用于以SIRPα-CD47的相互作用为靶标治疗血液癌症的组合物和方法

专利名称：用于以SIRPα-CD47的相互作用为靶标治疗血液癌症的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及以SIRP α -⑶47的相互作用为靶标从而治疗血液癌症(特别是人类急性粒细胞白血病(AML))，以及用于该目的的化合物。
背景技术：
虽然供体-受体的人白细胞抗原具有遗传同一性，但是在造血干细胞的移植中仍会发生移植失败，这表明有其它因素调节移植。最近通过非肥胖糖尿病(NOD)-重症联合免疫缺陷(SCID)的异种移植模型发现，与具有等效的免疫缺陷相关突变的其它品系相比， NOD 情况能进行更好的造血移植(Takenaka，K.等，Polymorphism in Sirpa modulates engraftment of human hematopoietic stem cells. Nat. Immunol. 8,1313-1323(2007))。 已经鉴定出Sirpa等位基因的多态性，并表明其是导致所分析的小鼠品系之间的移植差异的原因。虽然NOD情况可给予人移植最好的支持，但是具有Sirpa的其它多态性的小鼠不能被移植(即N0D.N0R-Iddl3.SCID)。在小鼠和人类中，Sirpa编码SIRP α蛋白， 所述的SIRPa蛋白与其配体⑶47相互作用。在造血系统中，SIRPa主要发现于巨噬细胞、树突细胞和粒细胞中，而⑶47存在于大多数造血细胞中(Matozaki，Τ.，Murata, Y.， Okazawa, H. &0hnishi, H. Functions and molecular mechanisms of the CD47_SIRPalpha signalling pathway. Trends Cell Biol. 19, 72-80 (2009)) 据显示，小鼠 Sirpa 等位基因在与CD47相互作用的胞外的免疫球蛋白的V样结构域中是高度多态性的。对三十七(37) 个不相关的正常人对照进行测序，鉴定出了 4种多态性，这表明人的Sirpa等位基因同小鼠的Sirpa等位基因一样，也是多态的(Takenaka等，同上)。大量的工作已经表明，人类急性粒细胞白血病(AML)克隆是由白血病起始细胞 (AML-LSC)分层组织和维持的(Wang，J. C. &Dick, J. Ε. Cancer stem cells =Iessons from leukemia. Trends Cell Biol. 15,494-501 (2005)) 但是，对于用于控制 AML-LSC 的分子调节子仍然知之甚少。大多数的人AML样本中均表达CD47，但是白血病母细胞的表达水平却各不相同。相比于正常的HSC，人AML LSC的⑶47表达水平更高(Majeti，R.等，⑶47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell 138, 286 (2009)) 较高的 CD47 表达在 AML 中已经显示为独立的不良预测因素(Majeti等，同上)。用直抗CD47的单克隆抗体治疗移植了人 AML的免疫缺陷小鼠，可导致小鼠骨髓中的白血病性移植的减少(Majeti等，同上)。但是， 由于⑶47也与SIRP γ和整联蛋白β 3亚基相结合，因此尚不明确这种效应是否是通过破坏⑶47-SIRP α相互作用而特异性地介导的(Matozaki等，同上)。发明概述
根据本发明的一个方面，提供了一种用于治疗血液癌症的方法，其包括调节人 Sirpa和人CD47之间的相互作用。优选的是，通过给予治疗有效量的多肽，从而调节所述人Sirp α和人⑶47之间的相互作用，所述多肽能够与人⑶47的胞外结构域结合。根据本发明的另一个方面，提供了一种用于治疗血液癌症的化合物的用途，所述化合物包含一种多肽，所述多肽能通过与人CD47的胞外结构域结合，从而调节人Sirp α和人⑶47之间的相互作用。根据本发明的另一方面，提供了一种化合物在制备用于治疗血液癌症的药物中的用途，所述化合物包含一种多肽，所述多肽能够通过与人CD47的胞外结构域结合，从而调节人Sirp α和人⑶47之间的相互作用。优选地，所述多肽包含可溶性人Sirp a、或其⑶47结合片段。在一些实施方案中， 所述多肽为人Sirp α的胞外结构域。在一个实施方案中，所述多肽为Sirp a-Fc融合蛋白，并优选为SEQ ID NO. 13。根据本发明的另一方面，提供了一种确定人类中的影响血液癌症的存活率的遗传多态性的方法，所述方法包括a)对多个患有血液癌症的人的Sirp α基因进行测序；b)确定所述多个人的Sirpa基因的核苷酸的差异；以及c)将所述的核苷酸的差异与存活率相关联，从而确定相关多态性。根据本发明的另一方面，提供了一种预测血液癌症的存活可能性的方法，所述方法包括a)对受体的Sirp α基因进行测序；以及b)确定本文所述相关多态性是否存在。根据本发明的一些实施方案，能够调节人Sirp α和人⑶47之间的相互作用的多肽，选自由下列物质所组成的组中a)由SEQ ID NO. 1的氨基酸序列构成的多肽；b)由SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的⑶47结合片段构成的多肽，其中所述片段包含 SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位残基中的至少一个；以及c) a)和b)中所述多肽中的任意一个的CD47结合变体，所述变体在该多肽的长度上的每7个氨基酸中具有至多一个氨基酸插入、缺失或置换，其中所述多肽包含SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位残基中的
至少一个。根据本发明的另一实施方案，能够调节人Sirp α和人⑶47之间的相互作用的多肽，选自由下列物质所组成的组中a)由SEQ ID N0. 2的氨基酸序列构成的多肽；b)由SEQ ID N0. 2的氨基酸序列的⑶47结合片段构成的多肽；以及c) a)和b)中所述多肽中的任意一个的CD47结合变体，所述变体在该多肽的长度上的每7个氨基酸中具有至多一个氨基酸插入、缺失或置换；其中i.在所述多肽中，SEQ ID N0. 2 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位残基中的至少一个被置换为 SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、 77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位的相应残基；或 在所述多肽中，SEQ ID NO. 2的第1 和130位残基中至少一个是缺失的。根据本发明的另一实施方案，能够调节人Sirp α和人⑶47之间的相互作用的多肽，选自由下列物质所组成的组中a)由选自由SEQ ID NOs. 4-7所组成的组中的氨基酸序列构成的多肽；b)由选自由SEQ ID NOs. 4_7所组成的组中的氨基酸序列的⑶47结合片段构成的多肽；以及c) a)和b)所述多肽的任意一个的CD47结合变体，所述变体在该多肽的长度上的每7个氨基酸中具有至多一个氨基酸插入、缺失或置换。根据本发明的另一方面，提供了一种用于治疗血液癌症的药物组合物，所述药物组合物包含有效量的上述多肽以及可药用的载体，所述血液癌症优选白血病，更优选人类急性粒细胞白血病。优选地，所述血液癌症优选地包括存在⑶47+的癌细胞或肿瘤(⑶47+presenting cancer cell or tumor)。


