用于从纤维素生物质产生可溶性糖的重组β-葡糖苷酶变体的制作方法

专利名称：用于从纤维素生物质产生可溶性糖的重组β-葡糖苷酶变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组3 -葡糖苷酶变体的表达及其在从纤维素生物质产生可溶性糖中的用途。
背景技术：
纤维素生物质是用于产生可溶性糖的重要的可再生资源。这些糖类可在包括发酵的多种代谢过程中用作反应物，以产生生物燃料、化合物以及其他有商业价值的产物。虽然将单糖诸如葡萄糖发酵成乙醇相对直接，但将纤维素生物质有效转化成可溶性糖是有挑战的(参见，例如，Ladisch等人，1983, Enzyme Microb. Technol. 5 :82)。纤维素可以用化学方法、机械方法、酶方法或用其他方法进行预处理以提高纤维素对水解的敏感性。这种预处理之后可以是使用打破纤维素的3 -1-4糖苷键的酶进行的纤维素到纤维二糖、纤维寡糖、葡萄糖和其他糖类以及糖聚合物的酶促转化。这些酶总称为“纤维素酶”。纤维素酶被分为三个亚类的酶1，4-P-D-葡聚糖葡聚糖水解酶(“内切葡聚糖酶”或“EG”)；1，4-3-D-葡聚糖纤维二糖水解酶(“外切葡聚糖酶”、“纤维二糖水解酶”或“CBH”)；和P-D-葡糖苷-葡糖水解酶(“ P -葡糖苷酶”、“纤维二糖酶”或“BGL”)。内切葡聚糖酶断裂内部键并破坏纤维素的晶体结构，暴露个别的纤维素多糖链(“葡聚糖”)。纤维二糖水解酶逐步缩短葡聚糖分子，主要释放纤维二糖单元(葡萄糖的水溶性￠-1,4-连接的二聚体)以及葡萄糖、纤维三糖和纤维四糖。3 -葡糖苷酶将纤维二糖分裂为葡萄糖单体。用于加工纤维素生物质的具有改进特性的纤维素酶将降低成本并提高生物燃料和其他有商业价值的化合物的生产效率。发明概述一方面，本发明提供了包括如下氨基酸序列的分离或重组的￠-葡糖苷酶变体所述氨基酸序列与SEQ ID NO :2的残基20-870 (野生型Cl P -葡糖苷酶)至少约60%相同，有时至少约65%相同且通常至少约70%相同，或由在严格条件下与SEQ ID NO :1或SEQID NO :1的精确互补序列(exact complement)杂交的核酸编码,并且具有至少一种相对于SEQ ID NO :2的本文所述的氨基酸残基取代，其中该变体具有比野生型蛋白更大的￠-葡糖苷酶活性和/或比野生型蛋白更热稳定。还提供了编码所述3-葡糖苷酶变体的多核苷酸、包含所述多核苷酸的表达载体、以及用所述表达载体转化的宿主细胞。本发明还提供了通过将用编码0 -葡糖苷酶变体的多核苷酸转化的宿主细胞在适于表达所述3-葡糖苷酶的条件下培养来产生3-葡糖苷酶变体的方法。在一些实施方案中，从培养基或从转化和培养的细胞回收0 -葡糖苷酶多肽。本发明还提供包含分离或重组的Cl ￠-葡糖苷酶变体的酶组合物。任选地所述酶组合物还包括至少一种另外的纤维素酶。在相关的和/或其他的方面，本发明提供了通过使P -葡糖苷酶变体与生物质基质(biomass substrate)在适于产生可发酵的糖的条件下接触来将该生物质基质如纤维二糖转化成可发酵的糖的方法。在一个实施方案中，生物质基质被保持在包含表达葡糖苷酶变体的细胞的培养基中。在一个实施方案中，表达￠-葡糖苷酶变体的重组宿主细胞还表达至少一种其他重组纤维素酶和/或其他酶。在使生物质基质与3-葡糖苷酶多肽变体接触之前，任选地对该生物质基质进行预处理。附图
简述
图I. (A)在Cl菌株中产生的改进的Cl Bgll变体的热稳定性；通过在pH 5，50°C持续20分钟的pNPG测定确定在pH 5，65°C孵育6小时后的残余酶活性。N = 6-8 ;误差棒代表±1标准差。(B)在Cl菌株中产生的改进的Cl Bgll变体的热稳定性；通过在pH 5，50°C持续20分钟的pNPG测定确定在pH 5，65°C孵育24小时后的残余酶活性。N = 6-30 ；误差棒代表±1标准差。(C)在酵母与Cl宿主之间的Cl Bgll热稳定性相关性。图2. (A)将改进的Cl Bgll变体481,269和3的热稳定性与天然Cl Bgll酶的热稳定性进行比较。使用PNPG做底物在pH 5，50°C持续20分钟测量在pH 4. 5，65°C孵育24小时后的残余酶活性。N = 6-16 ;误差棒代表土 I标准差。(B)改进的Cl Bgll变体664的热稳定性与变体481的热稳定性进行比较。使用pNPG做底物在pH 5，50°C持续20分钟测量在pH 4，65°C孵育4小时后的残余酶活性。N = 6-24 ;误差棒代表土 I标准差。图3. (A)将改进的Cl 8§11变体3、481、664、916、885和871的热稳定性与天然(1Bgll酶的热稳定性进行比较。使用pNPG做底物在pH 5，50°C持续20分钟测量在pH 4. 5，65°C孵育72小时后的残余酶活性。N = 6-10 ;误差棒代表±1标准差。图4.在纤维二糖测定中将天然Cl Bgll的比活性与变体871的比活性进行比较。测定条件pH 4. 5-5，温度55°C -75°C ；8g/L纤维二糖，18小时反应。将反应中的蛋白质浓度标准化。N+2 ;误差棒代表±1标准差。图5 图5显示天然(野生型)Cl Bgll氨基酸序列(SEQ ID NO 2)与变体3 (SEQID NO 5) ,269 (SEQ ID NO :7),481 (SEQ ID NO 9) ,647 (SEQ ID NO : 15)、664 (SEQ ID NO:13),871 (SEQ ID NO 17) ,885 (SEQ ID NO 19) 916 (SEQ ID NO 21)的氨基酸序列的比对。发明详述I.定义提供以下定义来帮助读者。除非另外定义，否则领域内的所有术语均旨在具有分子生物学领域和微生物学领域的技术人员所通常理解的含义。在一些情况下，具有通常理解含义的术语为了清晰和/或为了现成参考而在此定义，并且在此包含此类定义不应一定被认作代表与相关领域一般理解的术语定义相比有实质差异。术语“纤维素酶”是指能够将纤维素(￠-1, 4-葡聚糖或P-D-葡糖苷键)水解成较短寡糖、纤维二糖和/或葡萄糖的一类酶。术语“ 3 -葡糖苷酶”和“纤维二糖酶”被互换使用并且是指催化糖二聚体包括但不限于纤维二糖的水解同时释放对应的糖单体的3-D-葡糖苷葡糖水解酶。在一个实施方案中，^ -葡糖苷酶是催化纤维二糖水解为葡萄糖的分类为E. C. 3. 2. I. 21的P -葡糖苷酶葡糖水解酶。一些￠-葡糖苷酶还具有水解P-D-半乳糖苷、P-L-阿拉伯糖苷和/或3-D-岩藻糖苷的能力，并且另外一些￠-葡糖苷酶可作用于a-I，4-底物如淀粉。￠-葡糖苷酶活性可通过本领域熟知的方法来测量，包括本文以下描述的测定法。术语“ P -葡糖苷酶多肽”是指具有P -葡糖苷酶活性的多肽。术语“ 0 -葡糖苷酶多核苷酸”是指编码具有P -葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸。“纤维素水解活性”包括外切葡聚糖酶活性(CBH)、内切葡聚糖酶(EG)活性和/或 葡糖苷酶活性。术语“外切葡聚糖酶”、“外切纤维二糖水解酶”、或“CBH”是指分类为E. C. 3. 2. I. 91 的一组纤维素酶。这些酶从纤维素的还原性末端或非还原性末端水解纤维二糖。术语“内切葡聚糖酶”或“EG”是指分类为E. C. 3. 2. I. 4的一组纤维素酶。这些酶水解纤维素内部的￠-1,4糖苷键。如本文所用，术语“分离的”是指从与之通常缔合的组分(其他蛋白、核酸、细胞等等)中部分地或完全地分开的核酸、多核苷酸、多肽、蛋白或其他组分。术语“野生型”当应用于多肽(蛋白)时表示由自然存在的微生物诸如细菌或丝状真菌表达的多肽(蛋白)。当应用于微生物时，术语“野生型”是指天然的非重组微生物。关于Cl ￠-葡糖苷酶，野生型Bgl I是指具有SEQ ID NO :2的残基20-870的序列的蛋白的成熟(分泌)形式。如本文所用的“变体”表示包括相对于野生型Cl ￠-葡糖苷酶(Bgll)或野生型多核苷酸的一个或多个修饰(诸如在多肽或多核苷酸中的一个或多个特定的氨基酸残基或者一个或多个特定的核苷酸或密码子的取代、插入、缺失和/或截短)的3-葡糖苷酶多肽或编码￠-葡糖苷酶的多核苷酸。“参考@ -葡糖苷酶序列”是指用作序列比较的基础的限定序列，诸如SEQ ID NO 2。参考￠-葡糖苷酶序列可以是较大序列的子集(subset)。一般地说，参考序列为多肽的至少25个氨基酸残基长度、至少50个残基长度、至少100个残基长度、至少150个残基长度、至少200个残基长度、至少300个残基长度、至少350个残基长度、至少500个残基长度、至少600个残基长度、至少700个残基长度、或多肽的全长。核酸(诸如多核苷酸)、多肽或细胞当是人工的或工程改造的，或衍生自或包含人工的或工程改造的蛋白或核酸时，它们是“重组的”。例如，多核苷酸被插入到载体中或任何其他异源位置(例如，重组生物的基因组中)以使其不与自然界发现的正常情况下在该多核苷酸两侧的核苷酸序列相缔合，这样的多核苷酸是重组多核苷酸。从重组多核苷酸体外或体内表达的蛋白是重组多肽的实例。同样，不在自然界出现的多核苷酸序列例如自然存在的基因的变体是重组的。“改进的特性”是指与野生型Cl P -葡糖苷酶(Bgll) (SEQ ID NO :2的残基20-870)相比展示任何特性上的改进的￠-葡糖苷酶多肽。改进的特性可包括增加的蛋白表达、热活性、热稳定性、PH活性、pH稳定性、产物特异性、提高的比活性、底物特异性、对底物或终产物抑制的提高的抗性、改变的PH/温度曲线和化学稳定性。
具有“改进的P -葡糖苷酶活性”的变体，当该术语在本文使用时，表示显示在指定的时间在指定的反应条件下发生的底物水解的量相对于参考序列增加的变体。可使用本领域已知的多种方法测量￠-葡糖苷酶活性，诸如本文以下所述的纤维二糖测定法。为了比较两个重组表达的蛋白的￠-葡糖苷酶活性，可比较比活性(每摩尔酶的活性或每克酶的活性)。可选地，可在相同条件下培养表达和分泌重组蛋白的细胞并且可比较每体积培养基的￠-葡糖苷酶活性。如本文所用的术语“改进的热稳定性”表示相对于野生型酶展示“残余活性”的增加的变体酶。通过将酶(变体或参考，例如，野生型)暴露于提高的温度持续一段时间的应激条件并然后在参考(例如野生型)酶正常具有活性的条件下确定3-葡糖苷酶活性，来确定残余活性。暴露于应激条件下的酶的3 -葡糖苷酶活性(“a”)与其中酶没有被暴露于应激条件的对照的￠-葡糖苷酶活性(“b”)比较，且残余活性等于比值a/b。具有增加的热稳定性的变体将具有比参考(例如野生型)酶更大的残余活性。在下文实施例中提供了用于确定热稳定性的不例性条件。在一个实施方案中，酶被暴露于65°C、pH 5的应激条件6小时，并且在50°C，pH 5测定I. 5小时。 术语“同一性百分比(percentidentity) ”、“*% 同一性”、“同一百分比(percentidentical) ”和“ ％同一”在本文被互换使用是指通过ClustalW分析(可从EuropeanBioinformatics Institute,Cambridge,UK获得的W I. 8版)获得的氨基酸序列同一性百分比计算比对中相同匹配的数目并用此相同匹配的数目除以参考序列的长度，并且使用以下缺省ClustalW参数以达到缓慢的/准确的逐对最佳比对-空位开放罚分(Gap OpenPenalty) :10;空位延伸罚分(Gap Extension Penalty) :0. 10;蛋白权重矩阵(Proteinweight matrix) Gonnet 系列；DNA 权重矩阵IUB ；Toggle Slow/Fast 逐对比对=SLOW 或FULL比对。两条序列当以下时候是“最佳比对的”为相似性评分使用限定的氨基酸取代矩阵(例如，BL0SUM62)、空位存在罚分和空位延伸罚分对这两条序列进行比对以达到该序列对可能的最高分数。氨基酸取代矩阵及其在定量两条序列之间的相似性上的应用是本领域熟知的。参见，例如，Dayhoff 等人(1978), " A model of evolutionary changein proteins " ； " Atlas of Protein Sequence and Structure, "第 5 卷，增干丨J3 (编辑 M. 0. Dayhoff)，pp. 345-352, Natl. Biomed. Res. Round.，Washington, D. C.;以及Henikoff 等人(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 :10915-10919, 二者均通过引用并入本文。BL0SUM62矩阵在序列比对方案诸如Gapped BLAST 2. 0中通常用作缺省评分取代矩阵(default scoring substitution matrix)。空位存在罚分用于在比对序列之一引入单个氨基酸空位，而空位延伸罚分用于被插入到已开放的空位中的每个另外的氨基酸空位置。通过比对开始和结束所在的每条序列的氨基酸位置以及任选地通过在一条或两条序列中插入一个空位或多个空位以达到最高可能评分，来限定比对。尽管最佳比对和评分可手动完成，但通过使用计算机执行的比对算法例如描述于Altschul,等人(1997)Nucleic AcidsRes.，25 :3389-3402(通过引用并入本文)的gapped BLAST 2. 0促进该过程，并且该算法在美国国立生物技术中心(National Center for Biotechnology Information)网站为公众可用。可使用容易获得的程序诸如由上文Altschul，等人(1997)描述的PSI-BLAST，准备最佳比对和多重比对。一个有用的比对工具是“T-Coffee” (Notredame等人，2000，J. Mol.Bio. 302 :205-17) o 可使用缺省参数执行 T-Coffee 比对(T-Coffee TechnicalDocumentation, 8. 01 版，2009 年 7 月，fforldffideffeb. tcoffee. org)。“对应于”、“参考”或“相对于”在对给定的氨基酸序列或多核苷酸序列编号的背景下使用时，是指在给定的氨基酸序列或多核苷酸序列与参考序列比较时对指定的参考序列的残基的编号。氨基酸或核苷酸碱基的“位置”由根据其相对于N末端(或5’ -端)的位置顺序地辨别每个氨基酸(或核苷酸碱基)的编号表示。由于在确定最佳比对时必须被考虑的缺失、插入、截短、融合等，一般来说通过简单地从N末端计数而确定的测试序列中的氨基酸残基编号不一定与其在参考序列中的对应位置的编号相同。例如，在变体具有相对于比对的参考序列的缺失的情况下，在变体中将不存在对应于参考序列中该缺失位点处的位置的氨基酸。在比对的参考序列中存在插入的情况下，该插入将不会对应于参考序列中编号的氨基酸位置。在截短或融合的情况下，在参考序列或比对序列中可存在不对应于对应序列中的任何氨基酸的氨基酸串(stretches of amino acids)。 当核酸缔合形成双链结构(通常在溶液中)时，它们“杂交”。核酸杂交是由于各种被很好表征的物理-化学力，诸如氢键键合、溶剂排斥(solvent exclusion)、碱基堆积等。如本文所用，在核酸杂交实验诸如Southern杂交或Northern杂交的背景下术语“严格的杂交洗涤条件”是序列依赖性的，并且在不同环境参数下是不同的。对核酸杂交的广泛指导见 Ti jssen, 1993, " Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,"第 I 部分，第 2 章(Elsevier,New York)，其通过引用并入本文。对于至少100个核苷酸长度的多核苷酸而言，对低严格条件到极高严格条件限定如下在标准的DNA印迹程序后，在42°C在5XSSPE，0. 3% SDS,200 u g/ml剪切和变性的鲑鱼精DNA，以及对于低严格性的25%甲酰胺，对于中等和中-高严格性的35%甲酰胺，或对于高严格性和极高严格性的50%甲酰胺中预杂交和杂交。对于至少100个核苷酸长度的多核苷酸，使用2XSSC，0. 2% SDS至少在50°C (低严格性)、至少在55°C (中等严格性)、至少在60°C (中-高严格性)、至少在65°C (高严格性)以及至少在70V (极高严格性)将载体材料最终洗涤三次，每次15分钟。术语“培养(culturing) ”或“培养(cultivation) ”是指在液体或固体培养基中在适合的条件下使微生物细胞的群体生长。术语“接触”是指将相应的酶放置在与相应的底物足够靠近的位置以使酶能够将底物转化成产物。例如，将包含酶的溶液与相应的底物组合将实现接触。此类接触还包括在包含酶底物的介质中孵育分泌酶的细胞。如本文所用，提及细胞“代谢”可溶性糖或其他底物产生终产物，表示该糖充当细胞中代谢反应的碳源和/或能量源。通常细胞是微生物细胞，诸如真菌细胞或细菌细胞。如本文所用，关于细胞使用的术语“转化的”或“转化”表示细胞具有整合入其基因组或作为经过多代被维持的游离型质粒的非天然核酸序列。术语“引入”在将核酸序列插入细胞中的背景下表示被转染、转导或转化(统称为“转化”)或以其他方式并入到细胞的基因组中或作为附加体被保持在细胞内。术语“可操作地连接”在本文是指如下配置在该配置中控制序列被适当安放在相对于DNA序列的编码序列的位置以使得该控制序列影响多肽的表达。
当用于本文时，术语“编码序列”旨在覆盖直接指定其蛋白产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框确定，开放阅读框通常以ATG起始密码子开始。编码序列通常包括DNA、cDNA和/或重组核苷酸序列。启动子序列、信号肽、或其他序列当可操作地连接于在自然界与该启动子、信号肽或其他序列不相关的核酸或蛋白序列时，它们是“异源的”。如本文所用，术语“表达”包括多肽的产生所涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。术语“表达载体”在本文是指包括编码本发明的多肽的区段并且可操作地连接于提供其转录的另外区段的线型或环状的DNA分子。 P -葡糖苷酶变体多肽在其具有P -葡糖苷酶活性时是“酶活性的(enzymatically active)”。术语“前蛋白(pre-protein) ”是指包括附加的氨基末端信号肽(或前导序列)区域的蛋白。在分泌之前信号肽酶将信号肽从前蛋白上切割以产生“成熟的”或“分泌的”蛋白。如本文所用，“起始密码子”是编码蛋白的第一个氨基酸残基(甲硫氨酸)的ATG密码子。在序列同一性的上下文中，除非另外说明，否则本说明书中提及“至少x%序列同一性”意指“x%序列同一性”以及其中％序列同一性由每个整数从(x+1) %到99%同一性限定的可选实施方案，就如同每个可选实施方案被明确列出。例如，提及“对SEQ ID NO 2的至少70%序列同一性”或“对SEQ ID NO 2的氨基酸残基20-870的至少70%序列同一性”是指对氨基酸SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :2的残基20-870具有至少71 %序列同一性、至少72%同一性、至少73%同一性、至少74%同一性、至少75%同一性、至少76%同一性、至少77%同一性、至少78%同一性、至少79%同一性、至少80%同一性、至少81%同一性、至少82%同一性、至少83%同一性、至少84%同一性、至少85%同一性、至少86%同一性、至少87%同一性、至少88%同一性、至少89%同一性、至少90%同一性、至少91%同一性、至少92%同一性、至少93%同一性、至少94%同一性、至少95%同一性、至少96%同一性、至少97%同一性、至少98%同一性、或至少99%同一性的可选实施方案。对于延伸SEQ IDNO 2的残基20-870的整个851个氨基酸长度的比对来说，在变体序列与SEQ ID NO :2之间可存在至少596个相同残基(identity)，有时至少604、至少613、至少622、至少630、至少638、至少647、至少655、至少664、至少672、至少681、至少723、至少766、或至少808个相同残基(identity)。如本文所用，“Cl”是指由 Garg, A. ,1966, “An addition to the genusChrysosporium Corda，，Mycopathologia 30 3~4 描述的真菌菌株。