专利名称：枸杞多糖组分-Ⅲ在制备防治有机磷农药所致血管损伤的药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种枸杞多糖组分-III的新用途，具体为枸杞多糖组分-III在制备防治有机磷农药所致血管损伤的药物中的应用。
背景技术：
我们在2006年到2009年对豫北地区有机磷农药的使用人群进行调查研究，发现长期接触有机磷农药大于10年的农民体内呈明显的氧化应激状态，极易诱发多种血管性疾病(如动脉粥样硬化、糖尿病等)。氧化应激可以引起血管损伤性疾病(如动脉粥样硬化、糖尿病等)。发明人通过多种实验途径寻找长期低剂量接触有机磷农药引起机体损伤的直接原因，最终发现有机磷农药可以引起血管内皮依赖性舒张反应下降，血管组织氧化产物聚集，培养的人脐静脉内皮细胞单层通透性升高、凋亡增加，细胞培养液氧化产物聚集，最终导致血管损伤，诱发各种血管疾病。研究表明，机体长时间接触小剂量有机磷，可以导致血浆对氧磷酶-1活力和浓度明显下降，临床上也与动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病等疾病的发生有关，血浆对氧磷酶-1 (Paraoxonase-I)有强大的抗氧化作用，其活力和浓度下降直接导致机体抗氧化能力下降，体内自由基含量上升，且大量的研究表明氧化应激与许多疾病(如动脉粥样硬化、冠心病、糖尿病)的发生存在着密切的联系。因此，减少血管内皮损伤可以有效的防治有机磷农药所致的各种心、脑血管疾病， 本发明目的在于提供一种防治有机磷农药所致血管损伤的药物。枸杞(Lycium Barbarum)，其果谓枸杞子，是茄科植物枸杞的成熟果实，它在祖国的传统医学中具有重要的地位，其药用价值备受历代医家的推崇。《本草纲目》记载“枸杞， 补肾生精，养肝，明目，坚精骨，去疲劳，易颜色，变白，明目安神，令人长寿。”可治疗肝肾阴亏，腰膝酸软，头晕，目眩，目昏多泪，虚劳咳嗽，消渴，遗精等。现代分析表明枸杞子含有丰富的枸杞多糖、脂肪、蛋白质、游离氨基酸、牛磺酸、甜菜碱、维生素4』2丄丄，特别是类胡萝卜素含量很高。此外，还含有大量的矿物元素，如钾、 钠、钙、镁、铁、铜、锰、锌、硒等。枸杞多糖具有十分重要的、多方面的保健功能作用(1)免疫调节作用枸杞多糖对小鼠非特异性免疫、特异性免疫有非常显著的免疫调节作用，能显著地增强小鼠脾淋巴细胞增殖、迟发型变态反应、升高小鼠血清溶血素含量、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、小鼠碳粒廓清能力、以及显著增强抗体生成的能力等。(2)降血糖作用枸杞多糖对实验性糖尿病小鼠有明显的降血糖作用，有效率达100% ；且对正常小鼠血糖无影响。
4
(3)降血脂作用枸杞多糖对实验性高脂血大鼠的血脂有明显影响，可显著降低血清胆固醇、甘油三脂含量，而对高密度脂蛋白有升高作用。实验结果表明枸杞多糖有明显的调节血脂作用。(4)延缓衰老作用果蝇生存试验表明，枸杞多糖可明显延长雌性及雄性果蝇的平均寿命及最高寿命，并有显著升高小鼠红细胞SOD作用和明显降低MDA的作用。另外，还有动物及临床实验结果表明枸杞多糖能明显增强去胸腺小鼠的细胞免疫功能，对小鼠性功能也有一定的恢复作用。(5)抗疲劳作用枸杞多糖能提高实验小鼠的肌糖原、肝糖原储备。增加乳糖脱氨的总活力、加速血尿素的清除和降低运动后的血乳酸水平，能明显延长小鼠游泳时间。所以，枸杞多糖能增强机体体力、迅速消除运动后的疲劳。(6)其它作用通过对枸杞提取物的试验表明枸杞提取物能显著延长动物缺氧条件下及辐射条件下的存活时间。