在随后的发明详述中，本发明的优选实施方案的上述特征和其它特征将更加清楚，所述发明详述将参照以下附图，其中图 1 示出了携带 N0R-Iddl3 基因座的 NOD. SCID 小鼠(NOD. NOR-Iddl3. SCID)中无法进行人AML-LSC的再增殖(!^population)。Y轴表示的是在注射了来自4个患者的原发 AML细胞7-8周之后，NOD. SCID(NS)和NOD. NOR-Iddl3. SCID(Idd)小鼠的以下器官中发生人细胞移植的百分比所注射的右股骨(RF)、非注射点的骨头的骨髓(BM)或脾(SpI)。通过静脉(IV)或股骨内(IF)注射，将3X106个细胞导入每只小鼠体内。移植了同一患者样本的小鼠用相同形状的标记表示。图2 (A)示出了 NOD. N0R_Iddl3. SCID小鼠中的AML细胞有缺陷的归巢(homing)。 通过流式细胞仪检测以下小鼠的BM或脾中发生人CD45+移植的百分比在静脉注射原发性 AML细胞16h后，亚致死剂量辐照NOD. SCID和NOD. N0R-Iddl3. SCID(IDD)的小鼠。各个点、 方形或三角形表示的是一只小鼠。条状物表示平均值士SEM。图2(B)示出了 AML-LSC的功能被天然免疫细胞抑制。用抗小鼠⑶122抗体对N0D. SCID或NOD. N0R-Iddl3. SCID(IDD)小鼠进行预处理，将具有不同白血病亚型和细胞遗传标记的10例AML患者的原发细胞股骨内移植入上述小鼠中。7-8周后测定在所注射的右股骨 (RF)、未经注射的骨头的骨髓(BM)、或脾中的人细胞移植的百分比(Y轴)。与未经处理的小鼠(图1)相比，使用了抗CD122的预处理降低了 IDD小鼠对白血病细胞移植的抑制。图3示出了小鼠的天然免疫对人类急性粒细胞白血病(AML)在小鼠中异种移植的影响。A)N0D. SCID或N0D.N0R-Iddl3. SCID中自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞(ΜΦ)群的调节。示出了小鼠NK细胞和巨噬细胞的表面表型。B)巨噬细胞衰竭后人AML细胞移植入 NOD. SCID或N0D.N0R-Iddl3. SCID(Idd)中。图中示出了在收获器官中人白血病细胞的百分比。
图4示出了人AML细胞的体外吞噬作用分析。A) CFSE标记的人AML细胞与NOD. SCID或NOD. N0R-Iddl3. SCID小鼠巨噬细胞共孵育。2小时后收获巨噬细胞，并且通过流式细胞仪检测F4/80+CFSE阳性小鼠巨噬细胞的百分比。B)通过荧光激活细胞分类术分选 CFSE+/F4/80+细胞，并通过共聚焦显微镜显影。C)用细胞松弛素D预处理共培养物，所述细胞松弛素D通过抑制巨噬细胞中的肌动蛋白的聚合作用，而抑制吞噬作用。D)示出了未经处理的或如上文所述的经细胞松弛素D处理的CFSE+/F4/80+小鼠巨噬细胞中人⑶45的表达。图5示出了对人SIRPa (V2)融合蛋白进行的体外预孵育，阻断了原发AML细胞归巢到NOD. SCID小鼠骨髓(BM)和脾脏中。A)采用鼠抗人抗体，通过流式细胞仪，测量人⑶44+AML细胞在BM和脾脏的百分比。每个符号代表不同的小鼠。B)通过下式计算AML细胞归巢到NOD. SCID的BM和脾脏中的效率[回收的AML细胞总数]/[所注射的AML细胞总数]X 100。图6示出了采用人Sirp α融合蛋白(hSirp α -Fe)的体外处理降低了原发性AML 细胞在NOD. SCID小鼠中的再增殖能力。条状物表示的是hCD45+细胞的平均百分比。图7示出了采用人Sirp α融合蛋白(hSirp α-Fe)的体内处理降低了原发性AML 细胞在NOD. SCID小鼠中的移植。通过流式细胞仪分析染色的细胞，从而在hCD45+细胞的百分比的基础上确定每个小鼠中的移植水平。条状物表示各组中hCD45+人细胞的平均百分比。所显示的P值用于比较hSirp α -Fc处理与PBS处理。图8示出了 WO 09/046541中所公开的小鼠SIRP α的蛋白质序列比对。采用由BM 的巨噬细胞所制备的cDNA作为模板，对NOD和NOR小鼠Sirp α转录产物进行PCR扩增。Β6 小鼠序列来自EnsEMBL数据库。图9示出了 WO 09/046541中所公开的小鼠和人SIRPa IgV结构域的蛋白质序列比对。(a)采用由BM巨噬细胞所制备的cDNA作为模板，对NOD和NOR小鼠Sirp α转录产物进行PCR扩增。C57BL/6 (Β6)、BALB/c和129/Sv序列得自EnsEMBL和NCBI数据库。开放框代表的是b-折叠(所述b-折叠是在SIRP α的X-射线晶体结构中鉴定得到的)并对应于Ig重链可变区中的类似区域。将在小鼠品系之间不相同的氨基酸打上阴影。将Β6 用作亲本序列。(b)对人类基因组单体型图(HapMap)第1阶段发布的37个个体的基因组 DNA进行PCR扩增，从而得到包含IgV结构域的SIRP α的外显子3。开放框区域表示的是与(a)相同的特征，其以Vl作为亲本序列。发明详述在以下描述中，为了深入地理解本发明，对许多具体细节进行了说明。但是，应当理解，本发明在不包括这些具体细节的情况下也可以实施。申请人:示出了在异种移植模型中，⑶47-SIRP α的相互作用调节人AML-LSC的归巢和移植。通过以⑶47或SIRPa为靶标而中断⑶47-SIRP α信号，是一种有可能用于根除患者体内的血液的CD47+癌细胞和肿瘤的治疗方法，所述癌细胞和肿瘤包括癌干细胞， 例如 AML-LSC。本文所用的术语“癌干细胞”是指在肿瘤和血液癌症(例如AML)中发现的癌细胞， 在AML中癌干细胞被称为白血病干细胞(AML-LSC)，其在生物学上不同于块状肿瘤细胞，并且具有与干细胞相关的特性，特别是自我更新和增殖的能力，并在特定的癌样本中产生所有细胞类型。本文所用的术语“保守氨基酸置换”是指在某些共同特性的基础上对氨基酸进行分组。对各个的氨基酸的共同特性进行定义的一种可行方式是，对同源生物体的相应蛋白质的氨基酸的改变的归一频率进行分析(Schulz，G. E. and R. H. Schirmer. ,Principles of Protein Structure, Springer-Verlag)。根据该分析，可以这样定义氨基酸组，其中在一组内的氨基酸彼此优先互换，因此在其对整体蛋白质结构的影响上彼此最为类似(Schulz， G. Ε. and R. H. Schirmer. ,Principles of Protein Structure，Springer-Verlag)。以这禾中方式定义的氨基酸组的例子包括⑴带电组，由Glu和Asp、Lys、Arg和His组成，(ii)带正电组，由Lys、Arg和His组成，(iii)带负电组，由GIu和Asp组成，(iv)芳香组，由 Phe、Tyr 和 Trp 组成，(ν)氮环组，由His和Trp组成，(vi)大型脂肪族非极性组，由Val、Leu和Ile组成，(vii)弱极性组，由Met和Cys组成，(viii)小残基组，由 kr、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln 和 Pro 组成，(ix)脂肪族组，由Val、Leu、lie、Met和Cys组成，以及(χ)小羟基组，由Ser和Thr组成。除上述各组外，每个氨基酸残基可形成其特有的组，并且由单个氨基酸所形成的组可由本领域常用的该氨基酸的一个和/或三个字母的缩写来表示。本文中所用的术语“移植”细胞(例如癌干细胞，并优选为人急性粒细胞白血病干细胞)，指的是将所述干细胞放入(例如通过注射放入)动物中，其中所述细胞在体内持续存在。这可以很容易地通过肿瘤干细胞的能力(例如增殖能力)测量。