“Chrysosporiumlucknowense”包括描述于美国专利第6，015，707号、5，811，381号和6，573，086号；美国专利公布第 2007/0238155 号、US 2008/0194005、US 2009/0099079 ;国际专利公布第 WO2008/073914 号和 WO 98/15633 号的菌株，并且包括但不限于 Chrysosporium lucknowenseGarg 27K、VKM-F 3500D(登录号 VKM F-3500-D)、C1 菌株UV13-6 (登录号 VKM F-3632 D)、C1菌株NG7C-19(登录号VKM F-3633D)和Cl菌株UV18-25 (VKM F-3631 D)，其全部被保藏在俄罗斯科学院全俄微生物菌种保藏中心(VKM) ,Bakhurhina St. 8,Moscow, Russia, 113184,以及其任何衍生菌株(derivative)。尽管最初被描述为Chrysosporium lucknowense,目前可认为Cl是嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophilia)的菌株。示例性Cl衍生菌株包括其中一个或多个内源基因或序列被缺失或修饰和/或一个或多个外源基因或序列被引入的修饰的生物体。衍生菌株包括 UV18#100f Aalpl、UV18#100f Apyr5 A alpl、UV18#100. fAalpl A pep4 A alp2>UV18#100. f A pyr5 Aalpl A pep4 A alp2 和 UV18#100. f A pyr4Apyr5 AaIp I Ap印4 A alp2，如在通过引用并入本文的W02008073914中所描述的。以下命名法可用于描述多肽或多核苷酸序列中相对于参考序列的取代“R-#-V”，其中#是指在参考序列中的位置，R是指在参考序列中该位置处的氨基酸(或碱基)，并且V是指在变体序列中该对应位置处的氨基酸(或碱基)。例如，对于参考SEQ IDNO :2而描述的变体多肽而言，“D369L”表示在该变体多肽中，在该参考序列第369位的天冬氨酸被亮氨酸取代，其中通过该变体序列与SEQ ID NO :2的最佳比对确定氨基酸位置。类似地，“S182L/W”描述了两种变体其中在第182位的丝氨酸被亮氨酸取代的变体，和其中在第182位的丝氨酸被色氨酸取代的变体。 以下约定用来描述Bgll变体中的氨基酸位置。相对于参考序列SEQ ID NO :2对氨基酸位置进行编号，SEQ ID NO :2是野生型Cl Bgll前蛋白(包括信号肽)的序列。确定序列同一性的程度(例如，“至少70%同一性”)或描述缺失(例如，在蛋白c末端的残基的缺失)的比对是相对于野生型Bgll蛋白的分泌形式，即SEQ ID NO 2的残基20-870。核苷酸碱基取代相对于SEQ ID NO :I而编号。信号肽(SEQ ID NO 2的残基1_19)中的取代是指Bgll前蛋白的序列。II.引言真菌Cl产生多种纤维素酶和其他协同作用来催化纤维素的解晶和水解产生可溶性糖的酶。Cl 由 Garg, 1966, “An addition to the genus Chrysosporiumcorda”Mycopathologia 30 :3_4 描述。还参见美国专利第 6，015，707 号和 6，573，086 号，为所有目的将其通过引用并入本文。Cl基因组已被至少部分测序，如美国专利公布US 2007/0238155、US2008/0194005和US 2009/0099079所示，为所有目的将其通过引用并入本文。Cl P -葡糖苷酶I (bgll)基因及编码蛋白(Bgll)的序列作为SEQ ID NO :I和SEQ ID NO 2在本文给出(还参见共同未决的申请第61/247，379号和PCT/US 10/50982，其通过引用并入本文)。注意这些序列与专利公布US 2007/0238155的Bgll序列不同。本文描述的Cl 3 -葡糖苷酶变体对于从纤维素生物质产生可溶性糖是极其有用的。在一方面，本发明涉及通过使包含纤维二糖的组合物与重组表达的Cl 3 -葡糖苷酶变体在其中该纤维二糖被酶促转化为葡萄糖的条件下接触来产生葡萄糖的方法。在一方面，可将表达3-葡糖苷酶变体的重组宿主细胞与纤维二糖在其中3-葡糖苷酶被细胞表达(和在某些实施方案中被分泌)的条件下组合。可选地，可将纯化的或部分纯化的重组3 -葡糖苷酶蛋白与纤维二糖接触。在本发明的一个方面，接触包括在包含从纤维素原料产生的纤维二糖的培养基中培养重组宿主细胞。例如，本文描述的Cl 3 -葡糖苷酶变体显示与其他纤维素酶联合的在糖化反应中的益处，所述其他纤维素酶诸如里氏木霉(T. reesei)纤维素酶(例如，里氏木霉CBH1、CBH2和/或EGl或其变体，和/或里氏木霉培养液)和Cl纤维素酶(参见美国专利第6，015, 707号、5，811，381号和6，573，086号；美国专利公布第 2007/0238155 号、US 2008/0194005 号、US 2009/0099079 号；国际专利公布第 WO2008/073914号和WO 98/15633号，其全部通过引用并入本文)。在以下章节中描述了本发明的各方面。
_4] III.在本发明的方法中使用的葡糖苷酶蛋白的特性在一方面，本发明提供了通过将包含包含编码Cl Bgll变体的核酸序列的载体或游离型质粒或具有整合到其基因组中的编码Cl BglI变体的核酸序列的宿主细胞培养在其中￠-葡糖苷酶蛋白或其酶活性的片段被表达的条件下来表达￠-葡糖苷酶蛋白的方法。一般来说表达的蛋白包含在分泌酶时被细胞除去的信号肽。在一个实施方案中，编码ClBgll变体的序列的转录受可操作地连接的异源启动子控制。葡糖苷酶多肽变体 本发明提供了作为Cl ￠-葡糖苷酶(Bgll)变体的新颖的酶。本发明的￠-葡糖苷酶多肽变体是尤其在与商业糖化工艺相关的条件下显示P-葡糖苷酶活性、通常是比野生型Cl ￠-葡糖苷酶(SEQ ID NO :2的残基20-870)更大的P -葡糖苷酶活性的Bgll的变体。还包括在与商业糖化工艺相关的条件下显示更大的稳定性(例如，相对于野生型
葡糖苷酶增加的热稳定性)的￠-葡糖苷酶多肽变体。本发明提供了具有比野生型(WT)Cl Bgll蛋白更大的活性和/或热稳定性并具有见于本文所述的增加的活性和/或增加的热稳定性变体的取代中的至少一种的Bgll变体。如以下更详细讨论的，制备了编码野生型(WT)Cl Bgll蛋白(SEQ ID N02)的多核苷酸。如下文实施例I所述将该多核苷酸插入到表达载体中，通过诱变和定向进化制备了编码变体Bgll蛋白的多核苷酸的文库，并且评价了个体Bgll变体的特性(例如，￠-葡糖苷酶活性和热稳定性)(见表2-7和实施例2-9，下文)。在具有比野生型更大的活性和/或比野生型更大的热稳定性的变体中鉴定了许多氨基酸取代和取代组合。参见表2。选择具有增加的活性和热稳定性的变体并使其经历进一步的诱变和筛选。参见表3。选择来自这轮诱变和筛选的变体并使其经历进一步的诱变和筛选。参见表4。选择来自这又一轮筛选的变体并使其经历另外的诱变和筛选。参见表5。选择来自这轮筛选的两个变体并使其经历进一步的诱变和筛选。参见表6和表7。更具体地说，本发明提供了具有比野生型Cl蛋白更大的活性和/或热稳定性的分离的和/或重组的￠-葡糖苷酶多肽变体，且其包括与野生型Cl ￠-葡糖苷酶(Bgll) (SEQID NO :2的残基20-870)至少约70%相同的氨基酸序列以及在选自以下组成的组的位置处具有至少一个氨基酸残基取代K57 ；A88 ；I106 ；N112 ；Q119 ；T120 ；A123 ；R132 ；Y135 ；A136 ；A141 ；K142 ；L149 ；G158 ；P161 ；P172 ；T177 ；I179 ；G180 ；M181 ；S182 ；E183 ；K186 ；A197 ；G202 ；Y219 ；N220 ；S222 ；T224；I229 ；M234 ；F242 ；A243 ；V246 ；Q258 ；D274 ；V286 ；Q291 ；Q313 ；V318 ；A343 ；T354 ；T357 ；D358 ；E360 ；D369 ；P374 ；I375 ；A378 ；Q381 ；E385 ；S388 ；V390 ；A394 ；N398 ；E402 ；K406 ；I428 ；S434 ；N437 ；E449 ；Q474 ；A475 ；T482 ；S489 ；Y491 ；K530 ；N536 ；T540 ；T565 ；V674 ；R682 ；I867 ；E868 ；P870 (其中通过与 SEQ ID NO :2 最佳比对来确定氨基酸位置)。“取代”在该背景下表示该变体蛋白中的残基不同于所显示的残基。例如，“A88”表示在第88位包含除了丙氨酸以外的氨基酸(S卩，另外19种自然存在的氨基酸之一)的变体。在一些实施方案中，变体蛋白中的氨基酸既不是野生型残基也不是作为该野生型残基的保守性替代物(substitute)的残基。如以下所讨论的，在该背景下，残基的保守性替代物是在表I中鉴定的同一组中的另一个残基。本发明另外提供了具有比(WT)Cl Bgll蛋白更大的活性和/或热稳定性的分离的和/或重组的￠-葡糖苷酶多肽变体，其中该变体包括与野生型Cl (Bgll) (SEQ ID N0:2的残基20-870)至少约70%相同的氨基酸序列；在位置Q291、D369和E402的每一个具有取代；以及在选自以下组成的组的位置处具有至少一个氨基酸残基取代1106、A109、Q119、T120、R132、Y135、M181、Q215、A243、V246、Q258、A265、D274、N278、Q313、F314、G332、T357、D358、P374、E385、S434、N437、A475、S489、Y491、E493、K495、K497、S501、A503E、N504、A505、N521、K530、N536、T540、D566、T591、A601、K610、T611、R612、S614、L620、G628、T635、V638、V648、D650、S652、N670、R672、V674、S676、T685、T687、A689、Q690、T699、D703、K708、Y715、八7323742、1757、￥775、1777和0781(其中通过与5￡0 ID NO :2最佳比对来确定氨基酸位置)。在一些实施方案中，变体蛋白中的氨基酸既不是野生型残基也不是作为该野生型残基的保守性替代物(substitute)的残基。如以下所讨论的，在该背景下，残基的保守性替代物是在表I中鉴定的同一组中的另一个残基。本发明另外提供了具有比野生型Cl Bgll蛋白更大的活性和/或热稳定性的分离 的和/或重组的葡糖苷酶多肽变体，其中该变体包括与野生型Cl ￠-葡糖苷酶(Bgll)(SEQ ID NO 2的残基20-870)至少约70%相同的氨基酸序列；在位置Q258、Q291、Q313、D369、E402、S434、A475、K495和G628的每一个具有取代；以及在选自以下组成的组的位置处具有至少一个氨基酸残基取代A4、A15、E21、S22、K24、V25、H26、Q27、P29、L30、N45、D47、Q55、S58、A79、Q85、I106、A109、Q119、Y135、A136、P161、V175、G180、G202、G216、I221、L237、D244、V253、V260、L275、D311、F314、A343、D358、E360、Q381、E385、A394、A404、A405、K421、I428、P436、N437、M454、D470、R476、A477、Q479、T482、Y491、E493、E494、T496、S501、A505、N536、V559、V562、N588、S604、R612、G616、A617、G626、N627、F634、D646、D650、S652、R672、V673、T685、T687、A689、Q690、K708、Y715、Q716、A732、A748、D751、L757K、S764、R769、V775、T777、T783、T785、S787、S799、P806、K807、R817、E819、E822、T823、V840、V846、1847、S848、Y850、K866、和P870(其中通过与SEQ ID NO :2最佳比对来确定氨基酸位置)。在一些实施方案中，变体蛋白中的氨基酸既不是野生型残基也不是作为该野生型残基的保守性替代物(substitute)的残基。如以下所讨论的，在该背景下，残基的保守性替代物是在表I中鉴定的同一组中的另一个残基。本发明另外提供了具有比野生型Cl Bgll蛋白更大的活性和/或热稳定性的分离的和/或重组的葡糖苷酶多肽变体，其中该变体包括与野生型Cl ￠-葡糖苷酶(Bgll)(SEQ ID NO 2的残基20-870)至少约70%相同的氨基酸序列；在位置Q258、Q291、Q313、D369、E402、S434、A475、K495、G628、A689和Y715的每一个具有取代；以及在选自以下组成的组的位置处具有至少一个氨基酸残基取代C8、L9、K24、V25、D47、S58、A79、Q85、1106、A109、A136、V175、L237、A243、V253、V260、D274、L275、F314、A343、Q381、E385、P436、N437、Q474、R476、A505、S550、N588、S604、G616、G626、D650、D651、S652、V674、T687、Q690、D709、E710、A732、D733、Y736N、L757、S764、T777、T783、T785、K807、M816、D844、V846、L869 和P870(其中通过与SEQ ID NO :2最佳比对来确定氨基酸位置)。在一些实施方案中，变体蛋白中的氨基酸既不是野生型残基也不是作为该野生型残基的保守性替代物(substitute)的残基。如以下所讨论的，在该背景下，残基的保守性替代物是在表I中鉴定的同一组中的另一个残基。本发明另外提供了具有比野生型Cl Bgll蛋白更大的活性和/或热稳定性的分离的和/或重组的葡糖苷酶多肽变体，其中该变体包括与野生型Cl ￠-葡糖苷酶(Bgll)(SEQ ID NO 2的残基20-870)至少约70%相同的氨基酸序列；在位置D47、Q258、Q291、Q313、A343、D369、E402、S434、A475、K495、G628、T687、A689 和 Y715 的每一个具有取代；以及在选自以下组成的组的位置处具有至少一个氨基酸残基取代A79、Q85、V260、L275、F314、D395、P439、A505、D646、T693、N723、A730、A732、S764、R769、T827 和 Y855(其中通过与 SEQID NO :2最佳比对来确定氨基酸位置)。在一些实施方案中，变体蛋白中的氨基酸既不是野生型残基也不是作为该野生型残基的保守性替代物(substitute)的残基。如以下所讨论的，在该背景下，残基的保守性替代物是在表I中鉴定的同一组中的另一个残基。本发明另外提供了具有比野生型Cl Bgll蛋白更大的活性和/或热稳定性的分离的和/或重组的葡糖苷酶多肽变体，其中该变体包括与野生型Cl ￠-葡糖苷酶(Bgll) (SEQ ID NO 2的残基20-870)至少约70%相同的氨基酸序列；在位置1106、Q258、V260、Q291W、Q313、F314、D369、E402、S434、K495、G628、A689、Y715 和 A732 的每一个具有取代；以及在选自以下组成的组的位置处具有至少一个氨基酸残基取代A109、A343、A475、A505、A689、A79、C8、D47、L275、N315、Q85、T591 和 T687(其中通过与 SEQ ID NO 2 最佳比对来确定氨基酸位置)。在一些实施方案中，变体蛋白中的氨基酸既不是野生型残基也不是作为该野生型残基的保守性替代物(substitute)的残基。如以下所讨论的，在该背景下，残基的保守性替代物是在表I中鉴定的同一组中的另一个残基。表I
碱性氨基酸__精氨酸、赖氨酸、组氨酸_
酸性氨基酸__谷氨酸、天冬氨酸_
极性氨基酸__谷氨酰胺、天冬酰胺_
疏水性氨基酸__亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸_
芳香族氨基酸__苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸_
小氨基酸甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、曱_硫氨酸_在一些实施方案中，变体蛋白中的氨基酸既不是野生型残基也不是为如以下的对所限定的那样通常与该野生型残基交换的残基的残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu 和 Asp/Gly。如表2中概括的，在某些实施方案中，本发明提供了包括如下氨基酸序列的分离的和/或重组的￠-葡糖苷酶多肽变体该氨基酸序列具有比野生型Cl Bgll蛋白更大的活性和/或热稳定性，与野生型Cl ￠-葡糖苷酶(Bgll) (SEQ ID N0:2的残基20-870)至少约70%相同并且具有选自以下组成的组的至少一个氨基酸残基取代K57R ；A88S ；I106V ；N112V ；Q119E/L ；T120M/Y/V/H ；A123N ；R132K/G/ff ；Y135I/Q/M ；A136E ；A141F ；K142R ；L149Q/M ；G158D ；P161S ；P172A ；T177I ；I179M ；G180E ；M181Y ；S182L/ff ；E183G/M/Q/K ；K186R ；A197V ；G202M/V ；Y219V ；N220Y/S/L ；S222Q/E ；T224N ；I229M ；M234E/I ；F242L ；A243V ；V246L ；Q258N ；D274Y/N ；V286I ；Q291ff/A/F ；Q313M ；V318E ；A343V/T ；T354Q ；T357L/P ；D358K/N ；E360R/A/D ；P374Y ；I375V ；A378K/T ；Q381V/D/I/L ；D369Q/L/Y/C/A/I/P/E/K/R/F/M/H/V ；E385L ；S388ff/C ；V390I ；A394G/V/L/P/Q ；N398G ；E402N ；K406D ；I428V ；S434P ；N437F/Y/D/L/W ；E449Q ；Q474I ；A475F/Y/H/ff/C ；T482A ；S489L ；Y491H/F ；K530M/G ；N536K ；T540K ；T565A/G/P ；V674I ；R682ff ；I867M ；E868R ;P870S (其中通过与 SEQ ID NO :2最佳比对来确定氨基酸位置)。以上列出的取代的有益组合包括在以上鉴定的位置中的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或更多个位置处的取代的任何组合。如表3中概括的，在某些实施方案中，本发明提供了包括具有比野生型Cl Bgll蛋白更大的活性和/或热稳定性的氨基酸序列的分离的和/或重组的P-葡糖苷酶多肽变体，其中该变体与野生型Cl (Bgll) (SEQ ID NO :2的残基20-870)至少约70%相同；具有取代Q291W、D369H/L/R/Y和E402N ；以及在选自以下组成的组的位置处具有至少一个氨基酸残基取代A109S、A243V、A265S、A475C/F/L/W、A503E、A505C、A601T、A689I、A732G/M、D274Y、D358E/K/N、D566G、D650F/V、D703K、D781N、E385L、E493A/V/Y、E742G、F314L/V、 G332D、G628L/V/W、I106V、K495F/H/I/N/Q/V、K497R、K530C/D/E/I/M/N/V、K610S、K708F、L620M、L757K、M181Y、N278Y、N437D/F/I/K/L/V/W/Y、N504Y、N521C、N536K、N670D、P374Y、Q119E、Q215E/M、Q258H/N、Q313M、Q690A/K/R、R132H、R612H/P、R672A/D/F/G/I/S/T/V、S434P、S489I/L/N/T、S501H/N/R、S614A/C/D/H/L/R/V/Y、S652D、S676C、S764F、T120H/Y、T357A、T540K、T591A/C/R、T611A/H/Q、T635A/I/V、T685V、T687C/F/K/L/M/W/Y、T699L、T777N、T779S、V246I、V638E/R/S、V648W、V674M、V775C、Y135Q、Y491F/H/L 和 Y715P (其中通过与SEQ ID NO :2最佳比对来确定氨基酸位置)。以上列出的取代的有益组合包括在以上鉴定的位置中的任何 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、25、30、35、40、45、50、55、60、65或70或更多个位置处的取代的任何组合。如表4中概括的，在某些实施方案中，本发明提供了包括如下氨基酸序列的分离的和/或重组的￠-葡糖苷酶多肽变体该氨基酸序列具有比野生型Cl Bgll蛋白更大的活性和/或热稳定性，与野生型Cl P -葡糖苷酶(Bgll) (SEQ ID NO :2的残基20-870)至少约 70 % 相同，具有取代 Q258N、Q291W、Q313M、D369R、E402N、S434P、A475L、K495N 和 G628W ；并且具有选自以下组成的组的至少一个取代A4V、A15V、A109S/T、A136L、A343C、A394G、A404S、A405T、A477G、A505C、A617V、A689I、A732G/M/S、A748T、A79E/G/M、D244H、D311N、D358K、D470N、D47I、D646N、D650F/N/Y、D751N、E21Q/R、E360D、E385L、E493A/V/Y、E494K、E819A/L/V、E822A/G/K/M、F314L/V、F634A、G180E、G202M、G216L、G616D、G626D、H26R、I106V、I221V、I428V、I847T、K24G/L/T、K421R、K708F、K807R、K866I/Q、L237Y、L275Y、L30K、L757K、M454E、N437W、N45H、N536K、N588F、N627H、P161S、P29M/Q/R、P436E/Q、P806L、P870S、Ql19E、Q27H/R、Q381V、Q479R、Q55R、Q690A/H/K、Q716R、Q85N、R476Q、R612H、R672G、R769H、R817P、S22L/R、S501C/R、S58G、S604I、S652D、S764F、S787G、S799N、S848N、T482A、T496A、T685V、T687C/K/M、T777N、T783H/Q、T785L、T823K、V175A、V253F、V25A/G/R、V260G/L、V559T、V562C/L、V673A、V775C、V840I、V846F、Y135M/Q、Y491F、Y715P 和 Y850H/Q(其中通过与 SEQ ID NO 2最佳比对来确定氨基酸位置)。在一些实施方案中，该Bgl I多肽在位置A475不具有取代。以上列出的取代的有益组合包括在以上鉴定的位置中的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80 或更多个
