专利名称：党参多糖的提取方法
技术领域：
本发明涉及中药材有效成分的提取方法，具体为党参多糖的提取方法。
技术背景党参(Radix Codonopsis)为桔梗科党参属植物，干燥根入药，可补中益气，健脾益肺。 用于脾肺虚弱，气短心悸，食少便溏，虚喘咳嗽，内热消咳。党参主要含有(1)糖类，有多糖、杂多糖，其中目前巳确定的有4种杂多糖CPI-IV， 主要由葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖和鼠李糖以不同比例组成。此外含 有较多的菊糖和果糖。(2)苷类，丁香苷正己基-e-D-吡喃葡萄糖苷、乙基-a-D-呋喃果糖 苷，党参苷I 。 (3)微量生物碱和含氮成分。(4)甾醇及三萜成分。(5)挥发油及其他成分。党参提取物——党参多糖具有多个方面较好的生物活性，毒理学实验证明其为无毒物 质。现代药理研究表明，党参多糖具有调节机体免疫力、抗衰老、抗缺氧、抗应激、抗氧化 等作用。目前，党参多糖提取技术主要有水提离心分离法、水提醇沉法等，但现有提取方法由于 技术参数选择不合理，导致提取物中党参多糖含量低。如专利号为200410012172.7的中国专 利公开了一种采用水提离心分离法制备党参多糖的方法，提取物中党参多糖含量只在15%以 上；专利申请号为200510012557.8的中国专利也公开了一种党参多糖的制备方法，得到的黄 色粉末状的提取物中，党参多糖含量在60%以上。同时，现有的提取方法得到的提取物都是 党参多糖的粗品，由于提取未经进一步纯化，提取物杂质多、外观性状不佳、多糖组分不明 确。此外，现有提取方法通常仅以多糖含量为指标对提取工艺进行监测，不考察提取率，因 而不能很好地体现工艺的科学性和先进性。发明内容本发明为了解决现有党参多糖提取方法技术参数选择不合理，提取物党参多糖含量较 低，提取工艺未考察提取率以及未经纯化，提取物杂质多、外观性状不佳、多糖组分不明确 等问题，提供一种党参多糖的提取方法。该提取方法可得到含量达到70%以上的高纯度的党 参多糖，提取率达20% 30%，同时对党参多糖粗品进行进一步的纯化处理。本发明是采用如下技术方案实现的党参多糖的提取方法，包括如下步骤(1)除尘 洗净药材党参清水冲洗干净；(2)切碎将党参切成2 4 cm的段；(3)除杂将切好 的党参段，80% 95%乙醇回流2~3次，每次1 2小时，挥干乙醇；(4)水提除杂后的药渣 加入8 20倍药渣重量的蒸馏水，沸水回流2 3次，每次1 2小时，过滤，合并滤液，减压浓縮 至药液相对密度为0.8 1.2g/ml，放置冷却；(5)乙醇沉淀将放置冷却的浓縮液加入乙醇
至醇沉浓度为70%~90%，静置，离心，得到醇沉物；(6)脱水将醇沉物用无水乙醇、丙 酮、乙醚依次洗涤；(7)干燥将洗涤后的醇沉物真空干燥，得黄白色粉末状沉淀物即党 参多糖提取物。本发明所用的回流提取溶液一乙醇及其浓度(80%~95%)保证了党参中大部分非多糖类成分溶于提取溶液中，从而利于后续的减压浓縮(杂质过多会产生大量泡沫)，并保证了较 高含量的党参多糖。党参多糖提取液的浓縮程度是影响党参多糖提取率的一个重要因素，多 糖在低浓度的醇溶液中有少量的溶解，提取液未经浓縮而直接添加乙醇进行醇析，势必使乙醇得以稀释，乙醇浓度降低，使多糖有少量的溶解，多糖提取率减少；若浓縮过度，则使提 取液过于粘稠，多糖容易与蛋白、杂质及溶剂形成凝胶物质，从而影响了乙醇与多糖的接触， 给乙醇沉淀分离带来不便，降低党参多糖提取率。本发明在大量实验的基础上，优化确定了 提取液的相对密度在0.8 1.2 g/ml之间，从而能够在一定程度上提高党参多糖提取率。本发 明确定的乙醇醇沉浓度为70%~90%，不仅能够保证党参多糖成分充分的沉淀出来，而且在 此醇沉浓度范围内多糖沉淀时包裹的杂质较少，从而党参多糖含量较高。