本文中所用的术语“片段”涉及多肽或多核苷酸，是指仅由相关基因的完整的多肽序列和结构或核苷酸序列和结构的一部分所组成的多肽或多核苷酸。多肽片段可包括天然多肽的C-末端缺失和/或N-末端缺失，或可来自分子内部的部分。类似地，多核苷酸片段可包括天然多核苷酸的3'和/或5'缺失，或可来自分子内部的部分。本文中所用的术语“融合蛋白”是指复合多肽，即，单个邻接的氨基酸序列，由两个 (或多个)不同的异源多肽组成，所述异源多肽在同一个氨基酸序列中通常不融合在一起或不天然融合在一起。因此，融合蛋白可包括这样的单一的氨基酸序列，其中所述单一的氨基酸序列包含两个完全不同的氨基酸序列或两个相似或相同的多肽序列，而这些序列通常不会在自然发现的单个氨基酸序列中以相同的结构组合在一起。通常可通过以下方法制备融合蛋白采用重组核酸的方法，即作为重组基因融合产物的转录和翻译的结果，其中所述融合包含编码本发明的多肽的片段和编码异源多肽的片段；或者通过本领域公知的化学合成方法。融合蛋白还可包含融合蛋白的组成性多肽之间的连接体多肽。术语“融合构建体” 或“融合蛋白构建体”通常是指编码融合蛋白的多核苷酸。在一个实施方案中，融合蛋白为与Ig分子的一部分相融合的本文所述的多肽。融合蛋白的Ig部分可包括免疫球蛋白恒定区，例如人C γ 1结构域或C γ 4结构域(如人IgC γ 1结构域或IgC γ 4结构域的铰合部、 CH2 和 CH3 区域(参见(例如)Capon 等，美国专利 Nos. 5，116，964 ；5，580, 756 ；5，844，095
11等))。在一个优选的实施方案中，Ig融合蛋白包括与免疫球蛋白恒定区(例如Fc区域) 偶联的本文所述的多肽。在多肽与Fc结构域相偶联的实施方案中，所述Fc结构域可选自任意免疫球蛋白 (例如IgG，如IgG1或IgGh或IgG4)。适合地，所选的Fc结构域是经过修饰的(例如，通过在与Fc受体相结合的关键残基上进行氨基酸置换)，以减少或防止与Fc受体在体内的结合 (即，经修饰的Fc结构域优选地表现出降低的亲和力，所述亲和力是针对内源性Fc受体，而非新生Fc受体(FcRn)的，所述内源性Fc受体包括例如，Fc γ RI，Fc γ RII和Fc γ RIII)。 同时，所选的Fc结构域优选为经修饰而改变了效应子功能的Fc结构域，如降低了补体的结合和/或降低或消除补体依赖细胞毒性。(例如)Clark及其同事已经对这样的修饰进行了大量的描述，他们设计和描述了一系列IgGl或IgG2和IgG4的Fc结构域的突变体，以及其与Fc YR的结合属性(Armour等，1999 ；Armour等，2002，在本申请中通过引用的方式将其内容并入到本文中)。例如，选自第234、235、236、237、四7、318、320和322位的一个或多个氨基酸可被置换，从而改变对效应子配体的亲和力，所述效应子配体例如为Fc受体或补体的Cl组分，如Winter等的美国专利US5, 624，821和5，648，260中所详细报道的那样。如 (例如)US6, 194，551所述，选自第329、331和322位的一个或多个氨基酸也可被置换，从而改变Clq的结合并且/或者降低或消除CDC。在特别优选的经修饰的Fc结构域中，Fc结构域来自IgG1 (Wines等，2000)，并且包含在氨基酸第234和/或235位的氨基酸(即Leu234 和/或Leu235)修饰。这些亮氨酸残基位于IgG1的低铰合部区，Fc受体与Fc结构域在所述铰合部区处连接。可将所述亮氨酸残基中的一个或两个进行置换或删除，以阻止Fc受体的连接(即结合)；例如可将Leu234和Lei^5中的一个或两个置换为丙氨酸(即L234A和/或 L235A)，或其它合适的氨基酸(Wines等，2000)。在其他实施方案中，通过引入一个或多个氨基酸的修饰，而改善融合蛋白的半衰期，所述引入通常是氨基酸置换的形式，例如，在第252位残基上(例如)引入Thr，在第254 位残基上(例如)引入kr，和/或在第256位残基上(例如)引入Wre。也可作出其它修饰来改善半衰期，如通过改变CHl或CL区域从而引入补救受体基序(salvage receptor motif)，如发现于IgG的Fc区域的CH2结构域的2个回环之间的基序。在(例如)US 5，869，046和US 6，121，022中描述了上述改变。如US 6194551所述，可通过改变恒定区第329、331和322位的氨基酸，改变Clq的结合或降低补体依赖的细胞毒性。如W094/(^9351所述，可通过在恒定区第231和239位引入置换，而进一步改变抗体固定补体的能力。本文所用的术语“血液癌症”是指血液的癌症，并且其中包括白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等。“白血病”是指血液的一种癌症，其中产生了过量的对抵抗感染不起作用的白细胞，从而挤占了组成血液的其它部分，如血小板和红细胞。可以理解，白血病的例子分为急性的或慢性的。某些形式的白血病可以是(例如)，急性淋巴细胞白血病(ALL)；急性粒细胞白血病(AML)；慢性淋巴细胞白血病(CLL)；慢性粒细胞白血病(CML)；骨髓增生性疾病 /瘤(MPDQ ；骨髓增生异常综合征。“淋巴瘤”是指霍奇金淋巴瘤、惰性和侵袭性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、和滤泡型淋巴瘤(小细胞和大细胞)等。骨髓瘤可指多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞性骨髓瘤、重链骨髓瘤Oieavy chain myeloma)、轻链骨髓瘤(light chain myeloma)或本其jf -琼其jf骨髓瘤(Bence-Jones myeloma)。
术语“CD47+”用于表示与所述多肽结合的靶细胞的表型。可通过流式细胞仪，采用⑶47抗体作为亲合配体，来鉴定⑶47+细胞。用于检测⑶47表型的细胞可以包括标准肿瘤活检样本，所述样本特别包含从怀疑具有CD47+肿瘤细胞的个体中获得的血液样品。本文中所用的术语“巨噬细胞去抑制”或“巨噬细胞的去抑制”是指对巨噬细胞的作用、活性和/或效果的去抑制、抑制的消除、提高或启动。本文中所用的术语“可药用的载体”是指生理上可兼容的任意的和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。可药用的载体的例子包括水、生理盐水、磷酸盐缓冲液、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一种或多种，及其组合。在许多情况下，优选在其成分中包括等渗剂(如糖)、多元醇(如甘露醇)、山梨醇，或氯化钠。可药用的载体， 还可包括少量辅助物质，如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，所述辅助物质能延长药剂的保质期或提高药效。本文中所用的术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指蛋白质、蛋白质片段、经修饰的蛋白质、氨基酸序列和合成的氨基酸序列。所述多肽可以是糖基化的或非糖基化的。本文中所用的术语“预测”是指预测或鉴定受试者的临床结果。预测包括提供疾病恶化的指征，还包括提供因疾病或其它情况的死亡的可能性的指征。本文中所用的术语“治疗有效量”是指经过必要的特定时期达到所需治疗效果的有效剂量。药剂的治疗有效量可根据各种因素(如疾病状态、年龄、性别和个体重量)而变化，并且所述药剂引起个体中的所需反应的能力也可不同。治疗有效量也具有如下特性其治疗性有益效果超过药剂的任何毒性或不利影响。