位置处的取代的任何组合。如表5中概括的，在某些实施方案中，本发明提供了包括如下氨基酸序列的分离的和/或重组的￠-葡糖苷酶多肽变体该氨基酸序列具有比野生型Cl Bgll蛋白更大的活性和/或热稳定性，与野生型Cl P -葡糖苷酶(Bgll) (SEQ ID NO 2的残基20-870)至少约 70 %相同，具有取代 Q258N、Q291W、Q313M、D369R、E402N、S434P、A475L、K495N、G628W、A689I和Y715P ;并且具有选自以下组成的组的至少一个取代C8A、L9F、K24G/T、V25A、D47I/N、S58G、A79E/G/M、Q85H/N、I106V、A109S/T、A136L、V175A、L237Y、A243G、V253F、V260G、D274Y、L275F/Y、F314L/V、A343C/G、Q381V、E385L、P436Q、N437D/K、Q474I/L、R476G、A505C、S550C、N588F、S604A/C/I/V、G616D、G626D、D650N/Y、D651E、S652D、V674I、T687C/K/W、Q690H/K、D709E、E710G、A732G/M/V、D733G、Y736N、L757I/K、S764F、T777N、T783A、T785L、K807R、M816L、D844G、V846F/L/Q、L869R 和 P870S (其中通过与 SEQ ID NO 2 最佳比对来确 定氨基酸位置)。在一些实施方案中，该Bgll多肽变体在位置A475不具有取代。以上列出的取代的有益组合包括在以上鉴定的位置中的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、25、30、35、40、45、50或更多个位置处的取代的任何组合。如表6中概括的，在某些实施方案中，本发明提供了包括如下氨基酸序列的分离的和/或重组的￠-葡糖苷酶多肽变体该氨基酸序列具有比野生型Cl Bgll蛋白更大的活性和/或热稳定性，与野生型Cl P -葡糖苷酶(Bgll) (SEQ ID NO :2的残基20-870)至少约 70%相同，具有取代 D47I、Q258N、Q291W、Q313M、A343C、D369R、E402N、S434P、A475L、K495N、G628W、T687K、A689I、Y715P ;并且具有选自以下组成的组的至少一个取代A79E/G/M、Q85N、V260G、L275Y、F314L/V、D395N、P439S、A505C、D646N、T693A/E、N723G、A730S、A732G/M/V、S764Y、R769H、T827I和Y855(其中通过与SEQ ID NO :2最佳比对来确定氨基酸位置)。在一些实施方案中，该Bgll变体多肽具有代替T687K的取代T687K或T687W。在一些实施方案中，该Bgl变体多肽在位置A475不具有取代。以上列出的取代的有益组合包括在以上鉴定的位置中的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15或更多个位置处的取代的任何组合。如表7中概括的，在某些实施方案中，本发明提供了包括如下氨基酸序列的分离的和/或重组的￠-葡糖苷酶多肽变体该氨基酸序列具有比野生型Cl Bgll蛋白更大的活性和/或热稳定性，与野生型Cl ￠-葡糖苷酶(Bgll) (SEQ ID NO :2的残基20-870)至少约 70%相同，具有取代 I106V、Q258N、V260G、Q291W、Q313M、F314L/V、D369R、E402N、S434P、K495N、G628W、A689I、Y715P和A732G ;并且具有选自以下组成的组的至少一个取代A109S/T、A343C/G、A475L、A505C、A79E/G/M、C8G、D47I、L275F/Y、N315D、Q85H/N 和 T591I、T687C/K/W(其中通过与SEQ ID NO :2最佳比对来确定氨基酸位置)。在一些实施方案中，该Bgll蛋白另外具有取代F314V。以上列出的取代的有益组合包括在以上鉴定的位置中的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12或更多个位置处的取代的任何组合。本发明还提供了具有比野生型Cl Bgll蛋白更大的活性和/或热稳定性且具有由在严格条件下与SEQ ID NO : I的互补序列杂交(例如，在与SEQ ID NO : I精确互补的核酸的基本整个长度内)的核酸编码的氨基酸序列的分离的和/或重组的P-葡糖苷酶多肽变体，其中该编码多肽具有选自以下组成的组的至少一个氨基酸残基取代K57 ；A88 ；I106 ；N112 ；Q119 ；T120 ；A123 ；R132 ；Y135 ；A136 ；A141 ；K142 ；L149 ；G158 ；P161 ；P172 ；T177 ；1179 ；G180 ；M181 ；S182 ；E183 ；K186 ；A197 ；G202 ；Y219 ；N220 ；S222 ；T224 ；I229 ；M234 ；F242 ；A243 ；V246 ；Q258 ；D274 ；V286I ；Q291 ；Q313 ；V318 ；A343 ；T354 ；T357 ；D358 ；E360 ；P374 ；I375 ；A378 ；Q381 ；D369 ；E385L ；S388 ；V390I ；A394 ；N398 ；E402 ；K406 ；I428 ；S434 ；N437 ；E449Q ；Q474I ；A475 ；T482 ；S489 ；Y491 ；K530 ；N536 ；T540 ；T565 ；V674 ；R682 ；I867 ；E868 ;P870(其中通过与SEQ ID NO :2最佳比对来确定氨基酸位置)。以上列出的取代的有益组合包括在以上鉴定的位置中的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个位置处的取代的任何组合。本发明还提供了具有比野生型Cl Bgll蛋白更大的活性和/或热稳定性且具有由在严格条件下与SEQ ID NO : I的互补序列杂交(例如，在与SEQ ID NO : I精确互补的核酸的基本整个长度内)的核酸编码的氨基酸序列的分离的和/或重组的￠-葡糖苷酶多肽变体；其中该编码多肽在位置Q291、D369和E402中的每一个具有取代；以及在选自以下组成的组的位置处具有至少一个氨基酸残基取代I106、A109、Q119、T120、R132、Y135、M181、 Q215、A243、V246、Q258、A265、D274、N278、Q313、F314、G332、T357、D358、P374、E385、S434、N437、A475、S489、Y491、E493、K495、K497、S501、A503E、N504、A505、N521、K530、N536、T540、D566、T591、A601、K610、T611、R612、S614、L620、G628、T635、V638、V648、D650、S652、N670、R672、V674、S676、T685、T687、A689、Q690、T699、D703、K708、Y715、A732、E742、L757、V775、1777和D781(其中通过与SEQ ID NO :2最佳比对来确定氨基酸位置)。以上列出的取代的有益组合包括在以上鉴定的位置中的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、
18、19、20、21、22、23、24或更多个位置处的取代的任何组合。本发明还提供了具有比WT Cl Bgll蛋白更大的活性和/或热稳定性且具有由在严格条件下与SEQ ID NO : I的互补序列杂交(例如，在与SEQ ID NO : I精确互补的核酸的基本整个长度内)的核酸编码的氨基酸序列的分离的和/或重组的￠-葡糖苷酶多肽变体；其中该编码多肽在位置 Q258、Q291、Q313、D369、E402、S434、A475、K495 和 G628 中的每一个具有取代；以及在选自以下组成的组的位置处具有至少一个氨基酸残基取代A4、A15、E21、S22、K24、V25、H26、Q27、P29、L30、N45、D47、Q55、S58、A79、Q85、I106、A109、Q119、Y135、A136、P161、V175、G180、G202、G216、I221、L237、D244、V253、V260、L275、D311、F314、A343、D358、E360、Q381、E385、A394、A404、A405、K421、1428、P436、N437、M454、D470、R476、A477、Q479、T482、Y491、E493、E494、T496、S501、A505、N536、V559、V562、N588、S604、R612、G616、A617、G626、N627、F634、D646、D650、S652、R672、V673、T685、T687、A689、Q690、K708、Y715、Q716、A732、A748、D751、L757K、S764、R769、V775、T777、T783、T785、S787、S799、P806、K807、R817、E819、E822、T823、V840、V846、I847、S848、Y850、K866 和 P870(其中通过与 SEQID NO :2最佳比对来确定氨基酸位置)。以上列出的取代的有益组合包括在以上鉴定的位置中的任何 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 或更多个位置处的取代的任何组合。本发明还提供了具有比野生型Cl Bgll蛋白更大的活性和/或热稳定性且具有由在严格条件下与SEQ ID NO :1的互补序列杂交(例如，在与SEQ ID NO 1精确互补的核酸的基本整个长度内)的核酸编码的氨基酸序列的分离的和/或重组的￠-葡糖苷酶多肽变体，其中该编码多肽具有选自以下组成的组的至少一个氨基酸残基取代K57R;A88S ；I106V ；N112V ；Q119E/L ；T120M/Y/V/H ；A123N ；R132K/G/ff ；Y135I/Q/M ；A136E ；A141F ；K142R ；L149Q/M ；G158D ；P161S ；P172A ；T177I ；I179M ；G180E ；M181Y ；S182L/ff ；E183G/M/Q/K ；K186R ；A197V ；G202M/V ；Y219V ；N220Y/S/L ；S222Q/E ；T224N ；I229M ；M234E/I ；F242L ；A243V ；V246L ；Q258N ；D274Y/N ；V286I ；Q291ff/A/F ；Q313M ；V318E ；A343V/T ；T354Q ；T357L/P ；D358K/N ；E360R/A/D ；P374Y ；I375V ；A378K/T ；Q381V/D/I/L ；D369Q/L/Y/C/A/I/P/E/K/R/F/M/H/V ；E385L ；S388ff/C ；V390I ；A394G/V/L/P/Q ；N398G ；E402N ；K406D ；I428V ；S434P ；N437F/Y/D/L/W ；E449Q ；Q474I ；A475F/Y/H/ff/C ；T482A ；S489L ；Y491H/F ；K530M/G ；N536K ；T540K ；T565A/G/P ；V674I ；R682ff ；I867M ；E868R ;P870S (其中通过与 SEQ ID NO :2最佳比对来确定氨基酸位置)。以上列出的取代的有益组合包括在以上鉴定的位置中的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25 或更多个位置处的取代的任何组合。本发明还提供了具有比野生型Cl Bgll蛋白更大的活性和/或热稳定性且具有由在严格条件下与SEQ ID NO : I的互补序列杂交(例如，在与SEQ ID NO : I精确互补的核酸 的基本整个长度内)的核酸编码的氨基酸序列的分离的和/或重组的P-葡糖苷酶多肽变体，其中该编码多肽具有取代Q291W、D369H/L/R/Y和E402N ;且具有选自以下组成的组的至少一个氨基酸残基取代A109S、A243V、A265S、A475C/F/L/W、A503E、A505C、A601T、A689I、A732G/M、D274Y、D358E/K/N、D369H/L/R/Y、D566G、D650F/V、D703K、D781N、E385L、E402N、E493A/V/Y、E742G、F314V、G332D、G628L/V/W、1106V、K495F/H/I/N/Q/V、K497R、K530C/D/E/I/M/N/V、K610S、K708F、L620M、L757K、M181Y、N278Y、N437D/F/I/K/L/V/W/Y、N504Y、N521C、N536K、N670D、P374Y、Q119E、Q215E/M、Q258H/N、Q291W、Q313M、Q690A/K/R、R132H、R612H/P、R672A/D/F/G/I/S/T/V、S434P、S489I/L/N/T、S501H/N/R、S614A/C/D/H/L/R/V/Y、S652D、S676C、S764F、T120H/Y、T357A、T540K、T591A/C/R、T611A/H/Q、T635A/I/V、T685V、T687C/F/K/L/M/W/Y、T699L、T777N、T779S、V246I、V638E/R/S、V648W、V674M、V775C、Y135Q、Y491F/H/L和Y715P(其中通过与SEQ ID NO :2最佳比对来确定氨基酸位置)。以上列出的取代的有益组合包括在以上鉴定的位置中的任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、
19、20、21、22、23、24、25或更多个位置处的取代的任何组合。本发明还提供了具有比野生型Cl Bgll蛋白更大的活性和/或热稳定性且具有由在严格条件下与SEQ ID NO : I的互补序列杂交(例如，在与SEQ ID NO : I精确互补的核酸的基本整个长度内)的核酸编码的氨基酸序列的分离的和/或重组的￠-葡糖苷酶多肽变体，其中该编码多肽在位置 Q258N、Q291W、Q313M、D369R、E402N、S434P、A475L、K495N 和G628W处具有取代；且具有选自以下组成的组的至少一个取代A4V、A15V、A109S/T、A136L、A343C、A394G、A404S、A405T、A477G、A505C、A617V、A689I、A732G/M/S、A748T、A79E/G/M、D244H、D31IN、D358K、D470N、D47I、D646N、D650F/N/Y、D751N、E21Q/R、E360D、E385L、E493A/V/Y、E494K、E819A/L/V、E822A/G/K/M、F314L/V、F634A、G180E、G202M、G216L、G616D、G626D、H26R、1106V、I221V、I428V、I847T、K24G/L/T、K421R、K708F、K807R、K866I/Q、L237Y、L275Y、L30K、L757K、M454E、N437W、N45H、N536K、N588F、N627H、P161S、P29M/Q/R、P436E/Q、P806L、P870S、Q119E、Q27H/R、Q381V、Q479R、Q55R、Q690A/H/K、Q716R、Q85N、R476Q、R612H、R672G、R769H、R817P、S22L/R、S501C/R、S58G、S604I、S652D、S764F、S787G、S799N、S848N、T482A、T496A、T685V、T687C/K/M、T777N、T783H/Q、T785L、T823K、V175A、V253F、V25A/G/R、V260G/L、V559T、V562C/L、V673A、V775C、V840I、V846F、Y135M/Q、Y491F、Y715P、Y850H/Q(其中通过与SEQ ID NO :2最佳比对来确定氨基酸位置)。以上列出的取代的有益组合包括在以上鉴定的位置中的任何 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或更多个位置处的取代的任何组合。在某些实施方案中，该Cl Bgll蛋白具有取代Q258N、Q291W、Q313M、D369L、E402N、S434P、A475L、K495N 和 G628W。应理解本发明的Bgll变体可包括除以上列出的氨基酸取代以外的另外的氨基酸取代(例如，另外的保守性取代)并且与野生型Cl Bgll蛋白相比可小于全长。因而，本发明的Bgll变体可包括相对于SEQ ID NO 2的残基20-870的插入或缺失(例如，在氨基端和/或羧基端截短)。Cl Bgll蛋白的野生型分泌形式为约851个氨基酸长度；本发明的变体可比野生型更长或更短。为了举例说明且非限制，在一些实施方案中，变体可比野生型长度长或短达10%、有时达5%、有时达4%、有时达3%、有时达2%、有时达1%。