通过DEAE-cellulose*kphadex gel柱色谱以及NaCl作洗脱剂从枸杞粗多糖中分离得到针形晶体LBP-I、LBP-II, LBP-III和LBP-IV等四个组分，确定枸杞多糖(Lycium Barbarum Polysaccharides, LBP)成分是由阿拉伯糖(Ara)、鼠李糖(Rha)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、半乳糖Oial)与葡萄糖半乳糖醛酸组成的酸性杂多糖同多肽或蛋白质构成的复合多糖。采用色谱、光谱技术、氨基酸分析仪等对这四个组分的理化特性进行了研究， LBP-II, LBP-III, LBP-IV 的氨基酸总含量分别为 14. 00 %U1. 00 %,7. 81 %。LBP-II、 LBP-III和LBP-IV的等电点分别为4. 42,4. 61和4. 01。分子量均超过2万，均溶于水、难溶于酒精。枸杞多糖的总含量大约占枸杞子重量的3. 36%。枸杞多糖组分-IV用于有机磷农药所致血管损伤的药物中，已经在《安徽农业科学》的2010年第15期公开。目前虽然有枸杞多糖组分-III抗氧化和降低丙二醛的作用，但是没有枸杞多糖组分-III在防治有机磷农药所致血管损伤的报道。
发明内容
本发明的目的是提供枸杞多糖多组分-III (LBP-III)在制备防治有机磷农药所致血管损伤的药物中的应用。本发明的另一目的是提供LBP-III在制备防治有机磷农药所致血管内皮损伤的药物中的应用。本发明的另一目的是提供LBP-III在制备防治有机磷农药所致血管疾病的药物中的应用。本发明所述的LBP-III，可以直接购买，可以采用公知的方法制备，也可以采用下面的方法制备，具体为1)枸杞子，50-75°C通风烘干，粉碎；
2)用体积比为2 1的氯仿-甲醇回流脱脂，乙醇回流；3)将上述药物的残渣加蒸馏水IOOOml提取，滤液浓缩；4)浓缩液滴入乙醇中，搅拌，静置，离心，固形物用乙醇洗涤，随后分别用无水乙醇、丙酮洗涤，真空干燥，得LBP粗品；5)将取LBP粗品溶于水中，过纤维素柱，蒸馏水充分洗脱，然后用NaCl进行洗脱，以每管20ml收集，苯酚法显色，收取有吸收峰值的液体，经透析、浓缩、冷冻干燥，得到 LBP-III的半纯品；6)将半纯品溶于水中，加样于1. 6cmX 48cm Sephadex G_ 100柱，水洗脱，每管^il 收集，苯酚法显色，收取有吸收峰的液体，浓缩、冷冻干燥后得到对应的LBP-III纯品。根据上述方法，进步具体为1)枸杞子，60°C通风烘干72h，粉碎；2)将粉碎后的枸杞子体积比2 1氯仿-甲醇回流脱脂2次，乙醇回流2次；3)残渣加蒸馏水1000ml，90°C提取3次，滤液浓缩；4)浓缩液滴入5倍体积的乙醇中，磁力搅拌，静置12h，离心，固形物用乙醇洗涤， 无水乙醇洗涤，丙酮洗涤，真空干燥，得LBP粗品；5)将LBP粗品溶于水中，DEAE纤维素柱，蒸馏水充分洗脱，500ml的0. 5mol/L NaCl 进行洗脱，以每管20ml收集，苯酚法显色，合并有吸收峰的液体，透析、浓缩、冷冻干燥，得到LBP-III的半纯品；6)将半纯品溶于3ml水中，加样于kphadex G-100柱，水洗脱，每管2ml收集，苯酚法显色，合并有吸收峰的液体，浓缩、冷冻干燥后得到对应的LBP-III纯品。该制备方法进一步具体为1)枸杞子100g，60°C通风烘干72h，粉碎；2)将枸杞子用体积比2 1氯仿-甲醇回流脱脂2次，每次2-池，80%乙醇回流 2次，每次2-3h ；3)残渣加蒸馏水1000ml，90°C提取3次，每次0. 