger than 3cm with ultrasound-gu ided pe rcutaneous aceticacid injection. Hepatology， 1996， 24:1379; 吕国荣，李新丰，王静意，等.超声引导经皮醋酸注射治疗肝癌新方法.中华 超声影像学杂志，1999， 8: 229;周义成，杨华芬，张军宪，等.肝肿瘤化 学灭活治疗的初步报告放射学实践，2001， 16: 73 ) ; (2)手术前治疗，有利 于手术切除，且可减少肿瘤复发、转移的可能性；(3)肿瘤切除后的复发治疗。发明内容本发明的目的是提供一种对肝肿瘤、肺肿瘤、食管肿瘤等肿瘤细胞都具有 较强抑制作用的新的癌瘤体内注射治疗药物。本发明提供了 a -羟基酸在制备癌瘤体内注射治疗药物中的应用。 本发明的a -羟基酸具体指羟基乙酸或a -羟基丙酸。羟基乙酸的分子式是C2H403，是一种水溶性的固体。目前多用于除铁锈 和水垢的化学清洗；在纤维素织物中用作交联剂；在羊毛染色中作助染剂；在 鞣革工业中作为无机酸的代用品制造高级皮革；在皮肤病中对粉刺、老年斑、 疣、消除皱纹的治疗；作为护肤品用于去除死皮和汗毛剂及果酸的合成原料；在生产聚乳酸-乙醇酸(PLGA)中是一种重要的生物降解材料；可作为原料合成 乙二醇、乙醛酸等一些重要的化工产品。发明制备了不同浓度的羟基乙酸水溶液，进行了裸鼠实验、大鼠实验和细 胞试验等药效试验，并将其与同浓度的用于肝癌瘤内注射的阳性药乙酸的药效 进行了比较。通过裸鼠实验及大鼠的肝损伤实验，发现同浓度下羟基乙酸有跟 乙酸相似甚至比乙酸更好的抗肝肿瘤效果。通过细胞实验，发现羟基乙酸用于 瘤内注射对肝肿瘤、肺肿瘤、食管肿瘤等的肿瘤细胞都有强大的抑制作用。乙酸注射作为现在临床上已经应用的抗癌剂，对肝肿瘤组织比无水酒精具 有更强大的破坏作用，被认为是目前用于肝癌瘤内注射的较好的一种抗癌剂。 但是由于乙酸挥发刺激性很强，在注射过程中会对病人造成较剧烈的疼痛。而 且乙酸作为一种酸性液体，较难制成可以减少对病人刺激性的制剂。根据Ohnish傳推荐采用50X乙酸，注射剂量采取少量、多次注射，艮卩l 2cm肿瘤， 1 2ml/次，2 3cm肿瘤，2 3ml /次，2—3次/周，每次注射都会给病人 带来痛苦，但这又是在治疗肝癌过程中不可避免的。相比较而言，羟基乙酸就要好一些。首先它的水溶液没有乙酸那么强的挥 发刺激性，在裸鼠实验中通过注射过程中鼠的反应也表明羟基乙酸的刺激性要 小。而且羟基乙酸是一种水溶性的固体，比较容易做成制剂，以其作为功效成 分作成的制剂如水溶液、微球、微囊、包合物等，特别是制成微球后可以起到 进一步缓解病人疼痛的作用，且由于微球的缓释作用，可以减少注射次数，疗 效更持久稳定；羟基乙酸是目前广泛作为可生物降解的微球的囊材聚羟基乙酸 (PGA)在体内的初步降解物，其安全性已经得到了广泛的证实。a-羟基丙酸即乳酸，分子式为<:311603，经动物实验证明有与羟基乙酸相 似的抗癌效果。本发明证明了 a -羟基酸及以a -羟基酸作为功效成分，按常规方法制成的 制剂可作为一种新的用于癌瘤内注射的抗癌剂。
图l是注射15。/。羟基乙酸和乙酸的肿瘤生长变化曲线比较图。 图2是注射30%羟基乙酸和乙酸的肿瘤生长变化曲线比较图。 图3是注射15。/。、 20%、 30%羟基乙酸的肿瘤生长变化曲线比较图。 图4是15%的乙酸注射后第2天(A)和第6天(B)的裸鼠照片。图5是15%的羟基乙酸注射后第2天(A)和第6天(B)的裸鼠照片。 图6是30%的乙酸注射后第2天(A)和第6天(B)的裸鼠照片。 图7是30%的羟基乙酸注射后第2天(A)和第6天(B)的裸鼠照片。 图8是注射15。/。