根据在以下文献中描述的方法进行变体的序列-活性分析，以鉴定具有可能对活性的最显著影响的取代W0 03/075129、2003年3月3日提交的USSN 10/379, 378 ;R. Fox等人，2003,〃 Optimizing the search algorithm for protein engineering by directedevolution, " Protein Eng. 16 (8) :589-597 以及R. Fox等人，2005, " Directed molecularevolution by machine learning and the influence of nonlinear interactions," J.Theor. Biol. 234(2) :187_199，其全部通过引用并入本文。本发明的某些￠-葡糖苷酶变体具有包括选自以下组成的组的至少一个氨基酸残基取代的氨基酸序列Q119E ；R132H ；Y135Q ；G180E ；G202M/V ；Q258N ；D274Y ；Q291ff/A/F ；D358K/N ；D369L/Y/V/A/H/R/F/E/M/1/K/C/P/Q ；P374Y ；E385L ；A394L ；E402N ；S434P ；N437F/D/L/W/Y ；Q474I ；A475F/Y/H/C/ff ；T482A ；S489L ；K530M ；N536K ；T540K,预测这些取代是增加3-葡糖苷酶活性的高度有益的取代。本发明的某些P -葡糖苷酶变体具有包括取代Q291W+D369L+E402N(如见于变体3)或取代Q291W+D369H/L/R/Y+E402N的氨基酸序列。在一些实施方案中，序列包括选自以下组成的组的至少一个氨基酸残基取代Q258N/H、D358K/N、I106V、E385L、D274Y、K495H/I/N/Q、Q119E、Y135Q、G628W、R132H、N437I、S501R、P374Y、N437V、S614A、Q313M、L369H、S434P、N437W/D和Y491F。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是Q258N。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是D358K或Q258H。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是I106V、E385L、D274Y或K495H。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是K495I/N、Q119E、Y135Q或D358N。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是G628W、R132H、K495Q、N437I、S501R或P374Y。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是N437V、S614A、Q313M、L369H、S434P、N437W/D或Y491F。预测这些取代是增加^-葡糖苷酶活性的高度有益的取代。本发明的某些0-葡糖苷酶变体具有包括取代0258队02911、031311、03691 、E402N、S434P、A475L、K495N 和 G628ff(如见于变体 269)和选自由 Y715P、S764F、E385D/L、A732G/M、A689I、A109T、T687M/C/K、L757K、Q381V/D、A109S、T777N、I106V、T823K、Q716R、V846F、T685V、T687K、D650Y、F314V/L、S652D和I428V组成的组的至少一个氨基酸残基取代
的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是Y715P。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是S764F、E385L、A732G、A689I、或A109T、或E285D。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是T687M、A732M或L757K。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是 Q381V、A109S、I777N、I106V、T823K、T687C 或 Q716R。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是V846F、T685V、T687K、D650Y、F314V/L、S652D、Q381D或I428V。预测这些取代是增加3 _葡糖苷酶活性的高度有益的取代。本发明的某些0-葡糖苷酶变体具有包括取代0258队02911、031311、03691 、E402N、S434P、A475L、K495N、G628W、A689I 和 Y715P (如见于变体 481);或取代 258N、Q291W、Q313M、D369R、E402N、S434P、K495N、G628W、A689I 和 Y715P ；以及选自由 A79E/M/G、Q85N、I106V、A109S/T、V260G、F314L/V、A343C/G、A505C、T687K/W/C 和 A732G/M/V 组成的组的至少一个氨基酸残基取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是T687W。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是T687C或T687W、V260G、A343C、A732G或A109T。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是F314V/L、A732M/V、A109S或A343G。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是A79E、A505C、1106V或A79M/G。预测这些取代是增加￠-葡糖苷酶活性的高度有益的取代。 本发明的某些0-葡糖苷酶变体具有包括取代0471、0258队02911、0313114343(、D369R、E402N、A475L、S434P、K495N、G628W、T687K、A689I 及 Y715P (如见于变体 647)或取代 D47I、Q258N、Q291W、Q313M、A343C、D369R、E402N、S434P、A475L、K495N、G628W、T687W、A689I、及 Y715P ;或取代 D47I、Q258N、Q291W、Q313M、A343C、D369R、E402N、S434P、K495N、G628W、T687K/W/C、A689I 及 Y715P ;以及选自由 A79G/E/M、Q85N、V260G、L275Y、和 F314L/V、以及A732G/M组成的组的至少一个氨基酸残基取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是A79E、A79M、A79G、A732G、V260G或F314L。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是Q85N、F314V或A732M。预测这些取代是增加P _葡糖苷酶活性的高度有益的取代。本发明的某些￠-葡糖苷酶变体具有包括取代I106V、Q258N、V260G、Q291W、Q313M、F314L/V、D369R、E402N、S434P、K495N、G628W、A689I、Y715P 和 A732G (如见于变体664)以及选自由 D47I、A79G/E/M、A109T、A505C、A343C/G、T687W/C/K、N3iro 和 L275F 组成的组的至少一个氨基酸残基取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是A79E或A79G。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸是A109T、A79M、A505C或A343C。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸是了687胃、了687(、0471、了6871(川31 或A343G。预测这些取代是增加￠-葡糖苷酶活性的高度有益的取代。本发明的某些￠-葡糖苷酶变体具有包括选自以下组成的组的至少一个氨基酸残基取代的氨基酸序列1106V ；A123N ；G180E ；M181Y ；M234E ；Q258N ；Q291ff/F/A ；T357L/P ；D358K ；E360D ；D369L/V/C/Y/R/K/M/A/H/E/F/Q/P/I ；P374Y ；E385L ；A394G ；N437D/L ；T482A ；S489L ；K530M ；N536K ;T540K，预测这些取代是增加热稳定性的高度有益的取代。本发明的某些0 -葡糖苷酶变体具有包括取代Q291W、D369H/L/R/Y和E402N ；以及选自由 Q313M、Q258N/H、N536K、Q119E、S489I/N/L/T、T120Y、K495N/V/I/H/Q、I106V、T120H、N437I/D/W/F/K/L/V/Y、E385L、M181Y、D274Y、S434P、S501R、T591C、Y135Q、Y491H/F、T540K、N521C、T591R、G628W和A475L组成的组的至少一个氨基酸残基取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是Q313M或Q258N。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是N437I、K495N、Q258H或N536K。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是 Q119E、S489I、T120Y、K495V、S489L、I106V、T120H 或 N437D。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是N437W、K495I、N437F、E385L、K495H、N437K、N437L、S489T、M181Y、D274Y、S434P或N437V。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是S501R、T591C、Y135q、Y491H、R491F、T540K、N521C、T591R、K495K、G628W、N437Y、S489N 或A475L。预测这些取代是增加热稳定性的高度有益的取代。本发明的某些￠-葡糖苷酶变体具有包括取代Q258N、Q291W、Q313M、D369R、Q381V、E385L、E402N、S434P、A475L、K495N 和 G628W ；以及选自由 S764F、Y715P、E385L/D、A732G/M、A109T/S、T687M/C/K、T777N、I106V、L475A、F314V、D650Y、L757K、Q716R、T685V 或F314L组成的组的至少一个氨基酸残基取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是S764F或Y715P。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是E385L或A732G。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是A109T或T687M。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是T777N、I106V、! 732M、T687C、T687K、E385D、L475A或A109S。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是P720P、F314V、D650Y、 L757K、Q716R、T685V或F314L。预测这些取代是增加热稳定性的高度有益的取代。本发明的某些￠-葡糖苷酶变体具有包括取代Q258N、Q291W、Q313M、D369R、E402N、S434P、A475L、K495N、G628W、A689I 和 715P (如见于变体 481);以及选自由 D47I、A79E、Q85N、I106V、A109S/T、V260G、L275Y、F314L/V、A505C、T687W/C/K 和 A732G/M/V 组成的组的至少一个氨基酸残基取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是T687K/W/C。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是I106V、V260G、F314V、A732G、A109T、F314L、A732M、Q85N或A109S。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸是F314、A732V、A505C、D47I、L275Y或A79E。预测这些取代是增加热稳定性的高度有益的取代。本发明的某些0-葡糖苷酶变体具有包括取代0471、0258队02911、0313114343(、D369R、E402N、S434P、A475L、K495N、G628W、T687K/W、A689I 和 Y715P (如见于变体 647);或取代 D47I、Q258N、Q29Iff,Q313M、A343C、D369R、E402N、S434P、K495N、G628W、T687K/W、A689I和 Y715P ；以及选自由 A79E/G/M、Q85N、V260G、L275Y、F314V/L、D395N 和 A732G 组成的组的至少一个氨基酸残基取代的氨基酸序列，预测这些取代是增加热稳定性的高度有益的取代。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是A79M、F314V或A79G。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是A79E、F314L、V260G、A85N、D395N或A732G。本发明的某些￠-葡糖苷酶变体具有包括取代I106V、Q258N、V260G、Q291W、Q313M、F314L/V、D369R、E402N、S434P、K495N、G628W、A689I、Y715P 和 A732G (如见于变体664)以及选自由 A109S/T、A79G/E/M、D47I、Q85N/H、L314V 和 T591I 组成的组的至少一个氨基酸残基取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是A109S、A79G、A109T或A79E。在一些实施方案中，至少一个取代的氨基酸残基是D47I、A79M、A85N或A85H。预测这些取代是增加热稳定性的高度有益的取代。本发明的某些￠-葡糖苷酶变体具有在选自以下组成的组的位置处包括至少一个氨基酸残基取代的氨基酸序列G180E ；Q258N ；Q291ff/A/F ；D358K ；D369L/Y/V/A/H/R/F/E/M/1/K/C/P/Q ；P374Y ；E385L ；N437D/L ；T482A ；S489L ；K530M ;N536K ;和 T540K,预测这些取代是增加热稳定性和3-葡糖苷酶活性两者的高度有益的取代。本发明的某些0 -葡糖苷酶变体具有包括Q291W、D369H/L/R/Y和E402N ；以及选自以下组成的组的至少一个氨基酸残基取代的氨基酸序列Q258N/H、I106V、E385L、D274Y、K495H/I/N/Q、Q119E、Y135Q、G628W、N437I/V/W/D、S501R、Q313M、S434P 和 Y491F，预测这些取代是增加热稳定性和3-葡糖苷酶活性两者的高度有益的取代。本发明的某些￠-葡糖苷酶变体具有如下氨基酸序列所述氨基酸序列包括Q258N、Q291W、Q313M、D369R、E402N、S434P、A475L、K495N 和 G628W ;或 Q258N、Q291W、Q313M、D369R、E402N、S434P、K495N 和 G628W ;以及选自由 S764F、Y715P、E385L/D、A732G/M、A109T/S、T687M/C/K、I777N、I106V、F314V、D650Y、L757K、Q716R、T685V 和 F314L 组成的组的至少一个氨基酸残基取代。预测这些取代是增加热稳定性和3-葡糖苷酶活性两者的高度有益的取代。

本发明的某些￠-葡糖苷酶变体具有包括Q258N、Q291W、Q313M、D369R、E402N、S434P、A475L、K495N、G628W、A689I 和 715P(如见于变体 481)；以及选自由 A79E、Q85N、T687K/W/C、I106V、A109T/S、V260G、F314V/L、A505C 和 A732G/M/V 组成的组的至少一个氨
基酸残基取代的氨基酸序列。预测这些取代是增加热稳定性和3-葡糖苷酶活性两者的高度有益的取代。本发明的某些￠-葡糖苷酶变体具有包括D47I、Q258N、Q291W、Q313M、A343C、D369R、E402N、S434P、A475L、K495N、G628W、T687K/W、A689I 和 Y715P (如见于变体 647);或D47I、Q258N、Q291W、Q313M、A343C、D369R、E402N、S434P、K495N、G628W、T687K/W、A689I 和Y715P ；以及选自由 A79E/G/M、Q85N、V260G、F314V/L、A732G 和 L275Y 组成的组的至少一个氨基酸残基取代的氨基酸序列。在一些实施方案中，取代的氨基酸残基是A79E、A79M、A79G、Q85N、V260G、F314V、F314L或A732G。预测这些取代是增加热稳定性和P -葡糖苷酶活性两者的高度有益的取代。本发明的某些￠-葡糖苷酶变体具有包括取代I106V、Q258N、V260G、Q291W、Q313M、F314L/V、D369R、E402N、S434P、K495N、G628W、A689I、Y715P 和 A732G (如见于变体664)以及选自由D47I、A79E/M/G和A109T组成的组的至少一个氨基酸残基取代的氨基酸序列，预测这些取代是增加热稳定性和3-葡糖苷酶活性两者的高度有益的取代。值得注意地，许多具有优异活性和/或热稳定性的变体包括在位置369处的取代，其中14个不同的可选(S卩，非天冬氨酸)残基出现在有益变体中。预测在位置369处的取代增加活性和/或热稳定性。因而，在一方面，本发明提供了包含与野生型Cl ￠-葡糖苷酶(Bgll) (SEQ ID NO :2的残基20-870)至少约70%相同的氨基酸序列的分离的和/或重组的￠-葡糖苷酶多肽变体，其中在位置369处的氨基酸不是天冬氨酸。在一些实施方案中，在位置369处的氨基酸选自由Q、L、Y、C、A、I、P、E、K、R、F、M、H和V组成的组。在一些实施方案中，在位置369处的氨基酸是L (亮氨酸)，其表现为对3 -葡糖苷酶和热稳定性特别有益。许多具有优异活性和/或热稳定性的变体包括在位置291处的取代。预测在位置291处的取代增加活性和/或热稳定性。因而，在一方面，本发明提供了包含与野生型Cl^ -葡糖苷酶(Bgll) (SEQ ID NO 2的残基20-870)至少约70%相同的氨基酸序列的分离的和/或重组的￠-葡糖苷酶多肽变体，其中在位置291处的氨基酸不是谷氨酰胺。在一些实施方案中，在位置291处的氨基酸是W、A或F。在一些实施方案中，在位置369处的氨基酸是W(色氨酸)，其表现为对P -葡糖苷酶和热稳定性特别有益。许多具有优异活性和/或热稳定性的变体包括在位置402处的取代。预测在位置402处的取代增加活性和/或热稳定性。因而，在一方面，本发明提供了包含与野生型Cl^ -葡糖苷酶(Bgll) (SEQ ID NO 2的残基20-870)至少约70%相同的氨基酸序列的分离的和/或重组的P -葡糖苷酶多肽变体，其中在位置402处的氨基酸不是谷氨酸。在一些实施方案中，该氨基酸既不是谷氨酸也不是天冬氨酸。在一些实施方案中，该氨基酸不是谷氨酸、天冬氨酸或脯氨酸。在一些实施方案中，在位置402处的氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸或精氨酸。在一些实施方案中，在位置402处的氨基酸是天冬酰胺或谷氨酰胺。在一些实施方案中，在位置402处的氨基酸是N(天冬酰胺)，其表现为对￠-葡糖苷酶和热稳定性特别有益。