专利名称：核桃叶提取物的制备及其在改善记忆、抗肿瘤领域的应用前景的制作方法
技术领域：
本发明是关于核桃叶提取物的制备及其在改善记忆、抗肿瘤领域的应用前景的发
明，属于天然药物领域。
背景技术：
核桃，在国际市场上它与扁桃、腰果、榛子一起，并列为世界四大干果。它的足迹几 乎遍及世界各地，主要分布在美洲、欧洲和亚洲很多地方。核桃在国外，人称"大力士食品"、 "营养丰富的坚果"、"益智果";在国内享有"万岁子"、"长寿果"、"养人之宝"的美称。其卓 著的健脑效果和丰富的营养价值，已经为越来越多的人所推崇。 核桃的药用价值很高，中医应用广泛。祖国医学认为核桃性温、味甘、无毒，有健 胃、补血、润肺、养神等功效。《神农本草经》将核桃列为久服轻身益气、延年益寿的上品。唐 代孟诜著《食疗本草》中记述，吃核桃仁可以开胃，通润血脉，使骨肉细腻。宋代刘翰等著《开 宝本草》中记述，核桃仁"食之令肥健，润肌，黑须发，多食利小水，去五痔。"明代李时珍著
《本草纲目》记述，核桃仁有"补气养血，润燥化痰，益命门，处三焦，温肺润肠，治虚寒喘咳， 腰脚重疼，心腹疝痛，血痢肠风"等功效。 现代医学研究认为，核桃中的磷脂，对脑神经有良好保健作用。核桃油含有不饱和 脂肪酸，有防治动脉硬化的功效。核桃仁中含有锌、锰、铬等人体不可缺少的微量元素。人 体在衰老过程中锌、锰含量日渐降低，铬有促进葡萄糖利用、胆固醇代谢和保护心血管的功 能。核桃仁的镇咳平喘作用也十分明显，冬季，对慢性气管炎和哮喘病患者疗效极佳。民间 常用于清热、解毒、抗癌、镇痛等疾病的治疗。目前国内外对核桃的研究主要是对其植物形态分类、栽培、山核桃仁营养价值等 的研究，但对于其化学成分的提取分离及药理作用等的研究报道还比较少。关于核桃提取 物的作用，绝大部分报道是关于其在抑菌方面的功效。专利200710056996. 8曾报道了核桃 壳提取物的制备及其在强心和心脑血管领域药物制剂的应用，该发明是核桃壳的乙醇提取 物，并根据其药理活性研究表明，核桃壳提取物具有一定的强心及改善心肌供血等活性，有 可能研制成为具有多种药理活性低毒高效的天然中药的心脑血管病治疗新药。取有效量的 提取物与药用辅料混合制成多种不同药物组合物的各种口服制剂。而关于核桃叶的系统溶 剂微波提取法以及其在改善记忆和抗肿瘤方面的运用在本发明完成之前没有报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供了一种核桃叶有效成分的提取分离方法。 本发明的目的之二是提供了以核桃叶提取物为原料研制片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒
剂、口服液等。 本发明的目的之三是提供了以核桃叶活性成分为主要药用成分用于生产提高记 忆、抗肿瘤的保健品或药品。
本发明的技术解决方案如下 采集的核桃叶子用乙醇浸泡过夜，用微波加热提取，旋转蒸发仪回收乙醇得褐色 黏稠物；叶子再加乙醇浸泡过夜，回收乙醇浓縮液，合并两次的乙醇浓縮液留存备用。将总 浓縮液悬浮于适量水中，充分震荡混匀后分别采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃 取。先用石油醚萃取，旋转蒸发仪回收石油醚萃取层留存；余下液体用氯仿萃取，旋转蒸发 仪回收氯仿层；再以乙酸乙酯萃取，旋转蒸发仪回收乙酸乙酯层；余下液体用水饱和正丁 醇萃取，旋转蒸发仪回收正丁醇层。余下水层离心后取水层旋转蒸发仪回收留存。得石油 醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物5种提取物，将其在真空干燥箱中减压干燥，粉碎， 即得到本发明所说的核桃叶提取物。 本发明的核桃叶提取物具有用于制备改善记忆和抗肿瘤的药物和保健品的应用
前景。按照药剂学的方法，可以将本发明的核桃叶提取物制备成作为改善记忆和抗肿瘤的
药物或保健品，口服制剂或保健品选自片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液等。 本发明所得到的提取物具有制备改善记忆和抗肿瘤的药物和保健品的应用前景，