乙酸(A)和羟基乙酸(B)后瘤组织光镜检查结果，其中A:注射乙 酸后仍有瘤组织存在，B:注射羟基乙酸后瘤组织的坏死部分。 图9是注射30%乙酸后瘤组织光镜检査结果，其中A:坏死周边部示炎性反应，B:坏死周边部有肉芽组织形成，C:坏死周边的表皮基本正常，D:坏死周边的肌 组织。图10是注射30%羟基乙酸后瘤组织光镜检查结果，其中A:坏死边缘也见明显坏死，B:坏死明显伴钙化，C:坏死周边有大量的炎细胞伴钙化，D:坏死组织 仅见细胞轮廓。图11是乙酸对肝肿瘤细胞株7721的抑制曲线图。 图12是羟基乙酸对肝肿瘤细胞株7721的抑制曲线图。图13是15%的乳酸注射后第2天(A)与15%的羟基乙酸注射后第2天(B)的裸鼠 比较照片。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实施并不仅限于此。羟基乙酸与乙酸同浓度的换算由于羟基乙酸为固体，而乙酸为液体。所 以为了进行同浓度的比较，我们用mol/L作为浓度单位。 实施例1裸鼠实验选用裸鼠人肝癌组织模型(SMMC—LTNM ， 255代，由上海市嘉定区中 心医院提供)以及4一6周龄，体重18 20 g的雄性BALB / C裸鼠。将SMMC^LTNM的背部皮下移植瘤的新鲜无坏死的组织块剪成匀浆状， 用16号针头吸人注射器0.2ml，将瘤组织注入另一只裸鼠背部皮下，形成皮下 移植。约2-3周待其缓慢吸收又开始长出时每天按规定时间测量肿瘤体积大小， 瘤体测量用游标卡尺测量瘤体最长径(A)与最短径(B)。肿瘤体积为V(mm3 )=11 AXB2 /6，以肿瘤体积为0.6士0.05cm为成瘤入选标准。分别选了15%、 20%、 30%三个浓度的羟基乙酸(羟基乙酸固体购自北京偶 合科技有限公司)对裸鼠瘤体进行注射。15%、 20%组分别于第1天注射第一针 O.lml，第5天注射第二针0.1ml。 30W组第l天注射第一针0.1ml，由于注射后大6部分瘤体可见变黑结痂，所以在第5天只注射了0.05ml。同时作了15%、 30%的 乙酸与其作阳性对照，分别于第l天注射第一针0.1ml，第5天注射第二针0.1ml。 每天用精密卡尺测量瘤体最长径和和最短径.由肿瘤体积公式计算瘤体体积。 羟基乙酸组与乙酸组裸鼠都于第10天处死，所有裸鼠均做系统剖检，取肿瘤、 心肺肝肾组织作病理检查，石蜡包埋，HE染色，光镜下观察细胞和组织结构 的变化。结果15%与30%下注射羟基乙酸和乙酸的肿瘤生长变化曲线比较图分别 见图1和图2。 15%、 20%、 30%三个浓度下的羟基乙酸的肿瘤生长变化曲线比 较图见图3。裸鼠处死后瘤组织的光镜检查见图4、 5、 6。羟基乙酸组与乙酸组的裸鼠均生长良好。由15%与30%下羟基乙酸组与乙 酸组的裸鼠注射后，乙酸组裸鼠比起羟基乙酸组裸鼠有更明显的剧烈挣扎的反 应。注射后羟基乙酸组比乙酸组的肿瘤变黑范围大颜色深且局部结痂明显，通 过肿瘤生长变化曲线比较图可以看出羟基乙酸比乙酸的斜率更大，肿瘤縮小明 显。15%羟基乙酸与乙酸肿瘤的纵切片的光镜结果显示各组裸鼠的心肺肝肾 组织切片均未见异常。乙酸组的整个肿瘤组织中有60%坏死，而羟基乙酸则完 全坏死，坏死组织仅见细胞轮廓。30%羟基乙酸与乙酸肿瘤的纵切片的光镜结 果显示乙酸组的整个肿瘤组织仅有部分坏死，可见坏死周边部有肉芽组织形 成及可以看到肌组织。而羟基乙酸组则完全坏死，且坏死明显伴钙化，坏死边 缘也见明显坏死，周边有大量的炎细胞伴钙化。由以上的结果可知，同浓度下 羟基乙酸比乙酸的对肿瘤的治疗效果好。对于15%、 20%、 30%三个浓度下羟基乙酸对肿瘤的治疗效果的比较，发 现随着浓度的增加，裸鼠的肿瘤变黑更大，肿瘤縮小也更明显。又根据光镜 观察结果，15%组与30%组的羟基乙酸注射后的肿瘤虽都完全坏死，但30%组 的羟基乙酸的光镜下可以看到坏死明显伴钙化，可知30%组的羟基乙酸比15% 组的羟基乙酸使肿瘤的坏死程度更大。