在一些实施方案中，本发明的分离的和/或重组的￠-葡糖苷酶多肽变体与野生型Cl BglKSEQ ID N0:2的残基20-870)至少约70%相同并且包括选自 以下组成的组的取代组合M181Y+Q291W+E402N+S434P ；R132K+L149M+Q313M+D369L+E385L+N437D ；Q291W+D369L+E402N ；Y135I+Q258N+Q474I ；M181Y+Q291W+E360D+D369V+P374Y+T482A；Q258N+N437F+S489L+Y491H ；Q119E+Q258N+T357L+Q474I+S489L ；Q258N+D369R+S489L + Y491H ；N220Y + Q258N+T35 7L + D369R+Q474I+Y49IF ；M234E + V246L + D3 58K + D369L+N398G + K5 30M ；Y135Q + I229M + F242L+D369L + K530M ；D369Q+P374Y+E402N+T540K ；Y135Q+P172A+1179M+I229M+Q291A+D358K+D369L+N398G ；R132K+D369L+E385L ；Y135M+1179M+Q291A+D358K+D369L ；Q291ff+P374Y+E402N+S434P ；Ql 19E + N220Y + Q258N + T357L + S489L ； 1179M+Q291A + D3 58K+D369L + I37 5V + S388ff ；Q291ff+D369C ；R132K + T354Q + D369L+N437L ；Q29 1A+D369L + N398G + K530M ；Q119E+Q258N+D274Y+S489L ；Q119E+N220Y+Q258N+Q474I+S489L；M181Y+D369L ；T120M+S222E+Q313M+T354Q+D369L+E385L ；A4G+Q258N+D274Y+T357L+N437ff+Q474I+Y491H ；R132G+D369L+N437D ；S182L+Q313M+D369L+E385L ；R132G+D369L+E385L ；N112V + D358K + D369L + S388W + K530M ；I106V + G180E + D369L + Q38 1V ；I179M+Q291A+D369L ； 1179M+D358K+D369L+S388W ；M234E+Q291A+D369L+N398G ；1179M + Q2 91A + D3 5 8K + D36 9L + Q3811 ； Y I 35Q + N220L + Q29 IA + D369L + N398G ；Y135I+D369L ； S I 82L + D369L + E385L + N437L ； T I 20Y + R I 32K + D369L + N437D ；M2 34E + D3 69L + S3 88W + N3 98G + K5 3 0M ； Y I 35M+11 79M + D369L + V390 I+K53OM ；L149Q+A197V+Q313M+D369L ；T120M+R132K+D369L+N437L ；T120M+R132ff+L149M+Q313M+T354Q+D369L+E385L+N437D ；A4G+Y135I+N220Y+Q258N+T357P+N437Y ；D358K+D369L+S388ff ；Q258N+D274Y+N437F ；D369L+S434P+T540K ；G158D+I179M+Q291A+D358K+D369L+I375V+N398G+K530M ；Y135I+D274Y+D369R ；Q258N+D369L+Q474I + S489L+Y491F ；R132W+S182W+D369L+E385L ；S182L+T354Q+D369L+E385L ；S222Q+T354Q+D369L+E385L+N437D+T565G ；Y135M+P161S+Q291A+A343T+D369L+I375V+K406D ；Q291ff+D369C+T540K ；D369L+P374Y+E402N ；Y135I+A343V+D369F+S489L ；M234E+D358K+D369L+S388ff ；T120M + L149Q + D369L + E38 5L ； Q3 I 3M + D369L + E385L ； T I 20Y + D369L + E385L ；D369L+N437D+T565A ；N112V+Q291A+D369L+I375V ；R132ff+L149Q+Q313M+T354Q+D369L ；Y135M+D369L+I375V+N398G ；D369L+E385L ；T120M+S182L+Q313M+T354Q+D369L+E385L ；T177I+Q291ff+P374Y+T482A ；Q258N+N437F ；T120V+R132W+D369L+T565G ；N112V+Q291A+D358N+D369E+S388C+K406D ；Q291A+D358K+D369L+S388ff+K406D ；1106V+E360R+D369L+Q381V；M234E+Q291A+D369L+S388ff+N398G ；L149M+Q313M+D369L ；M2 34I+Q2 91W + E3 60D + D36 9V + T48 2A ； T I 20V + T354Q + D3 6 9L + E3 85L + T565P ；M234I+Q291W+E360D + S434P ；D369Y+I867M+E868R ；R132ff+S182L+Q313M+D369L ；M234I+Q29 1W+P374Y+T482A ；Y2 19V+M234I+D369C+P374Y+S434P ；S182L + Q3 13M + D369L + E38 5L + N43 7L ；M234E + D358K + D369L + S388ff+ K53OM ；R132G + S222E + D369L + E385L ； R I 32K + L I 49M + S I 82L + D369L + N437L ；T120H+Q313M+D369L ；R132ff+D369L ；D369L+P374Y ；N112V+N220L+Q291A+D369L+S388W+N398G；Q291A+D369L+I375V+K530G ；R132K+L149M+S182L+T354Q+D369L+N437D+T565G ；T120H+S222E+Q313M+D369L+N437D+T565G ；A123N+Q291W+T482A+T540K ；S222E+Q313M+T354Q+D369L+E385L；R132ff+D369L+T565G ；G202M+E360A+D369I+A394L ；R132G + S222Q+Q313M+D369L ；R132ff+L149M+D369L ；L149M+Q313M+T354Q+D369L ；Q119L+G202M+D369L ；M181Y+M234I+D369C ； 1179M+N220L+Q291A+D369L+I375V ； S222E+Q313M+D369L+E385L+N437L ； 1179M+M234E+D358K+D369L+S388W+N398G ；A123N+Y219V+Q291W+E360D+P374Y+S434P；D369L+E402N ；D369L ；Y219V+M234I+Q291ff+T482A ；Q291W + E360D + S434P ；D369L + S434P ；G180E + E360R+D369L ；Al23N+M181Y + Q291W+D369K + S434P + T540K ； Q119E + T357L + D369M + S489L ； Q119E + D369F + Y49IH ；Ql19L + D369L ； Q 11 9E + N220Y + V286 I+ S489L ； Q291A + D369L + Q38 11 ；A475F ；D369L + N536K ；Q 119E + YI 35 I+D369H ；Q258N + S489L ；Q I I9E + YI 35 I+N437Y ；Q119E+Y135I+N437F+Y491F ；Q119L+D369L+A394V ；E183G+E360A+D369L+I428V ；D369L+E449Q+N536K ；Q119L+G202M+E360A+A475F ；I106V+D369L ；Y135I+D369M ；M234I+D369C + S434P ；D369L + A475Y ； Q 11 9E + YI 35 I+ S489L ；D369Y + N536K ；E360R+D369L ；G202V+A475H ；D369L+Q381V+N536K ；N220Y+Q258N+S489L+Y49IF ；Q258N+T357L+D369M ；I179M+Q291A+D369L+Q381L+S388ff+N398G ；D369Y+A394G+N536K ；Q291W+E360D+D369V+P374Y ；T120M+L149Q+T354Q+D369L+E385L ；S489L+Y491H ；N220S+Q291F+D369L ；D369C+S434P+T540K ；V318E+D369L+I428V ；E183M+G202M+E360A+D369L+A378K+A394V ；A394G+N536K ；Q291ff+T540K ；N220L+Q291A+D369L+Q381L+S388W+K530M ；T120V+R132ff+E385L+N437D ；Q119L+E360A+D369L+A378K ；D369A+N536K ；G202V+D369L+A475H ；Q381V+A475Y+N536K ；S434P ； 1106V+G180E+D369Y+A394G ；G180E + Q381V + A475H ； Q 11 9E + N220Y + Q474 I ； 1106V + D369Q ；A475Y + N536K ；K142R + Y219V + Q291W + S434P + V674I ； L I 49Q +S I 82L + Q3I3M + D369L + N437L ；N112V+I179M+M234E+D369L+N398G ；E360A+D369L+A378K ；E360R+D369Y+N536K ；E360R+D369A+Q381V+N536K；D369L+Q381D ；N437F+S489L ；E183M+G202M+V318E+D369I +A394L+I428V；E360D+D369L+E402N+S434P ；Q119L+A141F+G202M+A394L+I428V+A475F ；T357L+D369R+S489L+Y491H；Y135I+Q258N+T357L ；K142R+Q291ff+E360D+D369C+E402N ；E183M + A243V + D369L + A3 78K + A47 5F ； R I 32K + L I 49M + E 3 8 5L ；D369Y ；M234I+E402N+S434P ；N437Y ；Q119E+N437F ；N536K ；Q119L+E183Q+G202M+D369P ；N112V+I179M+Q291A+D358K+K406D ；A123N+Q291W+T540K ；D369I+A394L + I428V ；A88S+N536K；Q119E+Y135I+N437F ；A141F+G202M+E360A+D369P+A378K ；A123N+T482A ；Q313M+N437D ；E360R+D369Y ；E183M+G202M+A475F；Q 119L+E360A+A394V+A475F ；D369L+A378K ；E360R+D369L+A394G ；M181Y+D369E + S434P ；D369I ；N112V+Y135Q +I375V+K406D+K530M+P870S ；Q119E+Y135I+N220Y+Q258N ；D369P+A394V+I428V ；V318E + D369L ；K186R + N536K ； Q 11 9L + D369L + A378K ； M2 34 I+D369K + S434P ；N112V+I179M+N220L+Q291A+Q381I+S388W+N398G ；E402N+S434P ；Q119L+A141F+G202M+A394Q ；Q313M+T354Q+N437D ；N112V+M234E+D369L+I375V+K406D ；Q119E+A136E+N220Y ；Q381D+A394G+N536K ；Q119L+E183G+D369Q+A378T+V390I ；Y135I+T357L+Q474I+S489L+Y491F ；D369E+A394P+I428V ；N112V+Q291A+Q381I+N398G ；E360R+N536K ；E360D+D369C ；R132ff+S 182L+E385L ；1179M+Q291A+D358K+N398G+K530G ；N220Y+Q258N+T357L ；T224N+D274Y+T357L+N437F ；N437D ；M234I+E360D+T482A ；A141F+G202M+D274N+V318E+E360A+I428V ；D369Q ；N112V+N220L+D358K+D369L+I375V+Q381I+N398G ；Y135I+D369F ；A243V+V318E+E360A+A475W ；N220L+D369L+Q381L+S38 8W+N398G+K530G ；S489L ；K142R+Y219V ；Y135I+N220Y+Y491F ；S182ff+T354Q+E385L；I179M+D358K+S388W ；L149M+Q313M+T565P ；R132G+E385L ；V318E ；Q119L+E183K ；R132W+E385L ；E183G+V318E+E360A+A394Q+A475C ；E183M+G202M+E360A ；A394G ；D369P ；Y135M + Q291A + S388ff + N398G ；Y219V + D369C ；A394V + I428V ；Q119L ；Y135I ；E360R + D369Q + Q381D + N5 36K ； N22OL + M234E + Q29 IA +1 375V + K53OM ；Q119L+G202M+E360A；N220Y+Q258N+D369R ；M181Y+M234I+Q291W+E402N ；A394V ；T120M+L149Q+Q313M ；Q119L+V318E+I428V ；E360R+Q381V ；K57R+G202M+E360A+A394V ；I179M+D358K+I375V+Q381L ；E360A ；I179M+R682ff ；E360A+I428V ；和 D369K+P374Y(其中通过与SEQ ID NO 2最佳比对来确定氨基酸位置)。在一些实施方案中，本发明的分离的和/或重组的P -葡糖苷酶多肽变体与野生型Cl BglKSEQ ID NO 2的残基20-870)至少约70%相同并且包括选自以下组成的组的取代组合I106V+Q258N+Q291W+D369L+E402N+S434P ；I106V+Y135Q+Q258N+Q291ff+Q313M+D369H+E402N+K495N+G628W ；Q258N+Q291ff+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628ff ；I106V+Q258N+Q291W+Q313M+D369H+E402N+S434P+A475C+K495I+T540K+G628W ；I106V+Q258N+Q291W+D369R+E402N+S434P+K495H+G628L ；D274Y+Q291ff+D358K+D369L+E385L+E402N+N437I+S489N ；Q258N+Q291ff+Q313M+D369H+E402N+S434P+T540K ；1106V+Q258N+Q291W+D369L+E402N+S434P+A475F+K495H+G628V ；Q258N+Q291ff+Q313M+D369L+E402N+S434P+A475C+K495I+G628W ；I106V+Y135Q+M181Y+Q258N+Q291ff+Q313M+D369L+E402N+S434P+K495N ；Y135Q+Q258N+Q291W+D369L+E402N+K495N ；Q119E+D274Y+Q291ff+D358K+D369L+E385L+E402N+N437V+S489N+S614A ；Y135Q+Q258N+Q291ff+Q313M+D369L+E402N+S434P+A475F+K495N+G628V ；R132H+Q258N+Q291W+D369Y+E402N+K495Q ；Y135Q+Q258N+Q291ff+D369L+E402N+S434P+A475F+K495H ；Y135Q+Q258N+Q291W+D369R+E402N+S434P+K495I4G628V ；I106V+M181Y+Q258N+Q291ff+D369L+E402N ；1106V+Q258N+Q291W+D369H+E402N+S434P+A475F+K495F+G628V ；Q258N+Q291ff+Q313M+D369L+E402N+S434P+G628V ；Q258N+Q291ff+D369L+E402N+A475F+K495I ；Q119E+D274Y+Q291W+D369L+E385L+E402N+N4371 ；Q258N+Q291ff+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L ；Q258N 6
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r-f , r-v r> r\n r\ , \ T/T , it -r r> ryTo. , t T I ry rr* 1TT T/-v/-, , r-v ^ rt r, -, T , kT/^/- T , ).-\ry r\T r-r , r~v r> r\n r\ , ).-[ r^nn r\ , it -r r> ryTo. , t T I ry rr* T Tf^Q291W+D369L+E402N+V648W ；Q291ff+D369L+E402N+D650V ；Q291ff+D369L+E402N+V674M ；Q291W+D369L+E402N+V638E ； 1106V+Q291W+D369L+E402N ；Y135Q+Q291ff+D369L+E402N ；Q291W+D369L+E402N+S764F ；Q291ff+D369L+E402N+E493A+N504Y+A505C+N521C+T591A+R612P ；Q291ff+D369L+E402N+S489N+K495Q+S501R+K530N+T611Q ；Q291ff+D369L+E402N+T685V ；I106V+Q291W+D369L+E402N+S434P+A475C+K495N+T540K ；Q119E+Q291ff+D358N+D369L+E402N+N437D+K530N+S614V ；Q291ff+D369L+E402N+T687K ；Q291ff+D369L+E402N+S652D ；Q291ff+D369R+E402N+A475F+K495Q+T540K+G628L ；Y135Q+Q291ff+D369L+E402N+G628V ；Q291ff+D369L+E402N + E493Y + A505C + N521C + T591A + L620M ; Q29 IW + D369L+ E4O2N +T687W ；Q291W+D369L+E402N+D650F ；Q291ff+D369L+E402N+T687C ；Q291W+D369L+E402N+S434P+K495N+G628V ；Q291ff+D369L+E402N+S501N ；D274Y+Q291ff+D369L+E402N+N437K+S489I+K530V+S614L ；Q291ff+D369L+E402N+T699L ；Q119E+V246I+Q291W+D358E+D369L+E402N+S614L ；Q291ff+D369L+E402N+N504Y+N521C+D566G+L620M+T635A ；Q291ff+D369L+E402N+E493Y+N504Y+D566G+T591A+R612P+L620M ；Q291ff+D369L+E402N+N536K+T591A ；Q291ff+D369L+E402N+Q690A ；Q291W+D358K+D369L+E402N+N437L+S489I+K530D ；Q119E+D274Y+Q291ff+D358E+D369L+E385L+E402N + N4 37V + S489N + K530M + S6 14H ; Q29 IW + D369L + P374Y + E4O2N +Y49 I L ； Q291W+D369L+E402N+S501R ；Q291ff+D369L+E402N+Y491L+N521C+N536K；Q291ff+D369L+E402N+E493Y+N504Y+N521C+T591C+R612P+L620M+T635V ；Q119E+Q291ff+D358N+D369L+E385L+E402N+N437I + S489I + S614L ； T I 20Y + Q29Iff+D369L + E402N + S50IR+N52 IC + D566G ；Q291W+D369L+E402N+Y491L+N52IC ；Q291W+D369L+E402N+Y491L+S501N+D566G+T59IA ；D274Y+N278Y+Q291W+D358E+D369L+E402N+N437Y+S489L+K530E ； 1106V+Q291W+D369L+E402N+S434P+A475W+K495F+T540K+G628V ；Q119E+Q291ff+D358N+D369L+E402N+N437Y+E742G ；Y135Q+Q291W+D369Y+E402N+A475F+K495F ；T120H+Q291W+D369L+E402N+Y491H+S501H+T59IC ；Q119E+Q291W+D358N+D369L+E402N+N437F+S489N+K530E+S614L ；Q119E+D274Y+Q291ff+D358N+D369L+E402N+N437I+S489N+K530V+S614Y ；T120Y+Q291ff+D369L+E402N+N521C+N536K ；Q291ff+D369L+E402N+Y491F+S501N+N521C+N536K+T59IR ；Q291W+D369L+E402N+S501N+N521C+D566G+T591R ；Q291W+D369L+E402N+Y491L+S501R+N536K+D566G+T59IR ；和 D274Y+Q291W+D358E+D369L+E402N+N437Y+S489N+K530I+S614L ；(其中通过与SEQ ID NO :2最佳比对来确定氨基酸位置)。