根据一个方面，提供了一种治疗血液癌症的方法，其包括调节人Sirp α和人 CD47之间的相互作用。优选地，通过给予治疗有效量的多肽，调节所述人Sirp α和所述人 CD47之间的相互作用，所述多肽能够与人CD47的胞外结构域结合。根据另一个方面，提供了一种用于治疗血液癌症的化合物的用途，所述化合物包括一种多肽，所述多肽能够通过与人CD47的胞外结构域结合，来调节人Sirp α和人CD47 之间的相互作用。根据另一个方面，提供了一种化合物在制备用于治疗血液癌症的药物中的用途， 所述化合物包括一种多肽，所述多肽能够通过与人CD47的胞外结构域结合，来调节人 Sirp α和人⑶47之间的相互作用。在一些实施方案中，所述多肽包含可溶性人Sirp α或其片段，优选的是，所述多肽为人Sirp α的胞外结构域。在一些实施方案中，所述多肽与第二蛋白(优选IgG的Fc部分)融合。优选地， 所得的融合蛋白为SEQ ID NO. 13。在一些实施方案中，所述调节导致巨噬细胞的去抑制。在一些实施方案中，所述血液癌症为白血病，优选地是，选自急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、和骨髓增生异常综合征， 优选为人急性粒细胞白血病。在一些实施方案中，所述血液癌症为淋巴瘤或骨髓瘤，所述淋巴瘤或骨髓瘤选自霍奇金淋巴瘤、惰性和侵袭性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤(小细胞和大细胞)、多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞性骨髓瘤、重链骨髓瘤、轻链骨髓瘤或本斯-琼斯骨髓瘤。目前显示，在AML中SIRP α -⑶47相互作用的中断，会导致损害AML细胞的归巢、移植和迁移。这些效果是通过宿主骨髓微环境中的巨噬细胞，由经改善的天然免疫监视介导的。该治疗方法有可能对其它占据了骨髓微环境生态位(bone marrow microenvironmental niche)的血液癌症有效。W009/065541描述了 SIRP α的多态性使NOD巨噬细胞具有分化能力，以支持人的造血作用。在图8和9中再现了 WO 09/065541中所述的SIRPa的蛋白质序列比对。采用 BM来源的巨噬细胞的cDNA作为模板，对NOD和NOR小鼠的Sirp α转录本进行PCR扩增。 对NOD和NOR的Sirp α编码序列进行比较，结果显示出有M个氨基酸是不同的，其中的20 个氨基酸位于该分子的胞外类IgV结构域，在所述类IgV结构域中，相比于NOR和Β6，NOD 序列示出了 18个置换和2个缺失。在NOD和NOR或Β6的Sirp α类IgV结构域的N-端中观测到的差异，比之前报道的在B6、BALB/c和129/Sv品系的该区域中的差异(Sano，S等， (1999)Biochem J 344 Pt 3，667-75)更大。WO 09/065541进一步描述了 SIRPa的多态性使其与人CD47进行不同的结合。 WO 09/065541描述了对来自人类HapMap基因组计划中的37个彼此不相关的正常个体的 SIRPa IgV结构域进行测序(其中所述个体分别来自高加索(CEU)、非洲(YRI)、中国(CHB) 和日本(JPT))，并鉴定出了 4个不同的SIRP a IgV等位基因，其反映出了 18个氨基酸的组合变异，如图9再现所示。申请人在预测的CD47结合残基处观察到人等位基因的变异，并且所述变异在区分NOD和NOR等位基因的SIRPa IgV结构域的相同亚区域上。W009/065541 进一步教导了，人CD47对得自NOD的SIRP a IgV结构域的结合力非常高，并可用于预测人干细胞的移植，以及该效应是通过⑶47-SIRPa信号介导的。根据本发明，提供了一种确定人中的遗传多态性影响血液癌症的存活率的方法， 所述方法包括a)对多个患有所述血液癌症的人的Sirp α基因进行测序；b)确定在所述多个人中Sirpa基因的核苷酸差异；以及c)将核苷酸差异与存活率相关联，从而确定相关多态性。另外一个方面，还提供了一种预测血液癌症存活可能性的方法，所述方法包括a)对受体的Sirp α基因进行测序；以及b)确定本文所述的相关多态性是否存在。在一些实施方案中，所述核苷酸差异导致氨基酸差异，优选为下列情形的至少一种a) SEQ ID NO. 2 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、 118、126 位残基中的至少一个被置换为 SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、 87、90、91、96、100、102、114、118、126 位的相应残基；或b) SEQ ID N0. 2的第1 和130位中的至少一个残基的缺失。另外，根据一些实施方案，能够调节人Sirp α和人⑶47之间相互作用的所述多肽，选自由下列物质组成的组中a)由SEQ ID NO. 1的氨基酸序列构成的多肽；b)由SEQ ID NO. 1的氨基酸序列的⑶47结合片段构成的多肽，其中所述片段包含
14SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位残
基中的至少一个；以及c)a)和b)中所述多肽中的任意一个的CD47结合变体，所述变体在该多肽的长度上的每7个氨基酸中具有至多一个氨基酸插入、缺失或置换，其中所述多肽包含SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位残基中的
至少一个。优选地，所述多肽为⑶47结合片段，并且在以下至少一个区域中包含至少3个连续氨基酸所述区域为在 SEQ ID NO. 1 内第 50-57、63-71、74-80、88-92、95-100、103-109、 114-125或128-141位残基之间的区域。根据另一实施方案，能够调节人Sirp α和人⑶47之间相互作用的所述多肽，选自由下列物质组成的组中a)由SEQ ID NO. 2的氨基酸序列构成的多肽；b)由SEQ ID NO. 2的氨基酸序列的⑶47结合片段构成的多肽；以及c) a)和b)中所述多肽中的任意一个的CD47结合变体，所述变体在该多肽的长度上的每7个氨基酸中具有至多一个氨基酸插入、缺失或置换；其中i.在所述多肽中，SEQ ID N0. 2 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、 100、102、114、118、126 位残基中的至少一个被置换为 SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、 77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位的相应残基；或 在所述多肽中，SEQ ID Ν0. 2的第1 和130位残基中的至少一个是缺失的。优选地，所述多肽为⑶47结合片段，并且在以下至少一个区域中包含至少3个连续氨基酸所述区域为在 SEQ ID N0. 2 内第 50-57、63-71、74-80、88-92、95-100、103-109、 114-125或U8-143位残基之间的区域。根据另一实施方案，能够调节人Sirp α和人⑶47之间相互作用的所述多肽，选自由下列物质组成的组中a)由选自由SEQ ID NOs. 4-7组成的组中的氨基酸序列构成的多肽；b)由选自由SEQ ID NOs. 4-7组成的组中的氨基酸序列的⑶47结合片段构成的多肽；以及c) a)和b)中所述多肽中的任意一个的CD47结合变体，所述变体在该多肽的长度上的每7个氨基酸中具有至多一个氨基酸插入、缺失或置换。优选地，所述多肽为⑶47结合片段，并且在以下至少一个区域中包含至少3个连续氨基酸，所述区域为:SEQ ID NOs. 4、6和7中任意一个内第24-31、37_45、48巧4、62_66、 69-74、77-83、88-99 或 102-116 位残基之间的区域；或 SEQ ID N0. 5 内第 24_31、37_45、 48-54、62-66、69-74、77-83、88-99 或 102-115 位残基之间的区域。在一些实施方案中，所述氨基酸插入、缺失或置换为保守氨基酸置换。在其它实施方案中，没有氨基酸插入、缺失或置换。在一些实施方案中，所述多肽为⑶47结合片段，并且长度为6到30个氨基酸，以下优选性依次增加的是，长度为8到观个氨基酸，长度为10到沈个氨基酸，长度为12到 24个氨基酸，长度为14到22个氨基酸。