对采用本发明提取方法获得的党参多糖CPS采用硫酸一苯酚法测定总糖含量，3， 5 — 二 硝基水杨酸法测定单糖含量，总糖含量减去单糖含量即为党参多糖含量。以葡萄糖为对照品， 党参多糖含量测定结果^2j_党参多糖批号 多糖含量(％)060222 79.37 060626 79.76061003_80.54_结果表明党参多糖提取物中多糖含量以葡萄糖计达70 %以上。对采用本发明提取方法获得的党参多糖采用高效凝胶渗透色谱法进行分子量测定高效 凝胶渗透色谱系统泵waters 515 HPLC pump;工作站Millennium32;检测器waters 2410 RID;柱子TSKGMPWXL;检测器温度35°C;柱温35°C;流速0.3ml/min;流动相 超纯水；结果党参多糖CPS分子量在2500 300万Dal之间成多重峰分布。本发明可采用如下方法对上述得到的党参多糖提取物进行进一步的纯化将制备得到的 党参多糖用水充分溶解，离心，上清液上弱阴离子交换柱，流速lml/min，先经蒸馏水洗脱， 苯酚i酸法跟踪检测，直到无阳性洗脱液为止，合并多糖反应呈阳性的洗脱液；再用NaCl 溶液依次以0.01 mol/L、 0.05 mol/L、 0.1 mol/L、 0.15 mol/L、 0.2 mol/L、 0.25 mol/L、 0.3 mol/L、 0.5mol/L、 1.0mol/L的浓度梯度洗脱，苯酚4酸法跟踪检测，直到无阳性洗脱液为止，合 并多糖反应呈阳性的洗脱液。蒸馏水洗脱部分经浓缩、真空干燥得到党参多糖亚级分；不同 浓度的各NaCl溶液洗脱部分经减压浓縮、透析、真空干燥得到党参多糖各亚级分。运用高
效凝胶渗透色谱法对党参多糖各亚级分的分子量进行测定，测定结果为党参多糖各亚级分 在2500 300万Dal之间分布。还可采用如下方法对上述得到的党参多糖提取物进行进一步的纯化提取得到的党参 多糖，用水充分溶解，离心，上清液上弱阴离子交换柱层析分离纯化，流速lml/min，先经 蒸馏水洗脱，苯酚i酸法跟踪检测，直到无阳性洗脱液为止，合并多糖反应呈阳性的洗脱 液；再用NaHCO3溶液依次以0.01 mol/L、 0.05 mol/L、 0.1 mol/L、 0.15mol/L、 0.2mol/L、 0.25 mol/L、 0.3mol/L、 0.5 mol/L、 1.0 mol/L的浓度梯度洗脱及0.05 mol/LNaOH溶液洗脱，苯酚-硫酸法跟踪检测，直到无阳性洗脱液为止，合并多糖反应呈阳性的洗脱液；蒸馏水洗脱部分 经浓縮、真空干燥得党参多糖亚级分；不同浓度NaHC03溶液洗脱部分经减压浓縮、透析、 真空干燥得到党参多糖各亚级分。运用高效凝胶渗透色谱法对党参多糖各亚级分的分子量进 行测定，测定结果为党参多糖各亚级分在2500 300万Dal之间分布。将得到的党参多糖各亚级分用水溶解后分别用排阻范围为1000 200,000Dal的分子筛柱 层析分离，得到一系列分子量不同的但各系列分别为均一分子量的高纯度的党参多糖各亚级 分。运用高效凝胶渗透色谱法对党参多糖各亚级分的分子量进行测定，测定结果为党参多 糖各亚级分在2500 300万Dal之间分布。本发明所述的党参多糖的提取方法属于水提醇沉法。在大量实验的基础上，本发明确定 了优化的党参多糖提取工艺技术参数(包括除杂所用的溶剂及浓度、提取液的相对密度、醇 沉浓度等)，提高了党参多糖的含量(达到70%以上)，提取率达到20%~30%;该提取方 法步骤简便，成本低廉、工艺稳定且提取得到的党参多糖杂质少、外观性状佳。本发明所述 的提取方法增加了后续纯化处理，进一步纯化后不仅可以很好地将党参多糖按酸性多糖和中 性多糖分离开来，而且可以将党参多糖按分子量大小进行分段，从而得到不同的党参多糖亚 级分，同时，通过对党参多糖各亚级分的分子量测定，进一步明确了党参多糖的构成组分。 采用本发明所述提取方法得到的党参多糖可在制备抗肿瘤药、活血抗栓药、降血压药、降血 脂药、降血糖药、抗衰老药、增强骨髓造血机能药或免疫调节药物中得到应用。