在一些实施方案中，本发明的分离的和/或重组的￠-葡糖苷酶多肽变体与WT ClBglKSEQ ID NO :2的残基20-870)至少约70%相同并且包括选自以下组成的组的取代组合Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W ；Q258N+Q291ff+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P ；Q258N+Q291W+Q3I3M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+Y715P+T823K ；Q258N+Q291ff+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T685V+Y715P ； 1106V+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495讲G628W+S764F ；A109T+Q258N+Q291ff+Q313M+D369R+E402N+I428V+S434P+A475L+K495N+G628ff ；Q258N+Q291ff+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+Y491F+K495N+G628ff+Y715P ；Q258N+Q291W+Q313M+D369R+Q381V+E402N+S434P+A475L+K495N+S501R+G628W+Y715P ；Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+S764F ；Q258N+Q291ff+Q313M+D369R+E385L+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W ；Q258N+Q291ff+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495Lb
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,TT /~>T , L Try r\T r~f , \T r> r\ t~ r\ , TiT/"> x /"> TCx , H-Tr^ryJrii , k TXj1 < IT/^Tm.TT/^rAI'T, it r\ry r\r\ , kT/~ /^T-VT , r~v n ITTT, TT, k Try r\T91W+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+D751N ；G202M+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+N627H+G628W+T687K+E822A ；Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+K866I ；Q258N+Q291ff+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T783Q ；Q258N+Q291ff+Q313M+D369L+E402N+S434P+A475L+K495N+G628ff ；Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+E493Y+K495N+A505C+G628W ；Q258N+Q291ff+Q313M+D3e9R+E402N+S434P+A475L+T482A+K495N+G628ff+D646N ；Q258N+Q291ff+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+A477G+K495N+G628W+S764F+S848N ；Q258N+Q291ff+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+I847T ；Q258N+Q291ff+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T685V+Y850Q ；Yl35M+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+S501R+G628W+T685V+T777N ；和 Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+Y850Q ；(其中通过与SEQ ID NO :2最佳比对来确定氨基酸位置)。在一些实施方案中，本发明的分离的和/或重组的￠-葡糖苷酶多肽变体与WT ClBglKSEQ ID NO :2的残基20-870)至少约70%相同并且包括选自以下组成的组的取代组合Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P ；D47I+Q2 58N+Q291W+Q313M+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T687K+A689I+Y715P ；A109S+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P ；A109T+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628ff+T687W+A689I+Y715P+S764F ；D47I+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T687C+A689I+Y715P+S764F ；Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P ；D47I+Q258N+V260G+Q291W+Q3I3M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T687C+A689I+Y715P ；D47I+A109T+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P ；Q258N+V260G+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T687W+A689I+Y715P ；Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A6891+Y715P+S764F 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IZA+1M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+S604V+G628W+A689I+Y715P+S764F ；S58G+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P+T785L ；K24G+A136L+Q258N+D274Y+Q291W+Q3I3M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+A505C+G628W+A689I+Y7I5P+T777N ;S58G+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+Q381V+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A6891+Y715P+T785L ；和 S58G+Q258N+Q291W+Q313M+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+A689I+Y715P+T785L+M816L ；(其中通过与SEQ ID NO :2最佳比对来确定氨基酸位置)。在一些实施方案中，本发明的分离的和/或重组的￠-葡糖苷酶多肽变体与WT ClBglKSEQ ID NO :2的残基20-870)至少约70%相同并且包括选自以下组成的组的取代组合D47I+Q258N+Q291W+Q313M+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T687K+A689I+Y715P ；D47I+A79G+Q85N+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T687K+A689I+Y715P+A732M ；D47I+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T687C+A689I+Y715P+A732G ；D47I+A79E+Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+A505C+G628W+T687W+A689I+ Y715P ；D47I+A79E+Q85N+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T687K+A689I+Y715P ；D47I+A79G+Q85N+Q258N+V260G+L275Y+Q291ff+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+A505C+G628W+T687C+A689I+Y715P+S764Y+R769H ；D47I+A79G+Q85N+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M^314V+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T687K+A689I+Y7I5P ；D47I+A79M+Q85N+Q258N+V260G+L275Y+Q291ff+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+A505C+G628W+T687K+A689I+Y715P ；D47I+A79M+Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+A505C+G628W+T687C+A6891+Y715P+A732G ；D47I+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+A505C+G628W+T687C+A689I+Y715P+A732G ；D47I+A79M+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+T687K+A689I+Y715P+A732G ；D47I+Q258N+L275Y+Q291W+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+T687K+A689I+Y715P+A732G ；D47I+A79E+Q85N+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+A505C+G628W+T687W+A689I+Y715P+A732V 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；D47I+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T687K+A689I+Y715P ；D47I+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+T687K+A689I+Y715P+A732V ；D47I+A79G+Q85N+Q258N+Q291ff+Q313M+A343C+D369R+E402N+S434P+P439S+A475L+K495N+G628W+T687K+A689I+Y715P ；D47I+Q85N+Q258N+Q291W+Q313M+F314V+A343C+D369R+D395N+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T687K+A689I+Y715P+A732V ；D47I+A79G+Q258N+Q291ff+Q313M+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+A505C+G628W+T687C+A689I+T693A+Y715P+T827I ；D47I+Q85N+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+A505C+G628W+T687K+A689I+Y715P+A732V #PD47I+A79G+Q258N+L275Y+Q291W+Q313M+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+A505C+G628W+T687K+A689I+T693E+N723G+A730S+Y855 ;(其中通过与 SEQ ID NO :2 最佳比对来确定氨基酸位置)。 在一些实施方案中，本发明的分离的和/或重组的￠-葡糖苷酶多肽变体与WT ClBglKSEQ ID NO :2的残基20-870)至少约70%相同并且包括选自以下组成的组的取代组合I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+A79E+Q85N+I106V+A109T+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+A79E+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+A505C+G628W+A689I+Y715P+A732G；A79M+Q85N+I106V+A109T+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+A79E+I106V+A109T+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+A79G+Q85N+I106V+A109T+Q258N+V260G+L275Y+Q291W+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A6891+Y715P+A732G ；A79E+Q85N+I106V+A109T+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；A79G+Q85N+1106V+A109T+Q258N+V260G+L275F+Q291W+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+A505C+G628W+T687C+A689I+Y715P+A732G ；D47I+I106V+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+A79E+Q85N+I106V+A109S+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+A79E+Q85N+I106V+Q258N+V260G+L275Y+Q291W+Q313M+F314L+N315D+D369R+E402N+S434P+K495N+A505C+G628W+T687W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+Q85N+I106V+Q258N+V260G+L275Y+Q291W+Q313M+F314L+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；A79E+Q85N+I106V+A109S+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；A79G+I106V+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+T687W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+A79G+Q85N+1106V+Q258N+V260G+L275Y+Q291W+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+A505C+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+Q85N+I106V+A109S+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+A79E+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+A79M+Q85N+1106V+Q258N+V260G+Q291W+Q3I3M+F3I4V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y7I5P+A732G ；D47I+I106V+A109T+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+A79G+Q85N+I 106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+D369R+E402N+S434P+K495N+A505C+G628W+A689I+Y715P+A732G ；A79M+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；A79M+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+A505C+G628W+A689I+Y715P+A732G ；A79M+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+A79G+Q85N+1106V+A109S+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A6891+Y715P+A732G ；A79E+Q85H+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+A79G+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314L+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；A79G+Q85N+1106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+A79E+Q85N+I106V+Q258N+V260G+L275Y+Q291W+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+I106V+A109T+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314V+D369R+E402N+S 434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；C8G+D47I+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314L+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；A79E+Q85N+1106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；A79G+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+A79G+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+T591I+G628W+A689I+Y715P+A732G ；Q85N+1106V+A109T+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；A79M+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；Q85N+I106V+A109S+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314L+D369R+E402N+S434P+K495N+A505C+G628W+A689I+Y715P+A732G ；I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+D369R+E402N+S434P+K495N+A505C+G628W+T687K+A689I+Y715P+A732G ；Q85N+I106V+A109T+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314V+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+Q85N+I106V+A109T+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314V+A343G+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+Q85N+1106V+A109T+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G；D47I+Q85N+I106V+A109S+Q258N+V260G+L275Y+Q291ff+Q313M+F314L+A343C+D369R+E4 02N+S434P+K495N+G628W+A6891+Y715P+A732G ；D47I+I106V+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314V +A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；1106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+I106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+Q85N+I106V+A109S+Q258N+V260G+L275Y+Q291ff+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+A475L+K495N+G628W+T687C+A689I+Y715P+A732G ；D47I+A79M+1106V+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；A79G+Q85N+I106V+A109S+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314V+D369R+E402N+S434P+K495N+A505C+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+A79E+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314L+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；Q85N+I106V+Q258N+V260G+L275Y+Q291ff+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+T687W+A689I+Y715P+A732G ；1106V+Q258N+V260G+L275Y+Q291W+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+Q85N+I106V+A109T+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314V+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；Q85N+I106V+A109S+Q258N+V260G+L275Y+Q291ff+Q313M+F314V+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；D47I+A79M+I106V+A109S+Q258N+V260G+Q291W+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G ；A79M+Q85N+I106V+Q258N+V260G+Q291ff+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+G628W+A689I+Y715P+A732G #PA79M+Q85N+I106V+Q258N+V260G+L275Y+Q291W+Q313M+F314L+A343C+D369R+E402N+S434P+K495N+A505C+G628W+A689I+Y715P+A732G(其中通过与SEQ ID NO 2最佳比对来确定氨基酸位置)。在一些实施方案中，变体包括选自以上示例(表2、3、4、5、6、7)的那些取代组合的取代组合并且还包括如下取代所述取代(a)不减少变体的活性或热稳定性，和(b)在以下组成的组中的任何另外的残基处不包括取代K57 ；A88 ；I106 ；N112 ；Q119 ；T120 ；A123 ；R132 ；Y135 ；A136 ；A141 ；K142 ；L149 ；G158 ；P161 ；P172 ；T177 ；I179 ；G180 ；M181 ；S182 ；E183 ；K186 ；A197 ；G202 ；Y219 ；N220 ；S222 ；T224 ；I229 ；M234 ；F242 ；A243 ；V246 ；Q258 ；D274 ；V286 ；Q291 ；Q313 ；V318 ；A343 ；T354 ；T357 ；D358 ；E360 ；D369 ；P374 ；I375 ；A378 ；Q381 ；E385 ；S388 ；V390 ；A394 ；N398 ；E402 ；K406 ；I428 ；S434 ；N437 ；E449 ；Q474 ；A475 ；T482 ；S489 ；Y491 ；K530 ；N536 ；T540 ；T565 ；V674 ；R682 ；I867 ；E868 ;和 P870。在一些实施方案中，本发明的分离的和/或重组的P -葡糖苷酶多肽变体与野生型Cl BglKSEQ ID NO :2的残基20-870)至少约70%相同并且包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于天然Cl Bgll至少6. 0至6. 9倍的活性改进，如表2中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于天然Cl Bgll至少5. 0至5. 9倍的活性改进，如表2中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于天然Cl Bgll至少4.0至4. 9倍的活性改进，如表2中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于天然Cl Bgll至少3. 0至3. 9倍的活性改进，如表2中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于天然Cl Bgll至少2. 0至2. 9倍 的热稳定性改进，如表2中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于天然Cl Bgll至少I. I至I. 9倍的热稳定性改进，如表2中所鉴定的。在一些实施方案中，本发明的分离的和/或重组的￠-葡糖苷酶多肽变体与野生型Cl BglKSEQ ID NO :2的残基20-870)至少约70%相同并且包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体3至少6. 0至6. 9倍的活性改进，如表3中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体3至少5. 0至5. 9倍的活性改进，如表3中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体3至少4. 0至4. 9倍的活性改进，如表3中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体3至少3. 0至3. 9倍的活性改进，如表3中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体3至少2. 0至2. 9倍的活性改进，如表3中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体3至少I. I至I. 9倍的活性改进，如表3中所鉴定的。在一些实施方案中，本发明的分离的和/或重组的P -葡糖苷酶多肽变体与野生型Cl BglKSEQ ID NO :2的残基20-870)至少约70%相同并且包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体269至少4. 0至4. 9倍的活性改进，如表4中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体269至少3. 0至3. 9倍的活性改进，如表4中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体269至少2. 0至2. 9倍的活性改进，如表4中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体269至少I. I至I. 9倍的活性改进，如表4中所鉴定的。在一些实施方案中，本发明的分离的和/或重组的P -葡糖苷酶多肽变体与野生型Cl BglKSEQ ID NO :2的残基20-870)至少约70%相同并且包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体481至少4. O至4. 9倍的活性改进，如表5中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体481至少3. O至3. 9倍的活性改进，如表5中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体481至少2. O至2. 9倍的活性改进，如表5中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体481至少I. I至I. 9倍的活性改进，如表5中所鉴定的。在一些实施方案中，本发明的分离的和/或重组的P -葡糖苷酶多肽变体与野生型Cl BglKSEQ ID NO :2的残基20-870)至少约70%相同并且包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体647至少4. 0至4. 9倍的活性改进，如表6中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体647至少3. 0至3. 9倍的活性改进，如表6中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体647至少2. 0至2. 9倍的活性改进，如表6中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选 自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体647至少I. I至I. 9倍的活性改进，如表6中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体647至少0. 6至I. 0倍的活性改进，如表6中所鉴定的。在一些实施方案中，本发明的分离的和/或重组的P -葡糖苷酶多肽变体与野生型Cl BglKSEQ ID NO 2的残基20-870)至少约70%相同并且包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体664至少3. 0至3. 9倍的活性改进，如表7中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体664至少2. 0至2. 9倍的活性改进，如表7中所鉴定的。在一些实施方案中，本发明的分离的和/或重组的P -葡糖苷酶多肽变体与野生型Cl BglKSEQ ID NO 2的残基20-870)至少约70%相同并且包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于天然Cl Bgll至少4. 0至4. 9倍的热稳定性改进，如表2中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于天然Cl Bgll至少3. 0至3. 9倍的热稳定性改进，如表2中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于天然Cl Bgll至少2.0至2. 9倍的热稳定性改进，如表2中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于天然Cl Bgll至少I. I至I. 9倍的热稳定性改进，如表2中所鉴定的。在一些实施方案中，本发明的分离的和/或重组的P -葡糖苷酶多肽变体与野生型Cl BglKSEQ ID NO 2的残基20-870)至少约70%相同并且包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体3至少3. 0至3. 9倍的热稳定性改进，如表3中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体3至少2. 0至2. 9倍的热稳定性改进，如表3中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体3至少I. I至I. 9倍的热稳定性改进，如表3中所鉴定的。
在一些实施方案中，本发明的分离的和/或重组的P -葡糖苷酶多肽变体与野生型Cl BglKSEQ ID NO 2的残基20-870)至少约70%相同并且包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体269至少2. 0至2. 0倍的热稳定性改进，如表4中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体269至少I. I至I. 9倍的热稳定性改进，如表4中所鉴定的。在一些实施方案中，本发明的分离的和/或重组的P -葡糖苷酶多肽变体与野生型Cl BglKSEQ ID NO :2的残基20-870)至少约70%相同并且包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体481至少4. 0至4. 9倍的热稳定性改进，如表5中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体481至少2. 0至2. 9倍的热稳定性改进，如表5中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体481至少I. I至I. 9倍的热稳定性改进，如表5中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体481至少 0. 6至I. 0倍的热稳定性改进,如表5中所鉴定的。在一些实施方案中，本发明的分离的和/或重组的P -葡糖苷酶多肽变体与野生型Cl BglKSEQ ID NO :2的残基20-870)至少约70%相同并且包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体647至少2. 0至2. 9倍的热稳定性改进，如表6中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体647至少I. I至I. 9倍的热稳定性改进，如表6中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体647至少0.6至1.0倍的热稳定性改进，如表6中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体647至少0. 2至0. 5倍的热稳定性改进，如表6中所鉴定的。在一些实施方案中，本发明的分离的和/或重组的￠-葡糖苷酶多肽变体与野生型Cl BglKSEQ ID NO 2的残基20-870)至少约70%相同并且包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体664至少I. I至I. 9倍的热稳定性改进，如表7中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体664至少0. 6至I. 0倍的热稳定性改进，如表7中所鉴定的。在一些实施方案中，本发明的分离的和/或重组的P -葡糖苷酶多肽变体与野生型Cl BglKSEQ ID NO 2的残基20-870)至少约70%相同并且包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于天然Cl Bgll的任何的活性和/或热稳定性改进，如表2中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体3的任何的活性和/或热稳定性改进，如表3中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体269的任何的活性和/或热稳定性改进，如表4中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体481的任何的活性和/或热稳定性改进，如表5中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体647的任何的活性和/或热稳定性改进，如表6中所鉴定的。