专利名称：：苦参总黄酮在制备药物中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种苦参总黄酮在制备药物中的新用途，尤其是一种苦参总黄酮在制备治疗骨质疏松药物中的应用。
背景技术：
：据世界卫生组织(WHO)的统计，骨质疏松症(osteoporosis)在常见多发病中列第5位，世界总患病人数超过3亿人，并有大量的潜在发病人群。目前，骨质疏松症的治疗药物主要包括三类第一类是促骨形成药物，如同化激素；第二类是抗骨吸收药物，如雌激素等；第三类是如维生素D等促进骨矿化药物，而这些药物都存在成本高、副作用大等缺点。中药苦参为豆科植物苦参(6b/7tora^"vayceraAit)的干燥根，来源广泛、价格低廉，在中国大部分地区均有生产，其主要成分是生物碱和黄酮类成分，具有清热燥湿、利尿杀虫的功效，用于热痢、便血、赤白带下、抗菌消炎等。目前，对于苦参碱、氧化苦参碱等生物碱类成分研究很多，并发现具有较多的药理活性如抗肿瘤、抗病毒、降压、抗炎、平喘等作用。而苦参中的黄酮类主要有在基本骨架结构中连有异戊烯基或薰衣草烯基的二氢黄酮、二氢黄酮醇类衍生物等，结构式包括下列通式曾有文献报道苦参总黄酮苦参总黄酮有抗糖尿病，对CAMP磷酸二酯酶的抑制活性、抗炎活性、抗肿瘤活性、抗病原微生物作用、抗心率失常作用等。中国专利申请号为200410030937.X的发明专利申请，公开"一种苦参总黄酮提取物及其制备方法和用途"，其苦参总黄酮提取物具有TNFa和IL-lf3抑制作用，可治疗多种疾病，但目前未见关于其抗骨质疏松作用的报道。
发明内容本发明是发现了苦参总黄酮中的主要成分一二氢黄酮、二氢黄酮醇类衍生物具有抗骨质疏松作用，发明了苦参总黄酮在制备治疗骨质疏松药物中的应用。本发明的技术解决方案是一种苦参总黄酮在制备药物中的应用，其特征在于下列通式I、II、III所列二氢黄酮、二氢黄酮醇类衍生物在制备抗骨质疏松药物中的应用<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>本发明是将苦参总黄酮在制备抗骨质疏松药物中的应用，具有疗效可靠，无毒副作用、资源丰富、价格低廉等优点。图1是正常组体内抗骨质疏松实验后大鼠胫骨近端病理切片图。图2是病理组体内抗骨质疏松实验后大鼠胫骨近端病理切片图。图3是对照组体内抗骨质疏松实验后大鼠胫骨近端病理切片图。图4是本发明实施例体内抗骨质疏松实验后大鼠胫骨近端病理切片图。具体实施例方式可用现有技术所述方法提取苦参总黄酮，也可用下述方法提取取苦参药材lKg，粉碎，过80目筛，加20倍的10%盐酸溶液，浸泡5小时，过滤，用3倍的水清洗。药材残渣干燥，用20倍的乙醇提取2次，提取液合并，减压浓縮至干，得到粗提物。用3倍量的乙酸乙酯，溶解粗提物，分别用等量的5%盐酸溶液、5%碳酸钠溶液和水等体积清洗1次，然后将乙酸乙酯溶液减压回收，可到苦参总黄酮提取物(40克)，以化合物kurarinone计，总黄酮含量51.5%。将苦参总黄酮提取物制成抗骨质疏松药物，可按现有技术的方法制成片剂、胶囊等各种剂型，按口服方式给药，给药量75mg/Kg.天。实验数据一.苦参黄酮单体类成分的体外抗骨质疏松实验(培养的HOSTE85细胞MTT和胶原合成的影响)(一)实验方法1.制取实验用化合物将所得到的总黄酮提取物按照下列方法进行分离利用硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇为洗脱溶剂，梯度洗脱(100:l到l:100)，得到12个馏分。其中，第3号馏分，利用硅胶柱色谱和LH-20柱色谱技术，并利用制备HPLC方法，得到化合物l(36mg)和化合物3(10mg);第5号馏分，制备HPLC方法(甲醇水=60:40)，得到化合物2(12mg)，第7号馏分，制备HPLC方法(甲醇水二55:45)，得到化合物4(8mg)，同样方法，第8号馏分利用制备HPLC方法(甲醇水=49:51)，得到化合物5(11mg)和化合物6(7mg)。在第9号馏分利用制备HPLC方法(甲醇水=45:55)，得到化合物7(5mg)。所得上述化合物1-7的iH-NMR和"C-NMR谱，通过同苦参中的已知成分NMR数据的比较，分别确定为Kurarinone、KushenolX、KusamolS、Kusheno1F、isoKurarinone、KushenolA、KushenolL，在参考文献1~7中均有i己载，其结构式如下Kushe加lL(7)2.药品与试剂所分离得到的7种化合物均以DMSO溶解，各样本的终浓度均以mol/L表示。人的骨髓肉瘤细胞株HOSTE85，其具有成骨细胞特征，由美国旧金山大学提供。F-12培养基为Irwitrogen公司产品，国产胎牛血清由中国医学科学院基础医学细胞中心提供，MTT(Sigma)。3&脯氨酸(中国原子能研究院)，PPO，POPOP(Fluka)，Tritonx100(Farco公司)3.成骨细胞培养成骨细胞HOSTE85的培养条件F-12培养基+10%胎牛血清+5xl(^U/L青霉素和50g/L链霉素，置于37。C,5%浓度032的培养箱中培养，视细胞生长状况换液和传代，将孵箱C02浓度适当提高以维持细胞外环境pH值稳定。4.MTT法检测细胞增殖细胞以lxl05密度接种于51孔板中，每孔200nL细胞液，F-12培养基中10%胎牛血清。第二天将7种待测化合物加入每个孔板中，每种化合物的浓度分别为l(T9，l(T8，It)'7mol/L。MTT溶液配制称取250mgMTT，放入小烧杯中，加50mlPBS(0.01mol/L,pH7.4)在电磁搅拌机上搅拌30min,用0.22um的微孔滤器除菌，分装，4"C保存。