具体实施方式
实施例l党参多糖的提取方法，包括如下步骤(1)除尘洗净药材党参100g清水冲洗干净；(2)切碎将党参切成2 4cm的段；(3)除杂将切好的党参段，80%乙醇回流2次， 每次1小时，挥干乙醇；(4)水提除杂后的药渣加入8倍药渣重量的蒸馏水，沸水回流2 次，每次1小时，过滤，合并滤液，减压浓縮至药液相对密度为0.8 g/ml，放置冷却；(5)乙醇沉淀将放置冷却的浓縮液加入乙醇至醇沉浓度为70%，静置，离心，得醇沉物；(6) 脱水将醇沉物用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤；(7)干燥将洗涤后的醇沉物真空干
燥，得黄白色粉末状沉淀物即党参多糖提取物35.5g。以苯酚一硫酸法测定提取物总糖含量， 3， 5 —二硝基水杨酸法测定提取物单糖含量，总糖含量减去单糖含量即为党参多糖含量。党 参多糖含量以葡萄糖计为76%。提取率按下式计算为27%。党参多糖提取率⑧=^^^^X100%原药材重量将提取得到的党参多糖用水充分溶解，离心，上清液上弱阴离子交换柱，流速lml/min， 先经蒸馏水洗脱，苯酚~^[酸法跟踪检测，直到无阳性洗脱液为止，合并多糖反应呈阳性的 洗脱液；再用NaCl溶液依次以0.01 mol/L、 0.05 mol/L、 0.1 mol/L、 0.15mol/L、 0.2mol/L、 0.25mol/L、 0.3mol/L、 0.5 mol/L、 1.0 mol/L的浓度梯度洗脱，苯酚i酸法跟踪检测，直到 无阳性洗脱液为止，合并多糖反应呈阳性的洗脱液。蒸馏水洗脱部分经浓缩、.真空干燥得党 参多糖亚级分；不同浓度的各NaCl溶液洗脱部分经减压浓縮、透析、真空干燥得到党参多 糖各亚级分。所述的弱阴离子交换柱是DEAE-弱阴离子交换柱。并优选DEAE-Sepharose F.F. 柱或DEAE纤维素柱或DEAE-Sephdex A。将得到的党参多糖亚级分用水溶解后分别用排阻范围为1000 200,000Dal的分子筛柱层 析分离，得到一系列分子量不同的但各系列分别为均一分子量的高纯度的党参多糖各亚级 分。运用高效凝胶渗透色谱法对党参多糖各亚级分的分子量进行测定，测定结果为党参多 糖各亚级分在2500 300万Dal之间分布。均含有D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、D-阿拉伯 糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等单糖残基。其中分子筛柱是SephdexG或Sephacryl凝胶柱或 Sephrose 6B凝胶柱。实施例2党参多糖的提取方法，包括如下步骤(1)除尘洗净药材党参100g清水冲洗干净； (2)切碎将党参切成2 4cm的段；(3)除杂将切好的党参段，95%乙醇回流3次， 每次2小时，挥干乙醇；(4)水提除杂后的药渣加入20倍药渣重量的蒸馏水，沸水回流 2次，每次2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至药液相对密度为1.2g/ml，放置冷却；(5) 乙醇沉淀将放置冷却的浓縮液加入乙醇至醇沉浓度为90%，静置，离心，得醇沉物；(6) 脱水将醇沉物用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤；(7)干燥将洗涤后的醇沉物真空干 燥，得黄白色粉末状沉淀物即党参多糖提取物33g。以苯酚一硫酸法测定提取物总糖含量， 3， 5 — 二硝基水杨酸法测定提取物单糖含量，总糖含量减去单糖含量即为党参多糖含量。党 参多糖含量以葡萄糖计为80%。提取率按下式计算为26%。党参多糖提取率(。/。) -沉淀物重xfff糖含量",。原药材重量将提取得到的党参多糖用水充分溶解，离心，上清液上弱阴离子交换柱层析分离纯化，流速1 ml/min，弱阴离子交换柱先经蒸馏水洗脱，苯酚~^酸法跟踪检测，直到无阳性洗脱