在一些实施方案中，变体包括选自以下取代组合组成的组的取代组合所述取代组合显示相比于变体664的任何的活性和/或热稳定性改进，如表7中所鉴定的。如上所述，本发明包括的P -葡糖苷酶多肽具有对SEQ ID NO 2的残基20-870的至少约70%序列同一丨丨生。在一些实施方案中,本发明包括的P -葡糖苷酶多肽包括具有与SEQ ID NO :2的残基20-870至少约71%相同、至少约72%相同、至少约73%相同、至少约73%相同、至少约74%相同、至少约75%相同、至少约76%相同、至少约77%相同、至少约78%相同、至少约79%相同、至少约80%相同、至少约81%相同、至少约82%相同、至少约83%相同、至少约84%相同、至少约85%相同、至少约86%相同、至少约87%相同、至少约88%相同、至少约89%相同、至少约90%相同、至少约91%相同、至少约92%相同、至少约93%相同、至少约94%相同、至少约95%相同、至少约96%相同、至少约97%相同、至少约98%相同或至少约99%相同的氨基酸序列的￠-葡糖苷酶多肽。本文每次提及“70%”应理解成还可选地包括以上更高值中的任何一个。如上所述，本发明的Bgll变体可包括除以上列出的取代之外的另外的氨基酸取代，包括，例如具有在氨基酸序列中作出的一个或多个另外的保守性取代的变体。保守性取 代的实例是在下组内的取代碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)以及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸)。一般不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本领域已知的并且被例如札Neurath和R. L. Hill，1979，在"TheProteins, " Academic Press, New York中描述,将其通过引用并入本文。最常出现的交换是 Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和 Asp/Gly,以及这些对颠倒过来。本发明的￠-葡糖苷酶多肽变体的保守取代的变异包括用同一保守取代组的保守选择的氨基酸取代小百分比、通常少于5%、更通常少于2%、并且通常少于1%的多肽序列的氨基酸。不改变编码的￠-葡糖苷酶活性的序列的添加，诸如非功能性或非编码序列的添加被认为是￠-葡糖苷酶多核苷酸的保守变异。本发明还提供了具有P -葡糖苷酶活性和本文描述的至少一种取代的本文描述的葡糖苷酶多肽变体的酶活性片段。基于现有研究，相信Cl Bgll容忍截短(S卩，保留活性)。已观察到在N末端25个氨基酸位置中的每个位置具有与野生型不同的序列的ClBgll变体保留￠-葡糖苷酶活性(未显示)。类似地，在伊拉克固氮螺菌(Azospirillumirakense) 0 -葡糖苷酶(CelA)中容忍羧基末端处16个氨基酸残基的截短。参见USSN61/218，020，其通过引用并入本文。据此，本发明还提供了具有如下氨基酸序列的分离的或重组的P -葡糖苷酶多肽变体所述氨基酸序列具有相对于SEQ ID NO 2的从羧基(C-)末端、氨基(N-)末端、或二者的I至50个氨基酸残基的缺失(即，从N末端或C末端中任一个或二者的 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50 个氨基酸残基的缺失)。在某些实施方案中，缺失是从N末端的I至15个氨基酸残基和/或从C末端的I至40个氨基酸残基。这些￠-葡糖苷酶片段在本文还分别称为N末端截短的和或
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权利要求
1.一种￠-葡糖苷酶(Bgll)变体，所述Bgll变体具有对SEQ ID NO :2的氨基酸残基20-870的至少70%同一性并且包括参考SEQ ID NO 2所确定的在位置Q291处的氨基酸取代、在位置D369处的氨基酸取代和在位置E402处的氨基酸取代，其中在Q291处的取代是W、A或F ;在D369处的取代是L、Y、V、A、H、R、F、E、M、I、K、C、P或Q ;并且在E402处的取代是No
2.如权利要求I所述的Bgll变体，其中所述在位置Q291处的氨基酸取代是W并且所述在位置D369处的氨基酸取代是L、H、R或Y。
3.如权利要求2所述的Bgll变体，其中所述在位置D369处的氨基酸取代是L。
4.如权利要求I至3中任一项所述的Bgll变体，所述Bgll变体具有相比于包含SEQID NO 2的氨基酸20-870的天然Cl Bgll, a)在大约pH5和大约65°C至少5倍大的热活性，或 b)在大约pH5和大约65°C至少3倍大的热稳定性,或 c)(a)和(b) 二者。
5.如权利要求I所述的Bgll变体，所述BglI变体在选自由Q258、Q313、S434、A475、K495和G628组成的组的位置处还包括至少一个氨基酸取代。
6.如权利要求5所述的Bgll变体，其中在Q258处的取代是N或H，在Q313处的取代是M，在S434处的取代是P，在A475处的取代是L，在K495处的取代是N，并且在G628处的取代是W。
7.如权利要求6所述的Bgll变体，其中所述变体包括取代Q258N、Q291W、Q313M、D369R、E402N、S434P、K495N 和 G628W。
8.如权利要求1-3或5-7中任一项所述的Bgll变体，所述Bgll变体具有相比于ClBgll 变体 3 (SEQ ID NO 5)， a)在大约pH5和大约70°C至少6倍大的热活性，或 b)在大约pH5和大约65°C至少3倍大的热稳定性,或 c)(a)和(b) 二者。
9.如权利要求6所述的Bgll变体，其中所述变体在选自由A689和Y715组成的组的位置处包括至少一个取代。
10.如权利要求9所述的Bgll变体，其中所述取代是A689I或Y715P。
11.如权利要求10所述的Bgll变体，其中所述变体包括取代Q258N、Q291W、Q313M、D369R、E402N、S434P、K495N、G628W、A689I 和 Y715P。
12.如权利要求1-3、5-7或9-11所述的Bgll变体，所述Bgll变体具有相比于ClBgll变体 269 (SEQ ID NO 7), a)在大约pH4. 5和大约70°C至少4倍大的热活性，或 b)在大约pH4. 5和大约70°C至少2倍大的热稳定性，或 c)(a)和(b) 二者。
13.如权利要求10所述的Bgll变体，所述Bgll变体在选自由D47、A343和T687组成的组的位置处还包括至少一个氨基酸取代。
14.如权利要求13所述的Bgll变体，其中所述取代是D47I、A343C或T687W/K/C。
15.如权利要求14所述的Bgll变体，其中所述取代是T687K。
16.如权利要求14所述的Bgll变体，其中所述变体包括取代D47I、Q258N、Q291W、Q313M、A343C、D369R、E402N、S434P、K495N、G628W、T687K、A689I 和 Y715P。
17.如权利要求1-3、5-7、9-11或13-16中任一项所述的Bgll变体，所述Bgll变体具有相比于 Bgll 变体 481 (SEQ ID NO 9), a)在大约pH4. 2和大约70°C至少4倍大的热活性，或 b)在大约pH4. 5和大约70°C至少4倍大的热稳定性，或 c)(a)和(b) 二者。
18.如权利要求10所述的BglI变体，所述Bgl I变体在选自由1106、V260、F314和A732组成的组的位置处还包括至少一个氨基酸取代。
19.如权利要求18所述的Bgll变体，其中所述取代是I106V、V260G、F314L/V或A732G/M/V。
20.如权利要求19所述的Bgll变体，其中所述取代是F314L或A732G。
21.如权利要求19所述的Bgll变体，其中所述变体包括取代I106V、Q258N、V260G、Q291W、Q313M、F314L/V、D369R、E402N、S434P、K495N、G628W、A689I、Y715P 和 A732G。
22.如权利要求1-3、5-7、9-11、13-16或18-21中任一项所述的Bgll变体，所述Bgll变体具有相比于Cl Bgll变体481 (SEQ ID NO 9), a)在大约pH4和大约70°C至少2倍大的热活性，或 b)在大约pH4. 5和大约70°C至少I. I倍大的热稳定性，或 c)(a)和(b) 二者。
23.如权利要求19所述的Bgll变体，所述Bgll变体在位置D47、A79、Q85、A109或A343处还包括至少一个氨基酸取代。
24.如权利要求23所述的Bgll变体，其中所述至少一个氨基酸取代是D47I、A79E/G/M、Q85N/H、A109S/T 或 A343C。
25.如权利要求24所述的Bgll变体，其中所述变体包括氨基酸取代D47I、A79E、Q85N、I106V、A109T、Q258N、V260G、Q291W、Q313M、F314V、A343C、D369R、E402N、S434P、K495N、G628W、A689I、Y715P 和 A732G。
26.如权利要求24所述的Bgll变体，其中所述变体包括氨基酸取代D47I、Q85N、I106V、A109S、Q258N、V260G、Q291W、Q313M、F314V、A343C、D369R、E402N、S434P、K495N、G628W、A689I、Y715P 和 A732G。
27.如权利要求24所述的Bgll变体，其中所述变体包括氨基酸取代D47I、A79M、I106V、Q258N、V260G、Q291W、Q313M、F314L、D369R、E402N、S434P、K495N、G628W、A689I、Y715P和 A732G。
28.如权利要求1-3、5-7、9-11、13-16、18-21或23-27所述的Bgll变体，所述Bgll变体具有相比于Cl Bgll变体664 (SEQ ID NO: 13)， a)在大约pH4和大约70°C至少2倍大的热活性，或 b)在大约pH4. 5和大约70°C至少I. I倍大的热稳定性，或 c)(a)和(b) 二者。
29.如权利要求1-3、5-7、9-11、13-16、18-21或23-27中任一项所述的Bgll变体，其中所述变体具有对SEQ ID NO :2的残基20-870的至少75%同一性、或至少80%同一性、或至少85%同一性、或至少90%同一性、或至少95%同一性。
30.如权利要求29所述的Bgll变体，所述Bgll变体长度为851个氨基酸残基。
31.一种￠-葡糖苷酶(Bgll)变体，所述Bgll变体包括SEQ ID NO:5、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO 13,SEQ ID NO : 15、SEQ ID NO : 17、SEQ ID NO :19 或 SEQ ID NO:21的氨基酸残基20-870。
32.—种P -葡糖苷酶(Bgll)变体，所述Bgll变体具有对SEQ ID NO 2的氨基酸残基20-870的至少70%同一性、或至少75%同一性、至少80%同一性、至少85%同一性、或至少90%同一性、或至少95%同一性并且包括参考SEQ ID NO :2所确定的在位置Q291处的氨基酸取代，其中所述取代是W、A或F ;并且进一步地，其中，相比于包括SEQ ID NO:2的氨基酸20-870的天然Cl Bgl I，所述变体具有 a)在大约pH5和大约65°C至少5倍大的热活性，或b)在大约pH5和大约65°C至少3倍大的热稳定性,或 c)(a)和(b) 二者。
33.一种￠-葡糖苷酶(Bgll)变体，所述BglI变体具有对SEQ ID NO :2的氨基酸残基20-870的至少70%同一性、或至少75%同一性、至少80%同一性、至少85%同一性、或至少90%同一性、或至少95%同一性并且包括参考SEQ ID NO 2所确定的在位置D369处的氨基酸取代，其中所述取代是1、￥、￥3、11、1 、？3^、1、1(、(、？或0;并且进一步地，其中，相比于包括SEQ ID NO 2的氨基酸20-870的天然Cl BglI，所述变体具有 a)在大约pH5和大约65°C至少5倍大的热活性，或 b)在大约pH5和大约65°C至少3倍大的热稳定性,或 c)(a)和(b) 二者。
34.一种￠-葡糖苷酶(Bgll)变体，所述BglI变体具有对SEQ ID NO :2的氨基酸残基20-870的至少70%同一性、或至少75%同一性、至少80%同一性、至少85%同一性、或至少90%同一性、或至少95%同一性并且包括参考SEQ ID NO :2所确定的氨基酸取代E402N，并且进一步地，其中，相比于包括SEQ ID NO :2的氨基酸20-870的天然Cl Bgll，所述变体具有 a)在大约pH5和大约65°C至少5倍大的热活性，或 b)在大约pH5和大约65°C至少3倍大的热稳定性,或 c)(a)和(b) 二者。
35.一种重组核酸，所述重组核酸编码权利要求1-3、5-7、9-11、13-16、18-21、23-27、30、31、32、33或34中任一项所述的Bgll变体。
36.如权利要求35所述的重组核酸，所述重组核酸编码包括与信号肽融合的所述BglI变体的前蛋白，所述信号肽任选地是自然存在的Cl Bgll信号肽。
37.一种表达载体,所述表达载体包括权利要求35的重组核酸。
38.一种宿主细胞，所述宿主细胞包括权利要求35的重组核酸，其中所述核酸任选地与不同于Cl Bgll启动子的启动子可操作地连接。
39.如权利要求38所述的宿主细胞，所述宿主细胞是丝状真菌的物种。
40.如权利要求39所述的宿主细胞，所述宿主细胞是曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、金孢属(Chrysosporium)、毁丝霉属(Myceliophthora)或梭孢壳属(Thielavia)的物种。
41.如权利要求39所述的宿主细胞，所述宿主细胞还表达至少一种另外的非自然存在的重组纤维素酶多肽，所述非自然存在的重组纤维素酶多肽选自 a)重组内切葡聚糖酶(EG)多肽，和/或 b)重组纤维二糖水解酶多肽(CBH)。
42.一种产生Bgl I多肽的方法，所述方法包括在表达所述Bgl I变体的条件下培养权利要求38的宿主细胞。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述变体被所述宿主细胞分泌。
44.如权利要求42所述的方法，所述方法还包括从培养所述细胞的培养基中回收所述Bgll变体的步骤。
45.一种组合物，所述组合物包括权利要求1-3、5-7、9-11、13-16、18-21、23-27、30、31、32、33或34中任一项所述的Bgll变体和至少一种另外的非自然存在的重组纤维素酶多肽，所述非自然存在的重组纤维素酶多肽选自 a)重组内切葡聚糖酶(EG)多肽 b)重组纤维二糖水解酶多肽(CBH) c)至少一种重组EG多肽和至少一种重组CBH多肽。
46.如权利要求45所述的组合物，所述组合物还包括选自由以下组成的多肽组的至少一种多肽半纤维素酶、果胶酶、木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶、虫漆酶和纤维二糖脱氢酶。
47.如权利要求45所述的组合物，其中所述纤维二糖水解酶(CBH)和/或内切葡聚糖酶(EG)来自里氏木霉(Trichoderma reesei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophilia)、或除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis),或者其是里氏木霉的CBH或EG、嗜热毁丝霉的CBH或EG、或者除虫链霉菌的CBH或EG的变体。
48.如权利要求45所述的组合物，所述组合物包括表达所述Bgll变体的宿主细胞。
49.一种糖化纤维素基质的方法，所述方法包括 (a)提供纤维素基质；并且 (b)使所述基质与纤维素酶混合物在所述纤维素酶混合物催化所述纤维素基质水解的条件下接触，所述纤维素酶混合物包括 i)至少一种具有纤维二糖水解酶活性的蛋白； ii)至少一种具有内切葡聚糖酶活性的蛋白；和 iii)权利要求1-3、5-7、9-11、13-16、18-21、23-27、30、31、32、33 或 34 中任一项所述的3 -葡糖苷酶变体。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶(CBH)和/或内切葡聚糖酶(EG)来自里氏木霉、嗜热毁丝霉、或除虫链霉菌，或者其是里氏木霉的CBH或EG、嗜热毁丝霉的CBH或EG、或者除虫链霉菌的CBH或EG的变体。
51.如权利要求49所述的方法，其中所述纤维素基质是预处理的纤维素生物质。
52.—种产生葡萄糖的方法,所述方法包括将纤维二糖与权利要求1-3、5-7、9_11、13-16、18-21、23-27、30、31、32、33或34中任一项所述的P -葡糖苷酶变体在产生葡萄糖的条件下组合。
53.一种产生葡萄糖的方法，所述方法包括将纤维素基质与 (a)权利要求1-3、5-7、9-11、13-16、18-21、23-27、30、31、32、33 或 34 中任一项所述的3-葡糖苷酶变体； (b)至少一种另外的纤维素酶 在产生葡萄糖的条件下组合。
54.如权利要求52或53所述的方法，所述方法还包括 i)在权利要求46中产生的葡萄糖用作能量源和碳源的条件下培养微生物以产生代谢产物， ii)回收所述代谢产物。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述微生物是酵母或细菌。
56.如权利要求54所述的方法，其中所述代谢产物是醇、有机酸或具有1-20个碳原子的烃。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述代谢产物是乙醇。
58.一种￠-葡糖苷酶(Bgll)变体，所述变体具有对SEQ ID NO :2的氨基酸残基20-870的至少80%同一性、或至少85%同一性、或至少90%同一性、或至少95%同一性并且包括参考SEQ ID NO 2所确定的在位置Q291处的氨基酸取代、在位置D369处的氨基酸取代和在位置E402处的氨基酸取代。
59.如权利要求58所述的Bgll变体，其中所述变体具有对SEQID NO :2的氨基酸残基20-870的至少90%同一性或至少95%同一性。
60.如权利要求58所述的Bgll变体，所述Bgll变体在D47、A79、Q85、I106、A109、Q258、V260、Q313、F314、A343、S434、A475、K495、G628、A689、Y715 或 A732 处还包括至少一个另外的氨基酸取代。
61.如权利要求60所述的8811变体，其中所述取代是0471479￡/6/] 、085~11、1106￥、A109/S/T、V260G、Q313M、F314L/V、A343C、S434P、A475L、K495N、G628W、A689I、Y715P 或A732G。
62.如权利要求61所述的Bgll变体，其中所述变体包括至少一个取代Q291W、D369L/H/R/Y 或 E402N。
63.如权利要求58至62中任一项所述的Bgll变体，其中所述变体具有，相比于包含SEQ ID NO 2的氨基酸20-870的天然Cl BglI，所述变体具有 a)在大约pH5和大约65°C至少5倍大的热活性，或 b)在大约pH5和大约65°C至少3倍大的热稳定性,或 c)(a)和(b) 二者。
全文摘要
本发明涉及真菌C1菌株β-葡糖苷酶的变体形式的重组表达。本发明还涉及从生物质中产生可发酵的糖和通过使用表达β-葡糖苷酶变体的基因修饰的生物体发酵糖来产生生物燃料。本发明提供了通过使纤维二糖与重组β-葡糖苷酶变体蛋白诸如由重组宿主细胞分泌到培养基中的变体蛋白接触来从纤维二糖产生可发酵的糖诸如葡萄糖的方法。本发明的方法还可用于将生物质基质转化成可发酵的糖，且最终转化成乙醇或其他生物燃料。
文档编号A61K36/00GK102740868SQ201080061944
公开日2012年10月17日 申请日期2010年11月24日 优先权日2009年11月25日
发明者张希云, 杨劼, 阿提拉·安朵 申请人:科德克希思公司