5_2h，滤液浓缩；4)浓缩液滴入5倍体积的乙醇中(磁力搅拌)，静置12h，离心，固形物用95%的乙醇洗涤，无水乙醇洗涤，丙酮洗涤，真空干燥，得LBP粗品；5)将LBP粗品溶于水中，DEAE纤维素柱，蒸馏水充分洗脱，500ml的0. 5mol/L NaCl 进行洗脱，以每管20ml收集，苯酚法显色，合并有吸收峰的液体，透析、浓缩、冷冻干燥，得到LBP-III的半纯品；6)将半纯品溶于3ml水中，加样于kphadex G-100柱，水洗脱，每管2ml收集，苯酚法显色，合并有吸收峰的液体，浓缩、冷冻干燥后得到对应的LBP-III纯品。LBP-111可以直接粉碎、压片，也可以与药学上可接受的载体或稀释剂组成各种剂型。对于LBP-III的新用途，其服用方法为其服用量以枸杞多糖组分-III计成人， 20-30mg/次，3次/日；儿童，0. 15-0. 25mg/kg/次，3次/日，即可达到防治有机磷农药所致血管内皮损伤的效果，特别地，孕妇等特殊人群服用时需遵医嘱(目前尚未发现其特殊不良反应)。经动物学试验研究表明，本发明药物对有机磷农药所致的血管内皮功能损伤有明显的保护作用，有效的防治了有机磷农药所致血管损伤，进而对有机磷农药所致血管疾病有预防和保护作用。与LBP-IV、黄芪多糖、白藜芦醇相比，LBP-III防治有机磷农药所致血管损伤的效果更优，LBP-III不仅在对血管内皮依赖性、内皮细胞单层通透性以及细胞培养液中的生化指标的影响更加明显。而且，发明人还发现LBP-III有效抑制内皮细胞钙离子的增加，降低细胞凋亡率，发现LBP-IV没有上述作用。
图ILBP-III对内皮细胞形态的影响(Wright-Giemsa染色X 1000)，A组为正常对照组；B组为枸杞多糖组分-III (10mg/mL)对照组；C组为对氧磷(3. 63 μ mol/L)对照组；D 组为枸杞多糖组分-III保护组1 ；E组为枸杞多糖组分-III保护组2 ；F组为枸杞多糖组分-III保护组3 ；G组为过氧化氢保护组；H组为枸杞多糖组分-IV保护组；I组为黄芪多糖保护组J组为白藜芦醇保护组。图2LBP-III对内皮细胞钙离子的影响，A组为正常对照组；B组为枸杞多糖组分-III (10mg/mL)对照组；C组为对氧磷(3. 63 μ mol/L)对照组；D组为枸杞多糖组分-III 保护组1 ；E组为枸杞多糖组分-III保护组2 ；F组为枸杞多糖组分-III保护组3 ；G组为过氧化氢保护组；H组为枸杞多糖组分-IV保护组；I组为黄芪多糖保护组；J组为白藜芦醇保护组。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不应用来限制本发明的范围。实施例1 :LBP-III的分离纯化1、枸杞子100g，60°C通风烘干72h，粉碎；2、将枸杞子用体积比2 1氯仿-甲醇回流脱脂2次(3h/次)，80%乙醇回流2 次(3h/次)；3、残渣加蒸馏水1000ml，90°C提取3次(lh/次)，滤液浓缩；4、浓缩液滴入5倍体积的乙醇中(磁力搅拌)，静置12h，离心，固形物，95%的乙醇洗涤，无水乙醇洗涤，丙酮洗涤，真空干燥，得LBP粗品6g ；5、称取LBP粗品1. 5g溶于水中，DEAE纤维素柱(0H-型，2. 6cm X 90cm)，蒸馏水充分洗脱，500ml的NaCl (0. 5mol/L)进行洗脱，以每管20ml收集，苯酚法显色，94管处出现吸收峰值，收集有吸收峰的液体，透析、浓缩、冷冻干燥，得到LBP-III的半纯品300mg ；6、称取半纯品 20mg 溶于 3ml 水中，加样于 Sephadex G-100 柱(1. 