综上可以得出随着浓度的增加，羟基 乙酸对肿瘤的治疗效果增强。 实施例2大鼠实验将大鼠用10%水合氯醛腹腔麻醉后，剑突下作一小切口，入腹腔后即可见 大鼠肝脏.向肝内直接注入15。/o的羟基乙酸50ul，然后关腹。另用15%的乙酸 50ul注入鼠肝，作为阳性对照组。于注射后第4天将鼠处死，从大体标本上形 成坏死灶的直径，进行比较。结果发现羟基乙酸会导致鼠肝注射局部发生凝固性坏死，提示其可以用于 局部注射治疗肝癌。而且通过乙酸和羟基乙酸对大鼠肝脏形成的坏死灶可以看 出，羟基乙酸有着与乙酸相似的效果。 实施例3肝肿瘤细胞的体外抑制作用细胞培养肝肿瘤细胞株7721 (购自中科院细胞库)，以含10%新生牛血清的DMEM培养基(含青霉素100吗/ml和链霉素100吗/ml)在37°C ， 5%C02 细胞培养箱中孵育，取对数生长期的细胞进行实验。肿瘤细胞的体外抑制作用7721细胞用胰酶消化，吹散，调整细胞浓度 为5xl04/mL，加于96孔培养板，每孔100pL。置37°C、 5%C02、饱和湿度 条件培养24h。去除培养基，加入120(iL新鲜培养基，然后再分别加入不同浓 度的药物乙酸和羟基乙酸各30pL，空白孔和对照孔加入等量的培养基，置37 °C、 5%C02、饱和湿度条件下培养48h。加入浓度为5mg/ml的MTT， 15|iL/ 孔，37"、5%<:02、饱和湿度条件孵育4h。弃上清液，加入二甲基亚砜(DMSO) IOOiiL/孔，振荡10min左右。置酶标仪测定吸收度(A)值，波长为570nm， 参照波长630nm。所得数据计算IC50。细胞生长抑制率=(l-试验组平均A值 /对照组平均A值)X100°/。。实验重复3次。结果不同浓度的乙酸和羟基乙酸作用于肝肿瘤细胞株7721 48 h后，随 着浓度增加，细胞存活率显著下降，对肿瘤细胞生长抑制率显著上升(附图12、 13)。从低浓度开始作乙酸和羟基乙酸对细胞的抑制作用与空白对照的统计分 析(t检验)，发现当浓度增加到25mM时，二者的差异具有显著性(p<0.05)， 而此时二者对细胞的抑制作用之间没有显著差异。由此可知乙酸和羟基乙酸对 肝肿瘤细胞株7721的最低抑制浓度相同，且二者的抑制程度相同。同浓度下 对乙酸与羟基乙酸对细胞的抑制作用之间作统计分析(t检验)，结果在各浓 度下二者均没有显著性差异。肝肿瘤细胞株7721的半数细胞抑制量(IC50值) 乙酸和羟基乙酸都为26mM。 实施例4肺肿瘤细胞的体外抑制作用以含10%新生牛血清的DMEM培养基(含青霉素，100吗/ml和链霉素 100吗/ml)在37°C， 5XC02细胞培养箱中孵育，取对数生长期的细胞进行实 验。肺肿瘤细胞A549 (购自中科院细胞库)用胰酶消化，吹散，调整细胞浓 度为5xl04/mL，加于96孔培养板，每孔100pL。置37°C、 5%C02、饱和湿 度条件培养24h。去除培养 基，加入120ul新鲜培养基，然后再分别加入不同浓度的药物羟基乙酸30pL，空白孔和对照孔加入等量的培养基，置37°C、 5 %C02、饱和湿度条件下培养48h。加入浓度为5mg/ml的MTT， 15pL/孔，37 °C、 5%C02、饱和湿度条件孵育4h。弃上清液，加入二甲基亚砜(DMSO) 100pL/孔，振荡10min左右。置酶标仪测定吸收度(A)值，波长为570nm， 参照波长630nm。实验重复'3次。结果表明羟基乙酸对肺肿瘤细胞有明显的体 外抑制作用。提示其可用于肺癌瘤内注射。 实施例5食管肿瘤细胞的体外抑制作用使用与上述实施例4中相同的方法，但用食管肿瘤细胞Eca-109 (购自中科 院细胞库)替换肺肿瘤细胞。