专利名称：含有红参多糖提取物的皮肤外用剂组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及皮肤外用剂组合物，该组合物用于减少皮肤皱纹，增强皮肤弹性和阻止皮肤老化，特别是，涉及ー种含有分子量少于10，000的红參多糖提取物作为有效成分，增强人体皮肤角质形成细胞中线粒体电子传递系统酶的表达，提升皮肤细胞活性，因而能够减少皮肤皱纹，增加皮肤弹性并且阻止皮肤老化的皮肤外用剂组合物。
背景技术：
细胞内的线粒体通过电子传递系统使用营养物质的化学能量合成细胞内的能量存储分子ATP。在这个电子传递系统中起重要作用的酶是电子传递系统酶。当营养物质的化学能量传递到电子时，高能量电子生成，并且在电子传递系统的ー些酶中传递，与此同时电子释放了能量。释放的能量用于产生合成ATP用的质子梯度。线粒体使用电子的能量传
递质子，并且使得跨越内膜的质子浓度不同。这ー浓度的不同称为“质子梯度”。当内膜的质子通道处于打开的状态，此时内膜内外的质子浓度不同，质子从高质子浓度的区域向低质子浓度的区域流动，这一流动能量用于合成ATP。线粒体内膜(嵴)包含无数的电子传递系统酶。当电子在这些电子传递系统酶中传递时，消耗了电子的能量，并且把质子从线粒体内膜中传递出去。现在进一步详细描述线粒体内膜中的酶及其功能。第一种电子传递酶是黄素单核苷酸(FMN)。它是ー种依附于线粒体内膜的酶，从脱氢酶反应的产物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)处接受2个电子和2个质子。黄素单核苷酸将从NADH处接收到的2个质子传递到内膜的外面，并且传递2个电子到辅酶Q(CoQ)，辅酶Q是电子传输系统的下一个酶。接收了电子的辅酶Q结合内膜中的2个质子组成了 CoQH2，接着将2个质子传递出内膜。同时，辅酶中的两个电子传递到细胞色素bo传递到细胞色素b的两个电子接着传递到细胞色素Cl,细胞色素c,细胞色素a,最后传递到细胞色素a3，在细胞色素a3电子传递到氧组成水。在这个过程中传递的质子构成了跨越线粒体内膜的质子梯度。电子传递由四个不同的复合物组成复合物I(NADH :泛醌氧化还原酶)，复合物II(琥珀酸盐泛醌氧化还原酶)，复合物III (泛醌细胞色素C氧化还原酶)和复合物IV (细胞色素C:氧化还原酶)。电子从复合物I经过复合物IV传递到ー个氧分子过程中，氢离子从线粒体基质中泵出，形成膜电位。当氢离子通过HVFl-ATP合酶(复合物V)流入线粒体基质时，ATP就由ADP制备出来了。这个过程就是氧化磷酸化作用(0XPH0S)。
发明内容
本发明的发明人发现，在红參多糖提取物中，分子量小于10，000的多糖提取物具有増加人皮肤角质形成细胞的线粒体电子传递系统酶表达的效果，増加皮肤细胞的活性，因而表现出減少皮肤皱纹，提高皮肤弹性和阻止皮肤老化的作用。基于这ー发现，完成了本发明。因此，本发明的目的是提供一种用于減少皮肤皱纹、提高皮肤弹性和阻止皮肤老化的皮肤外用剂组合物。为了实现上述目的，本发明提供了ー种含有分子量小于10，000的红參多糖提取物作为有效成分的皮肤外用剂组合物。本发明的分子量小于10，000的红參多糖提取物对比于相同分子量的白參多糖提取物和其他分子量的红參多糖提取物，能够增加人皮肤角质形成细胞的细胞传递系统酶的表达。因此，本发明红參多糖提取物能够增加皮肤角质形成细胞的能量活性，因而表现出促进皮肤再生、提高皮肤活力、提高皮肤弹性、阻止皮肤老化和改善肤色的作用。
图I到4是表明通过将红參多糖提取物根据分子量的不同进行分类后，实施RT-PCR使线粒体酶ND5、ND6、ATP6和ATP8进行表达，然后测定这些线粒体酶在对照组中的表达比率的结果的图表。图5到8是表明分别使用分子量小于10，000的红參多糖提取物和白參的多糖提取物处理细胞后，计算细胞中的ND5、ND6、ATP6和ATP8的表达水平的结果图表。
具体实施例方式本发明涉及ー种含有分子量小于10，000的红參多糖提取物作为有效成分的皮肤外用剂组合物。本发明还涉及ー种含有分子量小于10，000的红參多糖提取物作为有效成分的促进皮肤细胞中的线粒体电子传递系统酶表达的皮肤外用剂组合物。而且，本发明涉及ー种含有分子量小于10，000的红參多糖提取物作为有效成分的减少皮肤皱纹的皮肤外用剂组合物。此外，本发明涉及ー种含有分子量小于10，000的红參多糖提取物作为有效成分的提升皮肤弹性的皮肤外用剂组合物。另外，本发明涉及ー种含有分子量小于10，000的红參多糖提取物作为有效成分的阻止皮肤老化的皮肤外用剂组合物。在下文中，将会进一步详细描述本发明。