6cm X 48cm),/K 洗脱(流速20ml/h)，每管2ml收集，苯酚法显色，第16管有吸收峰，合并有吸收峰的液体， 浓缩、冷冻干燥后得到对应的LBP-III纯品约20mg。实施例2 =LBP-III的纯度进行鉴定DLBP-III经过kphadex G-100凝胶色谱柱层析，流出曲线为单一峰，表明 LBP-III为分子量均一的枸杞多糖组分。经高效液相图谱的峰面积计算显示，多糖的纯度大于85%以上，说明该组分是纯度较高的多糖；
2) LBP-111红外光谱分析，780CHT1吸收峰是由β _D_吡喃葡萄糖环振动引起； 1050CHT1和1020CHT1吸收峰是伯碳-OH的O-H变角振动引起；lllOcm—1吸收峰是仲碳-OH的 O-H变角振动引起；IMOcnT1吸收峰是由-COOH的-OH变角振动引起；2000-1500(^-1吸收峰是由-C00的C = 0及NH2对称伸缩振动引起；3800-33000^1处的宽峰是由O-H伸缩振动和 N-H伸缩振动引起；因此，可以推断LBP-III中含有-OH、-C00H、-NH2或-NH-；3) LBP-111紫外光谱分析，260nm处没有吸收峰，表明LBP-III不含核酸，280nm处未见吸收峰，表明LBP-III不含蛋白质。实施例3 水溶剂1)称取IOOmg LBP-III粉末，溶于IOOrnl三蒸水，制成lmg/ml的水溶剂，分装即可。2)称取500mg LBP-III粉末，溶于100ml三蒸水，制成5mg/ml的水溶剂，分装即可。3)称取500mg LBP-III粉末，溶于100ml三蒸水，制成10mg/ml的水溶剂，分装即可。实施例4 片剂按照以下重量比称取药物0. 2g LBP-III粉末与0.2g乳糖，0.05g微晶纤维素， 0. Olg硬脂酸镁混合，直接压片。实施例5 散剂按照以下份量称取药物5g LBP-III粉末与3g乳糖混合，分装即可。实验例考察LBP-III对有机磷农药所致血管损伤的保护作用1、药物采用实施例3制备的药物。2、材料过氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)试剂盒购自南京建成生物公司；混合醋酸纤维滤膜(直径25mm、孔径0.8 μ m)购自中国上海工业研究院；过氧化氢(HA)、枸杞多糖组分-III (LBP-III)、枸杞多糖组分-IV(LBP-IV)、黄芪多糖、白藜芦醇购自长沙力康生物有限公司。3、动物与细胞雄性Sprague Dawley(SD)大鼠，体重180_220g，购自河南省实验动物中心；HVUECV-304人脐静脉内皮细胞株，购自长沙力康生物有限公司。4、实验分组及给药共设10组正常对照组(A组)；LBP-III (10mg/mL)对照组(B 组)；PO (对氧磷，3.63ymol/L)对照组(C 组)；LBP-III 保护组 1(D 组)=LBP-III (lmg/ mL) +PO (3. 63ymol/L) ；LBP-111 保护组 2 (E 组):LBP_III (5mg/mL)+PO (3. 63 μ mol/L)； LBP-III 保护组 3 (F 组)=LBP-III (10mg/mL) +PO (3. 63 μ mol/L) ；SOD 保护组(G 组) SOD (200U/L) +PO (3. 63 μ mol/L) ；LBP-IV 保护组(H) =LBP-IV (10mg/mL) +PO (3. 