液为止，合并多糖反应呈阳性的洗脱液；再用NaHCO3溶液依次以0.01mol/L、 0.05 mol/L、 0.1mol/L、 0.15mol/L、 0.2mol/L、 0.25 mol/L、 0.3 mol/L、 0.5 mol/L、 1.0 mol/L的浓度梯度 洗脱及0.05mol/LNaOH溶液洗脱，苯酚~^酸法跟踪检测，直到无阳性洗脱液为止，合并多 糖反应呈阳性的洗脱液；蒸馏水洗脱部分经浓縮、真空干燥得党参多糖亚级分；不同浓度 NaHC03溶液洗脱部分经减压浓縮、透析、真空干燥得到党参多糖各亚级分。所述的弱阴离 子交换柱是DEAE-弱阴离子交换柱。并优选DEAE-S印harose F.F.柱或DEAE纤维素柱或 DEAE—Sephdex A。将得到的党参多糖亚级分用水溶解后分别用排阻范围为1000 200,000Dal的分子筛柱层 析分离，得到一系列分子量不同的但各系列分别为均一分子量的高纯度的党参多糖各亚级 分。运用高效凝胶渗透色谱法对党参多糖各亚级分的分子量进行测定，测定结果为党参多 糖各亚级分在2500 300万Dal之间分布。均含有D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-果糖、D-半乳糖、 D-阿拉伯糖、D-果糖、D-甘露糖等单糖残基。其中分子筛层析柱是SephdexG或Sephacryl凝 胶柱或Sephrose 6B凝胶柱。实施例3党参多糖的提取方法，包括如下步骤(1)除尘洗净药材党参300g清水冲洗干净；(2)切碎将党参切成2 4cm的段；(3)除杂将切好的党参段，90% (或85%乙醇) 乙醇回流3次，每次1.5小时，挥干乙醇；(4)水提除杂后的药渣加入15倍(或10倍或 13倍或18倍)药渣重量的蒸馏水，沸水回流提取3次，每次1.5小时，过滤，合并滤液， 减压浓縮至药液相对密度为1.0g/ml，放置冷却；(5)乙醇沉淀将放置冷却的浓缩液加入 乙醇至醇沉浓度为80% (或75%或85%)，静置，离心，得醇沉物；(6)脱水将醇沉物 用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤；(7)干燥将洗涤后的醇沉物真空干燥，得黄白色粉 末状沉淀物即党参多糖提取物111 g。以苯酚一硫酸法测定提取物总糖含量，3， 5 — 二硝基 水杨酸法测定提取物单糖含量，总糖含量减去单糖含量即为党参多糖含量。党参多糖含量以 葡萄糖计为77.8%。提取率按下式计算为28.8%。党参多糖提取率(％):沉淀物H，f糖含量X，/。原药材重量将提取得到的党参多糖用水充分溶解，离心，上清液上弱阴离子交换柱，流速lml/min， 先经蒸馏水洗脱，苯酚"^酸法跟踪检测，直到无阳性洗脱液为止，合并多糖反应呈阳性的 洗脱液；再用NaCl溶液依次以0.01 mol/L、 0.05 mol/L、 0.1 mol/L、 0.15mol/L、 0.2mol/L、 0.25mol/L、 0.3mol/L、 0.5 mol/L、 1.0 mol/L的浓度梯度洗脱，苯酚~^1酸法跟踪检测，直到 无阳性洗脱液为止，合并多糖反应呈阳性的洗脱液。蒸馏水洗脱部分经浓縮、真空干燥得党 参多糖亚级分；不同浓度的各NaCl溶液洗脱部分经减压浓縮、透析、真空干燥得到党参多 糖各亚级分。所述的弱阴离子交换柱是DEAE-弱阴离子交换柱。并优选DEAE-Sepharose F.F.