此处使用的术语“提取物”包含通过各种途径从天然物质中提取出来的所有成分。提取物的例子包含使用水或者有机溶剂从天然物质中提取的溶剂可溶性成分，和通过从天然物质中提取特殊成分(如油)而获得的物质。此处使用的术语“皮肤”不仅包含覆盖动物脸或者身体表面的组织，还包括头皮和头发。本发明中使用的红參是以ー种浅黄褐色或者浅红褐色人參，是由6年生新鲜人參根，未经削皮，通过蒸和干燥后制得的。在新鮮人參通过特殊エ艺过程蒸和干燥，制备红參的过程中，产生了有利于人体的生理活性成分。这些红參的生理活性成分包含抗癌组分(人參皂苷RH2 ;癌细胞增殖和转移的抑制剂)、癌细胞活性抑制组分(人參炔三醇；癌症患者减重抑制剂)、血小板聚集抑制组分(麦芽酚；血栓抑制组分)、肥胖抑制组分、老化抑制组分和中和重金属毒性组分。另ー方面，白參是由4-6年生新鲜參根经过削皮后，干燥所述去皮人參根至含水量14%以下制得。顔色黄白，通过自然阳光干燥，热风干燥或者其他干燥方式，不经蒸，和红參的制作方法不同。本发明所述的皮肤外用剂组合物的特征是在具有不同分子量的红參多糖提取物中含有分子量少于10，000的红參多糖提取物作为有效成分。本发明的组合物含有作为活性成分的分子量少于10，000的红參多糖提取物，其具有増加皮肤角质形成细胞中的线粒体电子传递系统酶的HiRNA的表达的作用，因而能活化皮肤细胞，提高皮肤弹性和阻止皮肤老化。在红參多糖提取物中，分子量少于10，000的提取物相比于具有相同分子量的白參多糖提取物有突出的效果。本发明所述的皮肤外用剂组合物包含红參多糖提取物，其分子量小于10，000，含
量为组合物总重量的O. 1-10重量％。
一个实施方式中，本发明所述的皮肤外用剂组合物能制成美容用组合物的形式，可以是，例如，化妆品组合物。此时，本发明的皮肤外用剂组合物包含一种化妆品或者皮肤病学可接受的介质或基质。组合物可以适用任何适合局部施用的配方，如，溶液、凝胶、固体、无水糊剂、水包油型乳剂、悬浮液、微乳、微胶囊、微小颗粒、离子(脂质体)或者非离子小囊分散剂(仝g萣过划)、乳霜、化妆水、乳液、粉、软膏、喷雾或者遮瑕棒。这些组分能够使用本领域中所知的任何便利的方法制备。另外，本发明的组合物可以用于制备泡沫组合物或者含有压缩的推进剂的气雾剂组合物。而且，本发明所述的皮肤外用剂组合物可以含有在化妆品或者皮肤病学领域中常用的添加剤，如，脂类、有机溶剂、增溶剤、浓缩剂、凝胶剂、软化剂、抗氧剂、混悬剂、稳定剂、起泡剂、芳香剤、表面活性剤、水、离子或者非离子乳化剤、填充剂、金属离子螯合剂、螯合齐U、防腐齐 、维生素、阻断剂、润湿齐 、精油、染料、顔料、亲水或者亲脂的催化齐 、脂囊泡或者其他。这些添加剂可以是化妆品或者皮肤病学领域中常用的量。本发明所述的皮肤外用剂组合物的配方没有特别限制，并且可以基于特定意图进行合适的选择。配方的例子，包含，但不限于，皮肤软化剂(化妆水和乳液)、营养液、精华、营养霜、按摩霜、面膜、凝胶、眼霜、眼部精华、清洁霜、清洁泡沫、清洁水、粉、身体乳、身体霜、身体油和身体精华。在本发明的一个实施方式，皮肤外用剂组合物可以用在脸上，特别是在眼角、嘴周、脸颊、前額、脖子、手和脚，但是不限于此。本发明所述的皮肤外用剂组合物可以制成韩医学的补气剂。在韩医学中补气定义为(I) ー种构成人体，保持生命力或者生命能量并且富含营养活性的精细物质，⑵组织器官的生理功能。物质⑴是功能⑵的基础物质，功能(2)通过(I)展示。气能够分为从父母那儿传递来的重要遗传物质精气，后天的气通过食物中消化和吸收中获得的，和清气通过呼吸从空气中获得。因此，食物相关气后天能控制，气的增补能通过摄取营养生成能量。这导致了细胞新陈代谢和能量生成的増加，通过使用皮肤病理学机制増加细胞中的线粒体活性能观察到这ー现象。下文中，通过实施例和对比例的參照来进ー步详细描述本发明。可以理解，然而，这些实施例仅用于举例的目的，不用来限制本发明的范围，并且本领域技术人员更倾向于在不违背本发明的范围和精神时可以进行各种调整，增补和替代。实施例I :制备来自红參和白參的多糖提取物