在一些实施方案中，所述多肽与第二多肽融合，优选IgG的Fc部分。在一个实施方案中，所述多肽为Sirpa融合蛋白，并且优选为SEQ ID NO. 13。根据另一方面，提供了一种治疗血液癌症的药物组合物，所述血液癌症优选为白血病，更优选为人急性粒细胞白血病，所述药物组合物包含有效量的本文所述的多肽以及可药用的载体。通过下面的实施例，进一步对本发明的优点进行说明。本文所述的实施例及其具体细节仅用作说明之用，而不应当用于对本发明的权利要求进行限制。
实施例小鼠在安大略癌症研究所(位于加拿大多伦多市)内在无菌条件下繁殖并饲养NOD/ LtSz-Prdkcsc7sc(NOD. SCID) (Shultz,L. D.等，Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J Immunol 154，180-191 (1995))。在儿童医院(位于安大略省多伦多市)内在特定的无病原体或隔离条件下饲养N0D.N0R-Iddl3 小鼠。将NOD. NOR-Iddl3 与 NOD. SCID 小鼠杂交产生 NOD. N0R-Iddl3. SCID 小鼠，然后进行兄妹交配，并通过表型辅助型的标记进行筛选，直到Iddl3和SCID基因座均获得纯合性 (Takenaka ，胃 )。将人造血细胞移植到小鼠体内获得知情同意后，根据人体实验委员会批准的程序，从患者中取得外周血细胞以及原发性或继发性AML。在Ficoll-泛影钠(Ficoll-Hypaque)(得自位于美国新泽西州皮斯卡塔韦的Wiarmacia公司)上分离后，收集低密度细胞(小于1. 077g/ml)，然后在含有 10%二甲基亚砜的FCS中冻存。移植人类细胞前，用137Cs γ -辐照器发出的275cGy亚致死性地辐照8_10周龄小鼠M小时。移植7-8周后处死小鼠，通过流式细胞仪分析是否存在人CD45+细胞，而对小鼠的BM和脾中的人细胞的移植进行评估。在进行股骨内移植的小鼠中，分别对所注射的股骨和其它骨头(非注射的股骨，胫骨)进行分析。在一些实验中，辐照后用200yg的抗小鼠CD122进行腹腔注射，从而对小鼠进行预处理。流式细胞术在流式细胞仪中采用LSR II(BD公司)。为了对小鼠中的人细胞的移植进行分析，收集小鼠骨髓中的细胞，并用结合藻红蛋白_Cy7的抗人CD45进行染色(HI. 30 ；BD Pharmingen 公司)。克隆到I型TM载体中的人SIRP Vl和V2在5XHF缓冲液中采用含有)(h0 1的正向引物、含有BgIII的反向引物和Phusion Hot start II型高保真聚合酶，对pUC57质粒中的人SIRP α变体1和2的cDNA进行PCR 扩增，以获得SIRP α变体1和2的完整的IgV结构域。用Xhol和BgIII对pUC57SIRPa载体进行限制性酶切。用EcoRI和BgIII对 pINFUSE-hIgG4-FCL进行酶切，并采用购自Promega 公司的LigaFast Rapid DNA连接体系，将SIRPa插入物连接入pINFUSE-hIgG4-Fcl中。
将所得的pINFUSE_hIgG4 Fcl-人SIRP α载体转化入购自hvitrogen公司的One Shot T0P10 感受态 Ε. coli 中。转染用适当体积的OptiMeM稀释质粒DNA和fectin并混合。在空气中含8% CO2的湿氛条件下在37°C的培养箱中转染FreeMyleTM293-F细胞。转染4_6天后收获细胞或培养基。收获蛋白质收获培养物中的Fc蛋白。旋转分离培养物，收集上清并通过PES 0. 45 μ m过滤器过滤，然后通过PES 0. 22 4 111过滤器过滤。采用0611廿化011-701^离心过滤器在；3500\8 下离心10-20分钟，从而对上清进行浓缩，并在4°C下将所述上清在G柱中洗脱。蛋白质收集在IM Tris HCl (pH 8.0)中。将该样品通过离心进一步脱盐，并用PBS重悬。实施例1为了研究原发性人AML中的⑶47-SIRP α相互作用的相关性，我们将3个AML患者的原发性细胞，通过静脉注射(i. v.)移植到NOD. SCID和NOD. N0R-Iddl3. SCID(Idd)小鼠中。上述AML样品都不能移植入Idd小鼠中，但是却观测到其大量移植入NOD. SCID小鼠中 (图1)，从而证实了之前用正常人HSCs获得的数据。当将相同的样品通过股骨注射(i.f.) 进行移植时，6只Idd小鼠中的2只在所注射的股骨中表现出了移植，但在其它骨骼或脾中没有发现移植(图1)。实施例2接下来，我们通过股骨注射(i.f.)移植到小鼠中，其中所述小鼠用直抗小鼠⑶ 122的抗体进行了预处理，所述⑶122可消耗宿主的自然杀伤(NK)细胞和一些巨噬细胞。 在NOD. SCID小鼠的所检测的10个AML样品中全部观察到所注射的股骨内的移植(43/43， 100% )，有趣的是，在42只Idd小鼠中的31只(74% ) (8/10AML检测样品)中观测到所注射的股骨内的移植(图2B)，然而相比于NOD. SCID小鼠，Idd小鼠的移植水平较低。与未经抗⑶122预处理获得的结果形成对比，在8/42只Idd小鼠中(19%，2/10AML检测样品) 可检测到未注射骨头中的移植，而与预期一致的是，大部分进行移植后的NOD. SCID小鼠能发生迁移(38/43，88%，10/10AML检测样品)。然而相比于NOD. SCID小鼠，在Idd小鼠中未注射的骨头的移植水平显著降低。此外，AML-LSC无法在Idd小鼠的脾脏中再增殖。在本研究中采用具有最佳移植效果的AML样品进行归巢分析，结果表明相比于NOD. SCID小鼠， Idd小鼠具有严重的归巢缺陷(图2A)。实施例3我们研究了在小鼠异种移植中，小鼠天然免疫对人类急性粒细胞白血病(AML)的影响。图3A示出了 NOD. SCID或NOD. N0R-Iddl3. SCID中自然杀伤(NK)细胞和巨噬细胞 (ΜΦ)群的调节。示出了小鼠NK细胞和巨噬细胞的表面表型。巨噬细胞而非NK细胞，可表达Sirp α (左栏)。通过腹腔注射(i. p.)抗⑶122 (主要在NK细胞中表达)的抗体或氯膦酸盐(Clodronate)，对小鼠进行处理。⑶122抗体处理(已被证明可提高人造血细胞在 NOD. SCID小鼠中的移植)导致NK细胞迅速被消耗，但不减少小鼠巨噬细胞(右上栏)。双膦酸盐(氯膦酸盐)的处理导致巨噬细胞的细胞凋亡和快速消耗(图3A右下栏)。图;3B 示出了在巨噬细胞耗竭后，NOD. SCID或NOD. N0R-Iddl3. SCID(Idd)中的人AML细胞的移植。亚致死剂量辐照的小鼠分别腹腔注射PBS(对照组)或氯膦酸盐(CL)，48 小时后股骨内注射移植人AML细胞。每周一次氯膦酸盐处理，直到小鼠移植8周后处死。