63 μ mol/L)； 黄芪多糖保护组(I)黄芪多糖(10mg/mL)+P0(3. 63 μ mol/L)；白藜芦醇保护组(J)白藜芦醇(10mg/mL) +PO (3. 63 μ mol/L)。5、实验方法以大鼠离体胸主动脉血管环(EVAPVR)和培养的人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)为实验对象，以对氧磷为损伤药物，LBP-III (10mg/mL)为保护药，检测血管内皮依赖性舒张反应(EDRR)、细胞内Ca2+浓度变化、内皮细胞单层通透性(ECMP)及细胞培养液生化指标，并观察内皮细胞的形态学改变及凋亡。5. 1内皮依赖性舒张功能的检测大鼠称重，腹腔注射3%戊巴比妥钠(30mg/kg)进行麻醉，切断双侧颈总动脉放血处死，开胸后快速取出胸主动脉置于4°C的K-H缓冲液中，并通以95% 02+5% CO2混合气体。分离并去除血管周围的脂肪及结缔组织，剪成3-4mm 长的血管环，将血管环移至含有K-H缓冲液(恒温37°C，通以95% 02+5% CO2混合气体)的浴槽内，环的一端用不锈钢钩固定于浴槽内，另一端连张力换能器，将血管的收缩与舒张反应通过RM 6M0B/C生物信号采集处理系统进行记录。5. 2内皮细胞单层通透性的测定接种于滤膜的HUVEC继续生长8d_10d，待滤膜上形成致密的内皮细胞单层后，即可检测内皮细胞单层通透性。滤膜上加入实验药物，共孵30min，然后滤膜用Hank’ s缓冲溶液冲洗2次，置于针头式滤器内(有效滤过面积S = 3. 14cm2)。针头式滤器上孔接长颈储液瓶(上腔)，下孔接量筒(下腔)。上腔中加入5g/ L白蛋白液(液面距离滤膜高度维持在25cm)，蛋白液通过液体流动产生的牵引作用透过滤膜进入下腔。平衡5min后，收集5-lOmin滤出液，测量滤出液容积，计算滤出液生成速度 Jv，内皮单层滤过系数Kf和渗透压反射系数ο。5. 3细胞培养液中SOD、MDA及NO含量的测定取不同处理组的细胞培养液 100 μ L，按试剂盒说明分别检测SOD活性、MDA及NO的含量。5. 4Right-GiemSa染色观察内皮细胞形态取下滤膜上的内皮细胞单层用HBSS洗 2次，2%甲醛和戊二醛混合液固定IOmin Jright-Giemsa常温下染色5min后用蒸馏水冲洗二遍，置于载玻片上用倒置显微镜观察。5. 5流式细胞仪检测凋亡率将IO6个内皮细胞与不同处理因子孵育1 后弃去培养液，收集IO6个细胞，生理盐水洗2遍，加入100%的冰乙醇固定24h，PBS洗2遍，RNA 酶37°C消化30min，50mg/L PI染色，流式细胞仪检测，低于Gl期DNA含量主峰(亚Gl期峰)的细胞为凋亡细胞。5. 6细胞内钙离子测定流式细胞仪检测(激发波长506nm，吸收波长526nm)万个细胞平均荧光强度。细胞钙离子变化荧光强度AF = F525处理组-F525对照组6、统计学方法所有数据以均数士标准差(^ ± s )表示。组间差异比较用ANOVA 及Newman-Student多重比较；t检验分析，由SPSS11. 5统计软件完成，双侧P < 0. 05认为差异有显著性。7、结果7. ILBP-III对大鼠离体胸主动脉血管环舒张功能的影响结果见表1。大鼠离体胸主动脉环与PO (3.63 μ mol/L)共孵30min后，与正常组比较PO损伤组最大舒张百分率(Emax)显著性降低，半表1 LBP-III对大鼠胸主动脉血管环Emax和EC5tl的影响([)
9
权利要求