将切片的红參和白參在60°C充分干燥2天。干燥的红參和白參切片的含水量少于5%。干燥的红參和白參切片使用研磨机制备微粒。在碾磨參切片的过程中，微粒粉碎优选粒度分布大约为2-5_。然后，将红參和白參的微粒以15%的浓度分散在水中，然后在室温缓慢搅拌提取24小吋。离心提取物并使用Iym孔径的滤膜过滤。滤液在大约55°C浓缩到原体积的1/10。向浓缩物中缓慢加入こ醇，由此得到纯化的红參和白參的多糖提取物。在此，添加こ醇直到浓缩物中こ醇含量达到85%。然后，得到沉淀形态的红參和白參多糖，并在40°C干燥24小时，由此获得了红參和白參的多糖粉末。然后，每份多糖粉末通过超滤作用分为具有分子量少于10，000、从10，000到30，000、从30，000到100，000和大于100，000的提取物。对比例I :线粒体电子传递系统酶表达的调节 步骤I :细胞株和细胞培养人体表皮新生角质形成细胞(购自Lonza, Inc. , Walkersville, MD,美国)在生产厂家(Lonza，Inc·，Walkersville，MD，美国)的指导下，在CO2培养箱中，温度为37°C、5%C02的条件下进行次代培养。特别是，细胞在500ml KBM-2培养基中(Clonetics CC-3103)使用KGM-2 bullet kit)[含有2ml牛垂体提取物(BPE)、0. 5ml人表皮生长因子(hEGF)、0. 5ml胰岛素、O. 5ml氢化可的松、O. 5ml铁传递蛋白、O. 5ml肾上腺素和O. 5mlGA_1000 (庆大霉素硫酸盐)+ ニ性霉素B (amphofericin-B)]进行培养。步骤2 :线粒体电子传递系统酶基因表达调节的检查培养后的人表皮新生角质形成细胞使用实施例I中得到的具有各种分子量的每份红參和白參多糖提取物10 μ M处理。另外，培养后的细胞使用30 μ M辅酶QlO处理作为阳性对照。然后，细胞培养48小时，之后细胞使用IOml磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗两遍，使用Trizol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA,美国)从细胞中分离总RNA。分离的RNA 使用 Qiagen RNeasy 试剂盒(Qiagen, Valencia, CA,美国)纯化,RNA 的质量和浓度使用安捷伦2100生物分析仪(安捷伦技术，Santa Clara, CA，美国)进行分析。cDNA使用Superscript逆转录酶(RT)II试剂盒(Invitrogen)从分离的RNA中合成出来,并且进行实时逆转录聚合酶链反应(Q-RT-PCR)，因此定量分析在细胞内ND5和ND6基因(属于线粒体电子传递系统酶的复合物I)和ATP6和ATP8基因(属于复合物V)的表达的变化量。使用TaqMan基因表达分析试剂盒(Applied Biosystems, Forster City, CA,美国)在人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，4333764F，Applied Biosystems)的基础上评估了基因表达模式的变化。首先，对红參多糖提取物根据分子量进行了分类，之后，细胞中的线粒体酶ND5，ND6，ATP6和ATP8使用分好的提取物的每一部分分别进行处理，其表达水平通过RT-PCR测定，并且測定了对照组中与这些相关的线粒体酶表达的比率。图I到4显示了測定的結果。结果，可以看到具有分子量小于10，000的红參多糖提取物最明显的增加了 ND5、ND6、ATP6和ATP8的表达水平，并且与阳性对照辅酶Q对比具有突出的效果。以上的PCR反应在下列条件下进行在95°C下变性15秒钟，在60°C下退火I分钟，并且在60°C扩增I分钟，循环50次。另外，在下表I中显示在PCR反应中使用的基因的名称、登录号和序列号。表I
权利要求
1.一种皮肤外用剂组合物，其特征在于，该组合物含有分子量小于10，OOO的红参多糖提取物作为活性成分。
2.根据权利要求I所述的组合物，其中，所述组合物是用来提升皮肤细胞中的线粒体电子传递系统酶表达的组合物。
3.根据权利要求I所述的组合物，其中，所述组合物是用来减少皮肤皱纹的组合物。
4.根据权利要求I所述的组合物，其中，所述组合物是用来提高皮肤弹性的组合物。
5.根据权利要求I所述的组合物，其中，所述组合物是用来阻止皮肤老化的组合物。
6.根据权利要求I所述的组合物，其中，所述组合物制备为化妆品或补气中药制剂。
全文摘要
本发明涉及一种用于减少皮肤皱纹、提高皮肤弹性和阻止皮肤老化的皮肤外用剂组合物，特别是，涉及一种含有分子量小于10,000的红参多糖提取物为有效成分的皮肤外用剂组合物，其中，红参多糖提取物增加人皮肤角质形成细胞的线粒体电子传递系统酶的表达，同时提高皮肤细胞活性，因此减少皮肤皱纹，增加皮肤弹性并阻止皮肤老化。
文档编号A61K8/73GK102665667SQ201080052447
公开日2012年9月12日 申请日期2010年11月23日 优先权日2009年11月30日
发明者廉明勋, 权纯祥, 金德姬, 金智晟, 金汉坤 申请人:株式会社爱茉莉太平洋