收获小鼠的经注射的骨髓、非注射的骨髓、脾脏和外周血，并且通过流式细胞仪，采用人特异性标记物，来评价人白血病移植。图中示出了收获器官中的人白血病细胞的百分比。相比于NOD. SCID小鼠，股骨注射了 PBS对照的Idd小鼠中移植较低，而其他位点则没有发生移植；在氯膦酸盐处理后，在Idd小鼠的所有位点中均发现了移植。这些发现为以下假设提供了支持=SIRP α -⑶47的相互作用是AML移植的关键，以及Idd小鼠中的AML细胞的移植是通过巨噬细胞介导的。实施例4进行人AML细胞的体外吞噬作用分析。将CFSE-标记的人AML细胞与NOD. SCID或 NOD. N0R-Iddl3. SCID小鼠巨噬细胞共孵育。2小时后收获巨噬细胞，并通过流式细胞仪测定CFSE阳性的F4/80+小鼠巨噬细胞的百分比。小鼠巨噬细胞的CFSE阳性表明了对人的 CFSE+AML 细胞的吞噬(图 4A)。相比于 NOD. SCID-AML 共培养物，NOD. N0R-Iddl3. SCID-AML 共培养物总是表现出CFSE+/F4/80+更高的百分比。这表明，AML细胞上的⑶47和小鼠巨噬细胞上的Sirp α不发生相互作用，会导致对AML细胞的吞噬作用增强。进行荧光激活细胞分选之后，采用共聚焦显微镜对CFSE+/F4/80+细胞进行显影。 图4Β示出了一个指示巨噬细胞吞噬CFSE+细胞的区域。用细胞松弛素D预处理共培养物，所述细胞松弛素D可通过抑制巨噬细胞中的肌动蛋白聚合作用，而抑制其吞噬作用。细胞松弛素D的处理显著地降低了 CFSE+/F4/80+细胞的百分比(图4C)。图4D示出了人⑶45在未经处理的或经细胞松弛素D处理的CFSE+/F4/80+小鼠巨噬细胞中的表达。由于人的抗体不能结合被吞噬的细胞，人CD45的低表达表明小鼠巨噬细胞吞噬了人AML细胞。这些结果证实了大部分未经处理的CFSE+/F4/80+细胞是吞噬人 AML细胞的巨噬细胞(⑶45阴性)。总而言之，这些研究结果表明，SIRP α -⑶47的相互作用对AML细胞逃避天然免疫攻击是关键性的，所述天然免疫攻击是通过巨噬细胞进行的。实施例5实施例5证明了对人SIRP α (V2)融合蛋白进行的体外预孵育，阻断了原发性AML 细胞归巢到NOD. SCID小鼠骨髓(BM)和脾脏中。从AML Pt9601收获的原代细胞与或不与浓度为50μ g/ml的人SIRP α -Fc融合蛋白，在IMDM+15% BIT中37°C下孵育2小时。收获与(hSIRPa-Fc)或不与(无处理)融合蛋白孵育的细胞，并通过静脉注射移植入亚致死剂量辐照后的NOD. SCID小鼠。移植16小时后，处死小鼠并从BM和脾脏中收获细胞。通过流式细胞仪，采用鼠抗人抗体，测量BM和脾脏中的人⑶44+AML细胞的百分比。相比于未处理组，在体外与人SIRP α -Fc的共孵育显著降低了 BM(P < 0. 02)和脾脏(P =0. 018)中的人⑶44+AML细胞的百分比(图5Α-每个符号代表不同的小鼠)。通过下式计算AML细胞归巢到NOD. SCID的BM和脾脏中的效率[所回收的AML细胞总数]/[所注射的AML细胞总数]X 100。人SIRP α -Fc处理显著地降低了 AML细胞归巢到NOD. SCID的BM (P = 0. 036)和脾脏(NS)中的效率(图5B)。实施例6实施例6示出了用人Sirp α融合蛋白(hSirp α -Fe)进行的体外处理，降低了原发性AML细胞在NOD. SCID小鼠中的再增殖能力。Pt90181 (未分类的AML)的原发性AML 细胞与或不与浓度为50 μ g/ml的hSirp α -Fe，在IMDM+15% BIT中在37°C下孵育2小时。 孵育后收获细胞，并以每只鼠2. 7 X IO6细胞通过股骨内注射移植到亚致死剂量辐照的NOD. SCID小鼠中。移植4周后处死小鼠，并从所注射的股骨(RF)和非注射的股骨(BM)中收获细胞，并用抗人抗体染色。通过流式细胞仪分析染色细胞，从而在hCD45+细胞的百分比的基础上，确定每只小鼠的移植水平(图6)。条状物表示的是hCD45+细胞的平均百分比。相比于未处理的对照组，AML细胞与hSirp α -Fc的预孵育，显著地降低了 RF(P = 0. 0016)和 BM (P = 0. 01)中AML的移植水平。实施例7实施例7证明了人Sirp α融合蛋白(hSirp α-Fe)的体内处理，降低了原发性AML 细胞在NOD. SCID小鼠的移植。将来自患者0285 (FAB M2)的原发性AML细胞，通过股骨内注射入亚致死剂量辐照的NOD. SCID小鼠中。移植后的最初10天内，以每只鼠200 μ g (8mg/ kg)的剂量，腹腔注射hSirp α-Fc，3次/周注射7个剂量。之后处死小鼠，并收获从所注射的股骨(RF)和非注射的股骨(BM)和脾中收获细胞，并用抗人抗体染色。通过流式细胞仪分析染色细胞，从而在hCD45+细胞的百分比的基础上，确定每个小鼠的移植水平(图7)。 条状物表示的是每组中h⑶45+人细胞的平均百分比。所标示的P值用于比较hSirp α -Fc 处理与PBS处理。用hSirp α -Fc处理显著地降低了所分析的所有组织中的AML的移植水平。在BM和脾脏中的AML细胞大幅降低至几乎检测不到的水平，这表明hSirp α -Fc完全抑制了 AML干细胞从所注射的股骨到其它造血位点的迁移。讨论在此我们已经表明了，人AML-LSC在NOD. N0R-Iddl3. SCID小鼠中的移植能力显著降低了，这与正常造血细胞获得的数据一致。我们的研究结果与抗⑶47处理移植了 AML 的小鼠所得到的结果一致(Majeti等，同上)，并支持以下假设⑶47-SIRPa相互作用的弱化(如在Idd小鼠中)削弱了 AML-LSC的功能。通过抗⑶122处理后的NK细胞和巨噬细胞的消耗，这种效果或多或少会得以改善，从而使得其能够在所注射的股骨中移植，以及在某些情况下能够迁移到其它骨头中。这表明至少有一些体内抗白血病活性可通过天然免疫系统细胞介导，特别是通过表达SIRP α的巨噬细胞介导。我们的研究结果进一步表明，SIRP α -CD47的相互作用对于AML细胞逃避天然免疫攻击是关键性的，所述天然免疫攻击是通过巨噬细胞进行的。通过以⑶47或SIRPa为靶标而中断⑶47-SIRP α信号，是一种可用于消除血液癌症细胞的治疗方法，所述血液癌症细胞为例如白血病干细胞，优选 AML-LSC。我们证实了，人SIRPa (V2)融合蛋白阻断了原发性AML细胞归巢到NOD. SCID小鼠骨髓(BM)和脾中，并且降低了原发性AML细胞在NOD. SCID小鼠中的再增殖能力。值得注意的是，我们证实了，体内的人Sirpa融合蛋白(hSirp a-FC)的处理降低了 NOD. SCID 小鼠中的原发性AML细胞的移植。以上对本发明的优选实施方案进行了描述，本领域技术人员应当理解，在不偏离本发明的精神或随附的权利要求的范围内的情况下，可以进行各种变化。通过引用的方式并入本文所公开的所有文件。
权利要求
1.一种治疗血液癌症的方法，其包括调节人Sirp α和人⑶47之间的相互作用。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过给予治疗有效量的多肽，来调节所述的人 Sirpa和人⑶47之间的相互作用，所述多肽能够与人⑶47的胞外结构域结合。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述多肽包含可溶性人Sirpa、或其CD47结合片段。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述多肽为人Sirpα的胞外结构域。