1.枸杞多糖组分-III在制备防治有机磷农药所致血管损伤的药物中的应用。
2.枸杞多糖组分-III在制备防治有机磷农药所致血管内皮损伤的药物中的应用。
3.枸杞多糖组分-III在制备防治有机磷农药所致血管疾病的药物中的应用。
4.制备权利要求1-3任意一项所述的枸杞多糖组分-III的方法，包括下述步骤1)枸杞子，50-75°C通风烘干，粉碎；2)粉碎后的枸杞子用氯仿-甲醇回流脱脂，乙醇回流，收取残渣；3)将上述药物的残渣加蒸馏水IOOOml提取，滤液浓缩；4)浓缩液滴入乙醇中，磁力搅拌，静置，离心，固形物用乙醇洗涤，随后分别用无水乙醇、丙酮洗涤，真空干燥，得枸杞多糖粗品；5)将枸杞多糖粗品溶于水中，过纤维素柱，蒸馏水充分洗脱，然后用NaCl进行洗脱，以每管20ml收集，苯酚法显色，合并有吸收峰值的，经透析、浓缩、冷冻干燥，得到枸杞多糖组分-III的半纯品；6)将枸杞多糖组分-III的半纯品溶于水中，加样于kphadexG-100柱，水洗脱，每管2ml收集，苯酚显色，合并有吸收峰的滤液，浓缩、冷冻干燥后得到对应的枸杞多糖组分-III纯品。
5.根据权利要求4所述的枸杞多糖组分-III的方法，具体为1)枸杞子，60°C通风烘干72h，粉碎；2)将粉碎后的枸杞子用体积比为2 1氯仿-甲醇回流脱脂2次，乙醇回流2次，收取残渣；3)将上述残渣加蒸馏水1000ml，90°C提取3次，滤液浓缩；4)浓缩液滴入5倍体积的乙醇中，磁力搅拌，静置12h，离心，固形物用乙醇洗涤，无水乙醇洗涤，丙酮洗涤，真空干燥，得枸杞多糖粗品；5)将枸杞多糖粗品溶于水中，DEAE纤维素柱，蒸馏水充分洗脱，500ml的0.5mol/L NaCl进行洗脱，以每管20ml收集，苯酚法显色，合并有吸收峰的液体，透析、浓缩、冷冻干燥，得到枸杞多糖组分-III的半纯品；6)将枸杞多糖组分-III半纯品溶于3ml水中，加样于S^hadexG-IOO柱，水洗脱，每管2ml收集，苯酚法显色，合并有吸收峰的液体，浓缩、冷冻干燥后得到对应的枸杞多糖组分-III纯品。
6.根据权利要求5所述的枸杞多糖组分-III的方法，具体为1)枸杞子100g，60°C通风烘干72h，粉碎；2)将粉碎后的枸杞子用体积比为2 1氯仿-甲醇回流脱脂2次，每次2-池，80%乙醇回流2次，每次2-3h，收取残渣；3)将收取的残渣加蒸馏水1000ml，90°C提取3次，每次0.5_池，滤液浓缩；4)浓缩液滴入5倍体积的乙醇中，磁力搅拌，静置12h，离心，固形物用95%的乙醇洗涤，无水乙醇洗涤，丙酮洗涤，真空干燥，得枸杞多糖粗品；5)将枸杞多糖粗品溶于水中，DEAE纤维素柱，蒸馏水充分洗脱，500ml的0.5mol/L NaCl进行洗脱，以每管20ml收集，苯酚法显色，合并有吸收峰的液体，透析、浓缩、冷冻干燥，得到枸杞多糖组分-III的半纯品；6)将半纯品溶于3ml水中，加样于kphadexG-100柱，水洗脱，每管2ml收集，苯酚法显色，合并有吸收峰的液体，浓缩、冷冻干燥后得到对应的枸杞多糖组分-III纯品。
全文摘要
本发明涉及枸杞多糖组分-Ⅲ(LBP-Ⅲ)在制药领域中的新用途，主要是LBP-Ⅲ在制备防治有机磷农药所致血管损伤的药物中的应用，可以预防长期接触有机磷农药的人员发生各种心、脑血管疾病的可能。
文档编号A61P9/00GK102210779SQ201010545980
公开日2011年10月12日 申请日期2010年11月12日 优先权日2010年11月12日
发明者刘俊扇, 尹雅玲, 李鹏, 杨丽敏, 梁金英, 牛秉轩, 王倩倩, 翟成凯, 许玲娟 申请人:新乡医学院