结果表明羟基乙酸对食管肿瘤细胞有明显的体外 抑制作用。提示其可用于食管癌瘤内注射。 实施例6乳酸作为抗癌剂的裸鼠实验选用4一6周龄，体重18 20g的雄性BALB/C裸鼠人肝癌组织模型，形成 皮下移植。约2-3周待其缓慢吸收又开始长出时每天按规定时间测量肿瘤体积 大小，瘤体测量用游标卡尺测量瘤体最长径(A)与最短径(B)。肿瘤体积为 V(mm3)=nAXB2 / 6，以肿瘤体积为0.6士0.05cm为成瘤入选标准。选用15%浓度的乳酸(乳酸购自无锡福菱制药有限公司)对裸鼠瘤体进行注 射。于第l天注射第一针0.1ml，第5天注射第二针0.1ml。每天用精密卡尺测量 瘤体最长径和和最短径.由肿瘤体积公式计算瘤体体积。于第10天处死裸鼠并 做系统剖检，取肿瘤、心肺肝肾组织作病理检查，石蜡包埋，HE染色，光镜 下观察细胞和组织结构的变化。结果注射乳酸后裸鼠生长良好，肿瘤变黑且局部结痂明显，各组裸鼠的 心肺肝肾组织切片均未见异常。与同浓度的羟基乙酸相比，与其有相似的抗癌 效果(见图13)。实施例7乳酸作为抗癌剂对肝肿瘤细胞的体外抑制作用以含10%新生牛血清的DMEM培养基(含青霉素10(^g/ml和链霉素 100|ig/ml)在37。C， 5XC02细胞培养箱中孵育，取对数生长期的细胞进行实 验。肝肿瘤细胞7721 (购自中科院细胞库)用胰酶消化，吹散，调整细胞浓 度为5xl04/mL，加于96孔培养板，每孔100|iL。置37°C、 5%C02、饱和湿 度条件培养24h。去除培养基，加入120|iL新鲜培养基，然后再分别加入不同 浓度的药物乳酸30pL，空白孔和对照孔加入等量的培养基，置37"C、 5%C02、 饱和湿度条件下培养48h。加入浓度为5mg/ml的MTT， 15jiL/孔，37°C、 5%C02、饱和湿度条件孵育4h。弃上清液，加入二甲基亚砜(DMSO) 100|iL/ 孔，振荡10min左右。置酶标仪测定吸收度(A)值，波长为570nm，参照波 长630nm。实验重复3次。结果表明乳酸对肝肿瘤细胞有明显的体外抑制作用。 提示其可用于癌瘤内注射。
权利要求
1、α-羟基酸在制备癌瘤体内注射治疗药物中的应用，其中的α-羟基酸是羟基乙酸或α-羟基丙酸。
2、 根据权利要求1所述的a -羟基酸在制备癌瘤体内注射治疗药物中的应用， 其中的癌瘤是肝肿瘤、肺肿瘤或食管肿瘤。
3、 根据权利要求l所述的a -羟基酸在制备癌瘤体内注射治疗药物中的应用， 该药物是含a-羟基酸的水溶液、微球、微囊或包合物。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，具体指α-羟基酸在制备癌瘤体内注射治疗药物中的应用。本发明的α-羟基酸指羟基乙酸或α-羟基丙酸。本发明制备了不同浓度的羟基乙酸水溶液，进行了裸鼠实验、大鼠实验和细胞试验等药效试验，并将其与同浓度的用于肝癌瘤内注射的阳性药乙酸的药效进行了比较。通过裸鼠实验及大鼠的肝损伤实验，发现同浓度下羟基乙酸有跟乙酸相似甚至比乙酸更好的抗肝肿瘤效果。通过细胞实验，发现羟基乙酸用于瘤内注射对肝肿瘤、肺肿瘤、食管肿瘤等的肿瘤细胞都有强大的抑制作用。本发明也证明了α-羟基丙酸(乳酸)具有与羟基乙酸相似的抗癌效果。本发明提供了对肝肿瘤、肺肿瘤、食管肿瘤等肿瘤细胞都具有较强抑制作用的新的癌瘤体内注射治疗药物。
文档编号A61K31/185GK101214234SQ20081003252
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月10日 优先权日2008年1月10日
发明者俊 严, 吴忠斌, 靖 孙, 悦 张, 扬 张, 莹 李, 胡育新, 莉 邓, 丹 郭, 陈建明 申请人:中国人民解放军第二军医大学