5.根据权利要求3或4任意一项所述的方法，其中，所述多肽与第二蛋白融合。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第二蛋白为IgG的Fc部分。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所得的融合蛋白为SEQID NO. 13。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中，所述调节导致巨噬细胞的去抑制。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其中，所述血液癌症为白血病。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述白血病选自急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、骨髓增生性疾病/瘤和骨髓增生异常综合征。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述白血病为人急性粒细胞白血病。
12.根据权利要求1-8任意一项所述的方法，其中，所述血液癌症为淋巴瘤或骨髓瘤， 所述淋巴瘤或骨髓瘤选自霍奇金淋巴瘤、惰性和侵袭性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤(小细胞和大细胞)、多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞性骨髓瘤、重链骨髓瘤、轻链骨髓瘤或本斯-琼斯骨髓瘤。
13.一种用于治疗血液癌症的化合物的用途，所述化合物包括一种多肽，所述多肽能够通过与人⑶47的胞外结构域结合，来调节人Sirp α和人⑶47之间的相互作用。
14.一种化合物在制备用于治疗血液癌症的药物中的用途，所述化合物包括一种多肽， 所述多肽能够通过与人CD47的胞外结构域结合，来调节人Sirp α和人CD47之间的相互作用。
15.根据权利要求13或14中任意一项所述的用途，其中，所述的能够与人CD47的胞外结构域结合的所述多肽包含可溶性人Sirp α、或其CD47结合片段。
16.根据权利要求15所述的用途，其中，所述多肽为人Sirpα的胞外结构域。
17.根据权利要求13-16中任意一项所述的用途，其中，所述多肽与第二蛋白融合。
18.根据权利要求17所述的用途，其中，所述第二蛋白为IgG的Fc部分。
19.根据权利要求18所述的用途，其中，所得的融合蛋白为SEQID NO. 13。
20.根据权利要求13-19中任意一项所述的用途，该用途还可用于巨噬细胞的去抑制。
21.根据权利要求13-19中任意一项所述的用途，其中，所述血液癌症为白血病。
22.根据权利要求21所述的用途，其中，所述白血病选自急性淋巴细胞白血病、急性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、骨髓增生性疾病/瘤和骨髓增生异常综合征。
23.根据权利要求22所述的用途，其中，所述白血病为人急性粒细胞白血病。
24.根据权利要求13-19中任意一项所述的用途，其中，所述血液癌症为淋巴瘤或骨髓瘤，所述的淋巴瘤或骨髓瘤选自霍奇金淋巴瘤、惰性和侵袭性非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤(小细胞和大细胞)、多发性骨髓瘤(MM)、巨细胞性骨髓瘤、重链骨髓瘤、轻链骨髓瘤或本斯-琼斯骨髓瘤。
25.一种用于确定人类遗传多态性影响血液癌症的存活率的方法，所述方法包括a)对多个患有所述血液癌症的人的Sirpα基因进行测序；b)确定所述多个人中的所述Sirpα基因的核苷酸差异；以及c)将所述的核苷酸差异与存活率相关联，从而确定相关多态性。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述核苷酸差异导致氨基酸差异。
27.一种用于预测血液癌症的存活可能性的方法，所述方法包括a)对受体的Sirpα基因进行测序；以及b)确定根据权利要求23所述的相关多态性是否存在。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述核苷酸差异导致氨基酸差异。
29.根据权利要求观所述的方法，其中，所述氨基酸差异为以下情形的至少一种a)SEQ ID NO. 2 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、 126 位残基中的至少一个被置换为 SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、 90、91、96、100、102、114、118、126 位的相应残基；或b)SEQID NO. 2的第1 和130位中的至少一个残基的缺失。
30.根据权利要求2所述的方法，其中，所述多肽选自由下列物质组成的组中a)由SEQID NO. 1的氨基酸序列构成的多肽；b)由SEQID NO. 1的氨基酸序列的⑶47结合片段构成的多肽，其中所述片段包含SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位残基中的至少一个；以及c)a)和b)中所述多肽中的任意一个的CD47结合变体，所述变体在该多肽的长度上的每7个氨基酸中具有至多一个氨基酸插入、缺失或置换，其中所述多肽包含SEQ ID NO. 1的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位残基中的至少一个。
31.根据权利要求2所述的方法，其中，所述多肽选自由下列物质所组成的组中a)由SEQID N0. 2的氨基酸序列构成的多肽；b)由SEQID N0. 2的氨基酸序列的CD47结合片段构成的多肽；以及c)a)和b)中所述多肽中的任意一个的CD47结合变体，所述变体在该多肽的长度上的每 个氨基酸中具有至多一个氨基酸插入、缺失或置换；其中i.在所述多肽中，SEQ ID N0. 2 的第 31、32、；34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、 102、114、118、126 位残基中的至少一个被置换为 SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、 83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位的相应残基；或 在所述多肽中，SEQ ID Ν0. 2的第1 和130位残基中的至少一个是缺失的。
32.根据权利要求2所述的方法，其中，所述多肽选自由下列物质所组成的组中a)由以下氨基酸序列构成的多肽所述氨基酸序列选自由SEQID NOs. 4-7所组成的组中；b)由以下氨基酸序列的CD47结合片段构成的多肽所述氨基酸序列选自由SEQID NOs. 4-7所组成的组中；以及c) a)和b)中所述多肽中的任意一个的CD47结合变体，所述变体在该多肽的长度上的每7个氨基酸中具有至多一个氨基酸插入、缺失或置换。
33.根据权利要求30所述的方法，其中，所述多肽为CD47结合片段，并且在以下至少一个区域中包含至少3个连续氨基酸所述区域为在SEQ ID NO. 1内第50_57、63-71、74_80、 88-92、95-100、103-109、114-125 或 128-141 位残基之间的区域。