可以通过以下的药效试验得到证实。 核桃提取液对肿瘤细胞的抑制作用 摘要将上述过程得到的核桃叶提取物采用MTI法观察其对肿瘤SGC-7901增殖的
抑制作用，并采用光学显微镜和电镜方法观察乙酸乙酯提取物SGC-7901细胞凋亡的诱导
作用。结果核桃乙酸乙酯提取物抗肿瘤作用最强，并且能够诱导肿瘤细胞凋亡。 目的采用MTI法观察其对肿瘤SGC-7901增殖的抑制作用，为核桃叶提取物开发抗
肿瘤药物提供理论依据。 方法步骤l.各称取2mg的上述5种提取物，水层直接用lml RP-MI1640溶解备用； 石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇提取物溶解于200iU二甲基亚砜中，旋涡震荡，全部溶解 后，加入800 iURPMI 1640培养液旋涡震荡混匀。将上述药物16000r/min离心后0. 22iim
滤膜过滤除菌后放置于4t:冰箱保存备用。 2.细胞培养方法将胃癌SGC-7901细胞接种于含10X新生小牛血清、100U/ml青霉 素和100U/ml链霉素的PPMI1640培养液中，37"C培养，长满后0. 08%胰蛋白酶消化传代培养。 3. MTT法观察山核桃提取物对肿瘤细胞增殖的抑制作用 用含10% FBS的1640培养液培养的胃癌细胞SGC-7901以7X103/孔接种于96 孔板，37t: 5% C02的培养箱中培养3h后，分别加入上述配制的药物，加入量分别为2、4、6、 8和10iU，每剂量组6复孔，不加任何药物的为对照。继续培养48h后，观察细胞形态的变 化。加入MTT孵育4h，弃去上清液，加入DMS0 150 y L震荡10min， 570nm处测OD值。RJ(细 胞增殖抑制率)=[(对照组A值-用药组A值)/对照组A值X100% ]。
4.乙酸乙酯提取物诱导SGC-7901细胞凋亡的观察 光学显微镜观察在6孔培养板中放入清洗干净的盖玻片，紫外线照射灭菌。每孔 接种SGC-7901细胞，4h后分别加入上述配制好的乙酸乙酯提取物96 y 1/ml，不加任何药物 的为对照，继续培养24h，取出盖玻片上细胞进行苏木素-伊红染色，光镜下观察细胞形态 变化。②透射电镜观在100ml培养瓶中接种SGC-7901细胞，4h后加入上述配制好的乙酸 乙酯提取物，浓度和对照组设立同上。处理24h后收集细胞，加2. 5%的戊二醛固定30min后，加1%四氧化锇固定lh，包埋后超薄切片，透射电镜下观察细胞形态变化。
试验结果 1.核桃的不同提取物均能抑制SGC-7901细胞的增殖；随着药物浓度的增加，其生 长抑制作用增强，呈量效关系；其中，乙酸乙酯提取物的抑制作用最强，随着加入药物浓度 的增加，其对SGC-7901细胞生长抑制率提高(同对照比较P〈0.05);氯仿提取物的作用次 之(同对照比较P < 0. 05);而其它3种提取物对SGC-7901细胞增殖的抑制作用不大(同 对照比较P > 0. 05)。
图1是本发明的实验用药比较图。 2.乙酸乙酯提取物诱导SGC-7901细胞凋亡乙酸乙酯提取物处理SGC-7901细胞，
HE染色后，光学显微镜下观察，多数细胞体积变小，变形，细胞核固縮，但细胞膜完整。而对
照组SGC-7901细胞形态学无明显变化。电子显微镜下可见，凋亡细胞体积变小，细胞核变
小。染色质浓縮并凝结成块，细胞核碎裂，细胞呈典型的凋亡现象。而对照组SGC-7901细
胞形态学无明显变化。 图2是本发明的实验对比结果 A :对照组(透射电镜。3700X) B :用药组(透射电镜。3700X)胃癌细胞可见细胞核的染色质高度凝聚、固縮、碎 裂。 结论核桃叶提取物均能抑制SGC-7901细胞的增殖；随着药物浓度的增加，其生 长抑制作用增强，呈量效关系；其中，乙酸乙酯提取物的抑制作用最强；再通过乙酸乙酯提 取物诱导SGC-7901细胞凋亡的观察，在光学显微镜下观察，多数细胞体积变小，变形，细胞 核固縮，电子显微镜下可见，凋亡细胞体积变小，细胞核变小。染色质浓縮并凝结成块，细胞 核碎裂，细胞呈典型的凋亡现象。 核桃叶提取液对衰老模型小鼠记忆力的影响