细胞培养44小时后，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20ul,37'C，继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加入150ul二甲基亚砜DMSO(分析纯)，振荡10min,使结晶物充分溶解。选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。5^H-脯氨酸掺入法检测胶原蛋白形成细胞以5xl05密度接种于24孔板中，每孔90(HiL细胞液。以F-12培养基加入10%胎牛血清。第二天加药后继续培养40小时后，加入3H-脯氨酸(O.lpCi)。8小时后以0.1MPBS(PH7.4)洗细胞3遍，洗去未掺入细胞得311-脯氨酸。随后，每孔中加入0.1MNaOHlmL，静止15分钟后吸出孔中液体加入闪烁杯中。每个闪烁杯中加入闪烁液7mL(含PP02.5g,POPOP0.05g，甲苯500mL)+TritonX100(v/v=2:1)，用液体闪烁计数仪检测放射量(cpm)。(二).实验结果见表1:*尸<0.05racontrol表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表l可以看出，苦参黄酮类中的二氢黄酮、二氢黄酮醇类衍生物化合物l-7均能不同程度的促进细胞增殖。同B寸，化合物3、4还具有刺激细胞胶原合成的作用。二.苦参黄酮总黄酮的体内抗骨质疏松实验以上述总黄酮含量51.5%的苦参总黄酮提取物进行体内抗骨质疏松实验，以淫羊藿总黄酮(含量大于50%)提取物为对照。实验动物Sprague-Dawley清洁级大鼠，雌性，3个月龄。试剂苦参总黄酮自制(黄酮含量51.5%);淫羊藿提取物(购自于宏久生物技术有线公司，含量52.5%)。1.方法取实验用SD大鼠50只，20%乌拉坦腹腔注射麻醉后，取其中10只，在两侧只切除小块脂肪作为正常组；其余用俯位固定，在背部两侧开口，于无菌条件下，摘除两侧卵巢，3周后，取存活的30只，随机3组，每组IO只，分别为骨质疏松模型组、对照组、本发明实施例组。对于以上4组分别经口给药，连续3个月，正常组及骨质疏松模型组给予10%阿拉伯胶，0.4g/Kg;对照组75mg/Kg淫羊藿提取物；本发明实施例组(苦参总黄酮组)75mg/Kg苦参总黄酮提取物。2.结果A.骨密度的测定于实验结束前2天在乙醚麻醉的条件下，取腰椎和股骨进行双能X线(DEXA)骨密度测定，结果见表2:表2组号体重(g)平均值骨密度(g/cm2)平均值~"正常组^0.290±0.010模型组3100.245±0.021对照组3200.277±0.028本发明实施例组2800.295±0.016结果表明对照组和本阿明实施例组，大鼠股骨密度明显高于模型对照组，并且本发明实施例组的骨密度值与正常组的骨密度较为接近，表明苦参总黄酮对大鼠骨密度有较好的改善作用。B.对骨形态学的影响取大鼠胫骨近端病理切片(图1图4)，光镜下观察可见模型组大鼠骨小梁稀疏，并且较正常组宽度变细，本发明实施例组和对照组骨小梁数目和宽度均明显增加，并且分布均匀、密集。参考文献1.HatatsuM，etal.StudiesontheconstituentsoftherootofSophoraangustifolia(2)ChemPharmBull,1971，19(10):2126-2131.(译文苦参化学成分研究(2))2.ShinTH，etal.CyotoxiclavandulylflavanonesfromSorphoraflavescens.JNatProd2000，63:680-681(译文苦参中具有细胞毒作用的异戊烯基黄酮)；3.KuroyanagiM.etal.AntibacterialandantiandrogenflavonoidsfromSorphoraflavescens.JNatProd62:1595-1599(译文苦参中具有抗菌和抗雄激素作用的黄酮)，4.KyogokuKetal.ConstituentsofaChinesecrudedrugKushen.Isolationoffivenewflavonoidsandformononetin.ChemPhaxmBull,1973，21(12〉2733-2738.(译文中药苦参中分离五个新黄酮类成分)；5.Wulj，etal.StudiesontheconstituentsofSophoraflavescensAiton.II.ChemPharmBull,1985,33(8):3231-3236.(译文:苦参化学成分研究(II))6.WuLJ，etal.StudiesontheconstituentsofSophomflavescensAiton.IV.YakugakuZasshi，1985，105(11):1034-1039.(译文:苦参化学成分研究(IV))权利要求1.一种苦参总黄酮在制备药物中的应用，其特征在于下列通式I、II、III所列的二氢黄酮、二氢黄酮醇类衍生物在制备抗骨质疏松药物中的应用通式I 通式II通式IIIR2＝OH或H。全文摘要本发明公开一种苦参总黄酮在制备药物中的应用，其特征在于是二氢黄酮、二氢黄酮醇类衍生物在制备抗骨质疏松药物中的应用。具有疗效可靠，无毒副作用、资源丰富、价格低廉等优点。文档编号A61P19/00GK101507750SQ20091001096公开日2009年8月19日申请日期2009年4月1日优先权日2009年4月1日发明者刘克辛,孙长凯,张宝璟,马骁驰申请人:大连医科大学