34.根据权利要求31所述的方法，其中，所述多肽为CD47结合片段，并且在以下至少一个区域中包含至少3个连续氨基酸所述区域为在SEQ ID NO. 2内第50_57、63-71、74_80、 88-92、95-100、103-109、114-125 或 128-143 位残基之间的区域。
35.根据权利要求32所述的方法，其中，所述多肽为CD47结合片段，并且在以下至少一个区域中包含至少3个连续氨基酸，所述区域为在SEQ ID NOs. 4、6和7中任意一个内第 M-31、37-45、48-54、62-66、69-74、77-83、88-99 或 102-116 位残基之间的区域；或者在 SEQ ID NO. 5 内第 24-31、37-45、48-54、62-66、69-74、77-83、88-99 或 102-115 位残基之间的区域。
36.根据权利要求30-35中任意一项所述的方法，其中，所述的氨基酸插入、缺失或置换为保守氨基酸置换。
37.根据权利要求30-35中任意一项所述的方法，该方法中没有氨基酸插入、缺失或置换。
38.根据权利要求30-35中任意一项所述的方法，其中，所述多肽与人CD47相结合。
39.根据权利要求30-35中任意一项所述的方法，其中，所述多肽为CD47结合片段，并且长度为6到30个氨基酸。
40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述片段的长度为8到观个氨基酸。
41.根据权利要求40所述的方法，其中，所述片段的长度为10到沈个氨基酸。
42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述片段的长度为12到M个氨基酸。
43.根据权利要求42所述的方法，其中，所述片段的长度为14到22个氨基酸。
44.根据权利要求30-43中任意一项所述的方法，其中，所述多肽与第二多肽融合。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述第二蛋白为IgG的Fc部分。
46.根据权利要求30-45中任意一项所述的方法，其中，所述血液癌症为白血病，优选为人急性粒细胞白血病。
47.根据权利要求13或14中任意一项所述的用途，其中，所述多肽选自由下列物质组成的组中a)由SEQID NO. 1的氨基酸序列构成的多肽；b)由SEQID NO. 1的氨基酸序列的⑶47结合片段构成的多肽，其中所述片段包含SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位残基中的至少一个；以及c)a)和b)中所述多肽中的任意一个的CD47结合变体，所述变体在该多肽的长度上的每7个氨基酸中具有至多一个氨基酸插入、缺失或置换，其中所述多肽包含SEQ ID NO. 1的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位残基中的至少一个。
48.根据权利要求13或14中任意一项所述的用途，其中，所述多肽选自由下列物质组成的组中a)由SEQID NO. 2的氨基酸序列构成的多肽；b)由SEQID NO. 2的氨基酸序列的CD47结合片段构成的多肽；以及c)a)和b)中所述多肽中的任意一个的CD47结合变体，所述变体在该多肽的长度上的每 个氨基酸中具有至多一个氨基酸插入、缺失或置换；其中i.在所述多肽中，SEQ ID NO. 2 的第 31、32、；34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、 102、114、118、126 位残基中的至少一个被置换为 SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、 83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位的相应残基；或 在所述多肽中，SEQ ID NO. 2的第1 和130位残基中的至少一个是缺失的。
49.根据权利要求13或14中任意一项所述的用途，其中所述多肽选自由下列物质组成的组中a)由下列氨基酸序列构成的多肽所述氨基酸序列选自由SEQID NOs. 4-7所组成的组中；b)由下列氨基酸序列的CD47结合片段构成的多肽所述氨基酸序列选自由SEQID NOs. 4-7所组成的组中；以及c)a)和b)中所述多肽中的任意一个的CD47结合变体，所述变体在该多肽的长度上的每7个氨基酸中具有至多一个氨基酸插入、缺失或置换。
50.根据权利要求47-49中任意一项所述的用途，其中，所述血液癌症为白血病，优选为人急性粒细胞白血病。
51.一种用于治疗血液癌症的药物组合物，其包含有效量的多肽以及可药用的载体， 所述血液癌症优选为人急性粒细胞白血病(AML)，所述多肽选自由下列物质组成的组中a)由SEQID NO. 1的氨基酸序列构成的多肽；b)由SEQID NO. 1的氨基酸序列的⑶47结合片段构成的多肽，其中所述片段包含SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位残基中的至少一个；以及c)a)和b)中所述多肽中的任意一个的CD47结合变体，所述变体在该多肽的长度上的每7个氨基酸中具有至多一个氨基酸插入、缺失或置换，其中所述多肽包含SEQ ID NO. 1的第 31、32、34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位残基中的至少一个。
52.一种用于治疗血液癌症的药物组合物，其包含有效量的多肽以及可药用的载体，所述血液癌症优选为人急性粒细胞白血病(AML)，所述多肽选自由下列物质组成的组中a)由SEQID N0. 2的氨基酸序列构成的多肽；b)由SEQID N0. 2的氨基酸序列的CD47结合片段构成的多肽；以及c)a)和b)中所述多肽中的任意一个的CD47结合变体，所述变体在该多肽的长度上的每 个氨基酸中具有至多一个氨基酸插入、缺失或置换；其中i.在所述多肽中，SEQ ID N0. 2 的第 31、32、；34、37、74、77、83、84、86、87、90、91、96、100、 102、114、118、126 位残基中的至少一个被置换为 SEQ ID NO. 1 的第 31、32、34、37、74、77、 ·83、84、86、87、90、91、96、100、102、114、118、126 位的相应残基；或 在所述多肽中，SEQ ID NO. 2的第1 和130位残基中的至少一个是缺失的。
53. 一种用于治疗血液癌症的药物组合物，其包含有效量的多肽以及可药用的载体，所述血液癌症优选为人急性粒细胞白血病(AML)，所述多肽选自由下列物质组成的组中a)由以下氨基酸序列构成的多肽所述氨基酸序列选自由SEQID NOs. 4-7所组成的组中；b)由以下氨基酸序列的CD47结合片段构成的多肽所述氨基酸序列选自由SEQID NOs. 4-7所组成的组中；以及c)a)和b)中所述多肽中的任意一个的CD47结合变体，所述变体在该多肽的长度上的每7个氨基酸中具有至多一个氨基酸插入、缺失或置换。
全文摘要
本发明涉及调节SIRPα-CD47的相互作用，以治疗血液癌症，本发明还涉及用于该目的的化合物。在一些实施方案中，提供了SIRPα多肽、片段和融合蛋白用于治疗血液癌症、尤其是人急性粒细胞白血病的方法和用途。
文档编号A61P35/00GK102596233SQ201080021398
公开日2012年7月18日 申请日期2010年5月14日 优先权日2009年5月15日
发明者亚历山大·塞奥哈利德斯, 杰恩·丹斯卡, 王君怡, 约翰·迪克, 苏伊萨·拉亚库玛, 靳黎清 申请人:儿童医院, 大学健康网络