目的观察核桃叶提取液对小鼠记忆功能的影响. 方法取健康小鼠，雌雄各半，适应环境1周后按体重随机分为空白对照组、模型 组、维生素E组和核桃叶提取液大、中、小剂量组.每日给予除空白对照组外的其他各组小 鼠皮下注射半乳糖0. 12g/kg，给予空白对照组小鼠皮下注射50ml/kg生理盐水。同时每日 分别灌胃给予核桃叶水提取液大、中、小剂量组小鼠核桃叶水提取液12、6、3g/kg，灌胃给予 维生素E组小鼠维生素E100mg/kg，模型组和空白对照组每日灌胃给予100ml/kg蒸馏水，连 续30d。于第31日起利用Morris水迷宫视频分析系统和Dig Behv动物行为分析系统软件 测试记忆能力。 结果与模型组比较，核桃叶提取液各剂量组小鼠搜索站台的潜伏期均明显縮短， 而穿越站台的次数则明显增加。 结论本研究结果表明，各剂量核桃叶提取液组小鼠在早期搜索站台潜伏期均明显 縮短，增加小鼠穿越站台的次数，提示核桃叶水提取液可明显改善衰老模型小鼠空间位置 觉和方向觉(空间定位)，改善记忆功能。
权利要求
一种核桃叶提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤采集的核桃叶子用乙醇浸泡过夜，用微波加热提取，旋转蒸发仪回收乙醇得褐色黏稠物；叶子再加乙醇浸泡过夜，回收乙醇浓缩液，合并两次的乙醇浓缩液留存备用。将总浓缩液悬浮于适量水中，充分震荡混匀后分别采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取。先用石油醚萃取，旋转蒸发仪回收石油醚萃取层留存；余下液体用氯仿萃取，旋转蒸发仪回收氯仿层；再以乙酸乙酯萃取，旋转蒸发仪回收乙酸乙酯层；余下液体用水饱和正丁醇萃取，旋转蒸发仪回收正丁醇层。余下水层离心后取水层旋转蒸发仪回收留存。得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物5种提取物，将其在真空干燥箱中减压干燥，粉碎，即得到本发明所说的核桃叶提取物。
2 根据权利要求1所述的采集的核桃叶子用乙醇浸泡过夜，其特征在于，乙醇的浓度 为70% _80%，所用的量为核桃叶8-10倍的量。
3. 根据权利要求1所述的用微波加热提取，其特征在于微波的功率为300W，温度为 8(TC，提取时间为0. 5h。
4. 根据权利要求1所述的叶子再加乙醇浸泡过夜，其特征在于乙醇的浓度为85%，所 用的量为核桃叶3-5倍的量。
5. 根据权利要求1所述的浓縮液分别采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取， 其特征在于，每一种溶剂萃取的次数为三次，每次加入溶剂的量均为100ml。
6. 以核桃叶提取物为主要有效成分主要用于改善记忆、抗肿瘤药物或保健产品之中。
全文摘要
本发明公开了一种核桃提取物的制备及其在改善记忆、抗肿瘤领域的应用前景。核桃叶用乙醇浸泡过夜，用微波加热提取，旋转蒸发仪回收乙醇得褐色黏稠物；叶子再加乙醇浸泡过夜，回收乙醇浓缩液，合并两次的乙醇浓缩液留存备用。将总浓缩液悬浮于适量水中，充分震荡混匀后分别采用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取、减压干燥，粉碎，得石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物5种提取物。该提取物有效成分可用于生产改善记忆、抗肿瘤药物或保健品。
文档编号A61K127/00GK101757097SQ20081016296
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月11日 优先权日2008年12月11日
发明者吴菁, 陈群 申请人:湖州来色生物基因工程有限公司;吴菁