柱或DEAE纤维素柱或DEAE-Sephdex A。将得到的党参多糖亚级分用水溶解后分别用排阻范围为1000 200，000Dal的分子筛柱层 析分离，得到一系列分子量不同的但各系列分别为均一分子量的高纯度的党参多糖各亚级 分。运用高效凝胶渗透色谱法对党参多糖各亚级分的分子量进行测定，测定结果为党参多 糖各亚级分在2500 300万Dal之间分布。均含有D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、D-阿拉伯 糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等单糖残基。其中分子筛柱是SephdexG或Sephaciyl凝胶柱或 Sephrose 6B凝胶柱。
权利要求
1、一种党参多糖的提取方法，其特征为包括如下步骤(1)除尘洗净药材党参清水冲洗干净；(2)切碎将党参切成2～4cm的段；(3)除杂将切好的党参段，80％～95％乙醇回流2～3次，每次1～2小时，挥干乙醇；(4)水提除杂后的药渣加入8～20倍药渣重量的蒸馏水，沸水回流2～3次，每次1～2小时，过滤，合并滤液，减压浓缩至药液相对密度为0.8～1.2g/ml，放置冷却；(5)乙醇沉淀将放置冷却的浓缩液加入乙醇至醇沉浓度为70％～90％，静置，离心，得到醇沉物；(6)脱水将醇沉物用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤；(7)干燥将洗涤后的醇沉物真空干燥，得黄白色粉末状沉淀物即党参多糖提取物。
2、 如权利要求l所述的党参多糖的提取方法，其特征为将制备得到的党参多糖用水充 分溶解，离心，上清液上弱阴离子交换柱，流速lml/min，弱阴离子交换柱先经蒸馏水洗脱， 苯酚i酸法跟踪检测，直到无阳性洗脱液为止，合并多糖反应呈阳性的洗脱液；再用NaCl 溶液依次以O.Ol mol/L、 0.05 mol/L、 0.1 mol/L、 0.15 mol/L、 0.2 mol/L、 0.25 mol/L、 0.3 mol/L、 0.5mol/L、 1.0mol/L的浓度梯度洗脱，苯酚~^酸法跟踪检测，直到无阳性洗脱液为止，合 并多糖反应呈阳性的洗脱液；蒸馏水洗脱部分经浓缩、真空干燥得党参多糖亚级分；不同浓 度的各NaCl溶液洗脱部分经减压浓縮、透析、真空干燥得党参多糖各亚级分。
3、 如权利要求1所述的党参多糖的提取方法，其特征为将提取得到的党参多糖用水充 分溶解，离心，上清液上弱阴离子交换柱柱层析分离纯化，流速lml/min，弱阴离子交换柱 先经蒸馏水洗脱，苯酚-硫酸法跟踪检测，直到无阳性洗脱液为止，合并多糖反应呈阳性的 洗脱液；再用NaHC03溶液依次以0.01 mol/L、 0.05 mol/L、 0.1 mol/L、 0.15 mol/L、 0.2mol/L、 0.25mol/L、 0.3mol/L、 0.5 mol/L、 1.0 mol/L的浓度梯度洗脱及0.05 mol/LNaOH溶液洗脱， 苯酚-硫酸法跟踪检测，直到无阳性洗脱液为止，合并多糖反应呈阳性的洗脱液；蒸馏水洗 脱部分经浓縮、真空干燥得党参多糖亚级分；不同浓度的各NaHC03溶液洗脱部分经减压浓 縮、透析、真空干燥得党参多糖各亚级分。
4、 如权利要求2或3所述的党参多糖的提取方法，其特征为将得到的党参多糖各亚 级分用水溶解后分别用排阻范围为1000~200，000Dal的分子筛柱层析分离，得到一系列分子 量不同的但各系列分别为均一分子量的高纯度的党参多糖各亚级分。
5、 权利要求2或3所述的党参多糖的提取方法，其特征为弱阴离子交换柱是DEAE-弱阴离子交换柱。
6、 如权利要求5所述的党参多糖的提取方法，其特征为DEAE-弱阴离子交换柱优选 DEAE—sepharose F.F.柱或DEAE纤维素柱或DEAE—Sephdex A。
7、 如权利要求4所述的党参多糖的提取方法，其特征为分子筛柱是Sephadex G或 Sephacryl凝胶柱或Sepharose 6B凝胶柱。
全文摘要
本发明涉及中药材有效成分的提取方法，具体为党参多糖的提取方法。解决现有党参多糖提取方法技术参数选择不合理，提取物党参多糖含量较低，以及未经纯化，提取物杂质多、外观性状不佳、多糖组分不明确等问题。包括如下步骤除尘洗净，切碎，除杂将切好的党参段，80％～95％乙醇回流，水提并减压浓缩至药液相对密度为0.8～1.2g/ml，放置冷却，乙醇沉淀将放置冷却的浓缩液加入乙醇至醇沉浓度为70％～90％，静置，离心，得到醇沉物，脱水，干燥。提高了党参多糖的含量，达到70％以上，提取率为20％～30％；该提取方法步骤简便，成本低廉、工艺稳定且提取得到的党参多糖杂质少、外观性状佳。增加了后续纯化处理，进一步明确了党参多糖的构成组分。
文档编号A61K125/00GK101129439SQ200710062520
公开日2008年2月27日 申请日期2007年8月1日 优先权日2007年8月1日
发明者张志勇, 李瑞燕, 漆小梅, 郑庆红, 高建平 申请人:山西医科大学